مطالعه اثرات پاتولوژیک آلودگی با قارچ کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) در هم‌کشتی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی با سلول¬های سرتولی گوسفند

محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی

امیرعلی شهبازفر ¹ , رضا اسد پور ² , مهداد تیر انداز ³ , فرزاد کتیرایی ⁴

1 - دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.
2 - دانشیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.
3 - دانش‌آموخته دکترای عمومی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.
4 - دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

تاریخ دریافت : 1402/08/06 تاریخ پذیرش : 1402/11/04 تاریخ انتشار : 1403/05/30

کلید واژه: سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی, سلول‌های سرتولی¬, سیتوپاتی, کاندید‌ا آلبیکنس.,

چکیده مقاله :

کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) عامل کاندیدیاز گوسفند، می‌تواند با ایجاد التهاب بیضه و التهاب اپیدیدیم در روند طبیعی قدرت باروری قوچ‌ها اختلال ایجاد کند. سلول‌های اسپرماتوگونی بیضه در طول حیات مرتباً تقسیم شده و با تولید اسپرماتوزوئیدها قدرت باروری جنس نر را حفظ می‌کنند. آسیب‌های وارد شده به بافت بیضه با تحت تأثیر قرار دادن سلول‌های بنیادی، باروری جنس نر را متأثر می‌سازند. در مطالعه حاضر، جداسازی، خالص‌سازی و کشت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی بیضه^ء گوسفند به همراه سلول‌های سرتولی، در محیط کشتDMEM-F12  (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) انجام گرفت. ماهیت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی توسط تکنیک ایمینوسیتوشیمی تایید شد. سپس سلول‌ها با قارچ کاندیدا آلبیکنس در 5 گروه با دزهای متفاوت قارچی آلوده شدند و یک گروه نیز به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد و هیچ قارچی به آن اضافه نشد. بعد از رشد قارچ‌ها در مدت 24 ساعت، سلول‌ها به همراه قارچ‌های رشد کرده توسط متانول فیکس شده و با رنگ هماتوکسیلین- ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. اثر سیتوپاتیک قارچ کاندیدا­آلبیکنس از طریق بررسی‌های ریخت‌شناسی و اندازه‌گیری شاخص‌های آسیب سلولی شامل لاکتات دهیدروژناز و مالون­دی‌آلدئید بعد از طی مدت 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که کاندیدا آلبیکنس روی سلول‌های سرتولی و سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی در طی مدت 24 ساعت اثر سیتوپاتیکی را با وارد نمودن آسیب سلولی و رشد سریع در محیط، ایجاد می‌کند و میزان آسیب سلولی و شاخص‌های آسیب سلولی با افزایش دوز قارچ در گروه‌های مختلف، افزایش مي­يابد. به همین دلیل باید در نظر داشت تاحد ممکن از رشد قارچ در محیط­های کشت جلوگیری شده و از تحقیقات روی محیط­های کشت قارچ­زده اکیداً خودداری گردد.

چکیده انگلیسی:

Candida albicans is the cause of candidiasis in sheep .Candida albicans can cause fertility disorder in ram with epididymitis and orchitis. Spermatogonia keep proliferating during sexual life of male animals and maintain male fertility by producing spermatozoa. Testicular tissue damage affects germ cells and consequently influences male fertility. In the present study, we isolated and purified and then co-cultured spermatogonial stem cells with sertoli cells in DMEM-F12 culture media. Spermatogonia stem cells and sertoli cells were identified by vimentin and Oct-4 immunocytochemical staining method, respectively. The cells were infected with Candida albicans in five groups with different doses and one group was considered as control without fungal infection. After fungal growth within 24 hours, the cells and fungus were fixed with methanol and stained with hematoxylin and eosin. The cytopathic effects of Candida albicans were evaluated by morphological changes and cell injury biomarkers (LDH and MDA measurement) after 24 hours. The results indicated that Candida albicans had cytopathic effect on spermatogonia stem cells and sertoli cells during 24 hours infection. Candida exerts its damages by its cytopathic effects and its rapid growth in culture, and these damages were dose dependent. Therefore, fungus infection of culture media should be prevented and research on infected culture media should be strictly avoided.

متن کامل:



آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی                                                                                                          دوره 18، شماره 2، پیاپی 70، تابستان 1403، صفحات: 158-143

 

 

"مقاله پژوهشی"                                                                                DOI: 10.71499/jvcp.2024.3061421

مطالعه اثرات پاتولوژیک آلودگی با قارچ کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) در هم‌کشتی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی با سلول­های سرتولی گوسفند

 

امیرعلی شهبازفر1*، رضا اسدپور2، مهداد تیرانداز3، فرزاد کتیرایی4

 

1- دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

2- دانشیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

3- دانش‌آموخته دکترای عمومی دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

4- دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 6/8/1402پذیرش نهایی: 4/11/1402)

 

 

چکیده

کاندیدا آلبیکنس (Candida albicans) عامل کاندیدیاز گوسفند، می‌تواند با ایجاد التهاب بیضه و التهاب اپیدیدیم در روند طبیعی قدرت باروری قوچ‌ها اختلال ایجاد کند. سلول‌های اسپرماتوگونی بیضه در طول حیات مرتباً تقسیم شده و با تولید اسپرماتوزوئیدها قدرت باروری جنس نر را حفظ می‌کنند. آسیب‌های وارد شده به بافت بیضه با تحت تأثیر قرار دادن سلول‌های بنیادی، باروری جنس نر را متأثر می‌سازند. در مطالعه حاضر، جداسازی، خالص‌سازی و کشت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی بیضهء گوسفند به همراه سلول‌های سرتولی، در محیط کشتDMEM-F12  (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) انجام گرفت. ماهیت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی توسط تکنیک ایمینوسیتوشیمی تایید شد. سپس سلول‌ها با قارچ کاندیدا آلبیکنس در 5 گروه با دزهای متفاوت قارچی آلوده شدند و یک گروه نیز به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد و هیچ قارچی به آن اضافه نشد. بعد از رشد قارچ‌ها در مدت 24 ساعت، سلول‌ها به همراه قارچ‌های رشد کرده توسط متانول فیکس شده و با رنگ هماتوکسیلین- ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. اثر سیتوپاتیک قارچ کاندیدا­آلبیکنس از طریق بررسی‌های ریخت‌شناسی و اندازه‌گیری شاخص‌های آسیب سلولی شامل لاکتات دهیدروژناز و مالون­دی‌آلدئید بعد از طی مدت 24 ساعت مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که کاندیدا آلبیکنس روی سلول‌های سرتولی و سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی در طی مدت 24 ساعت اثر سیتوپاتیکی را با وارد نمودن آسیب سلولی و رشد سریع در محیط، ایجاد می‌کند و میزان آسیب سلولی و شاخص‌های آسیب سلولی با افزایش دوز قارچ در گروه‌های مختلف، افزایش مي­يابد. به همین دلیل باید در نظر داشت تاحد ممکن از رشد قارچ در محیط­های کشت جلوگیری شده و از تحقیقات روی محیط­های کشت قارچ­زده اکیداً خودداری گردد.

 

کلیدواژه­ها­: سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی، سلول‌های سرتولی­، سیتوپاتی، کاندید‌ا آلبیکنس.

 

مقدمه

بيماري كانديديازيس (Candidiasis) به عنوان یکی از بیماری‌های عفونی قارچي در انسان و طیف وسیعی از حیوانات مطرح می‌باشد (Pappas et al., 2018). گونه کاندیدا­آلبیکنس متداول­ترین عامل آن بوده و می‌تواند موجب بیماری از حالت جلدی تا سیستمیک گردد (Touray and Touray, 2021). در حالت طبیعی مخمر مذكور جزء فلور طبیعی بدن بوده و بصورت هم‌زیست و بدون ضرر می‌باشد (Hull et al., 2000). 

استان آذربایجان­شرقی به لحاظ جمعيت دامی مخصوصاً پرورش گوسفند یکی از استان­های مهم و غنی کشور است. (Nematollahi et al., 2020). کاندیدا آلبیکنس به عنوان شایع‌ترین عامل کاندیدیازیس می‌تواند با ایجاد ارکیت و اپیدیدیمیت موجب اختلال در روند باروری قوچ‌ها شود. اساس اسپرم سازی، سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی است که دارای پتانسیل ویژه‌ای در نوسازی خود و یا تمایز به سایر رده‌های سلول ژرم و در نهایت اسپرم است (Daghighkia et al., 2017; Mescher et al., 2018). برای بقای سلول‌های بنیادی، نیاز به محیط ویژه نیچ است. نیچ ریز محیطی است که سرنوشت سلول‌های بنیادی را با جلوگیری از تمایز آن هاحفظ می کند و جلوی تبدیل شدن آن­ها به سلول­های بالغ را می­گیرد و غالباَ شامل سلول‌های تمایز یافته مجاور، سلول‌های بنیادی مجاور و ماتریکس خارج سلولی اطراف این سلول‌ها است. سلول‌های سرتولی در تشکیل این ریز محیط نقش بسزایی دارند (Hofmann, 2008).

براساس اطلاعات موجود‌، تاکنون مطالعه‌ای در رابطه با بررسی سیتوپاتی کاندیدا آلبیکنس بر روی سلول‌های سرتولی و اسپرماتوگونی در محیط آزمایشگاهی انجام نگرفته‌ است. البته قبلا با بکار بردن مواد مختلف مثل آنتی­اکسیدان­ها سعی در حفظ سلول‌های مختلف از آسیب عوامل آسیب‌رسان مثل قارچ‌ها شده­است (Shekari et al., 2020). لذا هدف از انجام مطالعه حاضر، بررسی اثر قارچ کاندیدا ­آلبیکنس بر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی در محیط کشت آزمایشگاهی بود که سعی شد سیتوپاتی قارچ کاندیدا آلبیکنس بر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی در آن بررسی‌ گردد و نتایج آن به درمان بالینی دام‌های مبتلا تعمیم داده ‌شود، 

 

مواد و روش­­ها

-نمونه‌برداری: طی مطالعه مداخله­ای حاضر که در طی بازه زمانی تابستان و پاییز 1399 صورت پذیرفته است، در هر بار برای نمونه‌برداری جهت بدست آوردن سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی به کشتارگاه صنعتی شهرستان تبریز واقع در خسروشاه مراجعه می‌شد و بیضه‌ء کامل بره‌های نابالغ گوسفند در حین کشتار بره و قبل از ضبط آن تهیه می­گردید. سپس کل پارانشیم  بافت بیضه توسط پنس استریل جدا شده و داخل محیط کشت DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) (Gibco, USA) انداخته می­شد و به صورت استریل در عرض 1 ساعت و در کنار کیسه یخ، به آزمایشگاه منتقل می‌گردید. در این مطالعه از بیضه گوسفند نابالغ استفاده گردید تا بتوان تعداد بیشتری از سلول‌های اسپرماتوگونی را جهت بررسی‌های تحقیقاتی حاضر جداسازی نمود (Rodriguez-sosa et al., 2006). سلول‌های سرتولی علاوه بر حمایت فیزیکی که محیطی همانند لوله‌های منی­ساز را ایجاد می‌کند، فاکتورهای رشد مختلفی را ترشح می‌کنند. این فاکتورها ریز محیط مناسبی برای بقا و تکثیر سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی فراهم می‌کنند (Griswold., 2018). از این رو در مطالعه حاضر سلول‌های اسپرماتوگونی و سرتولی با هم کشت داده شدند.

- استخراج و کشت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی: برای تهیهء سوسپانسیون سلولی، روش مورد استفاده‌ء ون پلت با کمی تغییرات به کار برده شد که شامل هضم مکانیکی و هضم آنزیمی دو مرحله­ای (Van Pelt et al., 1996)، به­شرح زیر می­باشد:

- هضم مکانیکی: در این مرحله نمونه تهیه شده ، در زیر هود کلاس 2 (پارس­آزما-ایران) به داخل یک پتری­دیش با قطر 5 سانتی‌متر حاوی محیط DMEM-F12 تازه منتقل شد. در ادامه بافت پارانشیم بیضه توسط تیغ بیستوری استریل به قطعات ریز در حد امکان خرد شد. سپس محتویات پتری دیش حاوی محیط DMEM-F12 و پارانشیم خردشده‌ء بیضه به داخل لوله فالکون دیگری منتقل شده و عمل سانتریفیوژ (Labtron, Iran) با سرعت 1200 دور در دقیقه، بمدت 1 دقیقه به عنوان شست‌و‌شو انجام گردیدو در ادامه محیط رویی تخلیه شد. این کار 2 بار تکرار شد.

 ‌‌‌‌- هضم آنزیمی: در این مرحله، محتویات حاصله از مرحله هضم مکانیکی، تحت اثر مخلوطی از آنزیم‌های کلاژناز، تریپسین و هیالورونیداز (Sigma-Aldrich, USA) در دو مرحله قرار گرفت. 

- هم‌کشتی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سلول‌های سرتولی: بعد از دور ریختن محیط رویی حاصله از سانتریفیوژ در مرحله دوم هضم آنزیمی، مقدار 2 میلی‌لیتر از محیط DMEM-F12 حاوی  10 درصد  FBS(Fetal Bovine Serum) (Gibco, USA) به رسوب حاصله در ته لوله فالکون افزوده شد. با سمپلر عمل مخلوط کردن انجام شده و سلول‌ها کاملا همگن شده و سوسپانسیون سلولی حاصله در زیر هود و شرایط استریل به داخل فلاسک T25 (فلاسک کشت سلول 25 میلی­لیتر (life science-South Korea)  منتقل شد و حجم محیط کشت به 5 میلی­لیتر رسانده شد. فلاسک کشت سلول بعد از درج تاریخ و اطلاعات بر روی آن به داخل گرمخانه 37 درجه (Memmet, Germany) منتقل شد. محیط کشت موجود در فلاسک‌ها هر دو روز یک بار تحت شرایط استریل و در زیر هود تعویض می‌گردید. در این مدت فلاسک‌های کشت داده شده با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Olympus, Japan) برای مشاهده رشد سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سلول‌های سرتولی و همچنین حصول اطمینان از عدم وجود آلودگی در فلاسک‌ها بررسی می‌شد. فرآیند کشت سلولی در حدود 5 تا 6 روز طول کشید. تأیید ماهیت سلول‌های سرتولی و اسپرماتوگونی به کمک روش ایمنوسیتوشیمی انجام گردید (Koruji et al., 2007; Dann et al., 2008).

روش ایمنوسیتوشیمی برای شناسایی سلول­های اسپرماتوگونی و سرتولی

رنگ‌آمیزی ایمنوسیتوشیمی سلول‌های سرتولی با آنتی‌بادی ضد ویمنتین کونژوگه با FITC (فلوئورسین ایزوتیوسیانات) که البته هسته‌ سلول‌ها با 7-AAD (Aminoactinomycin D-7) رنگ شده­است، صورت گرفته است. رنگ FITC نوعی رنگ فلئورسنت برای مشاهده سلول­ها در زیر میکروسکوپ فلوئورسنت است.

رنگ‌آمیزی ایمونوسیتوشیمی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی با آنتی Oct-4 (آنتی­بادی ضد پروتئین Oct-4 کونژوگه با FITC (فلوئورسین ایزوتیوسیانات) انجام شده است. پروتئین Oct-4 یک مارکر جهت شناسایی سلول بنیادی تمایزنیافته است. به طور خلاصه روش ایمنوسیتوشیمی به عنوان روشی برای شناسایی سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی جداشده با تشخیص بیان دو نشانگرOCT-4  و Vimentin (به­ترتیب) استفاده شد (Koruji et al., 2007).

- کشت قارچ کاندیدا آلبیکنس: در مطالعه حاضر از سویه استاندارد کاندیدا آلبیکنس (ATCC:10321) تهیه‌شده از مرکز پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران استفاده شد که جهت استفاده لازم، در محیط کشت سابارو دکستروز آگار (SDA) (Conda Lab, Spain) کشت داده شد.

 - افزودن کاندیدا آلبیکنس به سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی: بعد از آماده نمودن 5 گروه متفاوت از جمعیت قارچ کاندیدا آلبیکنس که در ادامه توصیف شده، هر کدام از گروه‌های مذکور، به داخل یکی از خانه‌های پلیت کشت سلول 6 خانه‌ای که قبلا در آن سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی به همراه سلول‌های سرتولی به تعداد 106 سلول در هر چاهک،  کشت داده شده بود، افزوده شد و به یکی از خانه­ها نیز به عنوان گروه شاهد، قارچ افزوده نشد: گروه 1­) شاهد، گروه 2) شامل103 عدد سلول قارچی، گروه 3) شامل 104 سلول قارچی، گروه 4) شامل 105سلول قارچی، گروه 5) شامل 106 سلول قارچی و گروه 6) شامل 107 سلول قارچی. همچنین هر کدام از خانه‌ها حاوی 2 میلی­لیتر محیط کشت سلولی DMEM-F12 بود تا شرایط مساوی برای هر کدام از گروه‌ها مهیا شود. پلیت 6 خانه به داخل گرمخانه (37-35 درجه سلسیوس) منتقل شد تا در محیط مناسب از نظر شرایط دمایی و میزان  CO2 5 درصد در کنار هم رشد نمایند. هر 12 ساعت رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس به همراه سلول‌های بنیادی توسط میکروسکوپ معکوس بررسی گردید. بعد از 48 ساعت بدلیل رشد بیش از اندازه‌ء قارچ‌ها پروسه‌ء هم‌کشتی متوقف شد. متوقف نمودن رشد سلول‌ها با تخلیه محیط کشت رویی سلول‌ها و افزودن متانول (Merck, USA) به مدت 3­ دقیقه در چاهک‌های پلیت انجام شد. افزودن متانول موجب فیکس شدن سلول‌ها در کف چاهک‌های پلیت 6 خانه شد. جهت مطالعات پاتولوژیک هم از روش رنگ­آمیزی سلول­ها در چاهک­ها با هماتوکسیلین-ائوزین (Bahar Afshan, Iran)استفاده شد. همچنین تکرار دیگری نیز جهت اندازه‌گیری آنزیم‌ها انجام شد، بدین ترتیب که همه‌ء سلول‌های رشد کرده توسط پاروی پلاستیکی  استریل کنده شدند و همراه محیط رویی برداشته شده و سانتریفیوژ شد. سانتریفیوژ با سرعت 1000 دور به­مدت 5/1 دقیقه انجام شد و بعد از تخلیه مایع رویی به اندازه 1 میلی‌لیتر PBS (Phosphate Buffered Saline) بر روی سلول‌ها ریخته شده و توسط سمپلر (Eppendorf, Germany) با سلول‌ها مخلوط گردید. سپس در دمای منفی80 درجه سلسیوس منجمد شده و سپس در بن‌ماری یخ‌زدایی شد تا شکست سلولی انجام شود. در نهایت این نمونه‌ها جهت اندازه‌گیری آنزیم‌ها به فریزر منفی80 درجه سلسیوس جهت نگه­داری منتقل گردید.

- اندازه‌گیری شاخص‌های آسیب سلولی: اندازه‌گیری لاکتات دهیدروژناز با استفاده از کیت (Delta Darman Part, Iran)  براساس اصول و روش ارائه شده توسط شرکت سازنده انجام­گردید. جهت ارزیابی استرس اکسیداتیو هم از اندازه‌گیری میزان مالون­دی‌آلدئید (MDA) تولید شده در فرآیند لیپید­پراکسیداسیون استفاده گردید (Koracevic et al., 2001).

- تحلیل آماری داده­ها: نتایج بدست آمده از اندازه‌گیری شاخص‌های بیوشیمیایی مورد آنالیز قرار گرفت. آنالیز آماری توسط نرم افزار22- SPSS انجام شد. برای بررسی اختلاف آماری در گروه­ها از آزمون­های آماری آنالیز واریانس یک‌طرفه­ (ANOVA) و توکی (Tukey) به عنوان تست مکمل استفاده شد. در تمامی موارد هم فاصله اطمینان 95 درصد در نظر گرفته شد.

 

یافته­ها

اشکال‌ 1 و 2 نتایج مربوط به رنگ‌آمیزی اختصاصی سلول‌های سرتولی و سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی گوسفند در روش ایمونوسیتوشیمی انجام گرفته را نشان می‌دهد.

 

 

 

شکل 1- نمائی از رنگ‌آمیزی ایمنوسیتوشیمی سلول‌های سرتولی با آنتی‌ویمنتین کونژوگه با FITC که البته هسته‌ سلول‌ها با 7-AAD رنگ شده­است (درشت­نمایی ×400).

 

 

شکل 2- نمائی از رنگ‌آمیزی ایمنوسیتوشیمی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی با آنتی Oct-4 کونژوگه با FITC (درشت­نمایی ×20).

 

مطابق روش كار ارائه­شده، در مطالعه حاضر سلول‌های سرتولی و سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی بعد از هم‌کشتی و رشد سلول‌ها توسط قارچ کاندیدا آلبیکنس با دزهای مختلف افزایشی آلوده شدند که بعد از 24 ساعت رشد رشته‌ای قارچ وکلنی‌های قارچی که چسبیده به سلول‌ها و کف چاهک‌ها بودند و موجب وارد شدن آسیب سلولی به سلول‌های کشت داده شده بودند، مشاهده گردیدند. رشد قارچ­ها در ساعات ابتدایی و تا 12 ساعت اولیه و قبل از رنگ‌آمیزی بیشتر بصورت کلنی­های کوچک و حالت مخمری دیده می‌شد ولی با افزایش زمان و رشد بیشتر قارچی، حالت هایفی نیز ایجاد شده و قارچ­ها بصورت رشد هایفی در بین سلول‌ها نفوذ یافتند. بنظر می‌رسد، افزایش زمان و رشد بیشتر کاندیداها شرایطی را ایجاد می‌کنند که رشد هایفی نیز علاوه بر رشد مخمری در قارچ‌های جنس کاندیدا ایجاد شود.

آسیب وارده به سلول‌ها در مشاهدات میکروسکوپ نوری از لحاظ مورفولوژیک بصورت واکوئله شدن سیتوپلاسم سلول‌ها، چروکیده شدن سلول‌ها و ائوزینوفیل­تر شدن سیتوپلاسم سلول‌ها دیده شد. همچنین در بعضی سلول‌ها تورم سلولی و کنده شدن سلول‌ها از کف پلیت مشاهده شد. در بخش‌هایی که کلونیزاسیون قارچی صورت نگرفته بود میزان آسیب سلولی به تدریج با افزایش دز قارچ در گروه­های دوم تا چهارم بیشتر شده و سلول‌ها چروکیده­تر ‌مي­شدند. در گروه پنجم و ششم بدلیل پوشیده شدن سلول‌های سرتولی و سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی توسط رشد قارچی، از لحاظ مورفولوژیک نمی‌توان اظهار نظر خاصی نمود.

در مورد گروه کنترل، با مطالعه توسط میکروسکوپ نوری، ضایعه خاصی مشاهده نشد (شکل 3). اما در گروه حاوی تعداد 103 سلول قارچی، با رشد قارچ­ها، سلول‌های زیرین از بین رفته بودند. در سایر سلول‌ها واکوئل‌های ریزی مشاهده گردید. همچنین در تعدادی از سلول‌ها تورم سلولی و تغییر رنگ سیتوپلاسم سلول‌ها و ائوزینوفیلیک شدن آن مشاهده شد (اشکال 4، 5 و6).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3-  تصویر سلول‌های اسپرماتوگونی در گروه کنترل که درآن هیچ عارضه خاصی مشاهده نمی­گردد (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

 

شکل 4- از بین رفتن کامل سلول‌های اسپرماتوگونی در محل رشد کلونی‌های قارچی در گروه 103 (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

شکل 5- تشکیل واکوئل‌های ریز در سلول‌های اسپرماتوگونی در گروه 103 (فلش) (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6 - سیتوپلاسم بعضی از سلول‌های اسپرماتوگونی ائوزینوفیل‌تر از حالت عادی شده است. (فلش‌ها) گروه 103 (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

همچنين با اضافه شدن قارچ­­ها در گروه حاوی تعداد 104 سلول قارچی، واکوئله­شدن در سلول‌ها بیشتر شد، گرچه اندازه واکوئل‌ها تغییر نکرد. سلول‌ها متورم شده و سیتوپلاسم ائوزینوفیلیک گردید. رشد کلنی‌های قارچی هم بیشتر از گروه قبلی بود. (اشكال 7 و8).

 

 

 

 

شکل 7- در گروه حاوی تعداد 104 سلول قارچی  بعضی از سلول­های اسپرماتوگونی حالت واکوئله شدن را نشان می­دهند (فلش) (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

 

 

 

شکل 8- در گروه حاوی تعداد 104 سلول قارچی بعضی از سلول‌های اسپرماتوگونی سیتوپلاسمی ائوزینوفیل­تر از حالت عادی را نشان می‌دهند و متورم نیز هستند (فلش) (رنگ‌آمیزی - ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

اما در گروه حاوی تعداد 105 سلول قارچی، تورم سلول‎ها دیگر مشاهده نشد و به­جای آن سلول‌ها حالت چروکیده پیدا کردند. سیتوپلاسم آن­ها هم واکوئله و ائوزینوفیلیک­تر از حالت عادی بود. 

 

 

 

شکل 9 – در گروه حاوی تعداد 105 سلول قارچی اکثر سلول‌های اسپرماتوگونی چروکیده شده است. همچنين سلول‌ها واکوئله و سیتوپلاسم آنها ائوزینوفیل‌تر از حالت عادی است (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

در مورد گروه­هاي حاوی تعداد 106 و 107 سلول قارچی، به­خاطر رشد فراوان قارچ­ها و پوشیده شدن سطح سلول‌ها توسط آن­ها، نمی‌توان راجع به وضعيت سلول‌ها اظهار نظر کرد (شکل ‌10).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 10- در گروه حاوی تعداد 106 سلول قارچی رشد قارچ­ها به حدی رسیده که همه سلول‌ها به وسیله آن­ها پوشیده شده‌اند (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین -ائوزین، درشت­نمایی ×200).

 

 

- نتایج اندازه‌گیری آنزیم‌ها: نتایج حاصله از آزمون‌های اندازه‌گیری آنزیم لاکتات دهیدروژناز و حمله اکسیدانی و دفاع آنتی‌اکسیدانی انجام شده در تحقيق حاضر در نمودارهای 1 و 2 ارائه شده­است. ملاحظه مي­گردد كه در مورد فاكتور‌هاي مذكور با اضافه شدن میزان قارچ در گروه تحقيق، مقادير آن‌ها هم بالا می‌رود. که نشان‌دهنده افزایش آسیب سلولی است كه این تفاوت‌ها ما­بین گروه‌های مختلف و گروه کنترل معنی‌دار بود (05/0p<). البته دو گروه 106 و107 اختلاف آماری معني­داري نداشتند که می­تواند به علت این باشد که وجود تعداد فراوان قارچ در گروه 106 حداکثر آسیب را به سلول­ها رسانده و بالا بردن تعداد قارچ دیگر آسیب را از آن بالاتر نبرده­است. 

 

 

 

نمودار 1- مقايسه­ میزان آنزيم لاکتات دهیدروژناز در گروه‌های مختلف تحقيق: گروه 1) شاهد، گروه 2) حاوي103 عدد سلول قارچی،  گروه 3) حاوي 104 سلول قارچی، گروه 4) حاوي 105سلول قارچی، گروه 5) حاوي 106  سلول قارچی، گروه 6) حاوي 107 سلول قارچی.

 

 

 

نمودار 2 - مقايسه میزان آنزيم مالون­دی‌آلدئید  در گروه‌های مختلف تحقيق: گروه 1) شاهد، گروه 2) حاوي103 عدد سلول قارچی،  گروه 3) حاوي 104 سلول قارچی، گروه 4) حاوي 105سلول قارچی، گروه 5) حاوي 106  سلول قارچی، گروه 6) حاوي 107 سلول قارچی.

 

بحث و نتیجه­گیری

جهت شناسایی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی از آزمون ایمینوسیتوشیمی برای تایید ماهیت سلول‌ها استفاده شد که این سلول‌ها از نظر بیان نشانگر اختصاصی فاکتور رونویسی متصل شونده به OCT-4  (Octamer-binding transcription factor 4) مثبت بودند (شکل 2) و از این نظر با سایر مطالعات مشابه مطابقت داشت (Luo et al., 2006; Dann et al., 2008).

 برای شناسایی سلول‌های سرتولی نیز از آزمون ایمینوسیتوشیمی استفاده شد که در طي آن یکی از پروتئین‌های اسکلت سلولی به نام وایمنتین مورد ارزیابی واقع گردید که نتایج حاصله از این آزمون، وجود این پروتئین را در سلول‌های رشد یافته نشان داد (شکل 1) و لذا این يافته هم با نتایج سایر مطالعات مطابقت داشت (Anway et al., 2003; Koruji et al., 2007). 

انتخاب عامل پاتوژن بدلیل ایجاد آسیب در سلول‌های رده اسپرماتوژن و ایجاد ارکیت توسط قارچ کاندیدا آلبیکنس در حیوانات درگیر بود (Pimental et al., 1996; Perumal et al., 2013) از مطالعات مشابهی که در این زمینه وجود دارد می توان به تاثیر قارچ کاندیدا آلبیکنس بر روی ماکروفاژهای کشت داده شده در آزمایشگاه اشاره کرد که قارچ کاندید آلبیکنس موجب آسیب سلولی و تاخیر در بالغ شدن فاگوزوم ماکروفاژها شده است و رشد قارچ کاندیدا آلبیکنس در محیط کشت بصورت هایفی و رشته ای بوده ( شکل‌های 9 و10) که این بخش از مطالعه مذکور مشابه نتایج مطالعه حاضر بود (Bain et al., 2014). در هم‌کشتی کاندیدا آلبیکنس به همراه لاین سلولی RAW264.7  با منشأ ماکروفاژهای موشی دیده شده که قارچ کاندیدا آلبیکنس در نهایت موجب مرگ سلولی ماکروفاژها می‌شود (Marcil et al., 2002).

نشان داده شده است زمانی که  قارچ کاندیدا آلبیکنز دارای رشد هایفی باشد از حدت بیشتری برخوردار است قابل ذکر است رشد هایفی کاندیدا آلبیکنس در صورت نامساعد بودن شرایط محیطی برای رشد قارچ انجام نخواهد شد (Chen et al., 2020,). چسبندگی یکی از عوامل حدت کاندیدا آلبیکنس بوده که نقش مهمی در آسیب زایی کاندیدا دارد (Goswami et al., 2000) در مطالعه‌ای میزان چسبندگی کاندیدا آلبیکنس نسبت به دیگر گونه های کاندیدا همچون کاندیدا دابلیننسیس بر روی رده های سلولی Buccal epithelial cell و Vaginal epithelial cell بیشتر بوده‌است. (Vidotto et al., 2003)، همچنین سرعت چسبیدن قارچ به رده های سلولی مختلف هم متفاوت است (Sohn et al., 2006; Negri et al., 2011; Silva et al., 2011). در هم‌کشتی کاندیدا آلبیکنس و رده‌های سلولی HELA و VERO میزان چسبندگی و سرعت رشد کاندیدا آلبیکنس در حضور گلوکز بیشتر از کربوهیدرات‌های دیگر ارزیابی شد (Pires et al., 2001) با توجه به استفاده از محیط کشت سرشار از گلوکز DMEMF-12 در این مطالعه، این مورد می‌تواند دلیل مناسبی برای رشد سریع قارچی و چسبندگی آن به سطوح سلولی و کف در مطالعه حاضر باشد.

در مطالعات با تاثیر دو آنزیم پروتئولیتیک کلاژناز و الاستاز بر روی لاین‌های سلولی  مختلف اثرات سیتوتوکسیک این آنزیم‌ها بر روی سلول‌ها ، با کاهش میزان بقای سلولی مشاهده می‌گردد .فعالیت آنزیمی دو آنزیم پروتئولیتیک کلاژناز و الاستاز در کاندیدا آلبیکنس بیشتر از سایر کندیداها است (Sayed et al., 2012).

علاوه بر بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها، پارامترهای LDH و MDA نیز جهت تایید آسیب وارده اندازه‌گیری شدند که نشان­دهنده افزایش آسیب سلولی وارده به سلول‌ها با افزایش دز قارچی در گروه­ها می‌باشد. از آنجایی‌که ترشح آنزیم لاکتات دهیدروژناز به عنوان یک مارکر مناسب برای تشخیص میزان آسیب و مرگ سلولی می‌باشد لذا اندازه‌گیری این شاخص بیوشیمیایی، برای تایید آسیب در انواع سلول‌ها در محیط آزمایشگاهی استفاده گسترده‌ای دارد (Kono and Rock, 2008). نتایج بیوشیمیایی حاصله از اندازه‌گیری LDH در مطالعه حاضر نشان داد که با افزایش تعداد قارچ‌ها در گروه‌های موجود، میزان LDH  نیز دارای روند افزایشی می‌باشد  این مورد احتمالاً به دلیل نشت آنزیمی اندامک‌های سلول به سیتوپلاسم است که پس از تخریب غشای سیتوپلاسمی، به این صورت قابل مشاهده و اندازه‌گیری است. در مطالعه نگری و همکاران برای تایید آسیب در سه رده سلولی TCC-SUP، HELA و Caco-2 توسط قارچ کاندیدا، اندازه‌گیری شاخص لاکتات دهیدروژناز انجام شده و آزاد شدن این آنزیم به محیط کشت تایید شد (Negri et al., 2011). 

همچنین در مطالعات انجام گرفته بر روی رده سلولی سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی موشی C18-4 (Braydich-Stolle et al., 2005; Moghimi et al., 2005) مشاهده شده است که میزان LDH آزاد شده با افزایش آسیب سلولی و کاهش زنده مانی سلول‌ها، معمولا روند افزایشی داشته است. نتایج به­دست آمده در این مطالعه با اطلاعات و نتایج موجود در مطالعات قبلی همخوانی دارد (نمودار1). شاخص دیگری که در این مطالعه اندازه‌گیری شد، مالون­دی‌آلدئید  بود عوامل پاتوژن با پراکسیداسیون چربی در سلول‌ها، موجب افزایش استرس اکسیداتیو و بدنبال آن افزایش مالون­دی‌آلدئید  می‌گردند. در مطالعه‌ای با افزودن ماده تیتانیوم دی‌اکسید به سلول‌های استئوبلاست انسانی با افزایش میزان ماده آسیب رسان، سطح  مالون دی آلدهید نیز افزایش یافته است (Niska et al., 2015). با تاثیر انواع مختلف مواد آسیب رسان بر روی رده‌های سلولی مختلف همچون تاثیر Grafen Oxid بر روی رده سلولی RPMI8226 (Wang et al., 2014)، تاثیر اتانول بر رده سلولی HEPG2 (Ogany et al., 2008)، میزان مالون‌دی‌آلدئید  افزایش یافته است. در مطالعه‌ای با تاثیر مورفین بر روی رده سلولی pc12 (Shang et al., 2007) مشاهده شده است که علاوه بر مالون­دی‌آلدئید، شاخص LDH نیز با افزایش میزان ماده سیتوتوکسیک افزایش می یابد. همچنین در مطالعاتی با اضافه کردن افزودنی‌های مفید مثل عصاره‌ Bee hony بر رده سلولی HEPG2 (Hassan et al., 2013) و عصاره چای سبز بر سلول‌های Jurkat T انسانی (Erba et al., 1999 )، میزان مالون­دی‌آلدئید  در گروه‌های تیمار شده کاهش یافته بود. هر چند در برخی مطالعات اثرات سیتوتوکسیک مواد آسیب رسان بر روی سلول‌ها، مانند اثرات سیتوتوکسیک روغن‌های ضروریChenopodium ambrosioides  بر رده سلولی MCF-7 (Liang et al., 2013) تغییرات معنی­داری در میزان مالون­دی‌آلدئید  ایجاد نکرده بود. نتایج مطالعات موجود با نتایج به­دست آمده در این پژوهش متناسب می‌باشد.(نمودار 2).

به­طور کلی طبق نتایج به­دست آمده می‌توان نتیجه گرفت که قارچ کاندیدا آلبیکنس با رشد سریع خود در کنار سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سرتولی و در محیط کشت، موجب ایجاد آسیب سلولی در سلول‌های مذکور شده که در نهایت می‌تواند به مرگ سلولی سلول‌های اسپرماتوگونی و سرتولی نیز ختم شود. این آسیب سلولی می‌تواند از طریق ایجاد شرایط رقابتی توسط کاندیدا آلبیکنس در محیط کشت و همچنین اثرات پاتولوژیک حاصل از متابولیت‌های ترشحی از قارچ کاندیدا آلبیکنس، حاصل شود. البته پيشنهاد مي‌شود كه اثر سایر قارچ‌ها هم در کشت این سلول‌ها بررسی شود و از تکنیک‌های بیشتری که امکان آن برای محققان وجود دارد برای بررسی اثرات این قارچ و سایر قارچ‌ها بر روی کشت سلول‌های بنیادی اسپرماتوگونی و سلول‌های سرتولی و همچنین در مورد سایر رده­های سلولی استفاده شود.

 

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز جهت تامین هزینه این تحقیق قدردانی می‌نمایند.

 

تعارض منافع

نویسندگان اعلام می­دارند که هیچ­گونه تضاد منافعی ندارند.

 

 

 

منابع

— Anway, M.D., Folmer, J., Wright, W.W. and Zirkin, B.R. (2003). Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of sertoli cell function. Biology of Reproduction, 68(3): 996-1002.

— Bain, J.M., Louw, J., Lewis, L.E., Okai, B., Walls, C.A., Ballou, E.R., et al. (2014). Candidia albicans hypha formation and mannan masking of β-glucan inhibit macrophage phagosome maturation. Microbiology, 5(6): 1874-1881.

— Braydich-Stolle, L., Hussain, S., Schlager, J.J. and Hofmann, M.C. (2005). In vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells. Toxicological Sciences, 88(2): 412-419.

—. Chen, H.; Zhou, X.; Ren, B.; Cheng, L. (2020). The regulation of hyphae growth in Candida albicans. Virulence, 11(1): 337-348  

—Daghigh Kia, H., Sadeghi Sadegh Abad, F., Ebrahimi, M. and Samadian, F. (2017). Comparative effect of different concentrations of hydro-ethanolic extract of chamomile on freeze-thawn semen quality of rams. Veterinary Clinical Pathology, 11(41):13-24. [In Persian]

— Dann, C.T., Alvarado, A.L., Molyneux, L.A., Denard, B.S., Garbers, D.L. and Porteus, M.H. (2008). Spermatogonial stem cell self‐renewal requires OCT4, a Factor downregulated during retinoic acid‐induced differentiation. Stem Cells, 26(11): 2928-2937.

— Erba, D., Riso, P., Colombo, A. and Testolin, G. (1999). Supplementation of jurkat T cells with green tea extract decreases oxidative damage due to iron treatment. The Journal of Nutrition, 129(12): 2130-2134.

— Goswami, R., Dadhwal, V., Tejaswi, S., Datta, K., Paul, A., Haricharan, R.N., et al. (2000). Species-specific prevalence of vaginal candidiasis among patients with diabetes mellitus and its relation to their glycaemic status. Journal of Infection, 41(2): 162-166.

— Griswold, M.(2018). 50 years of Spermatogenesis: Sertoli cells and their Interactions with Germ Cells Biology of Reproduction, 99(1): 87-100.

— Hassan, M.I., Zahran, F.M., Shehata, H.H. and Abdelhamid, M.S. (2013). The inhibitory, antioxidant and anti-inflammatory effect of bee hony on hepatocellular carcinoma cell line hepG2. International Journal of Biological and Pharmaceutical Research, 4(9): 618-626.

— Hofmann, M.C. (2008). Gdnf signaling pathways within the mammalian spermatogonial stem cell niche. Molecular and Cellular Endocrinology, 288(1): 95-103.

— Hull, C.M., Raisner, R.M. and Johnson, A.D. (2000). Evidence for mating of the" asexual" yeast candida albicans in a mammalian host. Science, 289(5477): 307-310.

—Jia-liang, W., Dan-wei, M., Ya-nan., W., Hong, Z., Bing, H., Qun, L., et al. (2013). Cytotoxicity of Essential Oil of Chenopodium ambrosioides L against Human Breast Cancer MCF-7 Cells. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 12(6): 929-933

— Kono, H. and Rock, K.L. (2008). How dying cells alert the immune system to danger. Nature Reviews Immunology, 8: 279-289

— Koracevic, D., Koracevic, G., Djordjevic, V., Andrejevic, S. and Cosic, V. (2001). Method for the measurement of antioxidant activity in human fluids. Journal of Clinical Pathology, 54(5): 356-361.

 

— Koruji, M., Movahedin, M., Mowla, S.J. and Gourabi, H. (2007). Colony formation ability of frozen thawed spermatogonial stem cell from adult mouse. International Journal of Reproductive Biomedicine, 5(3): 109-115.

— Koruji, M., Movahedin, M., Mowla, S.J., Gourabi, H. and Jabari Arfaei, A. (2007). The effects of inducer factors on adult mouse spermatogonial cells colony formation in vitro. Cell Journal, 2(9):141-150
— Luo, J., Megee, S., Rathi, R. and Dobrinski, I. (2006). Protein gene product 9.5 is a spermatogonia‐specific marker in the pig testis: Application to enrichment and culture of porcine spermatogonia. Molecular Reproduction and Development, 73(12): 1531-1540.

— Marcil, A., Harcus, D., Thomas, D.Y. and Whiteway, M. (2002). Candida albicans killing by RAW 264.7 mouse macrophage cells: effects of candida genotype, infection ratios, and gamma interferon treatment. Infection and Immunity, 70(11): 6319-6329.

— Mescher, A. (2018). Junqueira’s basic histology. Text and Atlas.15th ed., New York .McGraw Hill Education, pp: 480.

— Moghimi, S.M., Symonds, P., Murray, J.C., Hunter, A.C., Debska, G. and Szewczyk, A. (2005). A two-stage poly (ethylenimine)-mediated cytotoxicity: implications for gene transfer/therapy. Molecular Therapy, 11(6): 990-995.

— Negri, M., Botelho, C., Silva, S., Lopes, L.M.R.H., Henriques, M., Azeredo, J. and Oliveira, R. (2011). An in vitro evaluation of candida tropicalis infectivity using human cell monolayers. Journal of Medical Microbiology, 60(9): 1270-1275.

— Nematollahi, A., Habashizadeh, M., Raafat, S.A. and Moghaddam, Gh. (2020). Retrospective survey of the abundance of nematodes in the digestive tract of sheep in East Azerbaijan province and calculation of correlation between egg per gram (EPG) and humidity in the mentioned regions. Veterinary Clinical Pathology, 13(52): 328-340. [In Persian]

— Niska, K., Pyszka, K., Tukaj, C., Wozniak, M., Radomski, M.W. and Inkielewicz-Stepniak, I. (2015). Titanium dioxide nanoparticles enhance production of superoxide anion and alter the antioxidant system in human osteoblast cells. International Journal Nanomedicine, 10: 1095-1107.

— Ogony, J., Matthews, R., Anni, H., Shannon, K. and Ercal, N. (2008). The mechanism of elevated toxicity in HepG2 cells due to combined exposure to ethanol and ionizing radiation. Journal of Applied  

— Pappas, P.G., Lionakis, M.S.,Arendrup,M. C.,Ostrosky-Zeichner,L. and Kullberg, B. J. (2018). Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers, 4: Article number: 18026. 

— Perumal, P., Chamuah, J.K., Srivastava, N., Vupru, K. and Srivastava, S.K. (2013). Infectious causes of infertility in Buffalo bull. International Journal of Bio-Resource and Stress Management, 4(1): 84-90.

— Pimentel, M., Nicolle, L.E. and Qureshi, S. (1996). Candida albicans epididymo-orchitis and fungemia in a patient with chronic myelogenous leukemia. Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology, 7(5): 332-334.

— Pires, M.D.F.C., Corrêa, B., Gambale, W. and Paula, C.R. (2001). Experimental model of Candida albicans (serotypes A and B) adherence in vitro. Brazilian Journal of Microbiology, 32(3): 163-169.

— Rodriguez-Sosa, J.R., Dobson, H. and Hahnel, A. (2006). Isolation and transplantation of spermatogonia in sheep. Theriogenology, 66(9): 2091-2103.

— Sayed, M.A., Rahman, T.M.A., Assem, M.M. and Sayed, M.R.E. (2012). Cytotoxicity of collagenases and elastases purified from candida species on some carcinoma cell lines. Jordan Journal of Biological Sciences, 5(4): 321-330.

— Shang, Y.Z., Qin, B.W., Cheng, J.J. and Miao, H. (2008). Effect of scutellaria falvonoids on KCN-induced damages in rat pheochromocytoma PC12 cells. Indian Journal of Medical Research, 127(6): 610-615.

—Shekari, A., Safavi, SE. and Mousavi, GH. (2020) Effect of Coenzyme Q10 on testicular tissue after correction of experimental cryptorchidism in rat. Veterinary Clinical Pathology, 14(54):168-184. [In Persian]

— Silva, S., Hooper, S.J., Henriques, M., Oliveira, R., Azeredo, J. and Williams, D.W. (2011). The role of secreted aspartyl proteinases in candida tropicalis invasion and damage of oral mucosa. Clinical Microbiology and Infection, 17(2): 264-272.

— Sohn, K., Senyürek, I., Fertey, J., Königsdorfer, A., Joffroy, C., Hauser, N., et al. (2006). An in vitro assay to study the transcriptional response during adherence of Candida albicans to different human epithelia. Fems Yeast Research, 6(7): 1085-1093.

— Touray, M. and Touray, A. (2021). Urology and Nephrology. In: Clinical Work and General Management of a Standard Minimal-Resource Facility. Sustainable Development Goals Series. Springer, pp: 107-121

— Van Pelt, A.M., Morena, A.R., van Dissel-Emiliani, F.M., Boitani, C., Gaemers, I.C., De Rooij, D.G., et al. (1996). Isolation of the synchronized A spermatogonia from adult vitamin A-deficient rat testes. Biology of Reproduction, 55(2): 439-444.

— Vidotto, V., Mantoan, B., Pugliese, A., Pontón, J., Quindós, G., Aoki, S., et al. (2003). Adherence of candida albicans and Candida dubliniensis, to buccal and vaginal cells. Revista Iberoamericana De Micología, 20(2): 52-54.

— Wang, Y., Wu, S., Zhao, X., Su, Z., Du, L. and Sui, A. (2014). In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on human RPMI 8226 cells. Biomedical Materials and Engineering, 24(6): 2007-2013.

 

 

 

 

 

143