تجزیه و تحلیل مولکولی جمعيتي از بز نجدي با استفاده از توالی HVR1 ژنوم میتوکندری

خادمی, روح الله; قاسمیان, سیده ام البنین; سیدآبادی, حمید رضا; کاظمی زاده, امین

doi:10.22034/ascij.2023.1999044.1550

کد مقاله : ASCIJ-2310-1550 (R1) بازدید : 310 صفحه: 83 - 93

10.22034/ascij.2023.1999044.1550

نوع مقاله: پژوهشی

تجزیه و تحلیل مولکولی جمعيتي از بز نجدي با استفاده از توالی HVR1 ژنوم میتوکندری

محورهای موضوعی : فصلنامه زیست شناسی جانوری

روح الله خادمی ¹ , سیده ام البنین قاسمیان ² , حمید رضا سیدآبادی ³ , امین کاظمی زاده ⁴

1 - گروه علوم دامی، واحد بهبهان، دانشگاه آزاد اسلامی، بهبهان، ایران
2 - گروه دامپزشکی، واحد بهبهان، دانشگاه آزاد اسلامی، بهبهان، ایران
3 - موسسه تحقیقات علوم دامی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
4 - بخش تحقیقات علوم دامی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان لرستان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، خرم آباد، ایران

تاریخ دریافت : 1402/07/25 تاریخ پذیرش : 1402/09/01 تاریخ انتشار : 1402/10/15

کلید واژه: ژنوم میتوکندری, ناحیه HVR1 , تعیین توالی, فیلوژنی, بز نجدي,

چکیده مقاله :

این مطالعه با هدف تعیین توالی ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندری بز نجدي انجام گرفت. برای انجام این تحقیق تعداد 30 عدد نمونه خون از هر دو جنس از بزهاي غير خويشاوند جمع¬آوری شد. پس از استخراج DNA، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهای اختصاصی با تکنیک PCR تکثیر شد و تعیین توالی شد. براي مقايسه‎، فیلوژنی توالي ناحيه HVR1 بدست آمده از بز نجدي با سایر نژادها در جهان برای تعیین گروه هاپلوتیپی رسم گردید. درخت فيلوژنتيكي ترسيم شده براي نمونه‎ها نشان داد كه همگي از يك جمعيت منشأ گرفته‎اند و تعداد 5 هاپلوتیپ مختلف بر اساس 20 نوكلئوتيد چند شكل (SNP) براي ناحيه HVR1 موجود در توالی‎ها تعیین گردید. همچنين توالي ناحيه HVR1 نمونه مورد بررسي با 11 توالي ثبت شده از 6 گروه هاپلوتیپی از کشورهای مختلف موجود در پایگاه NCBI نشان داد که بز نجدي جز گروه هاپلوتیپی A می باشد. مقایسه توالي ناحيه HVR1 با توالی‎های موجود در بانک ژن می‎تواند به اطلاعات ما درباره نژادهای بز نجدی کمک کند و زمینه را برای استفاده بهتر از آن‎ها در برنامه‎های اصلاحی باز کند. بر اساس نتایج بدست آمده تنوع ژنتیکی بز نجدی در طی سال‎های متمادی افزایش یافته است، که این افزایش تنوع ژنتیکی می‎تواند به دلیل آمیخته‎گری این نژاد با نژادهای دیگر باشد که می‎تواند در آینده منجر به انقراض بز نجدی گردد، که نیازمند توجه بیشتر به این موضوع می‎باشد.

چکیده انگلیسی:

This study was conducted to determine the sequence of the HVR1 region of the mitochondrial genome of the Najdi goat. To conduct this study, 30 blood samples of both gender were collected from unrelated goats. After DNA extraction, the desired region was amplified by specific primers by PCR technique, and the sequence was determined. For comparison, the phylogeny of the HVR1 region sequence obtained from Najdi goat was drawn with other breeds worldwide to determine the haplotype group. The phylogenetic tree drawn for the samples showed that they all originated from the same population and the number of 5 different haplotypes was determined based on 20 nucleotide polymorphisms (SNP) for the HVR1 region in the sequences. Also, the sequence of the HVR1 region of the studied sample with 11 sequences recorded from 6 haplotype groups from different countries in the NCBI database showed that the Najdi goat belongs to haplotype group A. Comparing the sequence of the HVR1 region with the sequences in the gene bank can contribute to our information about the Najdi goat breeds and open the ground for their better use in breeding programs. According to the obtained results, the genetic diversity of the Najdi goat has increased over many years, and this increase in genetic diversity can be due to the mixing of this breed with other breeds, which can lead to the extinction of the Najdi goat in the future, which requires more attention to this issue.

منابع و مأخذ:

Asadollahpour N.H., Kharrati-Koopaee H., Esmailizadeh A. 2022. Genetic diversity and signatures of selection for heat tolerance and immune response in Iranian native chickens. BMC Genomics, 23(1):1-13.
Azizi Z., Abbasi M.A., Kazemi A., Mohammad Nazari B., Taheri A., Hasani Bafarani A. 2021. A review of the status of the native cattle and its conservation strategies in Iran. Agricultural Biotechnology Journal, 12(4):142-166.
Bashiri A., Rooshanfekr H.A., Salabi F. 2020. The genetic and phylogenetic analysis of the D-Loop region in mitochondrial genome of Najdi goat. Agricultural Biotechnology Journal, 12(3):45-66.
DeBenedictis E.A., Chory E.J., Gretton D.W., Wang B., Golas S., Esvelt K.M. 2022. Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery. Nature Methods, 19(1):55-64.
Diwedi J., Singh A.W., Ahlawat S., Sharma R., Arora R., Sharma H., Raja K., Verma N., Tantia M. 2020. Comprehensive analysis of mitochondrial DNA based genetic diversity in Indian goats. Gene, 756:144910.
Gammage P.A., Frezza C. 2019. Mitochondrial DNA: the overlooked oncogenome? BMC Biology, 17(1):1-10.
Hahn A., Zuryn S. 2019. The cellular mitochondrial genome landscape in disease. Trends in Cell Biology, 29(3):227-240.
Hoda A., Biçoku Y., Dobi P. 2014. "Genetic diversity of Albanian goat breeds revealed by mtDNA sequence variation. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 28(1):77-81.
Kamalakkannan R., Jose J., Thomas S., Prabhu V.R., Nagarajan M. 2018. Genetic diversity and maternal lineages of south Indian goats. Molecular Biology Reports, 45(6):2741-2748.
Karimi V., Hedayat Evrigh N., Seyed Sharifi N.S. 2017. Invetigation of genetic structure of Khalkhali goat using mitochondrial genome. Novin Genetic Journal, 12(2):217-227.
Li L., Goel A., Wang X. 2022. Novel paradigms of mitochondrial biology and function: potential clinical significance in the era of precision medicine, Springer: 1-5.
Mohammadpour A. 2018. Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism. Pharmaceutical and Biomedical Research, 4(2):28-32.
Naderi S., Rezaei H.R., Taberlet P., Zundel S., Rafat S., Naghash H.R., El-Barody M.A., Ertugrul O., Pompanon F., Consortium E. 2007. Large-scale mitochondrial DNA analysis of the domestic goat reveals six haplogroups with high diversity. Plos One, 2(10): 1012-1024..
Nazari M., Mohamadi Ahvazi G. 2022. Genetic and phylogenetic analysis of mitochondrial D-loop HVR I region in three breeds of native sheep Iran (Taleshi, Shal and Makui). Veterinary Researches and Biological Products, 35(1):31-39.
Pakpahan S., Artama W.T., Widayanti R., Suparta I. 2015. Genetic variations and the origin of native Indonesian goat breeds based on mtDNA D-Loop sequences. Asian Journal of Animal Sciences, 9(6):34-50.
Rohipoor M., Nazari M. 2019. Genetic and phylogenetic analysis of Adani Goat population based on cytochrome B gene. Research On Animal Production, 10(26):84-89.
Shariat M., Dashab G.R., Vafaye Valleh M. 2019. Comparison of phylogenetic and evolutionary of nucleotide squences of HVR1 region of mitochondria genom in goats and other livestock species. Research On Animal Production, 10(23):133-143.
Sharifi R.S., Sofla S.S., Seyedabadi H.R. 2018. Genetic diversity and molecular phylogeny of iranian goats based on cytochrome oxidase I (COXI) gene sequences. Jurnal Veteriner, 18(4):565-570.

Yi G., Ying G., HE Y.M., Yang B.G., Zhang W.Y., Chen B.E., Huang Y.F., Zhao Y.J., Zhang D.P., Chu M.X. 2022. Investigation of mitochondrial DNA genetic diversity and phylogeny of goats worldwide. Journal of Integrative Agriculture, 21(6):1830-1837

متن کامل:

تجزیه و تحلیل مولکولی جمعيتي از بز نجدي با استفاده از توالی HVR1 ژنوم میتوکندری

چكيده

این مطالعه با هدف تعیین توالی ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندری بز نجدي انجام گرفت. برای انجام این تحقیق تعداد 30 عدد نمونه خون از هر دو جنس از بزهاي غير خويشاوند جمع آوری شد. پس از استخراج DNA، ناحیه مورد نظر توسط پرایمرهای اختصاصی با تکنیک PCR تکثیر شد و تعیین توالی شد. براي مقايسه‎، فیلوژنی توالي ناحيه HVR1 بدست آمده از بز نجدي با سایر نژادها در جهان برای تعیین گروه هاپلوتیپی رسم گردید. درخت فيلوژنتيكي ترسيم شده براي نمونه‎ها نشان داد كه همگي از يك جمعيت منشأ گرفته‎اند و تعداد 5 هاپلوتیپ مختلف بر اساس 20 نوكلئوتيد چند شكل (SNP) براي ناحيه HVR1 موجود در توالی‎ها تعیین گردید. همچنين توالي ناحيه HVR1 نمونه مورد بررسي با 11 توالي ثبت شده از 6 گروه هاپلوتیپی از کشورهای مختلف موجود در پایگاه NCBI نشان داد که بز نجدي جز گروه هاپلوتیپی A می باشد. مقایسه توالي ناحيه HVR1 با توالی‎های موجود در بانک ژن می‎تواند به اطلاعات ما درباره نژادهای بز نجدی کمک کند و زمینه را برای استفاده بهتر از آن‎ها در برنامه‎های اصلاحی باز کند. بر اساس نتایج بدست آمده تنوع ژنتیکی بز نجدی در طی سال‎های متمادی افزایش یافته است، که این افزایش تنوع ژنتیکی می‎تواند به دلیل آمیخته‎گری این نژاد با نژادهای دیگر باشد که می‎تواند در آینده منجر به انقراض بز نجدی گردد، که نیازمند توجه بیشتر به این موضوع می‎باشد.

واژه‌های کلیدی: ژنوم میتوکندری، ناحیه HVR1 ، تعیین توالی، فیلوژنی، بز نجدي.

Molecular analysis of Najdi goat population using HVR1 sequence of mitochondrial genome

Abstract

The aim of study was evaluated the sequence of the HVR1 region of the mitochondrial genome of the Najdi goat. for this study, 30 blood samples of both gender were collected from unrelated goats. After DNA extraction, the desired region was amplified by specific primers by PCR technique and sequence was determined. For comparison, the phylogeny of the HVR1 region sequence obtained from Najdi goat was drawn with other goats in the world to determine the haplotype group. The phylogenetic tree drawn for the samples showed that they all originated from the same population and the number of 5 different haplotypes was determined based on 20 nucleotide polymorphisms (SNP) for the HVR1 region in the sequences. Also, the sequence of the HVR1 region of the studied sample with 11 sequences recorded from 6 haplotype groups from different countries in the NCBI database showed that the Najdi goat belongs to haplotype group A. Comparing the sequence of the HVR1 region with the sequences in the gene bank can contribute to our information about the Najdi goat breeds and open the ground for their better use in breeding programs. According to the obtained results, the genetic diversity of the Najdi goat has increased over many years, and this increase in genetic diversity can be due to the mixing of this breed with other breeds, which can lead to the extinction of the Najdi goat in the future, which requires more attention to this issue.

Key words: mtDNA, HVR1 region, DNA sequencing, phylogeny, Najdi goat

مقدمه

نژادهای بومی به عنوان سرمایه ملی و محصول استراتژیک هستند و حفظ آنها بسیار ضروری است. شناخت دقیق این ذخایر ژنتیکی می‎تواند مبنای دقیق‎تری برای برنامه‌های اصلاح نژادی در آینده و به نتیجه رسیدن در زمان کوتاه‎تر و استفاده بهینه از منابع موجود در جهت تولید بیشتر گردد (2). بز نجدی یکی از نژادهای بومی غرب و جنوب غربی ایران است. بز نجدی یک نژاد دو منظوره شیری و گوشتی است که تولید اصلی آن شیر است. این نژاد دو بار در سال زایش دارد و اغلب زایش‎ها با دوقلوزایی توأم است (3). بز نجدی براي قرن‎ها نقش مهمي در تامين منابع غذايي مردمان سرزمين فلات ايران بر عهده داشته است. بنابراین شناخت دقیق این نژاد برای حفظ و تکثیر آن بسیاری ضروری است (18).

حفاظت ژنتیکی از یک گونه خاص باید بر اساس دانش عمیقی از منابع ژنتیکی آن نژاد باشد، بنابراین تلاش برای شناسایی و تعیین خصوصیات ژنتیکی نژادهای بومی و محلی از اهمیت زیادی برخوردار است. یکی از راه‌های شناسایی این نژاد استفاده از ژنوم میتوکندري است. میتوکندری اندامکی سیتوپلاسمی است که در بیشتر سلول‌های بدن وجود دارند. این اندامک که قادر به تولید انرژی برای سلول است، که دارای DNA حلقوی اختصاصی و مستقل از DNA هسته‌ای است. DNA میتوکندری در گونه‌های جانوری 37 ژن را کد می‌کند که شامل 13 ژن کدکننده زنجیره تنفسی، 22 ژن کد کننده tRNA و 2 ژن کد کننده rRNA است و طول تقریبی آن 16 کیلو جفت باز می‌باشد (11). ژنوم میتوکندری به دلیل داشتن ویژگی‎هایی از جمله عدم نوترکیبی، تعداد کپی بالا، نرخ جایگزینی بالا و وراثت مادری، یک ابزار قدرتمند در تکامل می‎باشد (7). پيشرفت‌هاي ايجاد شده در حوزه بيولوژي مولكولي اين امكان را به وجود آورده كه از طريق نشانگرهای ژنتيكي در سطح مولکول DNA، ژن‌هاي مسئول ايجاد تفاوت ژنتيكي بين افراد و جمعیت‌ها تعيين شوند. در بين نشانگرهای ژنتيكي، توالی‌یابی ژنوم ميتوكندري يكي از بهترين و رايج ترين روش‌ها براي طبقه‌بندي ژنتيكي جمعیت‌ها و گونه‌های نزديك به هم، تشخیص هویت، بررسي امكان اشتقاق گونه‌های مختلف از يك جد مشترك، مطالعه رابطه فیلوژنی هر موجود با سایر گونه‌ها و نژادها و دست‌یابی به راه‌كارهايي براي حفظ ذخاير ژنتيكي می‌باشد (6). همچنین از ژنوم میتوکندری می‌توان برای تشخیص هم‌زمان گونه‌های مختلف گوشت مثل گاو، گاو میش، گوسفند و بز در مخلوط گوشت استفاده نمود (1).

حدود دو دهه است که از ژنوم میتوکندری، به دلیل نرخ جهش بالا و سیر تکاملی 5 تا 10 برابری نسبت به ژنوم سلولی به عنوان مارکر مولکولی در ژنتیک جمعیت استفاده می‎شود. بخشی از ژنوم ميتوكندری، منطقه D-Loop (Displacemen-loop) منطقه آغاز همانندسازی ژنوم ميتوكندري است. این ناحیه به دلیل اینکه ژن رمزکننده پروتئین ندارد، جهش در آن تجمع می‎یابد. همچنین از آنجایی که این ناحیه در کنترل رونویسی نقش مهمی ندارد، جهش‎های صورت گرفته در آن ابقاء می‎شوند و بدون تغيير به نسل‌های بعد منتقل می‌شوند. منطقه D-Loop دارای دو ناحيه بسيار متغير HVR1 و HVR2 است (15). از آنجایی که در ناحیه HVR1 میزان بروز تنوع نسبت به سایر قسمت‎های دیگر ژنوم میتوکندری بالاتری است، بسیاری از مطالعات در این ناحیه صورت گرفته است (9، 15 و 19). مطالعه‎ای بر روی ناحیه HVR1 بزهای آلبانی نشان داد که تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی این ناحیه در درون جمعیت 7/98 درصد و بین جمعیت‎ها 3/1 درصد می‎باشد (8). همچنین تجزیه واریانس ملکولی ناحیه ژنوم میتوکندری تعدادی از بزهای بومی ایران نشان داد که بیشترین تغییرات ژنتیکی ناحیه HVR1 مربوط به درون جمعیت‎هاست و تنها 08/3 درصد تغییرات در بین جمعیت‎ها مشاهده می‎شود (17). بنابراین شناسایی توالی این ناحیه به عنوان مشخصه ژنتیکی ثابت محسوب می‌شود و به تهیه شناسنامه ژنتیکی و نگه‌داری خلوص نژادهای بومی کمک می‌کند و با مقایسه گونه‌ها و نژادهای دیگر که در سال‌های مختلف مطالعه شده است و توالی آن‌ها در بانک ژن موجود است، امکان مطالعات فیلوژنتیکی، بررسی اشتقاق گونه‌ها و فاصله نسلي را فراهم می‌کند. از طرفی توالی‌یابی این مناطق شاخص مناسبی را از میزان تنوع موجود در جمعیت ارائه می‌دهد و امکان تشخیص گونه‌ها و نژادها را فراهم می‌کند و به حفظ گونه‌های بومی از خطر انقراض و اختلاط ژنتیکی با سایر نژادها کمک می‌کند (14). بنابراین این مطالعه با هدف تعیین توالی ناحیهHVR1 ژنوم میتوکندری برای تعيين ساختار ژنتيكي، رابطه فيلوژنتيكي و بررسي انشقاق جمعيت‎ها در بز نجدي انجام گرفت.

مواد و روش‎ها

در این پژوهش از تعداد 30 رأس بز نجدي موجود در ايستگاه پرورش و اصلاح نژاد مستقر در استان خوزستان نمونه‎گيري صورت گرفت. نمونه‎هاي خون به مقدار 5 میلی‌لیتر از سیاهرگ وداج گردني، در تیوب‌های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA اخذ و بلافاصله به آزمایشگاه بیوتکنولوژی موسسه تحقيقات علوم دامي كشور انتقال و تا زمان استخراج DNA در فریزر °C20- نگه‌داری شدند.

استخراج DNA

استخراج DNA از خون کامل با استفاده از روش اصلاح شده نمکی (12) صورت گرفت. الکتروفورز براي آگاهي‌ از حضور یا عدم حضور DNA در محلول استخراج شده و بررسی کیفیت DNA استفاده شد. در این روش DNA استخراج‌ شده‌ را بر روي‌ ژل‌ آگارز 1% حاوی اتیدیوم بروماید ران شد و سپس ‌به‌ مدت‌ 5/1 ساعت‌ با ولتاژ100 میلی ولت در كنار يك DNA استاندارد (λDNA) الکتروفورز شد. با مشاهده درخشندگي و حجم باند ايجاد شده در مقایسه با DNA استاندارد (λDNA) که دارای غلظت مشخصی است، كیفیت DNA را مشخص کردیم.

در مرحله بعد با استفاد از دستگاه اسپکتوفتومتر نانودراپ MD-1000 جذب نمونه‎ها در موج‌هاي 260 نانومتر (A260) و 280 نانومتر (A280) اندازه‎گیری گردید، و کمیت DNA استخراج شده مشخص‌ شد، كه اين نسبت در محدوده 2 - 8/1 براي DNA ایده‌آل مي‌باشد. سپس نمونه‌های DNA در غلظت 50 نانوگرم در میکرولیتر رقیق شد و در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. برای انجام واکنش PCR از بافر PCR در غلظت X10 که شامل KCL (mM500) و Tris-HCL (mM200) با 4/8 pH= می‌باشد و برای فعاليت از آنزيم Taq پليمراز استفاده شد. جهت بررسی صحت PCR محصول بدست آمده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد ران گردید.

پرایمرهای اختصاصی برای انجام PCR برای توالی ژن HVR1 ازmtDNA با استفاده از نرم افزارPrimer premier 5 (Premier Biosoft, USA) و ژنوم کامل میتوکندری بز اهلی (شماره دسترسی KR866125.1) صورت گرفت (جدول 1).

جدول 1: توالی های پرایمر و پروب مورد استفاده در واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

ژن	پرایمر	توالی (5'->3')
HVR1	Forward	ACTCCACAAGCCTACAGA
HVR1	Reverse	GGAAAGGTGGAGCGGATG

پس از الکترفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز و اطمینان از عدم وجود باند غیر اختصاصی، شکستگی و داشتن اندازه مورد نظر، نمونه‌ها جهت حدف قطعات کوچک DNA و پرایمر دایمر احتمالی تخلیص شدند. به این منظور از كيت خالص‌سازی NucleoSpin Extract II محصول شركت Macherey-Nagel MN آلمان که براي خالص‌سازی DNA از ژل آگارز TAE/TBE و محصولات مستقيم PCR طراحي شده است، استفاده شد.

20 میکرولیتر(400 نانوگرم) از محصولات PCR خالص‌سازی شده به همراه 20 میکرولیتر(30 پيكو مول) از هر یک از رشته‌های آغازگر رفت یا برگشت مورد استفاده در PCR به ازای هر نمونه در تیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری به طور جداگانه برای هر نمونه جهت توالی‌یابی به كره جنوبي فرستاده شد و با سرویس Value Read به طور اتوماتیک توالی‌یابی شد. جهت توالی‌یابی در دو رشته سمت َ5 به َ3 توسط پرایمر مستقیم از رشته پیش‌رو و توسط پرایمر معکوس از رشته پیرو است. به همین دلیل توالی‌های حاصل از پرایمر معکوس باید مکمل‌سازی شوند تا هر دو رشته به درستی زیر هم چیده شوند. توالی‌یابی به روش کاملا اتوماتیک انجام گرفت. در کل 30 نمونه توالی‌یابی گردید. توالی‌ها با 3 فرمت متفاوت (ab1, pdf, seq) و توسط پست الکترونیک از کره جنوبی دریافت گردید. کیفیت توالی‌یابی مناسب بود و موارد خوانش نشده تنها در ابتدای توالی که محل اتصال پرایمر است و معمولا به‌دلیل اتصال پرایمر خوانش نمی‌شود مشاهده شد.

توالی‌های به‌دست آمده با استفاده از برنامه Chromas Lite 2.01 تجزیه و تحلیل گردید. جهت تعیین بالاترین همولوژی توالی بز نجدي از رویه Blast تحت پایگاه NCBI استفاده شد. مقایسه توالی‌ها و هم‌ردیف کردن آن‌ها با استفاده از رویه ClastalW صورت گرفت. توالیConsensus برای بز نجدي با استفاده از برنامه نرم افزاري Bioedit تعیین شد و این توالی توسط برنامه Sequin پايگاه اطلاعاتي NCBI ثبت گرديد. جهت رسم نمودار فیلوژنی از روش Neighbor- joining نرم افزار MEGA5 استفاده شد و براي مقايسات فيلوژني توالي ناحيه HVR1، یک فیلوژنی با توالی بز نجدي با سایر نژادها در جهان برای تعیین گروه هاپلوتیپی رسم گردید.

نتایج

استخراج DNAاز خون در تمامی نمونه‌ها با موفقیت انجام شد. الکتروفورز تمام نمونه‌های استخراج شده بر روی ژل آگارز 1 درصد نشان دهنده باندهای کاملا شفاف و روشن، فاقد شکستگی و بدون کشیدگی در اثر آلودگی با نمک یا RNA بودند. هم‌چنین شفاف و متراکم بودن باندها بیانگر غلظت بالایDNA می‌باشد این امر نشان دهنده موفقیت این روش در استخراج DNA از خون کامل در بز نجدي می‌باشد (شکل 1).

شکل 1: نمونه‌های DNA استخراج شده بر روی ژل آگارز 1 درصد

همچنین نتایج نورسنجی با دستگاه اسپکتوفتومتری نانودراپ نشان داد که DNA استخراج شده از خون بز نجدي دارای کیفیت و کمیت مناسبی است.

توالی‌یابی به روش کاملا اتوماتیک انجام گرفت. در شکل 2، توالی‎های خوانش شده با فرمت ABI به صوت منحنی و قله‌های رنگی نشان داده شده است:

$C:\Documents and Settings\sedabadi.ASRI\Desktop\untitled.bmp$

شکل 2- بررسی صحت توالی‌یابی نمونه‌ها

به منظور توالی یابی، همه نمونه‌ها توسط رویه ClustalW نرم افزاز BioEdit هم‌ردیف شدند. همان‌طور که در بخشی از توالی‎های هم‌ردیف شده در شکل 3 مشاهده می‌شود پس از هم‌ردیف کردن نمونه‌ها قسمت‎های مشترک بین همه نمونه‌ها را با علامت " . " مشخص شدند و قسمت های متفاوت با نام نوکلئوتید در آن جایگاه مشخص تعیین گردیدند. نتایج نشان داد هم‌ریف شدن قطعات مورد آنالیز به خوبي صورت گرفته است و نمونه‎ها در سطح 100 درصد با هم هم‌پوشاني داشتند.

شکل3- توالی‌های هم‌ردیف شده برای تعیین جایگاه نوکلئوتیدهای متفاوت در نمونه‌ها

نتايج حاصل از هم‌ریف كردن توالی‌هاي ناحيه HVRI بز نجدي، كه گوياي نوکلئوتیدهای متفاوت در یک جایگاه مشخص برای تمام جایگاه‌های متفاوت پس از هم‌ردیف کردن نمونه‌ها است در جدول 2 آورده شده است.

جدول2- نوکلئوتیدهای متفاوت در بین نمونه‌های توالی‌یابی شده و تعیین هاپلوتیپ‌های مختلف ناحيه HVR1

هاپلوتايپ

فراواني از 30

موقعيت

189

247

324

346

366

387

409

411

415

422

424

442

447

458

492

473

486

591

668

876

همان‌طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود 5 هاپلوتیپ در بین 30 نمونه دیده می‌شود و در بين هاپلوتیپ‌ها 20 جايگاه SNPs وجود دارد.

به منظور تعیین توالیConsensus، نمونه‌های هم‌ردیف شده با استفاده از نرم افزار BioEdit و توالی Consensus به صورت شکل 4 با طول تقریبا 830 جفت باز به عنوان توالی شاخص برای این نژاد به‌دست آمد.

شکل 4- توالی Consensus شده براي ناحيه HVRI

آنالیزها به کمک روش Composition برنامه BioEdit نشان داد، این توالی براي ناحيه HVR1 شامل 268 نوکلئوتید A، 224 نوکلئوتید C، 143 نوکلئوتید G و 264 نوکلئوتید T می‌باشد. که نسبت C+G 2/39 درصد و A+T 64/56 درصد است و وزن مولکولی یک رشته از این توالی 285358 دالتون و وزن مولکولی دو رشته آن 567604 دالتون می‌باشد.

تعدادي توالی HVR1 ژنوم میتوکندریایی بز از کشورهای مختلف که با نواحی مورد مطالعه هم‌پوشانی داشتند از پایگاه NCBI دریافت و تحت رویه Clustal برنامه MEGA5 با توالی‌های به‌دست آمده در این مطالعه هم‌ردیف سازی شدند. مقایسه توالی HVR1 با توالی‌های موجود در پایگاه NCBI تحت فرآیند BLAST نشان داد، که طی این فرآیند فواصل ژنتیکی بین توالی گونه‌های مورد مطالعه كه به وسیله نرم افزارCLC Workbench 5 محاسبه گردید، به میزان 98% بیشترین هم‌پوشانی را داشته‎اند. درخت فواصل ژنتیکی در شکل 5 نشان داده شده است.

HVR NAJDI

شکل5- مقایسه توالی‌ Consensus به دست آمده براي ناحيه HVR1 با توالی‌های موجود در NCBI

بحث

لازمه تنوع ژنتیکی انجام برنامه اصلاح نژادی در حیوانات هر منطقه می‎باشد. در نتیجه حفاظت از تنوع ژنتیکی هر منطقه عامل کلیدی حفاظت از حیات گونه آن منطقه در طولانی مدت می‎باشد. همچنین بررسی وضعیت تکاملی جمعیت‎ها نیازمند شناخت صحیح ساختار ژنتیکی آن جمعیت‎ را دارد. از سوی دیگر شناسایی ساختار جمعیت‎ها در جهت توسعه برنامه‎های حفاظتی و مدیریت پایدار منابع ژنتیکی اهمیت دارد (19).

روحی پور و همکاران میزان تنوع هاپلوتیپی را در جمعت بزهای عدنی 57/0 برآورد کردند (16). در مطالعه‎ای دیگر شریعت و همکاران (17) میزان تنوع نوکلئوتیدی و تنوع هاپلوتیپی بر حسب جفت باز در جمعیت بزهای بومی ایران را به ترتیب 02929/0 و 1 گزارش کردند. که نتایج بدست آمده نشان دهنده میزان تنوع بسیار بالا و عدم وجود مناطق محافظت شده در ناحیه HVR1 می‎باشد (17). بررسی ساختار ژنتیکی بز خلخالی نشان داد که تعداد کل جهش 62، تعداد هاپلوتایپ 37، تنوع هاپلوتیپی 834/0 می‎باشد (10). نتايج بدست آمده از این مطالعه نشان داد که در ژنوم میتوکندری بز نجدي 5 هاپلوتیپ و 20 جايگاه چند شکل وجود دارد. از آنجایی که تعداد جایگاه‎های چند شکل وابسته به تعداد نمونه هستند، بنابراین در بعضی از مطالعات از پارامتر تنوع نوکلئوتیدی (π) یا هتروزیگوسیتی در سطح نوکلئوتید نیز استفاده شده است، که تحت تاثیر طول DNA و اندازه نمونه نیست. بر همین اساس تنوع نوکلئوتیدی 01427/0 درصدی حاصل شد که در محدوده متوسط تنوع نوکلئوتیدی در یوکاریوت‎ها که بین 002/0 تا 019/0 می‎باشد قرار گرفت (4). همچنين تنوع هاپلوتيپي بدست آمده در جمعيت مورد مطالعه 989/0 بدست آمد كه اين نتايج بيانگر تنوع ژنتيكي بالاي بز نجدي مي‎باشد.

تجزیه و تحلیل DNA میتوکندری در 443 بز هندی، 341 هاپلوتیپ متمایز متعلق به چهار هاپلوگروپ مادری A، B، C و D را نشان داد. هاپلوگروه A در 90 درصد بزها مشاهده شده است، همچنین شاخص‎های هاپلوتیپ و تنوع نوکلئوتیدی بزهای هندی به ترتیب 998/0 و 028/0 بود که نشان دهنده تنوع ژنتیکی فراوان است (5). با این حال، دقیق‎ترین تجزیه و تحلیل تنوع DNA میتوکندریایی بزها توسط نادری و همکاران انجام شده است. آن‎ها چشم انداز کاملی از تنوع ژنتیکی بز را در سراسر جهان ارائه کردند و 6 هاپلوگروپ میتوکندری (A، B، C، D، F و G) را در بزهای اهلی شناسایی کردند. همچنین 22 هاپلوتیپ را شناسایی کردند که نماینده این 6 هاپلوگروپ هستند و می توانند توسط محققان برای شناسایی هاپلوگروه‎های جدید یا طبقه بندی هاپلوتیپ‎های جدید بز به هاپلوگروه‎های موجود استفاده شوند (13). با مقایسه توالیD-Loop نژاد افشاری با توالی‎های مربوط به این شش گروه هاپلوتایپی به عنوان توالی‎های مرجع، و همچنین 5 توالي دیگر مربوط به ژنوم ميتوكندري نژادهای مختلف بز از سراسر جهان می‎توان موقعیت این نژاد در بین نژادهای دیگر را تعیین نمود و در نهایت برخی تغییرات در خصوصیات مورفولوژیکی نژادها را توجیه نمود. همانطور که در شکل 5 مشاهده می‎شود بز نجدي و بزهاي پاكستاني و چيني در يك گروه قرار دارند. در تحقيقات گذشته نيز بزهاي نژاد پاكستاني و هندي در هاپلوگروپ A قرار داشتند که این گزارش نیز می‎تواند قرار گرفتن بز نجدي در گروه هاپلوتایپی A را توجیه کند.

ارتباط تکاملی بین موجودات به وسیله درخت فیلوژنتیک نمایش داده می‌شود. از آن‌جا که تکامل در طول دوره‌های زمانی طولانی به طور مستقیم قابل مشاهده نیست، زیست‌شناسان بايد فیلوژنی‌ها را با استنباط روابط تکاملی میان جانداران امروزی بازسازی کنند. امروزه، داده‌های مولکولی، شامل پروتئین و رشته‌های DNA، برای تشخیص روابط تبارزایی و ساخت درخت‌های فیلوژنتیک استفاده می‌شوند. شریعت و همکاران نتایج حاصل از درخت فیلوژنی توالی نوکلئوتیدی ناحیه HVR1 در بز بومی ایران را به دو شاخه اصلی و تعداد 7 زیر شاخه فرعی معرفی نمودند (17). همچنین کریمی و همکاران براساس آنالیز فیلوژنی بزهای ایرانی عنوان کردند که این بزها به یکدیگر نزدیکی بیشتری دارند که این امر می‎تواند نشان دهنده دلیل منشاء مشترک یا جریان ژنی بالا بین این اکوتیپ‎ها با توجه به منطقه جغرافیایی محل زندگی آن‎ها باشد (10). در مطالعه حاضر درخت فیلوژنی توالی نوکلئوتیدی ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندری بز نجدي ثبت شده از 11 توالي در 6 گروه هاپلوتیپی از کشورهای مختلف موجود در پایگاه NCBI نشان داد که بزهای نجدي همگي از يك جمعيت منشأ گرفته‎اند و جز گروه هاپلوتیپی A می‎باشد.

نتیجه‌گیری

انتخاب توالی بخش‎هایی از ژن که توالی آن‎ها در بانک ژن موجود است و مقایسه توالی‎های به دست آمده با آن‏ها می‎تواند به اطلاعات ما درباره نژادهای بومی کمک کند و زمینه را برای استفاده بهتر از آن‎ها در برنامه‏های اصلاحی باز کند. با توجه به اینکه هیچ اطلاعاتی از توالی‎های مربوط به بز نجدي در بانک جهانی ژن وجود ندارد، با انجام این مطالعه بر روی ناحیه HVR1 ژنوم میتوکندری بز نجدي علاوه بر ثبت این توالی در بانک جهانی ژن، این نژاد به دیگر کشورها معرفی مي‎شود. در این مطالعه اطلاعاتي در مورد اين ناحيه از ژنوم ميتوكندري بدست آمد. درخت فيلوژنتيكي ترسيم شده براي نمونه‎ها نشان داد كه همگي از يك جمعيت منشأ گرفته‎اند و تعداد 5 هاپلوتیپ مختلف بر اساس 20 نوكلئوتيد چند شكل (SNP) براي ناحيه HVR1 تعیین گردید. همچنين توالي ناحيه HVR1 نمونه مورد بررسي با 11 توالي ثبت شده از 6 گروه هاپلوتیپی از کشورهای مختلف موجود در پایگاه NCBI مقايسه شد و نتیجه نشان داد که بز نجدي جز گروه هاپلوتیپی A می‎باشد.

منابع

1. Asadollahpour Nanaei, H., H. Kharrati-Koopaee and A. Esmailizadeh (2022). "Genetic diversity and signatures of selection for heat tolerance and immune response in Iranian native chickens." BMC genomics 23(1): 1-13.

2. Azizi, Z., M. A. Abbasi, A. Kazemi, B. Mohammad Nazari, A. Taheri and A. Hasani Bafarani (2021). "A review of the status of the native cattle and its conservation strategies in Iran." Agricultural Biotechnology Journal 12(4): 142-166.

3. Bashiri, A., H. A. Rooshanfekr and F. Salabi (2020). "The Genetic and Phylogenetic Analysis of the D-Loop Region in Mitochondrial Genome of Najdi Goat." Agricultural Biotechnology Journal 12(3): 45-66.

4. DeBenedictis, E. A., E. J. Chory, D. W. Gretton, B. Wang, S. Golas and K. M. Esvelt (2022). "Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery." Nature Methods 19(1): 55-64.

5. Diwedi, J., A. W. Singh, S. Ahlawat, R. Sharma, R. Arora, H. Sharma, K. Raja, N. Verma and M. Tantia (2020). "Comprehensive analysis of mitochondrial DNA based genetic diversity in Indian goats." Gene 756: 144910.

6. Gammage, P. A. and C. Frezza (2019). "Mitochondrial DNA: the overlooked oncogenome?" BMC biology 17(1): 1-10.

7. Hahn, A. and S. Zuryn (2019). "The cellular mitochondrial genome landscape in disease." Trends in Cell Biology 29(3): 227-240.

8. Hoda, A., Y. Biçoku and P. Dobi (2014). "Genetic diversity of Albanian goat breeds revealed by mtDNA sequence variation." Biotechnology & Biotechnological Equipment 28(1): 77-81.

9. Kamalakkannan, R., J. Jose, S. Thomas, V. R. Prabhu and M. Nagarajan (2018). "Genetic diversity and maternal lineages of south Indian goats." Molecular biology reports 45(6): 2741-2748.

10. Karimi, V., N. Hedayat Evrigh, R. Seyed Sharifi and N. S. . (2017). "Invetigation of genetic structure of Khalkhali goat using mitochondrial genome." Novin Genetic Journal 12(2): 217-227.

11. Li, L., A. Goel and X. Wang (2022). Novel paradigms of mitochondrial biology and function: potential clinical significance in the era of precision medicine, Springer: 1-5.

12. Mohammadpour, A. (2018). "Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism." Pharmaceutical and Biomedical Research 4(2): 28-32.

13. Naderi, S., H.-R. Rezaei, P. Taberlet, S. Zundel, S.-A. Rafat, H.-R. Naghash, M. A. El-Barody, O. Ertugrul, F. Pompanon and E. Consortium (2007). "Large-scale mitochondrial DNA analysis of the domestic goat reveals six haplogroups with high diversity." Plos one 2(10): e1012.

14. Nazari, M. and G. Mohamadi Ahvazi (2022). "Genetic and phylogenetic analysis of mitochondrial D-loop HVR I region in three breeds of native sheep Iran (Taleshi, Shal and Makui)." Veterinary Researches & Biological Products 35(1): 31-39.

15. Pakpahan, S., W. T. Artama, R. Widayanti and I. Suparta (2015). "Genetic variations and the origin of native Indonesian goat breeds based on mtDNA D-Loop sequences." Asian Journal of Animal Sciences 9(6): 34-50.

16. Rohipoor, M. and M. Nazari (2019). "Genetic and Phylogenetic Analysis of Adani Goat Population Based on Cytochrome B Gene." Research On Animal Production (Scientific and Research) 10(26): 84-89.

17. Shariat, M., G. R. Dashab and M. Vafaye Valleh (2019). "Comparison of Phylogenetic and Evolutionary of Nucleotide Squences of HVR1 region of Mitochondria genom in Goats and Other Livestock Species." Research On Animal Production (Scientific and Research) 10(23): 133-143.

18. Sharifi, R. S., S. S. Sofla and H. R. Seyedabadi (2018). "Genetic diversity and molecular phylogeny of iranian goats based on cytochrome oxidase I (COXI) gene sequences." Jurnal Veteriner 18(4): 565-570.

19. Yi, G., G. Ying, Y.-m. HE, B.-g. Yang, W.-y. Zhang, B.-e. Chen, Y.-f. Huang, Y.-j. Zhao, D.-p. Zhang and M.-x. Chu (2022). "Investigation of mitochondrial DNA genetic diversity and phylogeny of goats worldwide." Journal of Integrative Agriculture 21(6): 1830-1837.

مقالات مرتبط

اشتراک گذاری

آدرس مقاله

تجزیه و تحلیل مولکولی جمعيتي از بز نجدي با استفاده از توالی HVR1 ژنوم میتوکندری