ساخت شاتل وکتور بیانی برای باکتری های اشریشیا کلی و باسیلوس سابتیلیس
محورهای موضوعی : باکتری شناسی
محمدرضا رشیدی
1
,
مجید مقبلی
2
1 - کارشناس ارشد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم زیستی، گروه میکروبیولوژی
2 - استادیار، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دانشکده علوم زیستی، گروه میکروبیولوژی
کلید واژه: کلون سازی, باسیلوس سابتیلیس, شاتل وکتور, اشریشیاکلی,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: باسیلوس سابتیلیس به دلیل ویژگی های غیربیماری زا بودن و توانایی ترشح مقادیر بالای پروتئین، به عنوان یک میزبان خوب برای کلون سازی ژن و بیان پروتئین در نظر گرفته می شود. اما کارایی انتقال DNA پلاسمیدی اتصال یافته به درون سلول های باسیلوس سابتیلیس مستعد در مقایسه با سلول های اشریشیا کلی مستعد شده با کلرید کلسیم پایین می باشد. بنابراین بهتر است مراحل اولیه کلون سازی با استفاده از یک شاتل وکتور در اشریشیا کلی انجام شود و سپس باسیلوس سابتیلیس با مقدار زیادی از وکتور هیبرید ترانسفورم گردد. این مطالعه با هدف ساخت یک شاتل وکتور با استفاده از پلاسمیدهای pWB980 و pET-16b به منظور کلون سازی و بیان ژن در باسیلوس سابتیلیس انجام شد. مواد و روش ها: پلاسمید pWB980 به روش لیز قلیایی از میزبان خود جداسازی شد. به منظور دست یابی به قطعه مورد نظر با استفاده از آنزیم های برش دهندهEcoRI و SnaBI هضم دوگانه انجام شد. سپس یک توالی نوکلئوتیدی ویژه از پلاسمید pET-16b نیز به وسیله ی PCR تکثیر شد و مورد هضم دوگانه قرار گرفت. در مرحله بعد با انجام واکنش اتصال بین این دو قطعه پلاسمیدهای ایجاد شده به اشریشیا کلی TOP10 منتقل شدند. در نهایت سلول های دارای شاتل وکتور غربالگری و پس از استخراج پلاسمید با یک روش مناسب به باسیلوس سابتیلیس WB600 منتقل گردید. یافته ها: شاتل وکتور حاصله به سادگی در هر دو میزبان همانندسازی کرد. این پلاسمید در باسیلوس سابتیلیس ثبات مناسبی از خود نشان داد که در حفظ آن در میزبانش بسیار سودمند است. نتیجه گیری: شاتل وکتورpMR12 به دلیل داشتن 8 جایگاه منحصر به فرد در پلی لینکر و با اندازه مناسب kb 4/5 می تواند یک سیستم کارآمد به منظور کلون سازی آسان ژن محسوب گردد. این اولین گزارش از ساخت یک شاتل وکتور بیانی برای اشریشیا کلی و باسیلوس سابتیلیس در ایران می باشد.
Background and Objectives: Bacillus subtilis is considered as a suitable host for gene cloning and protein expression due to non-pathogenicity and ability to secrete high amounts of proteins. However, transformation efficiency of ligated plasmid DNA into competent cells of B. subtilis is low, as compared to that into CaCl2 shocked cells of Escherichia coli. Therefore, cloning the target in E. coli using a shuttle vector before transfer into B. subtilis by a high amount of hybrid vector is more efficient. The aim of this study is construction a shuttle vector using pW980 and pET-16b plasmids for gene cloning and expression in B. subtilis. Materials and Methods: pWB980 plasmid was isolated from its host using alkaline lysis method. It was undergone a double digestion to obtain the segment of interest using EcoRI and SnaBI enzymes. Then a special fragment of pET-16b plasmid was also amplified by PCR and was double digested. Ligation reaction was performed between these two segments and then it was transferred to E. coli TOP10. Following screening the cells containing shuttle vector, plasmid was extracted and was transferred to B. subtilis WB600 by an effective method. Results: The resulting shuttle vector replicated easily in both hosts. It showed good stability in B. subtilis, which is helpful for its maintenance in its host. Conclusion: In this study, the resulting shuttle vector - pMR12 - had 8 unique cloning site in its polylinker and a suitable size (5.4 kb), which make it possible to simply gene cloning into it. This is the first report of construction of an expression shuttle vector for Escherichia coli and Bacillus subtilis in Iran.