Investigation of the inhibitory effect of engineered probiotic Lactobacillus acidophilus on the growth of Salmonella enteritidis

Subject Areas : Food Microbial Contamination

Mottahareh Eskandari ¹ , Abbas Doosti ²

1 - IAU,,.shahrekord Branch
2 - Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.

Received: 2022-07-01 Accepted : 2023-10-19 Published : 2023-09-23

Keywords: Salmonella, Lactobacillus acidophilus, Tachyplesin,

Abstract :

Probiotics are living cellular components that have beneficial effects on the host in a certain number when they enter the gastrointestinal tract. The aim of this study was to produce and evaluate the effects of the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus, which expresses the peach's peptide Tachyplesin I, on the growth of Salmonella. The recombinant plasmid pNZ8148- Tachyplesin containing the Tachyplesin gene was introduced into E. coli by heat shock and then purified. The recombinant vector containing the tachiplicin gene was then inserted into Lactobacillus acidophilus by electroporation method and screened by chloramphenicol antibiotic and PCR. Then, the inhibitory effect of engineered Lactobacillus acidophilus on the growth of Salmonella was investigated and compared with antibiotic discs..After confirmation of the entry of plasmid pNZ8148-Tachyplesin into Lactobacillus acidophilus, it had an inhibitory effect on the growth of Salmonella pathogenic bacterium as the diameter of the growth inhibition zone created on Salmonella was acceptable under the influence of engineered Lactobacillus. After comparing the diameter of the auras of ampicillin, chloramphenicol and tetracycline antibiotic disks with engineered lactobacillus and performing statistical analysis, no significant difference was reported. Considering that the presence of Tachyplesin gene in Lactobacillus acidophilus was confirmed, the resulting growth inhibition zone around Salmonella indicates that the expression and secretion of Tachyplesin gene in Lactobacillus has an antibiotic-like effect on Salmonella.

Full-Text:



آبررسی تاثیر مهاری پروبیوتیک مهندسی شده لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر رشد سالمونلا انتریتیدیس

 

 

 

 

چکیده

ﭘﺮوﺑﻴوتیک­ها اﺟﺰ­اي ﺳﻠﻮﻟﻲ ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ زﻧﺪه­اي ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ وﻗﺘﻲ وارد دﺳﺘﮕﺎه ﮔﻮارش می­شوند یک یا چند اثر مفید را روی سلامتی میزبان می­گذارند. هدف از این تحقیق تولید و بررسی اثرات باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (ATCC 4356) بیان کننده پپتید Tachyplesin I خرچنگ نعل اسبی بر رشد باکتری سالمونلا انتریتیدیس (ATCC 13311) است. 

پلاسمید نوترکیب  pNZ8148- Tachyplesin I به روش شوک حرارتی وارد باکتری E.coli شد و سپس تخلیص شد­. در مرحله بعد وکتور نوترکیب حاوی ژن Tachyplesin I به روش الکتروپوریشن وارد باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس شد و غربالگری توسط آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل و PCR انجام گرفت. سپس تاثیر مهاری باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده بر روی رشد سالمونلا بررسی و با دیسک­های آنتی بیوتیکی مقایسه گردید.

ورود پلاسمید pNZ8148-Tachyplesin I درون باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به کمک آنتی بیوتیک و واکنش PCR تایید شد. سپس لاکتوباسیلوس مهندسی شده تاثیر مهاری بر روی رشد باکتری سالمونلا را نشان داد، به صورتی­که قطر هاله عدم رشد ایجاد شده بر روی سالمونلا تحت تاثیر لاکتوباسیلوس مهندسی شده قابل قبول بود. پس از مقایسه قطر هاله­های دیسک­های آنتی­بیوتیکی آمپیسیلین، کلرامفنیکل و تتراسایکلین با لاکتوباسیلوس مهندسی شده و انجام آنالیز آماری، بین لاکتوباسیلوس دستکاری نشده (کنترل) و لاکتوباسیلوس بیان کننده ژن Tachyplesin تفاوت معنی دار در هاله عدم رشد دیده شد.

با توجه به این که حضور ژنI  Tachyplesin درون لاکتوباسیلوس اسیلویدوفیلوس تایید شد، هاله عدم رشد حاصل از آن در اطراف سالمونلا نشان دهنده این مطلب است که بیان و ترشح ژن Tachyplesin I درون لاکتوباسیلوس اثری مشابه آنتی­بیوتیک بر سالمونلا دارد.

واژه های کلیدی: لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، سالمونلا، Tachyplesin I

 

 

 

 

 

مقدمه

ﭘﺮوﺑﻴوتیک­ها اﺟﺰ­اي ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ زﻧﺪه­اي ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻛﻪ وﻗﺘﻲ وارد دﺳﺘﮕﺎه ﮔﻮارش می­شوند از راه ایجاد تعادل میکروبی در روده اثرات مفیدی بر میزبان خود اعمال می­دارند از ﺟﻤﻠﻪ اﻳﻦ اﺛﺮات ﻣﻔﻴﺪ می­توان ﺑﻪ اﻓﺰاﻳﺶ ﻫﻀﻢ ﻣﻮاد ﻏﺬا‌ﻳﻲ، ﺗﻘﻮﻳﺖ ﺳﻴﺴﺘﻢ اﻳﻤﻨﻲ ﺑﺪن و ﺑﺎﻻ ﺑﺮدن ﻣﻘﺎوﻣﺖ در ﺑﺮاﺑﺮ ﻋﻔﻮنت­ها و ﺧﻮاص ﺿﺪ ﺟﻬﺶ زاﺋﻲ و ﺿﺪ ﺳﺮﻃﺎﻧﻲ اﺷﺎره ﻛﺮد (Abdel et al.,2013). باکتری­های مولد اسید لاکتیک به ویژه لاكتوباسیلوس­ها و بیفیدوباکتریوم­ها به طور عادی جزیی از سیستم دستگاه گوارش هستند و پروبیوتیک محسوب می­شوند (Pimentel et al.,2020). رابرفرويد (2007) تعريف جديدی از پربیوتیک ارائه کرد که طبق آن پربیوتیک­ها ترکیبات تخمیر شونده­ای هستند که به طور انتخابی سبب تغییرات ويژه در ترکیب و يا فعالیت میکروفلورای روده می­شوند (Tufarelli et al.,2016). پروبیوتیک­ها بر تعادل باکتری­های مفید و مضر روده تأثیر می­گذارند و این تعادل را به نفع افزایش جمعیت باکتری­های مفید تغییر می­دهند، در حقیقت پروبیوتیک­ها از همین طریق اثرات سلامت بخش خود را در بدن میزبان القا می­کنند. دوز پروبیوتیک مصرف شده عامل مهمی است که بر تراکم میکروارگانیسم­های موجود در بخش­های مختلف دستگاه گوارش تأثیر می­گذارد. پروبیوتیک­ها همچنین قادر هستند اختلالات میکروبی روده در میزبان را پس از درمان آنتی بیوتیکی به حداقل برسانند(Burns and Rowland, 2010; Gaspar et al.,2018 ). ویژگی­های عملکردی پروبیوتیک­ها  شامل موارد زیر است (Jay, 2012): 

1- رقابت برای جذب مواد غذایی: پروبیوتیک­ها از مواد غذایی که مورد مصرف باکتری­های بیماری­زا قرار می­گیرند استفاده می‌کنند.

2- مهار رقابتی جایگاه­های اتصال باکتری بر روی سطوح اپیتلیال روده: گفته می­شود که بسیاری از پاتوژن­های روده ای برای استقرار در روده و ایجاد بیماری باید بتوانند به روده متصل شوند با توجه به این مسئله تعدادی از گونه­های پروبیوتیک به دلیل توانایی اتصالشان به سلول­های اپی تلیال انتخاب شده­اند.

3- تعدیل میکروفلور روده: پروبیوتیک با کاهش تعداد کلی فرم­ها، کلستریدیا و افزایش لاکتوباسیل­ها یا بیفیدوباکترها ترکیب میکروفلور روده را بهبود می­بخشد.

 4- کاهش سموم: پروبیوتیک­ها تولید مواد مضر از قبیل آمونیاک، ایندول، فنل­ها و سولفید هیدروژن را که سرطان­زا هستند و به کبد آسیب می­رسانند مهار می­کنند.. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس هم نیتروزآمین را تجزیه می­کند و می­تواند تولید آن را در روده مهار کند. این دو باکتری قادرند تولید ایندول و رشد باکتری­های تولید کننده آن را کاهش دهند.

5- تقویت سیستم ایمنی.

6- تولید ویتامین­ها و سایر فاکتورهای غذایی.

7- اثرات سودمند از نظر تغذیه: ساخت مواد مغذی نظیر ویتامین B، K، آمینواسیدها، آنزیم لاکتاز، لیپاز و پروتئاز که از جمله آنزیم­های تولید شده هستند که هضم مواد غذایی را تسهیل می کنند.

انواع پروبیوتیک­ها شامل لاکتوباسیلوس¹، بیفیدوباکتر²، باسیلوس³، پدیوکوکوس⁴، انتروکوکوس⁵ و مخمر ساکارومایسس سرویزیه⁶ هستند. باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس⁷ یکی از مفیدترین گونه­های لاکتوباسیلوس می­باشد که به عنوان یک میکرواورگانیسم پروبیوتیک در محصولات لبنی مانند ماست، شیر و بخش­هایی از دستگاه گوارش پستانداران نظیر روده انسان دیده می­شود (Jones, 1999; Gaspar et al.,2018 ).

در این پژوهش این باکتری جهت بیان کردن پپتید Tachyplesin I خرچنگ نعل اسبی مورد بررسی قرار می­گیرد تا مشخص گردد چه تاثیری بر رشد سالمونلا دارد. باکتری سالمونلا، یک پاتوژن روده­ای بی هوازی گرم منفی است که به طور طبیعی در دستگاه گوارش انسان و حیوانات وجود دارد و یکی از مهم­ترین عوامل باکتریایی منتقله از طریق غذا محسوب می­گردد. ﮔﻮﻧـه­هـﺎي ﺳــﺎﻟﻤﻮﻧﻼ به ﻋﻨــﻮان ﻳﻜـی از ﻣﻬﻤﺘــﺮﻳﻦ آﻟــﻮده ﻛﻨﻨﺪه­های ﻣﻮاد ﻏـﺬاﻳﻲ و از ﻋﻮاﻣـﻞ اﻳﺠـﺎد کننده ﮔﺎﺳﺘﺮواﻧﺘﺮﻳﺖ (اﻟﺘﻬﺎب ﻣﻌﺪي روده­ای) در اﻧﺴﺎن ﺑـﻪ ﺷﻤﺎر می­آﻳﻨﺪ. در ﺟﻨﺲ ﺳـﺎﻟﻤﻮﻧﻼ ﺑـﻴﺶ از 2600 ﺳﻮﻳﻪ وﺟـﻮد دارد که ﺑﺴـﻴﺎري از اﻳـﻦ ﺳـﻮیه­ها، ﭘـﺎﺗﻮژن­هـﺎي ﻣﻬﻤـﻲ ﺑـﺮاي اﻧﺴـﺎن­هـﺎ و ﺣﻴﻮاﻧـﺎت ﻣﺤﺴﻮب می­ﺷﻮﻧﺪ  برای درﻣﺎن ﺑﯿﻤﺎری­های ﻧﺎﺷﯽ از ﺳـﺎﻟﻤﻮﻧﻼ از آﻧﺘـی­ﺑﯿﻮﺗﯿـک­هـﺎ اﺳـﺘﻔﺎده ﻣـی­ﺷـﻮد؛ اﻣـﺎ ﺷـﯿﻮع ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺑﻪ آﻧﺘـی­ﺑﯿﻮﺗﯿـک­ﻫـﺎ در ﻣﯿـﺎن ﺳـﺎﻟﻤﻮﻧﻼ­ها ﻣﺸـﮑﻞ اﺻـﻠﯽ در درﻣﺎن ﻋﻔﻮﻧت­های ﺳﺎﻟﻤﻮﻧﻼﯾﯽ اﺳـﺖ (Kolida et al.,2002). از علل افزایش مقاومت انتی­بیوتیکی، ﻣﺼﺮف ﺑـﯽروﯾـﻪ و ﮐﻨﺘـﺮل ﻧﺸـﺪه آﻧﺘـی­بیوﺗﯿـک­ها در اﻧﺴﺎن و ﺣﯿﻮان و ﮐﺎﻣـﻞ ﻧﮑـﺮدن دوره درﻣـﺎن ﺗﻮﺳـﻂ ﺑﯿﻤﺎر اﺳـﺖ ﮐـﻪ ﺑﺎﻋﺚ از ﺑﯿﻦ رﻓﺘﻦ ﺑﺎﮐﺘﺮی­هاي ﺣﺴـﺎس و اﻧﺘﺨـﺎب ﺳـﻮیه­هـﺎي ﻣﻘـﺎوم می­شود. ﻣﺎﻧﻨــﺪ ﺟﻮجه­های ﮔﻮﺷﺘﯽ و ﺑﻮﻗﻠﻤـﻮن ﺑـﺮاي اﻓـﺰاﯾﺶ رﺷـﺪ، ﺳـﺒﺐ ﭘﯿـﺪاﯾﺶ ﺳـﺎﻟﻤﻮﻧﻼ­های ﻣﻘﺎوم اﺳــﺘﻔﺎده از آنتی­بیوتیک­ها در ﺑﺮﺧــﯽ از ﺣﯿﻮاﻧــﺎت ﺑﻪ آنتی­بیوﺗﯿﮏ ﺷﺪه اﺳﺖ (Burns and Rowland, 2010). هدف از انجام این مطالعه ایجاد و بررسی اثرات پپتید Tachyplesin I خرچنگ نعل اسبی کلون شده در باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر رشد سالمونلا است.

روش کار

سویه­های باکتریایی و وکتور

در این مطالعه تجربی، باکتري E. coli سویهTop10F  که به منظور ترانسفورماسیون و تکثیر سازه ژنی نوترکیب مورد استفاده قرار گرفت از بخش بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تهیه گردید. باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (PTCC No 1643) که به منظور بیان پروتئین Tachyplesin I مورد استفاده قرار گرفت، از مرکز کلکسیون قارچ­ها و باکتری­های صنعتی ایران تهیه شد. باکتری سالمونلا انتریتیدس که به منظور بررسی اثرات پروبیوتیک مورد استفاده قرار گرفت، از بخش بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تهیه گردید. همچنین، پلاسمید نوترکیب pNZ8148-Tachyplesin I حامل ژنI  Tachyplesin خرچنگ نعل اسبی به همراه سیگنال پپتید جهت ترشح پروتئین ساخته شده طراحی و به شرکت جین­ری سفارش داده شد.

ترانسفورماسیون و استخراج پلاسمید

باکتری E.coli سویه TOP10  یک شب در محیط کشتLuria–Bertani (LB)   مایع در دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شد. سلول­های مستعد⁸ به کمک کلسیم کلراید (CaCl2) و شوک حرارتی (42 درجه سانتی­گراد) آماده شدند (Pimentel et al.,2020). از این سلول­ها برای انتقال پلاسمید نوترکیب pNZ8148-Tachyplesin I  و پلاسمید خالی pNZ8148 به طور جداگانه استفاده شد. سپس باکتری­ها در محیط کشت LB Agar حاوی آنتی بیوتیک کلرامفنیکل کشت داده شدند. پلاسمید مورد استفاده ژن مقاومت به آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل را دارا می­باشد. پودر کلرامفنیکل با غلظت 05/0 گرم در لیتر مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا 05/0 گرم از پودر کلرامفنیکل در 10 سی سی الکل خالص حل گردید سپس مقدار 1 سی‌سی از آن در هر 100 سی‌سی محیط کشت افزوده شد. به منظور استخراج پلاسمید ابتدا از ماتریکس­ها، درون 5 میلی­لیتر محیط کشت LB-Broth حاوی کلرامفنیکل 05/0 گرم در لیتر، کشت داده شد و لوله به مدت 24 ساعت درون انکوباتور شیکردار قرار داده شد. سپس با استفاده از کیت استخراج پلاسمید شرکت یکتا تجهیز آزما (شرکت یکتا تجهیز آزما، تهران، ایران) طبق پروتکل کیت، پلاسمیدها استخراج گردید.

تایید صحت استخراج پلاسمید توسط واکنش PCR

واکنش PCR بر روی پلاسمید­ استخراج شده با استفاده از پرایمر­های اختصاصی (جدول 1) ژنI  Tachyplesin انجام شد. در نهایت محصول آن روی ژل الکتروفورز برده شد و صحت استخراج پلاسمید بررسی شد.

 

 

رنگ آمیزی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس

ابتدا از نمونه باکتری یک گسترش روی لام تهیه گردید. سپس رنگ آمیزی با کریستال ویوله انجام شد و مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل به اینصورت انجام شد. سپس سطح گسترش با رنگ ثانویه یعنی سافرانین پوشانده شد و 30 تا 60 ثانیه زمان داده شد. بعد از آن رنگ اضافی خالی شد و با آب مقطر لام شستشو داده شد. لام رنگ آمیزی شده آهسته روی کاغذ خشک کن قرار داده شد.

الکتروپوریشن

باکتری­های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مورد نظر در محیط MRS مایع کشت داده شدند و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سه مرتبه به سلول­ها پالس داده شد (بین هر دو پالس کوت به مدت 5 دقیقه بر روی یخ قرار داده شد.). سلول­های باقی مانده بر روی پلیت حاوی محیط کشت MRS-Agar دارای آنتی بیوتیک کلرامفنیکل (05/0 گرم در ­لیتر) کشت داده شد.

تایید صحت انجام واکنش الکتروپوریشن

جهت تایید نهایی صحت الکتروپوریشن، از باکتری­های ترانسفورم شده مجددا استخراج پلاسمید انجام گرفت و بر روی پلاسمید­های استخراج شده مجددا واکنش PCR به کمک پرایمر­هایI  Tachyplesin انجام شد.

استخراج RNA، تیمار با آنزیم DNaseI و سنتز cDNA

پس از تایید انتقال پلاسمید درون باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، RNA تام سلولی از باکتری­ها استخراج شد. جهت استخراج RNA از میکروتیوب و سر سمپلرهای RNase Free/DNase Free استفاده شد. به این منظور از محلول RNX-Plus (سیناکلون، تهران، ایران) استفاده شد و RNA سلولی استخراج گردید و به میزان 25 میکرولیتر آب تزریق به تیوب اضافه شد تا رسوب RNA در آن حل گردید سپس DNase Treatment انجام شد. سنتز cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA یکتا تجهیز آزما انجام شد. به این منظور، میزان 10 میکرولیتر از نمونه RNA جهت حصول 500 نانوگرم از RNA، 1 میکرولیتر از پرایمر Random Hexamer (74 نانومول)، 4 میکرولیتر5 x first-strand buffer ، 1 میکرولیتر dNTPs (10 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر RNasin (40 واحد بر میکرولیتر) و 1 میکرولیتر M-MLV⁹ (200 واحد بر میکرولیتر) طبق پروتوکل کیت مورد استفاده قرار گرفت.

 

 

واکنش RT-PCR

صحت ساخت cDNA سنتز شده توسط واکنش PCR با پرایمر­های ژن Tachyplesin بررسی شد. محصولات PCR بر روی ژل آگارز %1 الکتروفورز گردید و پس از زمان مقرر با نور UV مشاهده شدند.

بررسی تاثیر ضد میکروبی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده

جهت بررسی اثر ضد میکروبی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده، باکتری سالمونلا روی محیط کشت مولر هینتون آگاردار کشت داده شد. سپس دیسک آنتی بیوگرام بلانک تهیه گردید و به باکتری مهندسی شده و غیر مهندسی شده آغشته گردید و بر روی سطح پلیت حاوی سالمونلا قرار داده شد. قطر هاله عدم رشد حاصل از باکتری لاکتوباسیلوس مهندسی شده با قطر هاله عدم رشد باکتری لاکتوباسیلوس سویه استاندارد دستکاری نشده و دیسک­های آنتی بیوتیکی نظیر آمپی سیلین، تتراسایکلین و کرامفنیکل پس از گذشت 24 ساعت مقایسه گردید.

آنالیز آماری

قطر هاله­های عدم رشد حاصل از دیسک­های آنتی­بیوتیکی آمپیسیلین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین و همچنین باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده بر حسب میلی­متر اندازه­گیری شد و سپس آنالیزهای مربوطه برای ایجاد باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیان کننده پپتید خرچنگ نعل اسبی و بررسی اثرات آن بر رشد سالمونلا با استفاده از نرم افزار Graphpad prism و آزمون های  ANOVA   TWO-Way انجام شد که سطح معنی داری 0.05 > Pدر نظر گرفته شد.

توسط نرم افزار GraphPad Prism آنالیز گردید.

جدول 1- اطلاعات پرایمر

Siz Bp	Primer sequence	Gene
147	Lp-Tach-F: 5’- ATGCGTAAAAAGTGGCGTTG -3’ Lp-Tach-R: 5’- ACGACAACGACGATAACAAATAC -3’	Tachyplesin

نتایج

نتایج تکثیر و استخراج پلاسمید­ها 

پلاسمید حاوی ژنI  Tachyplesin، پلاسمید­ درون باکتری E.coli منتقل شد. پس از گذشت 24 ساعت از زمان انکوبه نمونه­ها، از تک کلنی­های رشد یافته ماتریکس تهیه گردید (شکل 1). سپس از ماتریکس­ها درون محیط LB-Broth حاوی آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل کشت داده شد و پلاسمید توسط کیت استخراج پلاسمید شرکت یکتا تجهیز آزما طبق دستورالعمل کیت، استخراج شد. واکنش PCR بر روی پلاسمید­های استخراج شده با پرایمر­های ژنI  Tachyplesin انجام شد. حضور باند 147 جفت بازیI  Tachyplesin، صحت انجام استخراج پلاسمید را تایید کرد (شکل 2).

 

شکل 1- ترانسفکت پلاسمید و تهیه ماتریکس از تک کلنی­های رشد یافته.

 

شکل 2- واکنش PCR بر روی پلاسمید pNZ8148-Tachyplesin I استخراج شده. حضور باند 147 جفت بازی مربوط به ژن Tachyplesin (B) در کنار مارکر 50 جفت بازی (A) صحت استخراج پلاسمید را تایید کرد. چاهک C کنترل منفی.

 

شکل 3- تایید خلوص باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس. پس از رنگ آمیزی گرم، باسیل¬های باکتری زیر میکروسکوپ رویت شدند.( بزرگنمایی 40x)

نتایج الکتروپوریشن

پس از انجام واکنش الکتروپوریشن، باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بر روی محیط MRS-Agar حاوی 05/0 گرم در ­لیتر آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل کشت داده شد. از تک کلنی­ها، ماتریکس تهیه گردید (شکل 4). سپس از ماتریکس­های رشد یافته مجددا استخراج پلاسمید انجام گرفت و واکنش PCR مجددا بر روی پلاسمید استخراج شده با پرایمر­های ژنI  Tachyplesin انجام شد. صحت انجام واکنش الکتروپوریشن مجددا با رویت باند 147 جفت بازیI  Tachyplesin تایید گردید (شکل 5).

 

شکل 4- تهیه ماتریکس از باکتری استافیلوکوکوس اسیدوفیلوس نوترکیب. 24 ساعت پس از انجام الکتروپوریشن، از تک کلنی¬های حاصل ماتریکس تهیه گردید.

 

شکل 5- واکنش PCR بر روی پلاسمید استخراج شده از باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نوترکیب. حضور باند 147 جفت بازی مربوط به ژن Tachyplesin (B) در کنار مارکر 100 جفت بازی (A) صحت انجام الکتروپوریشن را تایید کرد. چاهک c: کنترل منفی.

 

نتایج استخراج RNA و سنتز cDNA 

باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نوترکیب درون محیط کشت LB-Broth حاوی 05/0 گرم در لیتر آنتی­بیوتیک کلرامفنیکل کشت داده شد. RNA تام استخراج گردید و cDNA سنتز شد. واکنش PCR تکرار شد، به اینصورت که بر روی cDNA ساخته شده با پرایمر­های ژنI  Tachyplesin واکنش PCR انجام شد و پس از الکتروفورز باند 147 جفت بازیI  Tachyplesin رویت شد در نتیجه بیان زهرI  Tachyplesin تایید گردید (شکل 6).

 

شکل 6- بررسی صحت سنتز cDNA به روش PCR. باند 147 جفت بازی (B) مربوط به ژنI  Tachyplesin در کنار مارکر 100 جفت بازی (A) صحت سنتز cDNA را تایید کرد. چاهک C کنترل منفی است.

نتایج مربوط به بررسی تاثیر ضد میکروبی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده

باکتری سالمونلا بر روی محیط کشت مولر هینتون آگاردار کشت داده شده. سپس دیسک­های آنتی­بیوگرام بلانک تهیه گردید و به باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی نشده آغشته گردید و بر روی پلیت حاوی باکتری سودوموناس آئروژینوزا قرار داده شد. علاوه بر این، دیسک­های آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کرامفنیکل نیز در کنار دو گروه قبلی قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد هاله­های اطراف دیسک ­ها مشاهده شد. همانطور که در تصویر 7 مشاهده می­شود اطراف دیسک حاوی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده هاله قابل قبولی تشکیل شده است که نشان می­دهد سمI  Tachyplesin تولید شده و پس از ترشح از باکتری لاکتوباسیلوس، بر روی باکتری سالمونلا اثر مهاری داشته است و اثری مشابه با آنتی­بیوتیک­های آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کرامفنیکل داشته است. این در حالی است که باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی نشده تاثیری بر رشد باکتری سالمونلا نداشته است (شکل 7).

 

شکل 7- تشکیل هاله اطراف دیسک. A: هاله حاصل از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نوترکیب در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس غیر نوترکیب. B: هاله­های حاصل از دیسک­های آنتی­بیوتیکی آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کرامفنیکل.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 8- نتایج تشکیل هاله اطراف دیسک. A: هاله حاصل از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نوترکیب در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس غیر نوترکیب. B: هاله¬های حاصل از دیسک¬های آنتی¬بیوتیکی آمپی-سیلین، تتراسایکلین و کرامفنیکل. C: اطراف دیسک حاوی باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده هاله قابل قبولی تشکیل شده است.

 

نتایج

قطر هاله­های عدم رشد اطراف دیسک­های آمپی­سیلین، تتراسایکلین، کلرامفنیکل و باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده با خط کش در مقیاس میلی­متر اندازه­گیری گردید و نتایج توسط نرم افزار GraphPad Prism آنالیز گردید. آزمون بررسی قطر هاله به صورت دو تکرار انجام شد. از نظر آماری اختلاف بین هاله عدم رشد آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل با هاله عدم رشد حاصل از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده معنی­دار نبود. در واقع بر اساس این نتایج می­توان ادعا کرد که هاله­های عدم رشد حاصل از باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده تفاوت آماری معنی­داری با هاله­های عدم رشد دیسک­های آنتی­بیوتیکی نشان ندادند (شکل 9) (جدول 2).

 

شکل 9- نتایج مربوط به آنالیز آماری قطر هاله­های عدم رشد. پس از آنالیز اختلاف آماری بین هاله عدم رشد باکتری مهندسی شده و دیسک­های آنتی­بیوتیکی مشاهده نشد (Blank control باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی نشده است).

جدول 2- قطر هاله­های عدم رشد بر روی پلیت

باکتری	قطر هاله
Salmonella enteritidis	Ampicillin		Tetracycline		Chloramphenicol		Lactobacillus-Tachyplesin		Blank control
	15.12	13.84	12.54	13.23	15.43	15.99	2.33	3.65	0.86	0.73

بحث

پروبیوتیک­ها میکروارگانیسم­های غیر بیماری­زایی هستند که اگر به تعداد کافی و به صورت زنده مورد استفاده قرار گیرند، از طریق ایجاد تعادل میکروبی در روده اثرات مفید و سلامت بخشی برای میزبان خود دارند. گزارش شده است که لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در تنظیم ژن­های مرتبط با پاسخ ایمنی، تنظیم هورمونی رشد و نمو بافت و هموستاز یونی دخیل است. افزون بر این گزارش شده است که استفاده از پروبیوتیک­ها تاثیر سودمندی روی عملکرد، بهبود تعادل میکروبی، سنتز ویتامین­ها، کاهش PH، رها سازی باکتریسین­ها و بهبود مصرف غذا در جوجه­های گوشتی و مرغ­های تخم­گذار دارد (Shirzadi et al.,2019). 

با توجه به اینکه موضوع این پژوهش بررسی اثرات باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیان کننده پپتید Tachyplesin I خرچنگ نعل اسبی بر رشد سالمونلا  بود به همین منظور، ژنI  Tachyplesin به صورت سنتتیک درون پلاسمید pNZ8148 قرار داده شد. آنالیزهای آماری نشان داد که این اختلاف معنی­داری بین هاله­های عدم رشد حاصل از دیسک­های آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل با هاله عدم رشد حاصل از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده وجو ندارد و فرضیه تحقیق قابل قبول بود. در واقع نتایج بدست آمده از این تحقیق نشان داد که پروتئین ترشحی Tachyplesin I که توسط باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس مهندسی شده تولید می­گردد می­تواند اثر مهاری بر رشد باکتری سالمونلا بگذارد. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و ترکیب آن با آنتی بیوتیک‌های طبیعی  اثرات مثبتی بر عملکرد رشد، اکولوژی میکروبی روده، و مورفولوژی روده جوجه‌های گوشتی نشان داده و می‌تواند به عنوان یک محرک رشد استفاده شود (Atabaigi et al.,2020). در مطالعات گذشته نشان داده شده است که افزایش مقاومت به سالمونلا ناشی از درمان با لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در  شیر تخمیر شده با اسیدوفیلوس به دلیل ایمنی محافظتی ضد سالمونلا است که عمدتاً توسط بافت مخاطی ایجاد می شود(Shirzadi et al.,2019). در دهه‌های اخیر نشان داده شده که پروبیوتیک‌های حاصل از فلور طبیعی روده باعث کاهش عفونت‌های باکتریایی روده می‌شود. علاوه بر این پروبیوتیک‌ها از چسبیدن مواد سمی به دیواره روده جلوگیری می‌کنند. پروبیوتیک‌ها از روده در برابر تشکیل ترکیبان سرطان‌زا محافظت می‌کنند. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که پروبیوتیک‌های لاکتوباسیلی درمان سرطان کولورکتال را با استفاده از 5-FlouroUracile تسهیل می‌کنند. استفاده از پروبیوتیک­ها گزینه خوبی برای پیشگیری از بدخیمی‌های دستگاه گوارش، به خصوص سرطان‌های روده بزرگ  می‌باشد. عمل ضد سرطانی پروبیوتیک‌ها ممکن است به دلیل مکانیسم‌های مختلفی از جمله اثرات ضد سرطان و یا ضد سرطان‌زا، ضد جهش‌زا، تغییر و تمایز در تومور،  تغییر تحرک کولون و زمان عبور و همچنین کاهش  pH روده برای کاهش فعالیت میکروبی باشد. باکتری‌های پروبیوتیک با الیگوساکاریدها می‌تواند رشد باکتری در روده بزرگ را افزایش دهد و منجر به مقادیر بیشتر اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه مانند بوتیرات که اثرات ضد توموری دارد شوند (Kailasapathy et al.,2000). مطالعات قبلی اثرات مهاری گونه‌های لاکتوباسیلوس را در برابر رشد اشریشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسیتوژنز، شیگلا فلکسنر، سالمونلا تیفی موریوم، انتروباکتر کلوآکا، سودوموناس آئروژینوزا و انتروکوکوس فکالیس نشان داده‌اند و نیز فعالیت آنتاگونیستی جدایه‌های لاکتوباسیلوس علیه سالمونلا تیفی در شرایط آزمایشگاهی نشان داده شده است  (Abdel et al.,2013). 

 Maragkoudakis et al.(2009) خواص عملکردی باکتری‌های اسید لاکتیک بر علیه لیستریا مونوسیتوژنز و سالمونلا انتریتیدیس جهت حافظت گوشت مرغ خام در محیط آزمایشگاهی را ارئه دادند. از سویی دیگر، آلودگي به سالمونلا در پرندگان به وفور گزارش شده است. بيماري سالمونلوزیز در پرندگان و به ويژه مرغ اسهال سفيد باسيلي (پولوروم) است كه عامل آن سالمونلا پولوروم مي‌­باشد. سالمونلا پولوروم علاوه بر مرغ از قرقاول، قناري، طوطي، گوساله، خوك، اسب، گربه و انسان نيز جدا شده است. اين سروتيپ براي جوجه‌‌ها در چند روز اول زندگي بسيار كشنده است ولي مرغ­ها معمولاً نسبت به آن مقاومت دارند. باکتری در تخمدان پرندگان مي‌­ماند و از طريق تخم‌مرغ به جوجه­‌ها منتقل مي­‌شود. بيماري با اسهال و سپتي سمي همراه است و تعداد زيادي باكتري از طريق مدفوع جوجه‌­هاي مبتلا دفع شده و باعث آلودگي محيط و در نتيجه ابتلاي ساير جوجه‌­ها مي‌شود (Safarpour et al.,2020). 

نتیجه­گیری

 Tachyplesin -، یک پپتید ضد میکروبی است که این پپتید از طریق آپوپتوز، پرولیفراسیون تومور کشت داده شده را خاموش می­کند. Tachyplesi  کاتیونیک هپارین است و به معروف بودن آن به دلیل طيف وسيع و خواص آنتی میکروبیال قوی در برابر باکتری­های مقاوم به داروها است و همچنین از طریق واکنش با غشا لیپیدی باکتری­ها موجب افزایش نفوذ پذیری غشا می­شود که این موضوع سبب مرگ باکتری­ها شده است. به دلیل معرفی شدن آن به عنوان یک گزینه جهت داروهای ضد میکروبی، ضد تومور و ضد ویروس، طيف وسيع در برابر باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی است. با توجه به نتایج حاصل از آنالیز آماری و همچنین مشاهدات میکروسکوپی کشت میکروبی، می­توان چنین اعلام کرد که ژنI  Tachyplesin پس از بیان شدن درون باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، توانایی ترشح به خارج از سلول را پیدا کرده و بر روی رشد باکتری سالمونلا تاثیر می­گذارد. در واقع، بر طبق نتایج این پژوهش، بیان ژن زهرI  Tachyplesin در باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، قادر این رشد باکتری سالمونلا را مهار کند و تاثیری شبیه به آنتی­بیوتیک­هایی نظیر آمپی­سیلین، تتراسایکلین و کلرامفنیکل داشته باشد.

 منابع

Abdel D.A., Hassouna N., Hafez M., Ashor M.S., Aboulwafa M.M. 2013. Antagonistic activity of Lactobacillus isolates against Salmonella typhi in vitro. BioMed rResearch iInternational. 233: 685-696.

 

Atabaigi E.V., Moradi s., Ghazi Sh ., Rahimi M. 2020. Effects of Lactobacillus acidophilus and natural antibacterials on growth performance and Salmonella colonization in broiler chickens challenged with Salmonella enteritidis. Livestock Science. 233: 103-114.

 

Burns A.J. and Rowland I.R. 2010. Anti carcinogenicity of probiotics and prebiotics. Intestinal mMicrobiology. 1: 13-24.

Gaspar C., Donders G.G., Palmeirade O.R., Queiroz J.A., Tomaz C., Martinezde O.J., Palmeirade O.A. 2018. Bacteriocin production of the probiotic Lactobacillus acidophilus KS400. Applied Microbiology and Biotechnology Express. 8: 1-8.

 

Jay J.M. 2012. Modern Food Microbiology. Springer Science & Business Media. Gaithersburg, Maryland, USA.

Jones F. 1999. Lactobacillus acidophilus. University of Wisconsim-Madison, Department of Bacteriology. London, U.K.

 

Kailasapathy K. and Chin J. 2000. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol Cell Biology. 78: 80-8.

 

Kolida S., Tuohy K., Gibson G.R.2002. Prebiotic effects of inulin and oligofructose. British J.ournal of Nutrition. 87: 193-7.

 

Maragkoudakis P.A., Mountzouris K.C., Psyrras D., Cremonese S., Fischer J., Cantor MD., Tsakalidou E.2009. Functional properties of novel protective lactic acid bacteria and application in raw chicken meat against Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis. Int. J. of Food Microbiology. 130: 219-226.

 

Pimentel T.C., Madrona G.S., Garcia S., Prudencio S.H. 2020. Probiotic viability, physicochemical characteristics and acceptability during refrigerated storage of clarified apple juice supplemented with Lactobacillus paracasei ssp. paracasei and oligofructose in different package type. Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie. Food Science and Technology.63: 415-422.

 

Safarpour D.M., Doosti A., Jami M.S. 2020. Impacts of the Staphylococcal Enterotoxin H on the Apoptosis and lncRNAs in PC3 and ACHN. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 35: 180-8.

 

Shirzadi H., Nasermanesh H., Khatibjoo A., Taherpour K., Akbari Gharaei M. 2019.  ٍEffect of sweet wormwood essence and Lactobacillus acidophilus on performance of Japanese quails in laying period. Animal Production. 21: 151-63.

 

Tufarelli V. and Laudadio V. 2016. An overview on the functional food concept: prospectives and applied researches in probiotics, prebiotics and synbiotics. J. of Experimental Biology and Agricultural Science. 4: 273-278.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Investigation of the inhibitory effect of engineered probiotic Lactobacillus acidophilus on the growth of Salmonella enteritidis

 

 

 

Abstract

Probiotics are living cellular components that have beneficial effects on the host in a certain number when they enter the gastrointestinal tract. The aim of this study was to produce and evaluate the effects of the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus, which expresses the peach's peptide Tachyplesin I, on the growth of Salmonella. The recombinant plasmid pNZ8148- Tachyplesin containing the Tachyplesin gene was introduced into E. coli by heat shock and then purified. The recombinant vector containing the tachiplicin gene was then inserted into Lactobacillus acidophilus by electroporation method and screened by chloramphenicol antibiotic and PCR. Then, the inhibitory effect of engineered Lactobacillus acidophilus on the growth of Salmonella was investigated and compared with antibiotic discs..After confirmation of the entry of plasmid pNZ8148-Tachyplesin into Lactobacillus acidophilus, it had an inhibitory effect on the growth of Salmonella pathogenic bacterium as the diameter of the growth inhibition zone created on Salmonella was acceptable under the influence of engineered Lactobacillus. After comparing the diameter of the auras of ampicillin, chloramphenicol and tetracycline antibiotic disks with engineered lactobacillus and performing statistical analysis, no significant difference was reported. Considering that the presence of Tachyplesin gene in Lactobacillus acidophilus was confirmed, the resulting growth inhibition zone around Salmonella indicates that the expression and secretion of Tachyplesin gene in Lactobacillus has an antibiotic-like effect on Salmonella.

 

Keywords: Lactobacillus acidophilus, Salmonella, Tachyplesin

 

---

[1]  Lactobacillus

[2]  Bifidobacterium

[3]  Bacillus

[4]  Pediococcus

[5]  Enterococcus

[6]  Saccharomyces cerevisiae

[7]  lactobacillus acidophilus

[8]  Competent Cell

[9]  Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase

---