مطالعه تاثیر محافظتی نارینژنین بر نفروپاتی پیشرس دیابتی در موشهای صحرایی دیابتیشده توسط آلوکسان
الموضوعات :
یوسف دوستار
1
,
رامین کفاشی الهی
2
,
داریوش مهاجری
3
1 - دانشیار گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2 - استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
3 - گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران
الکلمات المفتاحية: نارینژنین, دیابت, آلوکسان, نفروپاتی, موش صحرایی.,
ملخص المقالة :
دیابت شیرین یک ناهنجاری متابولیکی است که از میزان شیوع نسبتاً بالایی در سراسر دنیا برخوردار است. نارسایی کلیوی از عوارض اصلی بیماری دیابت محسوب میشود. روشهای درمانی زیادی از کل دنیا برای مداوای دیابت معرفی شده‌اند. هدف از مطالعه حاضر بررسی تاثیر حفاظتی نارینژنین بر آسیب پیشرس کلیوی در موشهای صحرایی دیابتیشده توسط آلوکسان بود. بدین منظور تعداد چهل سر موش صحرایی نر ویستار بهشکل تصادفی در چهار گروه برابر شامل گروههای شاهد سالم، سالم تیمار با نارینژنین، دیابتی و دیابتی تیمار با نارینژنین توزیع شدند. دیابت نیز توسط تزریق داخل صفاقی تک‌دز آلوکسان (mg/kg 120) ایجاد گردید. موشهای تیمار با نارینژنین (mg/kg50) دارو را از طریق گاواژ، روزانه و به مدت سه هفته دریافت کردند. در پایان، مقادیر سرمی شاخصهای عملکرد کلیه شامل اوره، اسید اوریک و کراتینین و همچنین میزان محصول پراکسیداسیون لیپیدی (مالوندیآلدئید) و فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در هموژنات کلیه موشها اندازهگیری شد. همچنین، هیستوپاتولوژی برای ارزیابی شدت درجات آسیب در کلیه انجام شد. تفاوت معنیدار بین گروهها با استفاده از آزمون تحلیل واریانس یکطرفه و پس‌آزمون توکی تعیین شد. معنی داری آماری 05/0p< در نظر گرفته شد. در موشهای دیابتیشده با آلوکسان، نارینژنین به طور معنیداری میزان اوره، اسید اوریک و کراتینین سرم را افزایش داد (05/0p<). همچنین، نارینژنین به طور معنیداری میزان پراکسیداسیون لیپیدی را در کلیه موشهای دیابتی کاهش و سطوح آنزیمهای آنتیاکسیدان را در آنها افزایش داد (05/0p<). یافتههای هیستوپاتولوژی کلیه نیز با یافتههای بیوشیمیایی در توافق بودند.
مطالعه تاثير محافظتي نارینژنین بر نفروپاتي پيشرس ديابتي در موشهاي صحرايي ديابتيشده توسط آلوكسان
چکیده
ديابت شیرین یک ناهنجاری متابوليكي است كه از میزان شيوع نسبتاً بالايي در سراسر دنیا برخوردار است. نارسایی کلیوی از عوارض اصلی بیماری دیابت محسوب میشود. روشهای درمانی زیادی از کل دنیا برای مداوای ديابت معرفی شده‌اند. هدف از مطالعه حاضر بررسی تاثیر حفاظتی نارینژنین بر آسیب پیشرس کلیوی در موشهای صحرایی دیابتیشده توسط آلوکسان بود. بدین منظور تعداد چهل سر موش صحرايي نر ویستار بهشکل تصادفي در چهار گروه برابر شامل گروههاي شاهد سالم، سالم تيمار با نارینژنین، ديابتي و ديابتي تيمار با نارینژنین توزیع شدند. دیابت نیز توسط تزریق داخل صفاقی تک‌دز آلوکسان (mg/kg 120) ایجاد گردید. موشهای تیمار با نارینژنین (mg/kg50) دارو را از طریق گاواژ، روزانه و به مدت سه هفته دریافت کردند. در پايان، مقادیر سرمی شاخصهای عملکرد کلیه شامل اوره، اسيد اوريك و كراتينين و همچنين میزان محصول پراكسيداسيون ليپيدي (مالونديآلدئيد) و فعاليت آنزیمهای سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتيون ردوكتاز در هموژنات کلیه موشها اندازهگیری شد. همچنین، هیستوپاتولوژی برای ارزیابی شدت درجات آسیب در کلیه انجام شد. تفاوت معنیدار بین گروهها با استفاده از آزمون تحلیل واریانس یکطرفه و پس‌آزمون توکی تعیین شد. معنی داری آماری 05/0p< در نظر گرفته شد. در موشهاي ديابتيشده با آلوكسان، نارینژنین به طور معنيداري ميزان اوره، اسيد اوريك و كراتينين سرم را افزايش داد (05/0p<). همچنين، نارینژنین بهطور معنيداري ميزان پراكسيداسيون ليپيدي را در کلیه موشهاي ديابتي كاهش و سطوح آنزيمهاي آنتي‌اكسيدان را در آنها افزايش داد (05/0p<). یافتههای هيستوپاتولوژي کلیه نيز با يافته‌هاي بيوشيميايي در توافق بودند. نتايج بررسي حاضر نشان داد كه نارینژنین با خاصیت آنتیاکسیدانی خود از بروز آسيبهاي زود هنگام ديابتي كليه ميابی‌تواند پيشگيري کند.
کلیدواژه‌ها: نارینژنین، دیابت، آلوکسان، نفروپاتی، موش صحرایی.
مقدمه
ديابت نوع دو شايعترين نوع ديابت بهشمار آمده و بهعنوان يك معضل و مشکل در بهداشت جهاني همچنان رو به افزايش است (Alberti and Zimmet, 1998). بيماري ديابت اختلالی مزمن در متابوليسم كربوهيدرات‌ها، چربي و پروتئين به شمار رفته و منجر به بالارفتن میزان قند خون ميشود كه متعاقباً باعث آسيبهاي شدید در عروق و بافت هاي مختلف بدن ميشود (Kesari et al., 2005). اگرچه پاتوژنز بیماری ديابت نوع دو دقیقاً مشخص نشده است، ولی مستندات موجود آشفتگی در سوخت و ساز گلوكز و چربي در اين میان موثر قلمداد شده است (McGarry, 1992). سندرم متابوليك، با تغييراتی در متابوليسم كربوهيدرات، چربي و پروتئين، ثانويه به عدم حضور يا ترشح كم انسولين و يا اختلال در عملکرد آن ایجاد گردیده و هيپرگليسمي نیز جزء لاينفك بيماري ديابت و شاخصی مهم در تشخيص و درمان آن، محسوب ميشود (Holman and Turner, 1991).
شواهد زيادي موجود هست که حاكي از نقش استرس اكسيداتيو و در پی آن توليد راديكالهاي آزاد در بدن مبتلایان به ديابت و دخالت اين عوامل در پاتوژنز این بیماری است (Cerielo et al., 1997; Kaneto et al., 2007; Butler et al., 2008). هيپرگليسمي از طریق افزايش توليد AGEs (Advanced glycation end products) باعث تسهيل در توليد گونههای فعال اکسیژن (Reactive oxygen species; ROS) از طريق اختلال در عملکرد زداينده‌هاي درونزاد رادیکالهای آزاد نظیر آنزیمهای سوپراكسيد دیسموتاز (Superoxide desmotase; SOD)، كاتالاز (Catalase; CAT) و کلوتاتیون پراکسیداز (Glutathione peroxidase; GPX) ميگردد (Kalia et al., 2004; Cameron et al., 2005; Jandeleit-Dahm et al., 2005). بنابراين، بيماري ديابت از طریق افزایش تولید رادیکالهای آزاد و القاء تنشهای اكسيداتيو باعث ایجاد آسیب در سلولها و بافتهای مختلف بدن میشود (Signorini et al., 2002). بدیهی است كه عوارض ناشی از ديابت توسط عوامل مختلف و متعددي ايجاد مي‌گردند و بنابراین، صرفاً از طريق كنترل افزایش قند خون قابل پيشگيري و درمان نيستند (Liu et al., 2008). هرچند که در مراحل ابتدای بيماري، آسیب سلولها و بافتها توسط ازدیاد قند خون ایجاد ميشود، اما پیشرفت آسیب به برقراری فزونی قند خون مرتبط نیست (Vestra and Fioretto, 2003). بنابراین، كنترل مقدار قند خون به تنهايي براي پیشگیری از عوارض ديابت كافي نيست.
سلول‌هاي سالم با مكانيسمهاي مختلف و متنوعي در مقابل آسیبهای ناشی از رادیکالهای آزاد از خود مراقبت مي‌كنند. آنزيمهاي سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و پارااُكسوناز در اين ميان نقش اساسي دارند. پارااُكسوناز يك استراز وابسته به یون كلسيم است كه در بافتهايي نظير كبد، كليه، روده و همچنين سرم وجود داشته و به نقش آن در ديابت نیز اشاره شده است. (Aviram et al., 1999; Tas et al., 2006; Rozenberg et al., 2008).
با توجه به نقش مهم راديكالهاي آزاد در پاتوژنز بیماری ديابت، يكي از زمینههای مورد بحث در درمان اين بيماري و کنترل عوارض ناشی از آن، اتخاذ تدابیری در جهت كاهش توليد راديكالهاي آزاد است (Butler et al., 2008). در اين مسیر، طی مطالعاتی اثر انواع آنتياكسيدانها در پيشگيري و يا كاهش آسیبهای وارده از طريق استرسهای اکسیداتیو ناشی از راديكالهاي آزاد مورد بررسي قرار گرفته است (El-Bassiouni et al., 2005; Peerapatdit et al., 2006). ميزان وقوع آسیب از نوع پراكسيداسيون ليپيدي در اجزای سلولی در اثر استرسهای اکسیداتیو، توسط مكانيسمهاي تدافعي مختلفی که شامل سيستم‌هاي پاکسازیکننده آنزيمی و غيرآنزيمی راديكالهاي آزاد هستند، كنترل ميگردد (Wohaieb and Godin, 1987). بنابراین، عواملی که بتوانند به هر طریق ممکن از آسیبهای اکسیداتیو سلولها جلوگیری کنند، مقاومت سلولها و بافتها را در برابر آسیب ناشی از رادیکالهای آزاد افزایش میدهند. كنترل بيماري ديابت در مبتلایان بدون وقوع هيچ‌گونه عارضه جانبي، هنوز مورد بحث محققین ميباشد و در این بین درخواست بيماران ديابتي براي استفاده از فرآوردههای با منشأ طبيعي و با خواص درمان ديابت همچنان رو به افزايش است، چرا كه داروی انسولين و سایر داروهای كاهنده قند خون داراي عوارض و اثرات جانبي ناخواسته فراوانی هستند (Kameswara Rao and Appa Rao, 2001). پيشرفتهاي قابل ملاحظهای در زمينه كنترل بیماری ديابت نوع دو توسط داروهاي سنتتیک بهدست آمده است، ولي سعی و تلاش براي دستیابی به عوامل طبيعي براي مقابله با عوارض ناشی از اين بيماري همچنان ادامه دارد. در این راستا شناسایی انواع جديد آنتياكسيدانها با منشأ گياهي بهطور جد مورد توجه محققين بوده است (Srivastava et al., 1993).
فلاوونوئیدها ترکیبات پلیفنلی با خصوصیات فارماکولوژیک متعدد بوده و به عنوان زداینده رادیکالهای آزاد عمل می‌کنند (Arul and Subramanian, 2013; Keser et al., 2013). بر اساس تفاوت در ساختار مولکولی این ترکیبات، شش گروه عمده از فلاوونوئیدها وجود دارد که شامل: فلاوونها (flavones)، فلاوونولها (flavonols)، ایزوفلاوونها (isoflavones)، فلاوانونها (flavanones)، کاتچینها (catechins) و آنتوسیانیدینها (anthocyanidins) هستند (Kinoshita et al., 2006). نارینژنین (Naringenin)، 7،5،4-تریهیدروکسی-تریهیدروکسیفلاوانون (4,5,7-trihydroxyflavanone) فلاوانونی هست که به مقدار زیاد در میوه خانواده مرکبات مثل گریپ فروت، نارنگی و پرتغال و همچنین گیلاس، گوجه فرنگی و کاکائو یافت میشود (Kawaii et al., 1999; Jain et al., 2011). بهطور طبیعی، این فلاوانون به فورم گلیکوزید تبدیل شده و جذب رودهای خود را ارتقاء میدهد (Haidari et al., 2009).
تحقیقات نشان دادهاند نارینژنین دارای خواص آنتیاکسیدانی، ضدالتهابی، ضدسرطانی و مراقبت از بافت عصبی میباشد (Miyake et al., 2003; Hirai et al., 2007; Choi and Ahn, 2008; Lee and Kim, 2010; Nalini et al., 2012). نارینژنین با سه گروه هیدروکسیل خود نسبت به سایر فلاوانونها توانایی و قدرت آنتیاکسیدانی بسیار بالایی دارد (Chiou and Xu, 2004; Pollard et al., 2006). مطالعات اثرات ضددیابتی (Ortiz-Andrade et al., 2008)، کاهندگی چربی خون (Mulvihill et al., 2009)، ضدسرطانی (Jong-Hwa et al., 2010)، ضدآتروژنی (Lisa et al., 1999)، ضدافسردگی (Zbarsky et al., 2005)، تعدیلکنندگی سیستم ایمنی (Lisa et al., 1999) و محاظتکنندگی از ژنوم (Oršolić et al., 2011) نارینژنین را نشان دادهاند.
مواد و روش‌ها
مطالعه پیشرو از نوع تجربي مداخلهگر آزمايشگاهي بوده و در سال 1401 در دانشکده دامپزشکی دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی تبریز انجام شد. در اين مطالعه كليه پروتكل‌هاي كار روي مدلهای حيوانات آزمايشگاهي و ملاحظات اخلاقي مورد تائيد كميته نظارت بر حقوق حيوانات آزمايشگاهي بود.
براي انجام اين مطالعه، تعداد 40 سر موش صحرايي نر نژاد ويستار با وزن تقريبي 20
200 گرم و سن 10 هفته از محل پرورش و نگهداري حيوانات آزمايشگاهي مركز تحقيقات دانشکده دامپزشکی دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی تبریز خريداري و بهطور تصادفي در 4 گروه سری شامل گروههاي: شاهد سالم، سالم تيمار با نارینژنین، ديابتي و ديابتي تيمار با نارینژنین توزيع شدند. شرايط تغذيه و نگهداري براي تمام گروهها يكسان در نظر گرفته شد. چرخه روشنايي/تاريكي به صورت 12 ساعته بود و دماي محیط در 212 درجه سلسیوس تنظیم گردید. جيره غذايي استاندارد (به شکل پلت) و آب بهطور آزادانه در دسترس حیوانات قرار گرفت. جهت تسريع در ايجاد نفروپاتي ديابتي، نفركتومي كليه راست در همه موشها با ايجاد بيهوشي از طريق تزريق داخل صفاقي پنتوباربيتال سديم (Alfasan, Netherland) به‌ميزان mg/kg 50 انجام شد (Anderson et al., 1992; Yong-Gui Wu et al., 2006). دو هفته پس از انجام نفركتومي، براي ديابتي‌كردن موشها، محلول تازه تهيه شده آلوكسان با دز mg/kg120 به‌صورت محلول در آب مقطر (5 درصد)، بعد از 15 ساعت پرهيز غذايي، از راه داخل صفاقي به موشهاي گروههاي ديابتي تزريق شد. موشهاي با میزان قند خون بیش از mg/dl240 به عنوان ديابتي مدّ نظر قرار گرفتند (Gupta et al., 2005). از كيت سنجش قند خون ساخت شرکت زيست شيمي نيز براي اندازهگیری مقدار گلوکز خون موشها استفاده شد. میزان انسولین پلاسما نیز بهوسیله کیت رادیوایمنواسی (Pharmacia, Uppsala, Sweden) و توسط کانتر بتاماتیک (Cronex, Dupont, France) مورد سنجش قرار گرفت. کیت مورد استفاده طبق بروشور حاوی انسولین انسانی به عنوان استاندارد و آنتیبادی نشاندار 125I انسولین انسانی میباشد که با انسولین موش صحرایی واکنش متقاطع دارد.
میزان و طریقه استفاده از نارینژنین بر اساس مطالعات آنادورای و همکاران در سالهای 2012 و 2013 تعیین گردید (Annadurai et al., 2012; Annadurai et al., 2013). موشهای گروههاي دریافتکننده نارینژنین، نارینژنین پودری (Sigma, USA) را با حل کردن در حلال دی‌متیل‌سولفوکسید، به میزان mg/kg 50، روزانه و به مدت سه هفته بهطور خوراکی از طریق گاواژ دریافت کردند. به موشهای گروههاي شاهد متناظر نيز سالین نرمال با حجم برابر تزریق شد. ساير شرايط نگهداري براي تمامي گروهها يكسان بود.
پس از سه هفته تیمار، به منظور اندازهگيري شاخصهای سرمی عملکرد کلیهها شامل اوره (Fawcett and Scott, 1960)، اسيد اوريك (Caraway, 1955) و كراتينين (Teitz, 1987)، نمونه خون از سینوس پشت کره چشم (retro-orbital plexus) توسط لولههای مویین (شیمیبیو، ایران) موشها اخذ گرديد. سرم خون توسط سانتريفيوژ با سرعت 2500 دور در دقيقه و به مدت 15 دقيقه در دماي 30 درجه سلسیوس جدا شد. هم‌زمان همه موشها با قطع سر (decapitation) آسانکُشی شدند. كليه چپ موشها سریعا خارج گردیده و قطعاتی از آنها جدا و پس از شستشو در سالين بسيار سرد، توزین و هموژنات 10 درصد در 15/1 درصد (w/v) كلرور پتاسيم تهيه شد. هموژنات با شتاب ×g7000 به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجه سلسیوس سانتريفيوژ شده و محلول شناور جهت سنجش ميزان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی اجزای سلولی (malondialdehyde; MDA) و اندازهگیری فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز (Superoxide dismutase; SOD)، کاتالاز (Catalase; CAT)، گلوتاتیون پراکسیداز (Glutathione peroxidase; GPX) و گلوتاتیون ردوکتاز (Glutathione reductase; GR) مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی مذکور و میزان MDA و پروتئین در محلول شناور با استفاده از کیتهای تجاری موجود (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) و طبق دستور شرکت سازنده کیت انجام شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول در میلیگرم پروتئین و فعالیت آنتیاکسیدانی به صورت واحدهای قراردادی در میلیگرم پروتئین عنوان گردید.
پراکسیداسیون چربی در کلیه با روش رنگسنجی به وسیله اندازهگیری TBARS (Thiobarbituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران در سال 1988 انجام شد (Fraga et al 1988). به طور خلاصه، 1/0 میلیلیتر هموژنات بافتی با 2 میلیلیتر راژین TBA-trichloroacetic acid—Hcl reagent (37 درصد TBA، 25/0 مول Hcl و 15 درصد TCA، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از 15 دقیقه حمام بخار، خنک گردیده و در g×3500 به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب محلول شناور شفاف در طول‌موج nm 535 در مقابل بلانک قرائت شد. مقادیر به صورت نانومول/100 گرم بافت بیان گردید.
فعاليت آنزیم سوپراكسيد دیسموتاز توسط روش نیشیکیمی و همکاران در سال 1972 اندازهگیری شد (Nishikimi et al., 1972). در حدود 5 ميكروگرم از پروتئينهاي تام هموژنات کلیوی با بافر پيروفسفات سديم، PMT (Phenazine methosulfate) و NBT (Nitro-blue Terazolium) مخلوط گرديد. واكنش با افزودن NADH (Nicotinamide-adenine dinucleotide) آغاز گرديد. مخلوط واكنش در دماي 30 درجه سلسیوس به مدت 90 ثانيه گرمخانهگذاري شده و با افزودن 1 ميليليتر اسيد استيك گلاسيال متوقف گرديد. شدت جذب مخلوط رنگزاي تشكيلشده در nm560 اندازه گيري شد. هر واحد از فعاليت سوپراكسيد دیسموتاز به صورت غلظت آنزيم مورد نياز براي ممانعت از توليد رنگ تا 50 درصد در 1 دقيقه، تحت شرايط مطالعه، تعيين گرديد.
فعاليت كاتالاز توسط روش کلایبورن در سال 1985 و براساس تجزيه پراكسيد هيدروژن در طول موج nm 240، مورد سنجش قرار گرفت (1985 Claiborne,). به‌طورخلاصه، مخلوط مورد سنجش متشكل از 95/1 ميليليتر بافرفسفات 05/0 مولار (7pH=)، 1 ميليليتر پراكسيد هيدروژن 019/0 مولار و 05/0 ميليليتر فسفات بافر 10 درصد در حجم نهايي 3 ميليليتر میباشد. تغييرات در جذب، در طول موج nm240 اندازهگيري گرديد. در نهايت نتيجه به شكل "فعاليت كاتالاز در دقيقه" محاسبه شد.
فعاليت گلوتاتيون پراكسيداز با استفاده از روش روتراک و همكاران در سال 1973 و بر اساس واكنش ذيل مورد سنجش قرار گرفت (et al., 1973 Rotruck).
H2O2 + 2GSH (گلوتاتيون احياء) → 2H2O + GSSG(گلوتاتيون اكسيد)
گلوتاتيون پراكسيداز، در هموژنات بافتي، گلوتاتيون را اكسيده كرده كه به طور هم زمان پراكسيد هيدروژن به آب احياء ميگردد. اين واكنش پس از 10 دقيقه توسط تري‌كلرواستيك اسيد متوقف و گلوتاتيون باقيمانده توسط محلول DTNB (Dithiobis nitrobenzoic acid) مجدداَ فعال گرديده و منجر به تشكيل تركيب رنگي ميگردد كه با اسپكتروفتومتر در nm 420 اندازهگيري ميشود. مخلوط واكنشگر متشكل از 2/0 ميليليتر EDTA (Ethylenediamine tetra-acetic acid) 8/0 میلیمولار، 1/0 ميليليتر آزيد سديم (Sodium azide) 10 میلیمولار، 1/0 ميليليتر پراكسيد هيدروژن 5/2 میلیمولار و 2/0 ميليليتر هموژنات بود كه در 37 درجه سلسیوس به مدت 10 دقيقه انكوبه گرديد. واكنش با افزودن 5/0 ميليليتر تري‌كلرواستيك اسيد 10 درصد متوقف و لولهها با 2000 دور در دقيقه به مدت 15 دقيقه سانتريفيوژ شدند. 3 ميلیليتر دي سديم هيدروژن 8/0 میلیمولار و 1/0 ميليليتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شده و بلافاصله رنگ حاصله در nm 420 اندازهگيري شد. فعاليت گلوتاتيون پراكسيداز به صورت ميكرومول گلوتاتيون اكسيد/دقيقه/ميلي گرم پروتئين بيان گرديد.
فعاليت گلوتاتيون ردوكتاز با استفاده از روش مهنداس و همكاران در سال 1984 بر اساس واكنش ذيل مورد سنجش قرار گرفت (et al., 1984 Mohandas).
NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH
در حضور گلوتاتيون ردوكتاز، گلوتاتيون اكسيد، احياء شده و هم زمان، NADPH به NADP+ اكسيده ميشود. فعاليت آنزيم در دمای اتاق توسط سنجش ميزان ناپديد شدن NADPH/ دقيقه در nm 340، با اسپكتروفتومتر اندازهگيري گرديد.
جهت ارزیابی و مقایسه شدت درجات آسیب در بافت کلیه موشها در گروههای مورد مطالعه، از كليه تمامي موشها نمونه‌هاي بافتي اخذ و در فرمالين بافري 10 درصد پايدار شدند. از نمونه‌هاي فوق با استفاده از شيوه‌هاي رايج پاساژ بافت و تهيه مقاطع هيستوپاتولوژي، برش‌هايي با ضخامت 5 ميكرون و با روش رنگآميزي هماتوكسيلين- ائوزين تهيه شد (Lee and Luna, 1988). بررسي مقاطع آسيب‌شناسي کلیه توسط يك مقياس نيمه كمّي (Semiquantitative scale) و به‌صورت دوسوكور جهت ارزيابي شدت آسيب گلومرولی-توبولي (Glomerulo-tubular) و ارتشاح بينابيني سلول‌هاي آماسي انجام گردید. شدت آسیب از صفر تا 4+ ( صفر نشانگر كليه طبيعي، 1+ نشانگر آسيب جزئي، 2+ نشانگر آسيب متوسط، 3+ نشانگر آسيب شديد و 4+ نشانگر آسيب در كل بافت كليه) درجه‌بندي شد. تمامی درجه‌‌بندي‌ها با بزرگنمايي 100× و در 5 ميدان ميکروسکوپي از هر برش، بهطور تصادفي انجام شد.
تحلیل آماری دادهها
داده‌هاي بهدست آمده کمی، به‌صورت mean±S.E.M ارائه و اختلاف معني‌دار بين گروهها توسط آزمون تحلیل واریانس یکطرفه (ANOVA) و آزمون تعقيبي توکی (Tukey) در سطح معنيداري 05/0p< توسط نرم‌افزار آماري SPSS مورد واکاوی قرار گرفت. داده های مربوط به آسیبشناسی بافتی دادها نیز توسط آزمون غیرپارامتری کروسکال والیس (the Kruskal wallis test) و آزمون تعقیبی یو من وایتنی (mann whitney U test) مورد تحلیل قرار گرفت. مقادیر p کوچکتر از 0/05 معنیدار تلقی شد.
یافتهها
نتایج تاثیر تیمار روزانه با نارینژنین با مقدار مصرف 50 میلیگرم بر کیلوگرم به مدت 3 هفته بر میزان قند خون موشهای مورد مطالعه در نمودار 1 ارائه شده است. نارینژنین اثر هیپوگلیسمیک معنیداری در موشهای سالم (05/0p<) و دیابتی (01/0p<) بعد از 3 هفته تیمار، ایجاد کرد.
نمودار 1- مقایسه تاثیر نارینژنین بر میزان قند خون در موشهای صحرایی مورد مطالعه (mean±SEM)
a,b: در مقایسه با گروه 1 (شاهد سالم)، c در مقایسه با گروه 3 (دیابتی) (05/0p<).
در موشهاي گروه دیابتی سطوح سرمی اوره، اسید اوریک و کراتینین در مقایسه با گروه شاهد سالم بهطور معنیداری (05/0p<) افزایش یافت. در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین، مقادیر افزایشیافته پارامترهای مذکور بهطور معنیدار (05/0p<) و تا حد نرمال کاهش یافت. در موشهای گروه سالم تیمار با نارینژنین، تغییر معنیداری در پارامترهای مذکور ایجاد نگردید (جدول 1).
در گروه دیابتی، فعالیت آنزيمهاي سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتيون ردوکتاز در مقايسه با گروه شاهد سالم، بهطور معنيداري (05/0p<) كاهش و ميزان TBARS بهعنوان مقياسي از پراكسيداسيون لیپیدی به طور معنيداري (05/0p<) افزايش یافت. در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین، نارینژنین بهطور معنيداري (05/0p<) مانع از افزایش TBARS و بهطور معنيداري (05/0p<) مانع از کاهش فعالیت آنزيمهاي سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتيون ردوکتاز در اثر دیابت شد. در موشهای گروه سالم تیمار با نارینژنین تغییر معنیداری در میزان پراکسیداسیون لیپیدی در سلولهای بافت کلیه و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی ایجاد نشد (جدول 2).
در گروههاي شاهد سالم و سالم تیمار با نارینژنین، بافت کلیه کاملاً طبیعی بود و تفاوت قابل ملاحظه‌اي از لحاظ آسیبشناسی بافتی بین آنها مشاهده نشد. تغييرات هيستوپاتولوژي كليه در موشهاي صحرايي ديابتي و ديابتي تیمار با نارینژنین در شکل 1 نشان داده شده است. در بافت كليه موشهاي گروه ديابتي، افزايش ضخامت غشاءهاي پايه گلومرولي و افزايش ماتريكس مزانژيال مشاهده شد. اتساع فضاي ادراري همراه با تجمع قطرات ريز هيالني پروتئيني (Hyaline proteinaceouse droplets) در آن، چسبندگي پرده‌هاي احشايي و جداري كپسول بومن (Synechiae) و هيپرسلولاريتي ملايم مزانژيال همرا با پرخوني و گاهي اوقات نكروز سلول‌هاي سنگفرشي پرده جداري كپسول بومن نيز قابل مشاهده بود. در لوله‌هاي ادراري تورم سلول‌هاي پوششي و افزايش ضخامت غشاء بازال توبولي نيز قابل توجه بود. كست‌هاي هيالن كه در برخي مواقع با انسداد و اتساع توبول‌ها همراه بودند، در داخل توبول‌ها قابل مشاهده بودند. مناطق پرخوني و خونريزي همراه با ادم و ارتشاح لنفوسيتي در بافت بينابيني كليه كاملاً مشخص بود. در گروه ديابتي تیمار با نارینژنین، نارینژنین بهطور قابل ملاحظه‌اي مانع از بروز آسيبهاي پاتولوژيك فوق در موشهاي ديابتي شد، به‌طوري‌كه در بافت کلیه آنها به‌جز پرخوني جزئي و تورم خفیف سلول‌هاي توبولي، آسيب قابل توجهي مشاهده نشد. شدت آسيب گلومرولی-توبولي (Glomerulo-tubular) و ارتشاح بينابيني سلول‌هاي آماسي و فيبروز بينابيني در جدول 3 بين گروههاي مورد مطالعه مقايسه گرديده است.
جدول 1- تاثير نارینژنین بر سطوح سرمی اوره، اسید اوریک و کراتینین در موشهای صحرايي سالم و دیابتی (mean±SEM)
گروه |
| فراسنجههای بیوشیمیایی |
|
اوره (mg/dl) | اسید اوریک (mg/dl) | اسید اوریک (mg/dl) | |
شاهد سالم | 41/0±52/28 | 90/0±19/1 | 09/0±06/1 |
سالم تیمار با نارینژنین | 54/0±40/27 | 12/0±23/1 | 13/0±09/1 |
دیابتی | *62/0±18/41 | *31/0±61/2 | *27/0±55/2 |
دیابتی تیمار با نارینژنین | 65/0±14/30 | 17/0±24/1 | 18/0±14/1 |
*: نشانگر اختلاف معني‌دار با گروه شاهد سالم (05/0p<).
جدول 2- تاثير نارینژنین بر فعاليت آنتي اكسيداتيوي کلیه در موشهای صحرايي سالم و دیابتی (mean±SEM)
فراسنجههای بیوشیمیایی | گروه | ||||
GR (U/mg protein) | GPX (U/mg protein) | CAT (U/mg protein) | SOD (U/mg protein) | TBARS (nmol/g protein) | |
15/8±12/114 | 54/1±80/25 | 19/5±55/51 | 50/0±59/9 | 31/1±26/20 | شاهد سالم |
52/6±16/108 | 82/1±33/27 | 31/5±53/53 | 37/0±18/10 | 26/1±18/18 | سالم تیمار با نارینژنین |
*84/4±13/75 | *63/0±21/16 | *80/2±33/25 | *18/0±47/5 | *65/1±50/45 | دیابتی |
72/5±86/99 | 23/1±81/24 | 97/4±51/48 | 29/0±70/8 | 14/1±06/23 | دیابتی تیمار با نارینژنین |
*: نشانگر اختلاف معني‌دار با گروه شاهد سالم (05/0p<).
جدول 3- مقایسه شدت آسیب توبولی-بینابینی و ارتشاح سلولهای آماسی و فیبروز بین گروههای مورد مطالعه (mean±SEM)
تغییرات پاتولوژیک | گروه | |
ارتشاح سلولهای التهابی و فیبروز | آسیب توبولی-بینابینی |
|
0/0±0/0 | 0/0±0/0 | شاهد سالم |
0/0±0/0 | 0/0±0/0 | سالم تیمار با نارینژنین |
*22/0±40/3 | *23/0±60/2 | دیابتی |
02/0±32/0 | 02/0±30/0 | دیابتی تیمار با نارینژنین |
*: نشانگر اختلاف معني‌دار با گروه شاهد سالم (05/0p<).
شکل 1- نماي ريز‌بيني از کلیه موشهای صحرايي مورد مطالعه (هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 400×). در نمای ریزبینی ساختار بافت کلیه در گروه شاهد سالم طبیعی میباشد (A). در گروه سالم تیمار با نارینژنین نیز تغییر پاتولوژیک خاصی مشاهده نمیشود (B). در گروه دیابتی در بافت کلیه افزايش قابل توجه در ضخامت غشاءهاي پايه گلومرولی و ماتريكس مزانژيال و چسبندگي پرده‌هاي احشايي و جداري كپسول بومن دیده میشود. اتساع فضاي ادراري همراه با تجمع مواد پروتئيني و واکوئولاسیون در سیتوپلاسم سلول‌هاي اپي‌تليال توبول‌ها مشخص میباشد. هيپرسلولاريتي مزانژيال همراه با پرخوني گلومرول و چسبندگي پرده‌هاي احشايي و جداري كپسول بومن توام با پرخونی و خونریزی خفیف بینابینی قابل مشاهده ميباشد. كستهای هيالن همراه با خونريزي در بافت بينابيني كليه مشخص ميباشد. نکروز سلولهای توبولی و ارتشاح تک هستهایها در بافت بينابيني كليه كاملاً مشخص میباشد (C). در گروه دیابتی تیمار با نارینژنین، نارینژنین از بروز تغییرات پاتولوژیک جلوگیری کرده، بافت کلیه تقریباً طبيعي بوده و به غیر از واکوئولاسیون خفیف سلولها تغيير پاتولوژيك خاصي در آن مشاهده نميشود (D).
بحث و نتیجهگیری
در بررسی حاضر مصرف نارینژنین به میزان mg/kg 50 و به مدت 3 هفته از راه خوراکی باعث کاهش قند خون در موشهای صحرایی سالم و دیابتی گردید. یافتههای بیوشیمیایی و هیستوپاتولوژی بررسی حاضر نیز حاکی از آسیب کلیه در موشهای صحرایی دیابتی میباشد. در اين مطالعه، القاء دیابت باعث افزايش معني‌دار مقادیر سرمي اوره، اسید اوریک و کراتینین و همچنین افزایش معنیدار میزان مالوندیآلدئید و کاهش معنیدار آنزيمهاي آنتياكسيداني سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتیون ردوکتاز بافت کلیه در مقايسه با گروه شاهد سالم شد. تغییرات معنیدار در مقادیر پارامترهای فوق نشان از آسیبهای کلیوی دارد (Burtis and Ashwood 1996). در این مطالعه، استفاده از نارینژنین بهطور معني‌داری مانع از افزايش مقادیر سرمي اوره، اسید اوریک و کراتینین در موشهای صحرایی دیابتی شد. همچنین مصرف نارینژنین مانع از افزایش میزان مالوندیآلدئید و كاهش سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز و گلوتاتیون ردوکتاز در اثر دیابت شد كه اين اثر ممكن است بهدلیل پاکسازی راديكال‌های آزاد توسط نارینژنین باشد كه منجر به حفظ و بقاء اين آنزيمها شده است. روی و همکاران ایشان در سال 2016 نشان دادند که نارینژنین با کاهش TGF-β1 و IL-1 از طریق تعدیل استرس اکسیداتیو، اختلال کلیوی موشهای صحرایی دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین را بهبود می بخشد که یافتههای ایشان با نتایج مطالعه حاضر در توافق میباشد (Roy et al., 2016). همچنین، طی مطالعهای که توسط خان و همکاران وی در سال 2022 انجام شده، اثرات محافظتی نارینژنین از نفروتوکسیسیتی ناشی از هیپرگلیسمی در موشهای صحرایی دیابتی به اثبات رسیده است که طبق اظهار نظر ایشان این تاثیر به دلیل ممانعت از استرس توری آندوپلاسمیک اتفاق افتاده است (Khan et al., 2022). یافته های یان و همکاران وی در سال 2016 نشان داد که نارینژنین با تنظیم سیگنال دهی let-7a/TGFBR1 (let-7a/transforming growth factor-β1 receptor 1) آسیب کلیه را در موشهای صحرایی دیابتی بهبود می بخشد (Yan et al., 2016).
در بررسی حاضر، افزایش میزان مالوندیآلدئید در بافت کلیه موشهای صحرایی دیابتی نشان میدهد که استرس اکسیداتیو ناشی از رادیکالهای آزاد، یکی از مکانیسمهای محتمل در پاتوژنز آسیب کلیوی دیابت میباشد. بهنظر ميرسد كه راديكالهاي آزاد باعث پراكسيداسيون ليپيدهاي غشايي و همچنين اسيدهاي چرب غيراشباع شبکه داخل سيتوپلاسمي گرديده كه منجر به تشكيل پراكسيدهاي ليپيدي (مالونديآلدئيد) و از دست رفتن سالم بودن غشاء سلولها و در نهايت آسيب کلیه شده است. افزايش ميزان مالونديآلدئيد در موشهاي ديابتي، نشاندهنده افزايش واكنشهاي پراكسيداسيوني استكه به ضعف مكانيسمهاي تدافعي آنتياكسيداني نيز منجر گرديده و بدين‌ترتيب ممانعت از توليد زیاد از حدّ راديكالهاي آزاد هم ممکن نخواهد بود (Naik, 2003). به عبارتي ديگر افزايش ميزان مالونديآلدئيد در کلیه حاكي از افزايش پراكسيداسيون ليپيدي است كه منجر به آسيب بافت کلیه و همچنين ناتواني مكانيسم تدافعي آنتياكسيداني در ممانعت از تشكيل بيرويه راديكالهاي آزاد ميگردد.
نقش استرس اکسیداتیو و مداخله گونههای فعال اکسیژن در پاتوژنز نفروپاتی دیابتی به اثبات رسیده است (Noyan, 2005). سوپراكسيد دیسموتاز، كاتالاز، گلوتاتيون پراكسيداز آنزيمهاي آنتي اكسيداني هستند كه سيستمی تدافعي را عليه گونههاي فعال اكسيژن تشكيل دادهاند (Lil, 1988). اين آنزيمها يكي از مهمترين عوامل در سيستم تدافعي آنتياكسيداني آنزيماتيك هستند. سوپراكسيد دیسموتاز آنيون سوپراكسيد را از طريق تبديل آن به پراكسيد هيدروژن زدوده و بدين ترتيب اثرات توكسيك آن را كاهش ميدهد (Curtis 1972). در بررسي حاضر، ميزان سوپراكسيد دیسموتاز در موشهاي دیابتی به دليل تشكيل فراوان آنيونهاي سوپراكسيد، بهطور معنيداري كاهش يافت که در پی آن فعاليت آنزيمهاي زداينده پراكسيد هيدروژن يعني كاتالاز و گلوتاتيون پراكسيداز نیز در اين موشها به طور معنيداري كاهش يافته بود. به نظر ميرسد كه غيرفعال شدن سوپراكسيد دیسموتاز توسط آنيونهاي افزايش يافته سوپراكسيد، منجر به غيرفعال شدن آنزيمهاي كاتالاز و گلوتاتيون پراكسيداز ميشود. كاتالاز آنزيم آنتياكسيداني است كه در بافتهاي حيواني به طور گستردهاي منتشر میشود و داراي بيشترين فعاليت در كبد و گلبولهاي قرمز است. كاتالاز، پراكسيد هيدروژن را تجزيه میکند و باعث محافظت بافتها از راديكالهاي بسيار فعال هيدروكسيل میشود (Chance, 1952). بنابراين، كاهش فعاليت كاتالاز ممكن است منجر به برخي اثرات مخرب ناشي از راديكال سوپراكسيد و پراكسيد هيدروژن گردد.
گلوتاتيون ردوكتاز يك آنزيم سيتوزولي كبدي است كه در كاهش گلوتاتيون اكسيد (GSSG)، بهعنوان محصول نهايي فعاليت گلوتاتيون پراكسيداز بر روي گلوتاتيون احياء (GSH)، دخيل ميباشد (Suresh and Vandana, 2008). متعاقب القاء ديابت در بررسی حاضر كاهش قابل توجهي در ميزان گلوتاتيون پراكسيداز حاصل گردید كه منجر به دسترسي گلوتاتيون ردوكتاز به سوبسترا شد كه بدين ترتيب فعاليت گلوتاتيون ردوكتاز كاهش یافت. مصرف نارینژنین در موشهاي ديابتي فعاليت گلوتاتيون ردوكتاز را مجدداَ برقرار نموده كه مصرفGSSG را جهت تشكيل گلوتاتيون احياء و افزايش سمزدايي متابوليتهاي فعال توسط كونژوگاسيون با گلوتاتيون احياء برقرار مي‌كند.
پر واضح است كه نفروپاتي ديابتي توسط فاكتورهاي متعددي ايجاد ميگردد و لذا تنها از طريق كنترل هيپرگليسمي و فشار خون قابل پيشگيري نيست (Liu et al., 2008). اگرچه در مراحل اوليه بيماري، تغييرات نفروپاتي ديابتي توسط هيپرگليسمي القاء ميشود، اما آسيبهاي بعدي به ابقاء هيپرگليسمي ارتباط ندارد (Vestra and Fioretto, 2003). از اينرو، كنترل گلوكز خون به تنهايي براي به‌تعويق انداختن روند نفروپاتي ديابتي كافي نيست. استرس‌هاي اكسيداتيو توأم با افزايش توليد ماتریکس خارج سلولی (Extra cellular matrix; ECM) نیز نقش اساسي در آسيبهاي پاتولوژيك كليوي دارند (Kalia et al., 2004; Cameron et al., 2005; Jandeleit-Dahm et al., 2005). در بررسي حاضر، كليه موشهاي ديابتي شده توسط آلوکسان، دچار آسيبهاي سلولي متعددي شده بودند كه اين آسيب‌ها احتمالاً با آسيب غشاءهاي سلولي همراه بوده است كه ممكن است در اثر استرس‌هاي اكسيداتيو ناشي از هيپرگليسمي ايجاد شده باشند.
استرس اكسيداتيو ناشي از آنيونهاي سوپراكسيد (Superoxide anions) در پاتوفيزيولوژي نفروپاتي ديابتي دخيل ميباشد (Vural et al., 2002). با تجويز نارینژنین به موشهاي ديابتي، تغییر پاتولوژیکی قابل توجهی در بافت کلیه مشاهده نشد كه اين خود اثرات محافظتي نارینژنین را در مقابل عوارض کلیوی ديابت نشان ميدهد. بنابراين، محافظت بافت كليه توسط نارینژنین در ديابت تجربي را علاوه بر اثرات هیپوگلیسمیک نارینژنین میتوان به اثرات آنتیاکسیدانی و کاهش استرسهای اکسیداتیو آن مربوط دانست.
آسيب مهم ديگري كه در كليه موشهاي ديابتي شده توسط آلوکسان در بررسي حاضر مشاهده شد، افزايش ضخامت غشا‌هاي پايه گلومرولي و ماتريكس مزانژيال بود. افزايش ماتريكس مزانژيال در نفروپاتي ديابتي، در ارتباط با تغييرات ماتريكس خارج سلولي ميباشد (Yamanea et al., 2004). مشخص شده است كه در بيماري ديابت، هيدروكسي‌پرولين كه از اجزاي ويژه كلاژن بافتي است، در كليه افزايش مي‌يابد (Liu et al., 2008). افزايش ماتريكس مزانژيال با افزايش سنتز كلاژن نوع 4 كه يكي از اجزاء ماتريكس خارج سلولي در كليه است، حاصل ميگردد (Kotajima et al., 2000). مشخص شده است كه MMPs (Matrix metalloproteinase) مسئول تجزيه و زوال ماتريكس خارج سلولي هستند و در اين ميان MMP2 و MMP9 بهطور اختصاصي مسئول تجزيه و نابودي كلاژن هستند (Midwood et al., 2004; Sottile, 2004). در نفروپاتي ديابتي فعاليت MMP2 و MMP9 كاهش مي‌يابد كه در نهايت به افزايش EMC منجر خواهد شد (Rysz et al., 2007). اين احتمال وجود دارد كه نارینژنین باعث بازگشت فعاليت MMP2 و MMP9 به حالت طبيعي گرديده كه مانع از افزايش ماتريكس مزانژيال و در نهايت اسكلروز گلومرولي و فيبروز كليه‌ها ميشود. در هر صورت، يافته‌هاي آسيب‌شناسي اين مطالعه در توافق با نشاني‌ها و شواهد، با نتايج بيوشيميايي بهدست آمده همخواني داشته و آنها را مورد تائيد قرار ميدهد.
نتايج بررسي حاضر اثرات فارماكولوژيكي نارینژنین را در مقابل عوارض کلیوی ديابت نشان ميدهد. بنابراين، پس از انجام كارآزمايي‌هاي شاهدار اتفاقی و حصول نتايج مثبت، نارینژنین مي‌تواند بهعنوان يك محصول دارویی گياهي جهت پيشگيري از آسيبهاي کلیوی ناشي از استرس اكسيداتيو موجود در بيماري ديابت، در مورد انسان نيز توصيه گردد. تعيين تاثير دزهاي مختلف نارینژنین و شناخت دقيق، مكان و مكانيسم يا مكانيسمهاي مولكولي و سلولي مؤثر در عملكرد فارماكولوژيكي آن نياز به مطالعات آتي دارد.
سپاسگزاری
از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تبریز جهت اجرای این مطالعه قدردانی میشود.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام می‌دارند که هیچ‌گونه تضاد منافعی ندارند.
منابع
· Alberti, K.G.M.M. & Zimmet, P.Z. (1998). Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation, Diabetes Medicine, 15(7): 539-553.
· Anderson, S., Rennke, H.G., Brenner, B.M., Zayas, M.A., Lafferty, H.M., Troy, J.L., et al. (1992). Nifedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats. Kidney International, 41(4): 891-897.
· Annadurai, T., Muralidharan, A.R., Joseph, T., Hsu, M.J., Thomas, P.A, & Geraldine P. (2012). Antihyperglycemic and antioxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. J Physiol Biochem, 68(3): 307-318.
· Annadurai, T., Thomas, P.A. & Geraldine, P. (2013). Ameliorative effect of naringenin on hyperglycemia-mediated inflammation in hepatic and pancreatic tissues of Wistar rats with streptozotocin- nicotinamide-induced experimental diabetes mellitus. Free Radical Research, 47(10): 793-803.
· Arul, D. & Subramanian, P. (2013). Inhibitory effect of naringenin (citrus flavonone) on N-nitrosodiethylamine induced hepatocarcinogenesis in rats. Biochemical and Biophysical Research Communications, 434(2): 203-209.
· Aviram, M., Rosenberg, M., Billecke, S., Erogul, J., Sorenson, R., Bisgaier, C.L., et al. (1999): Human serum paraoxonase (PON1) is inactivated by oxidized low-density lipoprotein and preserved by antioxidants. Free Radical Biology and Medicine, 26(7-8): 892-904.
· Bulter, R., Morris, A.D., Belch, J.J.E., Hill, A. & Struthers, A.D. (2000): allopurinol normalizes endothelial dysfunction in type 2 diabetes with mild hypertension. Hypertension, 35(3): 746-751.
· Burtis, C.A. & Ashwood, E.R. (1996). Enzymes, Teitz fundamentals of clinical chemistry. Philadelphia, USA: NB Saunders Company, pp: 4312-4335.
· Cameron, N.E., Gibson, T.M., Nangle, M.R. & Cotter, M.A. (2005): Inhibitors of advanced glycation end product formation and neurovascular dysfunction in experimental diabetes, Annual New York Academic Science, 1043(1): 784–792.
· Caraway, W.T. (1955). Determination of uric acid in serum by carbonate method, Am. J. Clin. Pathol, 25(7): 840–845.
· Cerielo, A., Motz, E., Cavarape, A., Lizzio, S., Russo, A., Quatararo, A., et al. (1997): Hyperglycemia counterbalances the antihypertensive effect of glutathione in diabetes patients: evidence linking hypertension and glycemia through the oxidative stress in diabetes mellitus, J. Diab. Compl, 11(4): 250-255.
· Chance, B., Greenstein, D.S. & Roughton, R.J.W. (1952). The mechanism of catalase action. 1. Steady-state analysis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 37(2): 301-321.
· Chiou GCY & Xu X. (2004). Effects of some natural flavonoids on retinal function recovery after ischemic insult in the rat. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 20(2): 107-113.
· Choi EJ & Ahn W S. (2008). Neuroprotective effects of chronic hesperetin administration in mice. Archives of Pharmacal Research, 31(11): 1457–1462.
· Claiborne, A. (1985). Catalase activityIn: Boca Raton FL, editor. CRC Handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, Boca Raton, P.283-284.
· Curtis, S.J., Mortiz, M. & Sondgrass, P.J. (1972). Serum enzyme derived from liver cell fraction and the response of carbon tetrachloride intoxication in rats. Gastroentrology, 62(1): 84-92.
· El-Bassiouni, E.A., Helmy, M.H. Abou Rawash, N. El-Zoghby, S.M., Kamel, M.A. & Abou Rayah, A.N. (2005): Embryopathy in experimental diabetic gestation: assessment of oxidative stress and antioxidant defense. Br. J. Biomed. Sci, 62(2): 71-76.
· Fawcett, J.K. & Scott, J.E. (1960). A rapid and precise method for the determination of urea, J. Clin. Pathol, 13(2): 156–159.
· Fraga C.G., Leibouitz B.E. & Toppel A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as TBARS in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes, Free Radical Biology & Medicine, pp: 155–161.
· Gupta, R.K., Kesari, A.N., Murthy, P.S., Chandra, R., Tandon, V. & Watal, G. (2005). Hypoglycemic and Antidiabetic Effect of Ethanolic Extract of Leaves of Annona squamosa L. in Experimental Animals. J. Ethnopharmacol, 99(1): 75-81.
· Haidari, F., Keshavarz, S.A., Rashidi, MR., & Shahi, M.M. (2009). Orange juice and hesperetin supplementation to hyperuricemic rats alter oxidative stress markers and xanthine oxidoreductase activity. Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 45(3): 285-291.
· Hirai, S., Kim, Y.I., Goto, T., Kang, MS., Yoshimura, M., Obata, A., et al. (2007). Inhibitory effect of naringenin chalcone on inflammatory changes in the interaction between adipocytes and macrophages. Life Sci, 81(16):1272-1279.
· Holman, R.R. & Turner, R.C. (1991): Oral agents and insulin in the treatment of NIDDM. In: Pickup, J. and Wiliams, G. Editors, Textbook of Diabetes, Blackwell, Oxford, pp: 467-469.
· Jain, A., Yadav, A., Bozhkov, A.I., Padalko, V.I. & Flora, S.J. (2011). Therapeutic efficacy of silymarin and naringenin in reducing arsenic-induced hepatic damage in young rats. Ecotoxicol Environ Saf, 74(4): 607–614.
· Jandeleit-Dahm, K.A., Lassila, M. & Allen, T.J. (2005): Advanced glycation end products in diabetes-associated atherosclerosis and renal disease: interventional studies, Annual New York Academic Science, 1043(1): 759-766.
· Jong-Hwa, P., Jin-Woo, L., Hyun-Dong, P., Ssang-Goo, C., Seung-Yeol, N., Yong-Sun, P., et al. (2010). Cytotoxic Effects of 7-O-Butyl Naringenin on Human Breast Cancer MCF-7 Cells. Food Sci Biotechnol, 19, pp: 717-724.
· Khan, M.F., Mathur, A., Pandey, V.K. and Kakkar, P. (2022). Naringenin alleviates hyperglycemia-induced renal toxicity by regulating activating transcription factor 4–C/EBP homologous protein mediated apoptosis. Journal of Cell Communication and Signaling, 16(2): 271-291.
· Kalia, K., Sharma, S. & Mistry, K. (2004): Non-enzymatic glycosylation of immunoglobulins in diabetic nephropathy, Clinical & Chemical Acta, 347(1-2): 169-176.
· Kameswara Rao, B. & Appa Rao, C.H. (2001). Hypoglycemic and antihyperglycemic activity of alternifolium (Wt.) Walp. Seed extracts in normal and diabetic rats, Phytomedicine, 8(2): 88–93.
· Kaneto, H., Katakami, N., Kawamori, D., Miyatsoka, T., Sakamoto, K., Matsuoka, T.A., et al. (2007): Involvement of oxidative stress in the pathogenesis of diabetes. Antioxide Redox Signal, 9(3): 355-366.
· Kawaii, S., Tomono, Y., Katase, E., Ogawa, & Yano, M. (1999). Quantitation of flavonoid constituents in Citrus fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(9): 3565-3571.
· Keser, S., Celik, S., & Turkoglu, S. (2013). Total phenolic contents and free-radical scavenging activities of grape (Vitis vinifera L.) and grape products. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 64(2): 210–216.
· Kinoshita, T., Lepp, Z., Kawai, Y., Terao, J. & Chuman, H. (2006). An integrated database of flavonoids. BioFactors, 26(3): 179–188.
· Kotajima, N., Kimura, T., Kanda, T., Obata, K., Kuwabara, A., Fukumura, Y. et al. (2000). Type IV collagen as an early marker for diabetic nephropathy in non-insulin-dependent diabetes mellitus. Journal of Diabetes and its Complications, 14(1): 13-17.
· Lee, J. & Kim, G. (2010). Evaluation of antioxidant and inhibitory activities for different subclasses flavonoids on enzymes for rheumatoid arthritis. Journal of Food Science, 75(7): 212–217.
· Lee, G. & Luna, H.T. (1988). Manual of histologic staining methods of the armed forces institute of pathology. 3rd ed. New York: Mc Graw-Hill Book Company, pp: 32-107.
· Lil, J.L., Stantman, F.W. & Lardy, H.A. (1988). Antioxidant enzyme systems in rat liver and skeletal muscle. Influences of selenium deficiency, chronic training, and acute exercise. Archives of Biochemistry and Biophysics, 263(1): 150-160.
· Lisa, J., Wilcox, M., Borradaile, W. (1999). Antiatherogenic Properties of Naringenin, a Citrus Flavonoid. Cardiovasc Drug Rev, 17(2):160–178.
· Liu, H.R., Tang, X.Y., Dai, D.Z. & Dai, Y. (2008): Ethanol extracts of Rehmannia complex (Di Huang) containing no Corni fructus improve early diabetic nephropathy by combining suppression on the ET-ROS axis with modulate hypoglycemic effect in rats. Journal of Ethnopharmacology, 118(3): 466-472.
· McGarry, J.D. (1992). What if Minkowski had been ageusic? An alternative angle on diabetes, Science, 258(5083): 766-770.
· Midwood, K.S., Williams, L.V. & Schwarzbauer, J.E. (2004). Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The international journal of biochemistry & cell biology, 36(6): 1031-1037.
· Miyake, Y., Minato, K. & Fukumoto, S. (2003). New potent antioxidative hydroxyflavanones produced with Aspergillus saitoi from flavanone glycoside in citrus fruit. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 67(7): 1443–1450.
· Mohandas, J., Marshall, J.J., Duggin, G.G., Horvath, J.S.L. & Tiller, D.G. (1984). Low activities of glutathione-related enzymes as factors in the genesis of urinary bladder cancer. Cancer Res, 44(11): 5086-5091.
· Mulvihill, E.E., Allister, E.M., Sutherland, B.G., Telford, D.E., Sawyez, C.G., Edwards, J.Y. et al. (2009). Naringenin prevents dyslipidemia, apolipoprotein B overproduction, and hyperinsulinemia in LDL receptor-null mice with diet-induced insulin resistance. Diabetes, 58(10): 2198–2210.
· Naik, S.R. (2003). Antioxidants and their role in biological functions: An overview. Indian Drugs, 40(9): 501-12.
· Nalini, N., Aranganathan, S. & Kabalimurthym J. (2012). Chemopreventive efficacy of hesperetin (citrus flavonone) against 1, 2-dimethylhydrazine-induced rat colon carcinogenesis. Toxicology Mechanisms and Methods, 22(5): 397–408.
· Nishikimi, M., Rao, NA. & Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulphate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun, 46(2):849-854.
· Noyan, T., Balaharoğlu, R. & Kömüroğlu, U. (2005). The oxidant and antioxidant effects of 25-hydroxyvitamin D3 in liver, kidney and heart tissues of diabetic rats. Clinical and experimental medicine, 5, pp: 31-36.
· Oršolić, N., Gajski, G., Garaj-Vrhovac, V., Dikić, D., Prskalo, Z.Š. & Sirovina, D. (2011). DNA-protective effects of quercetin or naringenin in alloxan-induced diabetic mice. Eur J Pharmacol, 656(1-3):110–118.
· Ortiz-Andrade, R.R., Sánchez-Salgado, J.C., Navarrete-Vázquez, G., Webster, S.P., Binnie, M., García-Jiménez, S., et al. (2008). Antidiabetic and toxicological evaluations of naringenin in normoglycaemic and NIDDM rat models and its implications on extra-pancreatic glucose regulation. Diabetes Obes Metab, 10(11):1097-1104.
· Peerapatdit, T., Patchanas, N., Likidlilid, A., Poldee, s. & Sriratanasathavorn, C. (2006): Plasma lipid peroxidation and antioxidant nutrients in type 2 diabetic patient. J. Med. Assoc. Thai, 89(5): 47-55.
· Pollard, S.E., Whiteman, M. & Spencer, J.P.E. (2006). Modulation of peroxynitrite-induced fibroblast injury by hesperetin: a role for intracellular scavenging and modulation of ERK signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications, 347(4): 916–923.
· Rahigude, A., Bhutada, P., Kaulaskar, S., Aswar, M. & Otari, K. (2012). Participation of antioxidant and cholinergic system in protective effect of naringenin against type-2 diabetes-induced memory dysfunction in rats. Neuroscience, 226, pp: 62–72.
· Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. & Hoekstra, W.G. (1973). Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179(4073): 588-90.
· Roy, S., Ahmed, F., Banerjee, S. and Saha, U. (2016). Naringenin ameliorates streptozotocin-induced diabetic rat renal impairment by downregulation of TGF-β1 and IL-1 via modulation of oxidative stress correlates with decreased apoptotic events. Pharmaceutical Biology, 54(9): 1616-1627.
· Rozenberg, O., Shiner, M., Aviram, M. and Hayek, T. (2008): Paraoxonase 1 (PON1) attenuates diabetes development in mice through its antioxidative properties, Free Radic. Biol. Med, 44(11): 1951-1959.
· Rysz, J., Banach, M., Stolarek, R.A., Pasnik, J., Cialkowska-Rysz, A., Koktysz, R., et al. (2007). Serum matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and metalloproteinase tissue inhibitors TIMP-1 and TIMP-2 in diabetic nephropathy. Journal of nephrology, 20(4): 444-452.
· Signorini, A.M., Fondelli, C., Renzoni, E., Puccetti, C., Gragnoli, G. & Giorgi, G. (2002). Antioxidant effect of gliclazide, glibenclamide and metformin in patients with type 2 diabetes mellitus, Current Therapeutic Research, 63(7): 411-420.
· Sottile, J. (2004). Regulation of angiogenesis by extracellular matrix. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer, 1654(1): 13-22.
· Srivastava, Y., Bhat, H.V., Verma, Y. & Venkaidh, K. (1993). Antidiabetic and adaptogenic properties of Momordica charantia extract: an experimental and clinical evaluation, Phytotherapy Research, 7(4): 285-288.
· Suresh, R.N. & Vandana, S.P. (2008). Hepatoprotective effect of Ginkgoselect Phytosome® in rifampicin induced liver injurym in rats: Evidence of antioxidant activity. Fititerapia, 79(6): 439-445.
· Tas, S., Sarandol, E., Ziyanok-Ayvalik, S., Ocak, N., Serdar, Z. & Dirican, M. (2006): Vanadyl sulphate treatment improves oxidative stress and increases serum paraoxonase activity in streptozotocin-induced diabetic rats. Nutr. Res, 26(12): 670-676.
· Teitz, N.W. (1987). Fundamentals of Clinical Chemistry. Philadelphia: NB Saunders Company, pp: 638.
· Vestra, M.D. & Fioretto, P. (2003): Diabetic nephropathy: renal structural studies in type 1 and type 2 diabetic patients, Internatrional Congress Series, 1253: 163-169.
· Vural, P., Cevik, A., Curgunlu, A. & Canbaz, M. (2002): Effects of diabetes mellitus and acute hypertension on plasma nitricoxide and endothelin concentrations in rats, Clinical & Chemical Acta, 320(1-2): 43–47.
· Wohaieb, S.A. & Godin, D.V. (1987). Alterations in free radical tissue defense mechanism in STZ induced diabetes in rat, effects of insulin treatment, Diabetes, 36(9): 1014–1018.
· Yamanea, T., Maedaa, T., Yamamotoc, Y., Nishic, K., Asanof, M., Shirahama-Nodaf, K., et al. (2007). Legumain/asparaginyl endopeptidase controls extracellular matrix remodeling through the degradation of fibronectin in mouse renal proximal tubular cells. FEBS Letters, 581(7): 1417-1424.
· Yan, N., Wen, L., Peng, R., Li, H., Liu, H., Peng, H., et al. (2016). Naringenin ameliorated kidney injury through Let-7a/TGFBR1 signaling in diabetic nephropathy. Journal of Diabetes Research, Article ID: 8738760 .
· Yong-Gui, W.u., Hui Lin, Xiang-Ming. Q.i., Guo-Zhong, W.u., Hao Qian, Min Zhao, Ji-jia Shen. & Shan-Tan, Lin. (2006). Prevention of early renal injury by mycophenolate mofetil and its mechanism in experimental diabetes. International Immunopharmacology; 6(3): 445-453.
· Zbarsky, V., Datla, K.P., Parkar, S., Rai, D.K., Aruoma, O.I. & Dexter, D.T. (2005). Neuroprotective properties of the natural phenolic antioxidants curcumin and naringenin but not quercetin and fisetin in a 6-OHDA model of Parkinson’s disease. Free Radical Research, 39(10): 1119-1125.
Protective effect of Naringenin (Citrus flavonone) on incipient diabetic nephropathy in the rats with alloxan-induced diabetes
Abstract
Diabetes mellitus is a metabolic abnormality that has a relatively high prevalence all over the world. Kidney failure is one of the main complications of diabetes. Many therapeutic methods have been introduced from all over the world to treat diabetes. The aim of the present study was to assess the protective effect of Naringenin on early kidney injuries in alloxan-induced diabetic rats. Forty male Wistar rats were randomly allocated into 4 equal groups, including: healthy control, normal healthy receiving Naringenin, diabetic and diabetic receiving Naringenin. Diabetes was also induced by intraperitoneal injection of a single dose of naloxone (120 mg/kg). Naringenin treatment groups received the drug (50 mg/kg) daily for 3 weeks through the gavage. Finally, serum levels of kidney function markers including urea, uric acid and creatinine as well as amount of lipid peroxidation product (MDA) and activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) and glutathione reductase (GR) were assessed in kidney hemogenates. Moreover, histopathological observation was assayed at the degree of renal injury. Significant differences among the groups were determined by one-way analysis of variance followed by Tukey post-test. Statistical significance was considered at p<0.05. In alloxanized diabetic rats, Naringenin significantly decreased the levels of serum urea, uric acid and creatinine (p<0.05), and significantly decreased the lipid peroxidation and elevated the levels of antioxidant enzymes in these rats (p<0.05). Histopathological changes were in agreement with biochemical findings. The results of the present study showed that naringenin with its antioxidant properties can prevent early diabetic kidney damage.
Conflict of interest: None declared.
Keywords: Alloxan, Diabetes, Naringenin Citrus flavonone, Nephropathy, Rat.
