توسعه جدایه پربازده ساکارومایسس سرویزیه از طریق جهشزایی تصادفی، مهندسی تکاملی و بهینهسازی مبتنی بر روش سطح پاسخ
محورهای موضوعی :
1 -
2 - دانشگاه مراغه
کلید واژه:
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: مخمر ساکارومایسس سرویزیه کاربردهای گسترده¬ای در تولید خمیرمایه¬ نانوایی و تولید اتانول زیستی دارد و از ویژگی¬های شاخص و مهم این سویه که کاربرد آن در صنعت تولید اتانول را تحت تاثیر قرار می¬دهد، می¬توان به تحمل در برابر غلظت های بالاتر اتانول اشاره کرد. افزایش تحمل در برابر اتانول در سویه¬های صنعتی منجر به تخمیر سریع¬تر، کامل¬تر و افزایش راندمان تولید اتانول در صنعت می¬شود. مواد و روش¬ها: در تحقیق حاضر به منظور بهبود فنوتیپ تحمل اتانول، جدایه¬ی برتر با تحمل بیشترین غلظت اتانول، تحت تیمار با ماده شیمیایی اتیدیوم برماید و اعمال گزینش بر مبنای تکامل تطبیقی و مهندسی تکاملی قرار داده شدند. جدایه¬های جهش¬یافته با استفاده از محیط حاوی غلظت¬های رو به افزایش اتانول از غلظت 8% تا غلظت 12% اتانول در طی 144 روز خو داده شده و غربال شدند. غلظت اتانول تولید شده توسط جدایه¬ها بر مبنای تقطیرمستقیم و الکل¬سنجی تعیین شد. میزان تولید اتانول توسط این جدایه با متد سطح پاسخ بهینه¬سازی شد. یافته ها: جدایه طی اعمال جهش¬زایی با اتیدیوم بروماید و همچنین اعمال آزمون¬های تکامل تطبیقی و مهندسی تکاملی از غلظت 8% تا غلظت 12% اتانول طی 144 روز به غلظت 12% اتانول خو داده شد. در این مطالعه بهترین جدایه با قابلیت تولید بیشترین میزان اتانول جدایه F1نامگذاری شد. پس از اعمال روش¬های جهش¬زایی و گزینش برمبنای تکامل تطبیقی، توان تولید اتانول توسط این جدایه 0.25±10% شد. این جدایه همچنین با اعمال شرایط بهینه تولید شامل درصد بریکس 26، سولفات آمونیوم 20 گرم در لیتر و میزان تلقیح 109 میزان تولید اتانول توسط این جدایه از 0.25±10% به 0.25± 11% رسید. نتیجه گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که جدایه F1 از نظر میزان تولید اتانول می¬تواند سویه کارآمدی برای استفاده در صنعت تولید اتانول کشور جهت افزایش راندمان تولید باشد. واژه¬های کلیدی: اتانول، ساکارومایسس سروزیه، جهش زایی، مهندسی تکاملی
فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی
توسعه جدایه پربازده ساکارومایسس سرویزیه از طریق جهشزایی تصادفی، مهندسی تکاملی و بهینهسازی مبتنی بر روش سطح پاسخ
زهرا فتحی1*، هادی سعیدی2
1. استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علومپایه، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران
2. دانشجوی کارشناسی ارشد زیست فناوری میکروبی، گروه زیست شناسی، دانشکده علومپایه، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران
چکیده
سابقه و هدف: مخمر ساکارومایسس سرویزیه کاربردهای گستردهای در تولید خمیرمایه نانوایی و تولید اتانول زیستی دارد و از ویژگیهای شاخص و مهم این سویه که کاربرد آن در صنعت تولید اتانول را تحت تاثیر قرار میدهد، میتوان به تحمل در برابر غلظت های بالاتر اتانول اشاره کرد. افزایش تحمل در برابر اتانول در سویههای صنعتی منجر به تخمیر سریعتر، کاملتر و افزایش راندمان تولید اتانول در صنعت میشود.
مواد و روشها: در تحقیق حاضر به منظور بهبود فنوتیپ تحمل اتانول، جدایهی برتر با تحمل بیشترین غلظت اتانول، تحت تیمار با ماده شیمیایی اتیدیوم برماید و اعمال گزینش بر مبنای تکامل تطبیقی و مهندسی تکاملی قرار داده شدند. جدایههای جهشیافته با استفاده از محیط حاوی غلظتهای رو به افزایش اتانول از غلظت 8% تا غلظت 12% اتانول در طی 144 روز خو داده شده و غربال شدند. غلظت اتانول تولید شده توسط جدایهها بر مبنای تقطیرمستقیم و الکلسنجی تعیین شد. میزان تولید اتانول توسط این جدایه با متد سطح پاسخ بهینهسازی شد.
یافته ها: جدایه طی اعمال جهشزایی با اتیدیوم بروماید و همچنین اعمال آزمونهای تکامل تطبیقی و مهندسی تکاملی از غلظت 8% تا غلظت 12% اتانول طی 144 روز به غلظت 12% اتانول خو داده شد. در این مطالعه بهترین جدایه با قابلیت تولید بیشترین میزان اتانول جدایه F1نامگذاری شد. پس از اعمال روشهای جهشزایی و گزینش برمبنای تکامل تطبیقی، توان تولید اتانول توسط این جدایه 0.25±10% شد. این جدایه همچنین با اعمال شرایط بهینه تولید شامل درصد بریکس 26، سولفات آمونیوم 20 گرم در لیتر و میزان تلقیح 109 میزان تولید اتانول توسط این جدایه از 0.25±10% به 0.25± 11% رسید.
نتیجه گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که جدایه F1 از نظر میزان تولید اتانول میتواند سویه کارآمدی برای استفاده در صنعت تولید اتانول کشور جهت افزایش راندمان تولید باشد.
واژههای کلیدی: اتانول، ساکارومایسس سروزیه، جهش زایی، مهندسی تکاملی
Development of a High-Ethanol Producing Saccharomyces cerevisiae isolate through Random Mutagenesis, Evolutionary Engineering, and Response Surface Methodology Optimization
Zahra Fathi1*, Hadi Saeidi2
1. Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Maragheh, Maragheh, Iran
2. Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Maragheh, Maragheh, Iran
Abstract
Introduction: Saccharomyces cerevisiae yeast has wide applications in the production of baker's yeast and the production of bioethanol, and one of the important characteristics of this strain, which affects its use in the ethanol production industry, is tolerance to higher concentrations of ethanol. Increasing the tolerance against ethanol in industrial strains leads to faster, more complete fermentation and increasing the efficiency of ethanol production in the industry.
Materials and Methods: In the current research, in order to improve the phenotype of ethanol tolerance, the superior isolate with the highest concentration of ethanol was treated with the chemical substance ethidium bromide and selection was applied based on adaptive evolution and evolutionary engineering. Mutant isolates were cultured using medium containing increasing concentrations of ethanol from 8% to 10% ethanol concentration during 144 days and screened. The amount of ethanol production by this isolate was optimized by the response surface method.
Results: The isolate was acclimated to 10% ethanol concentration during 144 days from 8% concentration to 10% concentration of ethanol during mutagenesis with ethidium bromide as well as adaptive evolution and evolutionary engineering tests. In this study, the best isolate with the ability to produce the highest amount of ethanol was named Saccharomyces cerevisiae F1. After applying mutagenesis and selection methods based on adaptive evolution, the ethanol production capacity of this isolate was 10±0.25%. Also, by applying the optimal production conditions including the percentage of brix 26, sulfate ammonium 20 g/l, and Inoculation rate 109 the amount of ethanol production by this isolate reached from 10± 0.25% to 11± 0.25%.
Conclusion: The results of this study showed that the strain of Saccharomyces cerevisiae ZF2 can be an efficient strain for use in the country's ethanol production industry in terms of ethanol production to increase production efficiency.
Key words: Bioethanol, Saccharomyces cerevisiae, Mutation, Evolutionary engineering
مقدمه
نویسنده مسئول: استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علومپایه، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران آدرس الکترونیک: z.fathi@maragheh.ac.ir تاریخ دریافت مقاله: 10/01/1404 تاریخ پذیرش: 17/05/1404
|
مواد و روشها
محیطهای کشت و شرایط کشت مخمرها
جداسازی سلولهای مخمر با تحمل به غلظتهای بالاتر اتانول از خمیرمایههای مختلف موجود در کشور به عنوان جمعیت اولیه و سویههای والدی انجام شد. سویهی والد در محیط کشت مایع YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) حاوی 8% اتانول (حجم در حجم) کشت داده شدند و به مدت 48 ساعت در 30 درجه سانتیگراد در شیکر انکوباتور گرماگذاری شد. این محیط حاوی 20 گرم در لیتر گلوکز (مرک)، 20 گرم در لیتر پپتون (مرک) و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر (مرک) میباشد. برای ساخت محیط جامد، 2 درصد وزنی آگار (مرک) به سایر مواد افزوده شد و درنهایت، محیطها در دمای 121 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل شدند. پس از 48 ساعت رشد در محیط کشت مایع YPD حاوی 8% اتانول، 100 میکرولیتر از محیط بر روی محیطهای کشت YPDA (Yeast extract Peptone Dextrose Agar) حاوی 8% اتانول منتقل و کشت داده شدند و به مدت 24 ساعت در در 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. کلنیهای تشکیل شده برای سنجش توانایی تولید اتانول در ابتدا و سپس برای اعمال جهشزایی برداشت شدند.
جهشزایی با اتیدیوم بروماید
به این منظور 108×2 سلول از محیط کشت مایع YPD، تهیه و سپس سوسپانسیون سلولی در بافر فسفات سدیم با غلظت 1/0 مولار و 2/7 pH در یک لوله درپیچدار تهیه شد و به مدت 1 ساعت روی شیکر در 30 درجه سانتیگراد با دور rpm 110 در مجاورت 500 میکروگرم بر لیتر اتیدیوم بروماید (سیگما) جهت ایجاد تنوع ژنتیکی قرار داده شد. سلولها در دور rpm 3000 سانتریفیوژ و تهنشین شدند و واکنش با شست و شوی سوسپانسیون سلولی با بافر فسفات سدیم متوقف شد. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده به محیط کشت مایع YPD حاوی 8% (حجم در حجم) اتانول منتقل و به مدت 48 ساعت در 30 درجه سانتیگراد در شیکر انکوباتور گرماگذاری شد(11و 29).
آزمایشهای تکامل تطبیقی
در این آزمایش از محیط کشت ملاس برای آزمایشهای تکامل تطبیقی و از الکل اتانول بهعنوان تنش فیزیولوژیک در مجاورت غلظت 5 میکروگرم بر لیتر اتیدیوم بروماید (سیگما) به عنوان عامل ایجاد جهش تصادفی و ایجاد تنوع ژنتیکی استفاده شد. محیط کشت ملاس با رقیق کردن ملاس چغندر قند در آب مقطر تا بریکس 18 تهیه شد. پس از تهیه رقت، بهمنظور حذف ناخالصیهای جامد، محیط کشت آماده شده در rpm5000 بهمدت 25 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. پس از افزودن 2 گرم در لیتر سولفات آمونیوم، محیط کشت با افزودن اسید سولفوریک در 5/4pH تنظیم شد. محیط کشت در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد(30). تکامل تطبیقی طی80 مرحله متوالی کشت جدایهها و هر مرحله به مدت زمان 24 ساعت، در میکروپلیتهایی با 96 چاهک انجام خواهد شد. به عبارتی در هر چاهک جمعیتی حاصل از جدایههای جهشیافته در شرایط تنش الکل و غلظت غیرکشنده ماده جهشزای اتیدیوم بروماید قرارگرفت و غلظت اتانول بهتدریج درطول کشتهای متوالی افزایش خواهد یافت. در این تحقیق، مثبت بودن رشد سلولها و افزایش کدورت محیط کشت در هر مرحله، بهعنوان پارامتر انتخابی برای انتخاب و انتقال جدایههای با تحمل بالاتر به مرحله بعد مدنظر قرار میگیرد. جمعیت مخمری با رشد مکرر در حضور اتیدیوم بروماید و غلظت بالای تنش الکل با آن خو گرفته و سازگار شده که در نهایت به تکثیر جمعیت برتر در این شرایط منجر شد و سویههای تکاملیافته به غلظتهای بالاتر اتانول انتقال داده میشوند(31). باتوجه به جداسازی جدایههای اولیه در غلظت اتانول 8%، برای شروع آزمایشهای تکامل تطبیقی از غلظت اولیه 8% (حجم در حجم) تا 12% درصد (حجم در حجم) اتانول، به صورت افزایش %0.5 اتانول در هر افزایش غلظت و 10 پاساژ در هر غلظت جهت اعمال تطابق کارآمدتر، استفاده شد که بهطور مستقیم و بدون استریل کردن به محیط کشت اضافه شد. سپس هر میکروپلیت با فویل غشایی کاملا محکم پوشیده شد تا از تبخیر الکل جلوگیری شود. میکروپلیتها در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm70 گرماگذاری شدند. برای جلوگیری از تبخیر محیط از بیرونیترین ردیفهای میکروپلیت استفاده نشد(11و 16). رشد مثبت با توجه به خوگیری سویهها از طریق اندازهگیری میزان کدورت در OD600 هر 24 ساعت یکبار با استفاده از دستگاه (Bio tech, USA) خوانش میشود و هر دور در صورت افزایش کدورت به مرحله بعدی پاساژ داده خواهد شد. بهمنظور نگهداری و حفظ تمامی ردههای سلول تکامل یافته، قبل از هربار تکرار کشت، 2/0 میلیلیتر از کشت قبلی به 2/0 میلیلیتر از محلول گلیسرول 40 درصد در محیط کشت YPD تازه، اضافه و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیرهسازی صورت گرفت . از تابع رشد نمایی برای محاسبهی نرخ ویژه رشد برای هر نمونه استفاده گردید. مقادیر اولیه OD600 یکسان برای همه چاهکها محاسبه و مورد استفاده قرار گرفت. نرخ ویژه رشد با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد(32).
بررسی توان تولید اتانول توسط جدایههای حاصل از تکامل تطبیقی
جدایه مخمر حاصل از تطابق در محیط غلظت 12% اتانول (حجمی - حجمی)، به محیط کشت YPDA حاوی 12% اتانول منتقل و کشت داده شد و به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. کلنیهای تشکیل شده برای سنجش توان تولید اتانول به 200 میلیلیتر محیط کشت ملاس با بریکس 22 حاوی 2 گرم در لیتر سولفات آمونیوم، محیط کشت با افزودن اسید سولفوریک در 5/4pH منتقل و در دمای 29 درجه سانتیگراد و 200 دور در دقیقه بهمدت 24 ساعت گرماگذاری میشوند. پس از 24 ساعت رشد هوازی و افزایش زیستتوده سلولی، محیط جهت تولید اتانول بیهوازی میشود و در دمای 29 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت گرماگذاری میشوند. بهمنظور ایجاد شرایط بیهوازی جهت تولید اتانول از درپوش نازلدار و دارای قفل هوا جهت جلوگیری از ورود اکسیژن به داخل محفظه استفاده میشود. میزان تولید اتانول توسط جدایه خاصی با بالاترین میزان تولید جدایه های والدی مقایسه خواهد شد. جهت شناسایی فنوتیپی جدایه مخمر، آزمونهای ریخت‌شناسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی به همراه تست‌های بیوشیمیایی افتراقی انجام می شود. کلنی‌ها پس از کشت روی محیط YPD آگار در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت از نظر ویژگیهای ظاهری (رنگ، سطح، حاشیه و برجستگی) و به صورت میکروسکوپی مورد بررسی قرار میگیرند. همچنین توانایی تخمیر قندها شامل گلوکز، مالتوز، ساکاروز، لاکتوز و گالاکتوز بررسی خواهد شد(33و 34).
ارزیابی تولید اتانول با روش تقطیر مستقیم و الکل سنجی نمونه
پس از اتمام فرایند 48 ساعت کشت بیهوازی، کل محتویات محیط کشت درون بالن تقطیر 500 میلیلیتری تخلیه گردید و با استفاده از سیستم تقطیر شیشهای، اتانول تولید شده از محیط ملاس استخراج گردید. در نهایت 100 میلی لیتر از مایع حاصل از تقطیر بهمنظور اندازهگیری درصد اتانول در یک استوانه مدرج ریخته شد و با استفاده از الکلسنج آنالوگ درصد اتانول سنجش شد.
طراحی آزمایش به روش سطح پاسخ
از روشهای متداول طراحی آزمون، روش سطح پاسخ برای ساخت مدلهای تجربی استفاده میشود. روش سطح پاسخ مجموعهای از تکنیکهای آماری و ریاضیات کاربردی میباشد. هدف در این گونه طرحها بهینهسازی پاسخ (متغیر خروجی) است که متاثر از چندین متغیر مستقل ورودی میباشد. روش سطح پاسخ برای بهینهسازی طرح، در کاهش هزینه روشهای گرانقیمت و بینظمیهای عددی مرتبط با آنها کاربرد دارد(35). متغیرهای میزان بریکس، غلظت سولفات آمونیوم و میزان تلقیح سویه به محیط تخمیر، پارامترهای وروردی هستند که در جدول 1 آورده شده اند و در سه سطح وارد معادله سطح پاسخ میشوند. پس از وارد نمودن این اطلاعات، نرمافزار 15 آزمایش مختلف را برای انجام آزمایشها پیشنهاد نمود که همه آنها در جدول 2 آورده شده است. عموما معادله سطح پاسخ، مدل درجه دوم کامل یا فرم کاهیده آن است. مقدار تولید الکل براساس مقادیر واقعی محاسبه شد. از نرمافزار Minitab 19 جهت تجزیه و تحلیل اطلاعات و رسم نمودارهای مربوط به روش سطح پاسخ استفاده شد.
جدول 1. عوامل اصلی (بریکس محیط، سولفات آمونیوم، میزان تلقیح) و سطوح آنها
جدول 2. آرایههای متعامد برای سطوح مختلف عوامل اصلی بریکس محیط، سولفات آمونیوم و میزان تلقیح
بریکس محیط | سولفات آمونیوم | میزان تلقیح | |
1 | 22 | 30 | 107 |
2 | 22 | 10 | 109 |
3 | 22 | 20 | 108 |
4 | 26 | 20 | 107 |
5 | 26 | 10 | 108 |
6 | 22 | 20 | 108 |
7 | 22 | 10 | 107 |
8 | 18 | 10 | 108 |
9 | 18 | 20 | 109 |
10 | 26 | 20 | 109 |
11 | 18 | 20 | 107 |
12 | 18 | 30 | 108 |
13 | 26 | 30 | 108 |
14 | 22 | 30 | 109 |
15 | 22 | 20 | 108 |
نتایج
جداسازی جدایههای با توان تحمل غلظتهای بالاتر اتانول
سلولهای مخمر خمیرمایههای مختلف و نمونه های تخمیری موجود در کشور تحت تنش ثابت 8 درصد (حجم در حجم) اتانول در محیط کشت مایع YPD قرار گرفتند و پس از 48 ساعت رشد در دمای 30 درجه سانتیگراد، کشت بر روی محیط YPDA انجام شد و مجددا سلولهای مخمری تحت تنش 8 درصد اتانول قرار گرفتند. پس از 24 ساعت، کلنی های 3 جدایه حاصل از غربال گری اولیه، تحت عنوان جمعیت اولیه و سویههای والدی جهت اعمال جهشزایی و آزمایشهای تکامل تطبیقی بهره گرفته شد. جدایه های حاصل قابلیت تولید اتانول به طور میانگین 0.5±7 درصد را در ابتدا و قبل از جهش زایی و اعمال مهندسی تکاملی نشان دادند.
نتایج جهشزایی و مهندسی تکاملی
قبل از شروع آزمایشهای تکامل تطبیقی میزان رشد جدایه های ساکارومایسس سرویزیه در محیط کشت YPD دارای 8% اتانول تحت ارزیابی قرار گرفت. این جدایه ها پس از تیمار با ماده شیمیایی اتیدیوم بروماید و اعمال جهشزایی، در معرض غلظتهای مختلفی از اتانول از 8 تا 12 درصد (حجم در حجم) قرار گرفت و نرخ رشد سویه در هر یک از غلظتهای یاد شده تعیین گردید. در این مطالعه، کلنیهای حاصل از جهش با اتیدیوم بروماید و سویهی والدی ابتدا در محیط کشت YPD کشت داده شدند و جمعیت حاصل کشت هر یک از آنها که جمعیت اولیه نامیده شد، طی 144روز در آزمایشهای تکامل تطبیقی در شرایط تنش اتانول قرارگرفتند. در راستای مشابهسازی با شرایط صنعتی در جهت انتخاب جدایههای برتر از لحاظ مقاومت به اتانول، از محیط کشت ملاس در آزمایشهای تکامل تطبیقی استفاده شد. معیارمان برای گزینش جدایه برتر، توان تکثیر و رشد طی کشتهای پیدرپی در شرایط تنش اتانول بود. این جمعیتها در محیط کشت ملاس در دوحالت کلی تنش افزایشی و ثابت در معرض اتانول قرارگرفتند؛ بهصورتیکه از 8 تا 12 درصد در تنش افزایشی با نرخ افزایش 5/0% اتانول و در هر پله تحت تنش ثابت به مدت 20 الی 24 روز و 10 الی 12 پاساژ در هر پله قرار گرفته سازگار شدند. در شکل 1، طرح شماتیک آزمایشهای فوق آورده شده است. این آزمایش به طوری انجام شد که در رویکرد افزایشی فرایند انتقال سویه به یک محیط تازه حاوی غلظت بالاتر اتانول زمانی صورت گرفت که نرخ رشد در غلظت قبلی برای چندین نسل ثابت باقی مانده بود. پس از بیش از 20 دوره کشت که طی 160 روز صورت گرفته بود، در رویکردی تنش افزایشی و ثابت در معرض قرار گرفتن تحت فشار انتخابی اتانول برخی از ردههای سلولی آزمایش شده قادر به رشد در غلظت 12% درصد (حجم در حجم) اتانول بودند؛ درحالی که سویهی والد قادر به رشد در این غلظت نبودند.
شکل 1. طرح شماتیک جهشزایی و تکامل تطبیقی
بهتدریج درطول آزمایشهای تکامل تطبیقی رشد مثبت در برخی از تکرارها مشاهده شد و بدین ترتیب به مرحله بعد تنش افزایشی ارتقاء یافتند. در برخی از تکرارها نیز در مراحلی رشد مثبت مشاهده نگردید و کاهش رشد در این کشت ها نشان دهنده عدم تطابق با فشار تنشی اعمال شده و در نتیجه به حذف آنها از ادامه مراحل تکامل شد. بنابراین پس از چندین دوره کشت متوالی در شرایط تنش انتخابی اتانول، از بین جدایههای تطابق یافته با 12 درصد (حجم در حجم) اتانول، یک جدایه با قابلیت تحمل و رشد در بالاترین غلظت اتانول یعنی 12% ارتقا پیدا کرد، که این جدایه دارای حداکثر رشد مثبت به عنوان جدایههای منتخب پس از آزمایش تکامل تطبیقی انتخاب شد. این جدایه تحت عنوان جدایه F1 نامگذاری گردید. جدایه مورد بررسی پس از کشت روی محیط YPD آگار، کلنی‌هایی با رنگ کرم تا سفید، سطح صاف و حاشیه‌های مشخص ایجاد کرد که با ویژگیهای شناخته‌شده ساکارومایسس سروزیه همخوانی داشت. مشاهده میکروسکوپی سلولها شکل بیضوی و در حال جوانه زنی مشخص را نشان داد که بیانگر ریخت‌شناسی کلاسیک این گونه است(33). در جدول 3 آزمونهای تخمیری نشان داد جدایه قادر به مصرف گلوکز، مالتوز، ساکاروز و گالاکتوز بوده اما لاکتوز را تخمیر نکرد؛ این الگوی متابولیکی کاملاً با مشخصات فنوتیپی ساکارومایسس سروزیه مطابقت دارد(34). نتایج فوق در مجموع تأیید میکند که جدایه مورد نظر از نظر فنوتیپی با ساکارومایسس سروزیه تطابق کامل دارد و برای مطالعات بعدی مهندسی زیستی و بهینهسازی تولید اتانول قابل اعتماد است.
جدول 3. نتایج آزمونهای فنوتیپی و بیوشیمیایی جدایه مخمر ساکارومایسس سروزیه
نوع آزمون | ویژگی/تست انجام‌شده | نتیجه مشاهده‌شده | تفسیر |
مشاهده ماکروسکوپی کلنی | رنگ کرم تا سفید، سطح صاف، لبه‌های کامل و برجسته | مثبت | ویژگی تیپیک ساکارومایسس سروزیه |
مشاهده میکروسکوپی | سلولهای بیضوی (5-10 میکرومتر) در حال جوانه زنی | مثبت | ریخت‌شناسی شاخص مخمرها |
تولید گاز از گلوکز | محیط حاوی گلوکز با لوله دورهام | مثبت (تشکیل حباب گاز) | توانایی تخمیر گلوکز |
تخمیر گلوکز | محیط حاوی گلوکز | مثبت (اسیدی شدن محیط) | قابلیت مصرف گلوکز |
تخمیر مالتوز | محیط حاوی مالتوز | مثبت | ویژگی خاص ساکارومایسس سروزیه |
تخمیر ساکاروز | محیط حاوی ساکاروز | مثبت | تایید هویت گونه‌ای ساکارومایسس سروزیه |
تخمیر لاکتوز | محیط حاوی لاکتوز | منفی | عدم توانایی مصرف لاکتوز |
تخمیر گالاکتوز | محیط حاوی گالاکتوز | مثبت | توانایی مصرف گالاکتوز |
میزان تولید اتانول توسط جدایهی منتخب
برای مشخص کردن تاثیر افزایش تحمل به الکل بر میزان اتانول تولیدی در جدایههای تکامل یافته منتخب، جدایه F1، بر افزایش تولید اتانول توسط آنها، میزان تولید اتانول هر جدایهی تکامل یافته مشخص گردید به صورت مستقیم با روش تقطیر و اندازه گیری درصد اتانول با الکل سنج انجام گردید که در شکل 2 نشان داده شده است. درجهت بررسی اثرات جهش بر میزان تولید اتانول جدایهها، میزان تولید والدین میانی جدایهی منتخب (جهش یافتههای قبل از آزمایشهای تکامل تطبیقی) نیز مورد بررسی قرار گرفتند. آزمونها نیز نشاندهندهی افزایش میزان تولید اتانول والدین میانی نسبت به سویهی اولیه میباشد.
شکل 2. تقطیر اتانول تولید شده با سیستم تقطیر شیشه ای
یافته ها
نتایج نشان داد که مقدار تولید اتانول برای جدایه تکامل یافته منتخب افزایش یافته است به طوری که بیشترین میزان تولید اتانول توسط سویه والد که قبل از انجام آزمون تکامل تطبیقی با اتیدیوم بروماید جهش و جدایه F1منتخب به برابر با 25/0±10% (حجم در حجم) اتانول تکامل یافت. بنابراین طبق این نتایج مقدار تولید اتانول با اعمال راهبردهای مهندسی تکاملی و فشار تنشی اتانول در این جدایه 20% افزایش یافت. این دادهها نشاندهنده افزایش تحمل مخمر به اتانول میباشد که منجر به افزایش تولید اتانول در جدایهی منتخب گردیده است.
نتایج بهینه سازی تولید اتانول به روش پاسخ سطح
با استفاده از نمودار سه بعدی سطح پاسخ، تعامل بین دو عامل متغیر و سطوح بهینه آنها به راحتی قابل درک است. در شکل 3، اثر بریکس محیط و سولفات آمونیوم بر غلظت اتانول (% v/v) با در سطح صفر در نظر گرفتن متغیر دیگر نشان داده شده است. حداکثر غلظت اتانول در محدوده بریکس %26 و g/L30 سولفات آمونیوم مشاهده شد. شکل4، اثر متقابل بریکس محیط و میزان تلقیح را بر غلظت اتانول با در سطح صفر در نظر گرفتن متغیر دیگر نشان میدهد. همانطور که در نمودار نشان داده شده است، غلظت بهینه اتانول تحت افزایش بریکس از مقدار مرکزی محدوده آزمایش، نزدیک به %26 و cell/ml 109 میزان تلقیح مشاهده شد. شکل5، اثر متقابل سولفات آمونیوم با میزان تلقیح را بر غلظت اتانول با در سطح صفر در نظر گرفتن متغیر دیگر نشان میدهد. همانطور که در نمودار نشان داده شده است، غلظت بهینه اتانول در محدوده g/L 30 سولفات آمونیوم و cell/ml 109 میزان تلقیح مشاهده شد. برای تایید شرایط بهینه آزمایش تایید در سه تکرار صورت گرفت. با آنالیز دادهها جهت بررسی رگرسیون دادههای تجربی، مقادیر R-Squared، R-Squared (adj) و R-Squared (Pred) تاییدکننده قابل قبولی برای رگرسیون بودند. مقدار 981/0 پارامتر R-sq نشان دهنده این است که بیش از 1/98 درصد دادههای تجربی با مدل پیشنهادی قابل توصیف هستند و تنها حدود 2 درصد خطا در پیشبینی دادهها وجود دارد.
شکل 3. نمودارهای الف) سطح پاسخ و ب) کانتور، اثر بریکس محیط و سولفات آمونیوم بر غلظت اتانول (%v/v) با سایر متغیرها
شکل 4. نمودارهای الف) سطح پاسخ و ب)کانتور، اثر بریکس محیط و میزان تلقیح بر غلظت اتانول (%v/v) با سایر متغیرها
شکل 5. نمودارهای الف) سطح پاسخ و ب) کانتور، اثر سولفات آمونیوم و میزان تلقیح بر غلظت اتانول (%v/v) با سایر متغیرها
مطابق شکل 6 برای انتخاب شرایط و محدوده بهینه، مدل به طور جداگانه نیز مورد تجزیه و تحلیل قرارگرفت. از گزارش اعتبارسنجی، معیارهای مورد نیاز با حداکثر اتانول به عنوان هدف انتخاب شدند. انتخاب راه حلها نیز بهطور خودکار توسط نرمافزار بازیابی شدند. هدف نهایی دستیابی به حداکثر بازده اتانول با بهینه کردن عوامل محدودکننده میباشد زیرا منبع کربن یکی از منابع غذایی پرهزینه برای تخمیر است. بنابراین بریکس 25% ملاس انتخاب شد. سطوح سولفات آمونیوم در محدوده g/L 21 و میزان تلقیح نیز در محدوده cell/ml 107 ×86 انتخاب شد.
هدف، تولید اتانول بالای %10 است. حد پایین 10% و حد بالایی 9/11% (v/v) میباشد. حداکثر پاسخ پیشبینی شده از مدل 08/11% (v/v) بود. همچنین آزمایشهای مکرری جهت تأیید بهینه پیش‌بینی‌شده صورت گرفت. نتیجه حاصل از سه تکرار با مقدار پیش‌بینی‌شده منطبق بود. میانگین 11% (v/v) بود که مدل ثابت شد. در مقایسه با محیط غیربهینه، نزدیک به 10% افزایش در بازده نهایی اتانول تحت شرایط بهینه آماری مشاهده شد.
شکل 6. پیشبینی بهینه حالت و بیشترین درصد اتانول تولید شده توسط متد سطح پاسخ
بحث و نتیجهگیری
باتوجه به افزایش رشد تقاضای جهانی اتانولزیستی، پاندمی اخیر COVID-19 در سراسر جهان و نیاز به تولید هرچه بیشتر اتانول در سالهای اخیر، در زمان حاضر نیاز به حجم زیادی از اتانولزیستی وجود دارد(36). این بدان معناست که در هر مرحله از تولید این محصول زیستی بهبود عملکرد و بهرهوری بسیار ضروری میباشد. بسیاری از این شرایط با مهندسی میکروارگانیسمها قابل برطرف شدن میباشد که با طراحی دوبارهی مسیرهای متابولیسمی منجر به افزایش سطح عملکرد و بهرهوری میشود؛ درنهایت، مواد اولیه موردنیاز در مقیاس کارخانههای تولیدکننده و میزان سرمایه و هزینههای تولید کاهش مییابد(37 و 38). بهمنظور تولید کارآمد و مقرون بهصرفه اتانول، تخمیر سریع لازم است؛ از اینرو، سویه مخمر برگزیده شده باید دارای سرعت رشد خوب و میزان تولید اتانول در غلظت بالای اتانول باشد(39). طی مطالعات متعدی که تاکنون صورت گرفته است، جهشهایی که با استفاده از مواد جهشزا در ژنوم سویهها رخ میدهد یا جهشهای خودبهخودی که از طریق انطباق تکاملی جمعیت مخمری با تنش اتانول سازگار میشوند باعث میشود که میزان رشد مخمر در تنش افزایش یابد. در واقع جهش هنگامی صورت میگیرد که مخمر در غلظت کشنده یا مهارکننده رشد اتانول قرار میگیرد و با تغییرات حاصل از جهش، بقای خود را در حدود این غلظت الکل بهطور چشمگیری در مقایسه با سویههای والدی بهبود میدهد(40 و 41). بنابراین، رشد مخمرها در غلظت بالای اتانول بهعنوان پارامتر انتخاب مناسبی برای آزمایشهای تکامل تطبیقی برای صفت تحمل اتانول میباشد(15). برای بررسی تأثیر افزایش تحمل به الکل بر افزایش تولید اتانول، از سنجش مستقیم تولید اتانول توسط جدایه مذکور استفاده شد. نتایج نشان دادند تحمل این سویهها نسبت به اتانول بهبود یافته و همچنین توان تولید اتانول توسط این جدایه نسبت به سویهی والد افزایش یافته است و علاوه بر اینکه رشد خود را در این شرایط ادامه دادند؛ درنهایت، میزان اتانول بیشتری نیز نسبت به سویهی والدی تولید کردند. Dinh و همکاران (2008) با روش ناپیوسته و با استفاده از راهبرد مهندسی تکاملی، تحمل به اتانول یکی از سویههای ساکارومایسس سرویزیه هاپلوئید آزمایشگاهی را از 8 درصد به 10 درصد ارتقا دادند(26). طی مطالعه دیگری Stanley و همکاران در سال 2010 پس از جهش سویهی ساکارومایسس سرویزیه W303-1A با اتیل متان سولفونات، میزان تحمل به اتانول سویههای جهشیافته و سویهی والدی را پس از یک دوره آزمایش تکامل تطبیقی در اتانول بهصورت پیوسته بررسی کردند و نشاندادند که پس از 192 روز کشت مداوم در بیوراکتور در شرایط تنش اتانول، میزان تحمل به اتانول هر دو سویه از 5/7 درصد به 9 درصد (حجم در حجم) افزایش یافته بود؛ اما میزان مصرف گلوکز در سویهای که بدون هیچگونه عامل جهشزایی در شرایط تنش اتانول تکامل یافته بود، نسبت به سویهی دیگر نیز افزایش یافته بود(42). Turanli و همکاران (2017) در مطالعهای از اتیل متان سولفونات برای جهشزایی استفاده کردند و میزان تحمل یک سویهی ساکارومایسس سرویزیه هاپلوئید آزمایشگاهی CEN.PK 113-7D را از 5 درصد تا 10 درصد (حجم در حجم) افزایش دادند. در ادامه نیز با روش مهندسی تکاملی تحمل به اتانول را تا 12درصد افزایش دادند و پس از آن تغییرات در تعداد کروموزومها در سویههای تکامل یافته را مورد بررسی قرار دادند. در تحقیق حاضر افزایش تحمل به اتانول روش تنش افزایشی و ثابت طی 144 روز و در کشت بسته، در میکروپلیتهای با 96 چاهک و در حجم بسیارکم با غلظتهای افزایشی 8% تا 10% صورت گرفت(39). بهبود نرخ رشدی که طی روند تکاملی صورت گرفت، در مقایسه با هزینههای بالای کشت پیوسته و حفظ شرایط بسیار سخت این سیستمها، در زمان کوتاه و با صرف هزینه بسیارکمی همراه بود. در این مطالعه تغییرات رشدی و رشد مثبت مقاومترین جدایههای جهشیافته بررسی و درنهایت به انتخاب 1 جدایهی برتر منجر شد. همچنین در این تحقیق از سویه والد اولیه بهعنوان شاهد استفاده شد. با توجه به نتایج بهدست آمده در این پژوهش، میتوان از درصدهای تعیین شدهی اتانول به منظور فشار انتخابی در مرحلهی غربالگری و همچنین در مرحله بعد از جهش و تطابق سازشی همراه با فشار انتخابی بهرهبرد. این فرایند به انتخاب جدایههایی منجر شد که تحمل به اتانول در آنها افزایش یافته بود. استفاده از محیط کشت ملاس تاثیر چندانی در روند بهبود مقاومت به اتانول در مقایسه با محیط آزمایشگاهی YPD نداشت. در سال 2012 Paradeep و همکاران مطالعهای را تحت عنوان بهینهسازی فرایند تولید اتانول از طریق گندمیان انگشتی با استفاده از روش سطحپاسخ آغاز کردند. متغیرهایی که در این مطالعه بهینه شده بود عبارت بودند از: غلظت عصاره مخمر، سولفات منیزیم و pH محیط که پس از بهینهسازی این عوامل، غلظت اتانول به میزان 66/13 درصد رسید. مقادیر پیشبینی شده برای شرایط فرایند بهینهسازی شده با دادههای تجربی همخوانی خوبی داشت. تایید مدل ثابت کرد که تفاوت معناداری بین مقادیر پیشبینی شده و مشاهده شده وجود ندارد(43). Ratnam و همکاران در سال 2003 مطالعهای تحت عنوان تولید اتانول از نشاستهی درخت نخل در مرحلهی تخمیر و در غلظتهای مختلف انجامدادند. طی این آزمایش غلظت بهینه مشخص شد و سپس بهترین شرایط تولید اتانول تخمیر به مدت زمان 17 ساعت و اسیدیته 2 و دمای 37 درجه سانتیگراد برای غلظت140 گرم در لیتر نشاسته بهدست آمد که این مقادیر از طریق روش سطح پاسخ بهدست آمدند. همچنین غلظت بهینه مشخص شده توسط روش سطح پاسخ با توجه زمان و هزینه با روش تجربی کاملا همخوانی داشت(44). Gebregergs و همکاران در سال2016 مطالعهای تحت عنوان تولید اتانول صنعتی از پوست موز برای کشورهای درحال توسعه و بهینهسازی روش از طریق سطح پاسخ را انجام دادند. در واقع آنها از پوست موز جهت تولید اتانول از طریق مخمر ساکارومایسس سرویزیه بهره بردند و اثرات عوامل هیدرولیز را مورد بررسی قرار دادند و با طرحهای سطح پاسخ ترکیبی بهینه از عوامل پیدا کردند. تجزیه و تحلیل ضریب همبستگی واریانس R2= 0/865 و R2 تعدیل شده= 0/9782 بیانگر ارزیابی بسیار خوبی از دادههای تجربی توسط مدل رگرسیون چندجملهای درجهی دوم میباشد. این مقدار همبستگی دادههای تجربی بیانگر توانایی روش سطح پاسخ در صحت و درستی شرایط آزمایشگاهی میباشد(45). درمطالعه فوق از پوست موز جهت تخمیر اولیه استفاده نمودند درحالیکه در مطالعه ما از ملاس چغندر استفاده شد و ضریب همبستگی واریانس تقریبا مشابه بود. El-Gendy و همکارانش در سال 2013 مطالعهای تحت عنوان طراحی و بهینهسازی فرایند تخمیر ملاس چغندر قند توسط ساکارومایسس سرویزیه با استفاده از روش سطح پاسخ انجام دادند. از روش سطح پاسخ بر اساس طراحی مرکزی نمای کامپوزیت بهمنظور ارزیابی و بهینهسازی شرایط برای تولید حداکثری بیواتانول بهره بردهشد. در این آزمایش اهمیت دوره انکوباسیون، pH اولیه، دمای انکوباسیون و غلظت ملاس در عملکرد بیواتانول مورد بررسی قرار گرفت. با استفاده از معادلهی مدل، تولید حداکثر اتانول در شرایط بهینه 255 گرم در لیتر در اسیدیتهی 6/5 و دمای 38 درجه سانتیگراد بهدست آمد که با شرایط آزمایشگاهی آن همخوانی بالائی با مطالعه حاضر داشت(46). در هر دو مطالعه از ملاس چغندرقند بهعنوان منبع کربن استفاده شده است اما تفاوت در میزان الکل تولید شده ناشی از تفاوت در سایر عوامل ازقبیل دما و pH و... و همچنین جدایه مخمری مورد استفاده در تولید میباشد. در تمامی موارد ذکر شده، روش سطح پاسخ بهینهترین و بهترین شرایط را برای تولید اتانول تعیین کرده و همخوانی روش نتیجه تجربی با نتیجهی مدل ارائه شده توسط روش سطح پاسخ تایید شده است، لذا جهت تولید بیواتانول با بالاترین راندمان و کمترین هزینه میتوان از روش سطح پاسخ بهرهبرد و توصیه به استفاده از این روش در مدلهای آزمایشگاهی میگردد.
منابع
1. Barnett JA, Lichtenthaler FW. A history of research on yeasts 3: Emil Fischer, Eduard Buchner and their contemporaries, 1880-1900. Yeast. 2001;18(4):363–88.
2. Wang F, Jiang Y, Guo W, Niu K, Zhang R, Hou S, et al. An environmentally friendly and productive process for bioethanol production from potato waste. Biotechnol Biofuels. 2016;9(1):50.
3. Mohseni M, Ebrahimi H. Isolation, identification and optimization of ethanol producing bacteria from Saccharomyces-based fermentation process of alcohol industries in Iran. J Microb Biol. 2013;2(7):15–28.
4. Azizi S, Tarinejad A, Pazhang M. Isolation, cloning and analysis of the hexose transporter 6 gene (HXT6) in a native strain of Saccharomyces cerevisiae IBRC-M30069. J Microb Biol. 2016;5(18):29–40.
5. Liu X, Xu W, Mao L, Zhang C, Yan P, Xu Z, et al. Lignocellulosic ethanol production by starch-base industrial yeast under PEG detoxification. Sci Rep. 2016;6(1):20361.
6. Celińska E, Borkowska M, Białas W. Evaluation of a recombinant insect-derived amylase performance in simultaneous saccharification and fermentation process with industrial yeasts. Appl Microbiol Biotechnol. 2016;100(6):2693–707.
7. Rodionova M V, Poudyal RS, Tiwari I, Voloshin RA, Zharmukhamedov SK, Nam HG, et al. Biofuel production: Challenges and opportunities. Int J Hydrogen Energy. 2017;42(12):8450–61.
8. Dekker WJC, Wiersma SJ, Bouwknegt J, Mooiman C, Pronk JT. Anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D does not depend on synthesis or supplementation of unsaturated fatty acids. FEMS Yeast Res. 2019;19(6):foz060.
9. Deparis Q, Claes A, Foulquié-Moreno MR, Thevelein JM. Engineering tolerance to industrially relevant stress factors in yeast cell factories. FEMS Yeast Res. 2017;17(4):fox036.
10. Argyros DA, Stonehouse EA. Yeast train improvement for alcohol production. alcohol Textb. 2017;6:287–97.
11. Wallace-Salinas V, Gorwa-Grauslund MF. Adaptive evolution of an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae for
12. Attfield P V. Stress tolerance: the key to effective strains of industrial baker’s yeast. Nat Biotechnol. 1997;15(13):1351–7.
13. Dinh TN, Nagahisa K, Hirasawa T, Furusawa C, Shimizu H. Adaptation of Saccharomyces cerevisiae cells to high ethanol concentration and changes in fatty acid composition of membrane and cell size. PLoS One. 2008;3(7):e2623.
14. Lockshon D, Surface LE, Kerr EO, Kaeberlein M, Kennedy BK. The sensitivity of yeast mutants to oleic acid implicates the peroxisome and other processes in membrane function. Genetics. 2007;175(1):77–91.
15. Petek-Cakar Z, Turanli-Yildiz B, Alkim C, Yilmaz Ü. Evolutionary engineering of Saccharomyces cerevisiae for improved industrially important properties. FEMS Yeast Res. 2012;12(2):171–82.
16. Fiedurek J, Skowronek M, Gromada A. Selection and adaptation of Saccharomyces cerevisae to increased ethanol tolerance and production. Pol J Microbiol. 2011;60(1):51–8.
17. Stanley D, Chambers PJ, Stanley GA, Borneman A, Fraser S. Transcriptional changes associated with ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;88(1):231–9.
18. Caspeta L, Chen Y, Ghiaci P, Feizi A, Buskov S, Hallström BM, et al. Altered sterol composition renders yeast thermotolerant. Science (80- ). 2014;346(6205):75–8.
19. Zabed H, Sahu JN, Suely A, Boyce AN, Faruq G. Bioethanol production from renewable sources: Current perspectives and technological progress. Renew Sustain Energy Rev. 2017;71:475–501.
20. Pradeep P, Goud GK, Reddy OVS. Optimization of very high gravity (VHG) finger millet (ragi) medium for ethanolic fermentation by yeast. Chiang Mai J Sci. 2010;37(1):116–23.
21. Springham DG, Moses V, Cape RE. Biotechnology-the science and the business. CRC press; 1999.
22. Khongsay N, Laopaiboon L, Laopaiboon P. Growth and batch ethanol fermentation of Saccharomyces cerevisiae on sweet sorghum stem juice under normal and very high gravity conditions. 2010;
23. Fishell VK, Aberle ED, Judge MD, Perry TW. Palatability and muscle properties of beef as influenced by preslaughter growth rate. J Anim Sci. 1985;61(1):151–7.
24. Gulshan A. Bioethanol and recombinant proteins production from milk whey and molasses. 2014;
25. Antoni D, Zverlov V V, Schwarz WH. Biofuels from microbes. Appl Microbiol Biotechnol. 2007;77(1):23–35.
26. Briggs DE, Brookes PA, Stevens R, Boulton CA. Brewing: science and practice. Elsevier; 2004.
27. Atkinson AC. Optimum experimental design. In: International Encyclopedia of Statistical Science. Springer; 2011. p. 1037–9.
28. Myers RH, Montgomery DC, Anderson-Cook CM. Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments. John Wiley & Sons; 2016.
29. Stanley D, Fraser S, Chambers PJ, Rogers P, Stanley GA. Generation and characterisation of stable ethanol-tolerant mutants of Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 2010;37(2):139–49.
30. Baltz RH, Demain AL, Davies JE. Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology Press; 2010.
31. Ghiaci P, Norbeck J, Larsson C. Physiological adaptations of Saccharomyces cerevisiae evolved for improved butanol tolerance. Biotechnol Biofuels. 2013;6(1):101.
32. Sheikhi F, Rostami K, Azin M, Asadollahi M ali, Ebrahimi M, Ghiaci P. Improving Ethanol Tolerance in Industrial Yeast Strain by a Combination of Mutation and Evolutionary Engineering. J Microb Biol. 2022;11(43):13–28.
33. Barnett JA, Payne RW, Yarrow D. Yeasts: characteristics and identification. 1983.
34. Kurtzman C, Fell JW, Boekhout T. The yeasts: a taxonomic study. Elsevier; 2011.
35. Sasikumar E, Viruthagiri T. Optimization of process conditions using response surface methodology (RSM) for ethanol production from pretreated sugarcane bagasse: kinetics and modeling. BioEnergy Res. 2008;1(3):239–47.
36. Abuga K, Nyamweya N %J P. Alcohol-based hand sanitizers in COVID-19 prevention: a multidimensional perspective. 2021;9(1):64.
37. Winston F. EMS and UV mutagenesis in yeast. Curr Protoc Mol Biol. 2008;82(1):13.
38. Darvishi F, Abolhasan Moghaddami N. Isolation of industrial strain Saccharomyces cerevisiae with high tolerance to ethanol from Iran’s alcohol manufactures. Cell Mol Res (Iranian J Biol. 2018;31(4):500–10.
39. Turanlı-Yıldız B, Benbadis L, Alkım C, Sezgin T, Akşit A, Gökçe A, et al. In vivo evolutionary engineering for ethanol-tolerance of Saccharomyces cerevisiae haploid cells triggers diploidization. J Biosci Bioeng. 2017;124(3):309–18.
40. Liao JC, Mi L, Pontrelli S, Luo S. Fuelling the future: microbial engineering for the production of sustainable biofuels. Nat Rev Microbiol. 2016;14(5):288–304.
41. Ding J, Huang X, Zhang L, Zhao N, Yang D, Zhang K. Tolerance and stress response to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 2009;85(2):253–63.
42. Elshreef AY. Effect of molasses levels as source of energy on broiler performance. Fac Anim Prod Univ Khartoum. 2010;
43. Pradeep P, Sarathi Reddy OV, Rama Mohan P, Ko S. Process optimization for ethanol production from very high gravity (VHG) finger millet medium using response surface methodology. Iran J Biotechnol. 2012;10(3):168–74.
44. Ratnam BVV, Narasimha Rao M, Damodar Rao M, Subba Rao S, Ayyanna C. Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology. World J Microbiol Biotechnol. 2003;19(5):523–6.
45. Gebregergs A, Gebresemati M, Sahu O. Industrial ethanol from banana peels for developing countries: Response surface methodology. Pacific Sci Rev A Nat Sci Eng. 2016;18(1):22–9.
46. El-Gendy NS, Madian HR, Amr SSA. Design and optimization of a process for sugarcane molasses fermentation by Saccharomyces cerevisiae using response surface methodology. Int J Microbiol. 2013;2013(1):815631.