طراحی و بهینه سازی برون تنی پروتئین Loa22 در سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا جهت استفاده در واکسن نوترکیب

الموضوعات :

مهدی قره‌خانی ¹ , محمد فائزی قاسمی ² , پژواک خاکی ³ , مجید اسمعیلی زاد ⁴ , مجید تبیانیان ⁵

1 - دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان، ایران
2 - دانشیار، گروه میکروبیولوژی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان، ایران
3 - دانشیار، بخش میکروب‌شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران
4 - دانشیار، بخش تحقیق و توسعه، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران
5 - دانشیار، بخش ایمونولوژی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران

تاريخ الإرسال : 01 الأربعاء , جمادى الأولى, 1445 تاريخ التأكيد : 16 الإثنين , شوال, 1446 تاريخ الإصدار : 08 الإثنين , رمضان, 1445

الکلمات المفتاحية: لپتوسپیروز, لپتوسپیرا, پروتئین Loa22, بیوانفورماتیک, ایمونوانفورماتیک,

ملخص المقالة :

لپتوسپیروز که توسط گونه‌های بیماری‌زای لپتوسپیرا ایجاد می‌شود، یک بیماری مشترک بین انسان و دام است که پیامدهای بهداشت عمومی قابل توجهی دارد. توسعه یک واکسن نوترکیب موثر علیه لپتوسپیروز به دلیل ماهیت پیچیده پاتوژن و پروتئین‌های غشاء خارجی آن (OMPs) کماکان بصورت یک چالش باقی مانده است. پروتئین غشاء خارجی Loa22 به دلیل خواص ایمنی‌زایی آن به عنوان یک واکسن بالقوه مطرح شده است. هدف این مطالعه بررسی کاربرد بیوانفورماتیک و ایمونوانفورماتیک در مطالعه پروتئین Loa22، توضیح ویژگی‌های ساختاری و عملکردی آن، و ارزیابی پتانسیل آن به عنوان یک واکسن کاندید برای لپتوسپیروز است.

بر اساس یافته‌های این تحقیق، با همترازی چند توالی، پروتئین Loa22  در سویه‌های مختلف لپتوسپیراهای بیماریزا، بین100-98 درصد همگرایی نشان داد. ارزیابی ویژگی‌های مختلف این پروتئین، آن را یک آنتی‌ژن ایمنی‌زا، غیر‌توکسیک و غیر‌حساسیت‌زا نشان داد که می تواند پاسخ‌ ایمنی قابل توجهی را در برابر عفونت لپتوسپیرا القاء کند. همچنین بر اساس پیش‌بینی‌ها، نشان داده شد که پروتئینLoa22   ساختاری پایدار، محلول و دارای نواحی آنتی‌ژنی منطبق با اپی‌توپ های سلول T و B دارد که در تمام ایزوله ها حفاطت شده است و می تواند بعنوان واکسنی نوترکیب  و یا با استفاده از اپی‌توپ‌های ایمونوژن آن در ترکیب با اپی‌توپ‌های ایمونوژن سایر پروتئین‌های حفاظت شده غشاء خارجی لپتوسپیرا در طراحی واکسنی مولتی اپی‌توپ در نظر گرفته شود.

المصادر:

Adler, B. (2015). Vaccines against leptospirosis. Leptospira and leptospirosis, 251-272. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-45059-8_10
Adler, B. & Faine, S. (1977). Host immunological mechanisms in the resistance of mice to leptospiral infections. Infect Immun, 17, 67-72. https://doi.org/10.1128/iai.17.1.67-72.1977
Balamurugan, V., Thirumalesh, S., Alamuri, A., SowjanyaKumari, S., Vinod Kumar, K., Linshamol, L., et al. (2021). Evaluation of the diagnostic potential of recombinant leptospiral OMP A‐like protein (Loa22) and transmembrane (OmpL37) protein in latex agglutination test for serodiagnosis of leptospirosis in animals. Lett Appl Microbiol, 72, 730-740. https://doi.org/10.1111/lam.13461
Cerqueira, G. M., Souza, N. M., Araújo, E. R., Barros, A. T., Morais, Z. M., Vasconcellos, S. A., et al. (2011). Development of transcriptional fusions to assess Leptospira interrogans promoter activity. PLoS One, 6, e17409. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017409
Clark, D. P. & Pazdernik, N. J. (2016). Recombinant Proteins. Biotechnology. Second Edition ed. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-385015-7.00001-6
Clifford, J. N., Høie, M. H., Deleuran, S., Peters, B., Nielsen, M. & Marcatili, P. (2022). BepiPred‐3.0: Improved B‐cell epitope prediction using protein language models. Protein Science, 31, e4497. https://doi.org/10.1002/pro.4497
Dellagostin, O. A., Grassmann, A. A., Rizzi, C., Schuch, R. A., Jorge, S., Oliveira, T. L., et al. (2017). Reverse vaccinology: an approach for identifying leptospiral vaccine candidates. Int J Mol Sci, 18, 158. https://doi.org/10.3390/ijms18010158
Dhayabaran, V., Chidambaram, D. & Krishnaswamy, P. R. (2020). Identification of compounds for improved growth of Leptospira in culture and isolation. Diagn Microbiol Infect Dis, 96, 114923. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2019.114923
Dong, H., Hu, Y., Xue, F., Sun, D., Ojcius, D. M., Mao, Y., et al. (2008). Characterization of the ompL1 gene of pathogenic Leptospira species in China and cross-immunogenicity of the OmpL1 protein. BMC Microbiol, 8, 1-12. https://doi.org/10.1186/1471-2180-8-223
Fraser, T. & Brown, P. D. (2017). Temperature and Oxidative Stress as Triggers for Virulence Gene Expression in Pathogenic Leptospira spp. Front Microbiol, 8, 783. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00783
Gharakhani, M., Ghasemi, M. F., Khaki, P., Esmaelizad, M. & Tebianian, M. (2022). Improvement the Expression and Purification of Loa22: A Lipoprotein with OmpA domain from Pathogenic Leptospira Serovars. https://doi.org/10.18502/ijm.v15i5.13873
Grassmann, A. A., Souza, J. D. & McBride, A. J. A. (2017). A universal vaccine against leptospirosis: are we going in the right direction? Front Immunol, 8, 256. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00256
Haake, D. A. & Matsunaga, J. (2010). Leptospira: a spirochaete with a hybrid outer membrane. Molecular microbiology, 77, 805-814. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07262.x
Haake, D. A. & Zückert, W. R. (2015). The leptospiral outer membrane. Leptospira and Leptospirosis, 187-221. https://doi.org/10.1007/978-3-662-45059-8_8
Hallgren, J., Tsirigos, K. D., Pedersen, M. D., Almagro Armenteros, J. J., Marcatili, P., Nielsen, H., et al. (2022). DeepTMHMM predicts alpha and beta transmembrane proteins using deep neural networks. BioRxiv, 2022.04. 08.487609. https://doi.org/10.1101/2022.04.08.487609
Hidalgo, J., Rodriguez-Vega, G. M. & Arriaga, P. (2020). Leptospirosis. Evidence-Based Critical Care: A Case Study Approach. Cham: Springer International Publishing. 10.1007/978-3-030-26710-0_66
Hsu, S.H., Chang, M.Y., Lin, S.M., Ko, Y.-C., Chou, L.-F., Tian, Y.-C., et al. (2021). Peptidoglycan mediates Leptospira outer membrane protein Loa22 to toll-like receptor 2 for inflammatory interaction: a novel innate immune recognition. Scientific reports, 11, 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-79662-8
Hsu, S.H. & Yang, C.W. (2022). Insight into the structure, functions, and dynamics of the leptospira outer membrane proteins with the pathogenicity. Membranes, 12, 300. https://doi.org/10.3390/membranes12030300
Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., et al. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature, 596, 583-589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2
Kaur, D., Verma, R., Kumar, B., Deka, D. & Agrawal, R. K. (2014). Cloning, Phylogenetic Analysis and Expression of Recombinant LipL41, Loa22 and LipL21 Proteins from Leptospira interrogans. Int J Environ Agric Biotechnol, 7, 409-420. http://dx.doi.org/10.5958/2230-732X.2014.01345.X
Koizumi, N. & Watanabe, H. (2003). Molecular cloning and characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain. FEMS Microbiol Lett, 226, 215-219. https://doi.org/10.1016/S0378-1097(03)00619-0
Lin, M.H., Chang, Y.C., Hsiao, C.D., Huang, S.-H., Wang, M.-S., Ko, Y.-C., et al. (2013). LipL41, a hemin binding protein from Leptospira santarosai serovar Shermani. PLoS One, 8, e83246. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083246
Lin, X. a., Xiao, G., Luo, D., Kong, L., Chen, X., Sun, D., et al. (2016). Chimeric epitope vaccine against Leptospira interrogans infection and induced specific immunity in guinea pigs. BMC Microbiol, 16, 1-9. https://doi.org/10.1186/s12866-016-0852-y
Mohammadi, Y. M., Khaki, P., Bidhendi, S. M. & Nofeli, M. (2022). Evaluation of the Presence of Gene Encoding Loa22 in Pathogenic Leptospira Serovars. Iran J Med Microbiol, 16(5), 392-398. http://dx.doi.org/10.30699/ijmm.16.5.392
Monaris, D., Sbrogio-Almeida, M., Dib, C., Canhamero, T., Souza, G., Vasconcellos, S., et al. (2015). Protective immunity and reduced renal colonization induced by vaccines containing recombinant Leptospira interrogans outer membrane proteins and flagellin adjuvant. Clin Vaccine Immunol, 22, 965-973. https://doi.org/10.1128/CVI.00285-15
Nazifi, N., Mousavi, S. M., Moradi, S., Jaydari, A., Jahandar, M. H. & Forouharmehr, A. (2018). In Silico B Cell and T Cell epitopes evaluation of lipL32 and OmpL1 proteins for designing a recombinant multi-epitope vaccine against leptospirosis. International Journal of Infection, 5. https://doi.org/10.5812/iji.63255
Raja, V. & Natarajaseenivasan, K. (2015). Pathogenic, diagnostic and vaccine potential of leptospiral outer membrane proteins (OMPs). Crit Rev Microbiol, 41, 1-17. https://doi.org/10.3109/1040841X.2013.787387
Ristow, P., Bourhy, P., McBride, F. W. d. C., Figueira, C. P., Huerre, M., Ave, P., et al. (2007). The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog, 3, e97. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0030097
Victor, A. A. R., Abraham, S., Tennyson, J. & Pradhan, N. (2015). In silico prediction and threading based epitope mapping of OmpA-like outer membrane Leptospiral Lipoprotein Loa22. Int J Sci Eng Res, 6, 477-485.
Yan, W., Faisal, S. M., McDonough, S. P., Chang, C.-F., Pan, M.-J., Akey, B., et al. (2010). Identification and characterization of OmpA-like proteins as novel vaccine candidates for Leptospirosis. Vaccine, 28, 2277-2283. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.12.071
Zhang, Y., Bao, L., Zhu, H., Huang, B. & Zhang, H. (2010). OmpA-like protein Loa22 from Leptospira interrogans serovar Lai is cytotoxic to cultured rat renal cells and promotes inflammatory responses. Acta Biochim Biophys Sin, 42, 70-79. https://doi.org/10.1093/abbs/gmp109

نص كامل:



 

 

 

نشریه میکروبیولوژی‌ دامپزشکی دوره نوزدهم، شماره دوم،پاییز و زمستان 1402،  پیاپی 47: 130-114

 

 

 

 

مقاله پژوهشی

طراحی و بهینه سازی برون تنی پروتئین Loa22 در سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا جهت استفاده در واکسن نوترکیب

مهدی قره‌خانی1، محمد فائزی قاسمی2 پژواک خاکی3*، مجید اسمعیلی زاد4، مجید تبیانیان5

1- دانشجوی دکتری، گروه میکروبیولوژی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان، ایران

2- دانشیار، گروه میکروبیولوژی، واحد لاهیجان، دانشگاه آزاد اسلامی، لاهیجان، ایران

3- دانشیار، بخش میکروب‌شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران

4- دانشیار، بخش تحقیق و توسعه، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران

5- دانشیار، بخش ایمونولوژی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران

                    تاریخ دریافت:24/08/1402 تاریخ پذیرش:25/01/1404 

چکیده

لپتوسپیروز که توسط گونه‌های بیماری‌زای لپتوسپیرا ایجاد می‌شود، یک بیماری مشترک بین انسان و دام است که پیامدهای بهداشت عمومی قابل توجهی دارد. توسعه یک واکسن نوترکیب موثر علیه لپتوسپیروز به دلیل ماهیت پیچیده پاتوژن و پروتئین‌های غشاء خارجی آن (OMPs) کماکان بصورت یک چالش باقی مانده است. پروتئین غشاء خارجی Loa22 به دلیل خواص ایمنی‌زایی آن به عنوان یک واکسن بالقوه مطرح شده است. هدف این مطالعه بررسی کاربرد بیوانفورماتیک و ایمونوانفورماتیک در مطالعه پروتئین Loa22، توضیح ویژگی‌های ساختاری و عملکردی آن، و ارزیابی پتانسیل آن به عنوان یک واکسن کاندید برای لپتوسپیروز است.

بر اساس یافته‌های این تحقیق، با همترازی چند توالی، پروتئین Loa22  در سویه‌های مختلف لپتوسپیراهای بیماریزا، بین100-98 درصد همگرایی نشان داد. ارزیابی ویژگی‌های مختلف این پروتئین، آن را یک آنتی‌ژن ایمنی‌زا، غیر‌توکسیک و غیر‌حساسیت‌زا نشان داد که می تواند پاسخ‌ ایمنی قابل توجهی را در برابر عفونت لپتوسپیرا القاء کند. همچنین بر اساس پیش‌بینی‌ها، نشان داده شد که پروتئینLoa22   ساختاری پایدار، محلول و دارای نواحی آنتی‌ژنی منطبق با اپی‌توپ های سلول T و B دارد که در تمام ایزوله ها حفاطت شده است و می تواند بعنوان واکسنی نوترکیب  و یا با استفاده از اپی‌توپ‌های ایمونوژن آن در ترکیب با اپی‌توپ‌های ایمونوژن سایر پروتئین‌های حفاظت شده غشاء خارجی لپتوسپیرا در طراحی واکسنی مولتی اپی‌توپ در نظر گرفته شود.

کلمات کلیدی: لپتوسپیروز، لپتوسپیرا،  پروتئین Loa22، بیوانفورماتیک، ایمونوانفورماتیک

* نویسنده مسئول: دکتر پژواک خاکی

آدرس: بخش میکروب شناسی، موسسه تحقیقات واکسن و سرم رازی، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج(AREEO) ، کرج، ایران.

پست الکترونیک: [e-mail] 

مقدمه

لپتوسپیروز یک بیماری مشترک بین انسان و دام با توزیع جهانی است که عامل آن اسپیروکت‌هایی از جنس لپتوسپیرا می باشد. لپتوسپیروز عمدتاَ در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری و نیز مناطق معتدل پر باران شیوع بیشتری دارد. منبع اصلی آن جوندگان و حیوانات وحشی می باشند که لپتوسپیراها را در ادرار خود دفع می کنند. این بیماری در انسان و در تمام پستانداران اهلی و وحشی بروز می کند (Adler, 2015). انسان بواسطه قرارگیری در معرض آب آلوده و یا حیواناتی که بطور مزمن آلوده می باشند، تبدیل به میزبان تصادفی می‌شود، بطوریکه در دنیا سالانه بیش از یک میلیون مورد ابتلا گزارش می‌شود (Fraser and Brown, 2017).

 این بیماری در انسان، درجات مختلف از شدت شامل یک بیماری تب دار خود محدود شونده تا نارسایی کلیوی، کبدی و تظاهرات ریوی شدید را سبب می شود. عمده مشکل مرتبط با لپتوسپیروز، تشخیص صحیح و سریع بیماری است که بدلیل علایم متعددی است که غالباً با دیگر بیماری‌های تب دار و خونریزی دهنده اشتباه گرفته می‌شود (Hidalgo et al., 2020).

از اولین مطالعات درباره واکسن بر علیه لپتوسپیروز تاکنون، واکسن‌های تجاری عمدتا از نوع واکسن‌های کشته، بطور گسترده در دامپزشکی استفاده می‌شوند که از محدودیت‌های زیادی از جمله عدم ایجاد ایمنی پایدار، عوارض جانبی متعدد ناشی از اجزای باقیمانده محیط و لیپوپلی‌ساکارید لپتوسپیرال و ایجاد سطح پایینی از ایمنی متقاطع رنج می‌برند (Adler, 2015).

مطالعات ژنومی که منجر به تعیین توالی کامل ژنوم گونه‌های مختلف لپتوسپیرا اعم از بیماریزا و محیطی شده، مبنایی برای درک بیماریزایی سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا فراهم کرده است. همچنین، مطالعه خصوصیات عملکردی غشاء خارجی و پروتئین‌های سیتوپلاسمی، راه را برای جستجوی عوامل تشخیصی و کاندیداهای جدید احتمالی واکسن هموارتر کرده است (Cerqueira et al., 2011). از سوی دیگر، واکسینولوژی معکوس (RV) با رویکرد برون‌تنی (In-silico) با استفاده از این توالی‌های ژنومی، پیش‌بینی اولیه تقریبا دقیقی در مورد کاندیداهای واکسن ارائه می‌کند. با استفاده از این روش می‌توان تمام آنتی‌ژن‌های بالقوه کدگذاری شده توسط ژنوم را صرف نظر از فراوانی،  مرحله بیان و ایمنی‌زایی آنها شناسایی کرد (Dellagostin et al., 2017).

در سال های اخیر، شناسایی پروتئین‌های ایمونوژنیک غشاء بیرونی لپتوسپیرا که در میان گونه‌های بیماریزا حفاظت شده‌اند به موضوعی مهم در تحقیقات لپتوسپیرایی در راستای توسعه واکسن‌های نوترکیب با خاصیت حفاظت متقاطع تبدیل شده است (Grassmann et al., 2017).

غشاء بیرونی لپتوسپیرا با داشتن فسفولپیدها، LPS و سه نوع مختلف پروتئین های غشاء خارجی(OMPs) شناخته می شود(Haake and Matsunaga, 2010). لیپوپروتئین‌ها، پروتئین‌های ترا‌غشایی و پروتئین‌های سطح غشایی؛ سه گروه پروتئین‌های غشاء خارجی لپتوسپیراها هستند(Hsu and Yang, 2022). لذا با گسترش و پیشرفت علوم وابسته به بیوتکنولوژی و مهندسی ژنتیک، واکسن‌هایی بر پایه پروتئین نوترکیب ممکن است جایگزینی برای واکسن های کلاسیک جهت پیشگیری از لپتوسپیروز باشد.

 چندین پروتئین غشاء خارجی لپتوسپیرا از جمله لیپوپروتئین‌هایی مانند LipL21، LipL36،LipL41 و LigB به عنوان آنتی‌ژن‌های بالقوه واکسن، ارزیابی شده اند(Monaris et al., 2015). دو فاکتور مهم در ارزیابی این پروتئین‌ها بعنوان عوامل بیماریزایی در لپتوسپیراها؛ موقعیت سطحی این پروتئین‌ها و بیان آنها در طول عفونت پستانداران بوده است (Raja and Natarajaseenivasan, 2015). آنتی‌ژن های در معرض سطح، بدلیل موقعیت مکانی که دارند، احتمالا در تعامل اصلی میزبان- پاتوژن، چسبندگی و/یا تهاجم دخیل هستند. این میانکنش‌ها با اتصال باکتری به بافت هدف، پاسخ‌های ایمنی و در نهایت ورود به بافت های میزبان دنبال می‌شوند (Haake and Zückert, 2015, Dhayabaran et al., 2020).

لیپوپروتئین Loa22 از خانواده پروتئین‌های ompA غشاء بیرونی لپتوسپیرا است که اولین بار توسط محققان ژاپنی با استفاده از روش فیوژن phoA  و سپس با روش ایمونوبلاتینگ با استفاده از سرم موش‌های در حال بهبودی شناسایی و نشان داده شد که توالی آن بشدت حفاظت شده است(Koizumi and Watanabe, 2003, Ristow et al., 2007). در این مطالعه طی آنالیزهای برون‌تنی، پارامترهای فیزیکی و شیمیایی، ساختارها، موقعیت مکانی، مارپیچ‌های گذرنده، آنتی‌ژنیسیته، توالی سیگنال  و  اپی‌توپ‌های سلول‌های B و T در توالی پروتئین Loa22  در راستای امکان استفاده از آن در طراحی واکسنی نوترکیب برعلیه لپتوسپیروز مورد پیش‌بینی و بررسی قرارگرفت.

مواد و روش‌ها

 بررسی توالی پروتئین Loa22 

هجده توالی پروتئین Loa22 مربوط به سرووارهای بومی لپتوسپیرا، در کنار دیگر توالی‌های ثبت شده تا تاریخ 13 سپتامبر 2021  در پایگاه اطلاعات ژنتیکی NCBI، جهت مطالعات بیوانفورماتیک استخراج شد. همچنین با استفاده از همترازی توالی سرووار بومی کانیکولا؛ با بیش از 50 توالی کامل ژنومی (کروموزوم I) سرووارهای مختلف لپتوسپیراهای پاتوژن موجود در بانک ژنومی NCBI، هفده توالی جهت مطالعه جامع‌تر استخراج شد.

مطالعات فیلوژنتیکی

آناليز توالی کامل پروتئین (Complete Coding Sequence)  Loa22از سرووارهای بومی و غیر بومی مورد مطالعه در این تحقیق، با استفاده از سرور آنلاین BlastP از ابزارهای پایگاه داده NCBI و نرم افزارDNASTAR Lasergene 17  انجام گرديد و درصد تشابه و واگرايي توالي پروتئین Loa22 مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی ORF در توالی پروتئین Loa22

برای پیش بینی چارچوب باز خوانش(Open Reading Frames)  در توالی‌ پروتئین Loa22 از سرور ExPASy استفاده شد. این سرور چارچوب باز خوانشی که طول بلندتری دارد را بعنوان ORF اصلی و کد کننده پروتئین گزارش می‌کند.

 بررسی حضور و جایگاه سیگنال پپتید

برای پیش بینی حضور و بررسی جایگاه توالی سیگنال پپتید از سرورSMART (http://smart.embl- heidelberg.de/)  و ابزار SignalP استفاده شد. در انتهای سیگنال پپتید ناحیه برشی قرار دارد که در بعضی پروتئین‌ها در حین یا پس از جایگیری در محل هدف، برش می خورد. در باکتری های گرم منفی وجود سیگنال پپتید باعث قرارگیری پروتئین در غشاء داخلی یا منطقه پری پلاسمی می‌شود و یا ترشحی بودن پروتئین را مشخص می‌کند.

پیش بینی ساختار دوم پروتئین Loa22 

برای پیش بینی ساختار دوم پروتئین هدف از سرور آنلاین GOR4 (https://npsa-pbil.ibcp.fr/NPSA/npsa_gor4.html) استفاده شد . این سرور، با انجام محاسبات؛ موقعیت و نحوه قرارگیری آمینواسیدهای درگیر در انواع مارپیچ‌ها، دورها، پل‌ها و در نهایت ساختار ثانویه پروتئین هدف را پیش‌بینی می کند.

پیش بینی ساختار سه‌بعدی پروتئین Loa22 

بررسی و شناسایی ساختار سه‌بعدی پروتئین‌ها یک منبع بسیارمهم از اطلاعات برای درک عملکرد و فعالیت پروتئین‌ها، میانکنش آنها با لیگاند، پروتئین،DNA  و همچنین درک اثرات جهش‌ها می‌باشد. روش مدل سازی ساختار سه‌بعدی پروتئین بر اساس توالی آمینواسیدی راهکار در مواردی است که ساختار کریستالوگرافی شده ای در مورد پروتئین هدف وجود ندارد. به‌روزترین ابزار مدل سازی که توسط گوگل ارایه شده Alphafold (alphafold21_predict_colab.ipynb) نام دارد که از طریق یک نرم‌افزار رابط بنام ChimeraX  نیز قابل دسترسی است (Jumper et al., 2021). این سرور همچنین از هوش مصنوعی آنلاین  Dali server  (http://ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/dali/) برای پیش‌بینی ساختار پروتئین هدف بهره می‌گیرد. سرور Dali با استفاده از بهترین مدل (best model) پیش‌بینی شده، ساختارهای مشابه به پروتئین هدف را شناسایی و نتایج را بصورت تفاوت در آمینواسیدها (درصد Identity)، تفاوت در ساختار (عدد RMSD) و در نهایت برایند تمام محاسبات (عدد Z ) گزارش می‌کند.

 تعیین محل قرارگیری پروتئین Loa22 در ساختار غشاء

برای پیش بینی محل و نحوه قرارگیری پروتئین Loa22 در ساختار غشاء باکتری؛ توالی آمینواسیدی این پروتئین با استفاده از سرور آنلاین DeepTMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM) مورد بررسی قرار گرفت. این سرور در حال حاضر بهترین برنامه پیش‌بینی غشایی است که از یک مدل پنهان مارکوف (Hidden Markov Model) برای پیش‌بینی مارپیچ‌های گذرنده در توالی‌های پروتئینی استفاده می‌کند (Hallgren et al., 2022).

پیش‌بینی اپی‌توپ های سلول T

برای یافتن اپی‌توپ‌هایی در پروتئین هدف که توسط سلول T سیستم ایمنی (T Cell Epitopes) شناسایی می‌شوند، از دو سرور مختلف استفاده شد. سرورNet CTL 1.2 (http://services.healthtech.dtu.dk) با 12 سوپرتایپ HLA (A1, A2, A3, A4, A26, B7, B8, B27, B39, B44,B58, B62) و سرور IEDB (Immune Epitope Database Analysis Resource) با 50 سوپرتایپ مختلف HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-C  و HLA-C) جهت پیش بینی اپی‌توپ های احتمالی (9 مری) در ساختار پروتئین Loa22 مربوط به MHC-I بررسی شد. حد آستانه (Threshold) در سرور  NetCTL بر اساس حساسیت و اختصاصیت مورد نیاز مطالعه، بین مقادیر 5/0-25/1 متغیر است. هر چه آستانه بالاتری را انتخاب کنیم، نتایج کمتر اما موثرتر خواهد بود. با استفاده از سرور IEDB بر پایه روش SMM، اپی‌توپ‌هایی با IC50 کمتر از 200 انتخاب شدند. هر چه عدد کوچکتری داشته باشیم تطابق اپی‌توپ با آلل انتخابی بیشتر می باشد.

جهت بررسی آلل های MHC-II، لوکوس HLA-DR بدلیل تنوع وسیع‌تر نسبت به سایر HLA ها انتخاب شد. از آنجا که تاکنون هیچ سروری آلل‌های MHC-II دامی را جهت پیشگویی اپی‌توپ‌های آنتی‌ژنیک سلول T ارائه نکرده است؛ آللهای MHC انسانی مشابه با آللهای دامی به عنوان آللهای معادل برای پیشگویی اپی‌توپ‌های مورد استفاده قرار گرفتند. به دلیل اینکه MHC-II شیار بازتری نسبت MHC-I دارد لذا برای پیش‌بینی افینیتی اتصال، طول اپی‌توپ‌ها بین 18-12 آمینواسید انتخاب شد. از آنجائیکه سرور IEDB بطور پیش‌فرض آمینواسیدهای اول، دوم و آخر هر اپی‌توپ را بعنوان متصل به MHC (Masked)در نظر می گیرد، لذا هسته 9-12 مری از آمینواسیدها (Core Peptide) برای شناسایی شدن توسط TCR در دسترس هستند.

پیش‌بینی اپی‌توپ های سلول B

سول‌های B سیستم ایمنی هم توانایی شناسایی اپی‌توپ‌های خطی و هم فضایی را دارد. برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های خطی و آمینواسیدها در اپی توپ‌های ناپیوسته سلول B در توالی پروتئین Loa22 از سرور آنلاین BepiPred-3.0 (DTU Health tech) با استفاده از الگوریتم LM  و حد آستانه مفروض (5/0) استفاده شد (Clifford et al., 2022).

برای پیش‌بینی اپی‌توپهای فضایی از سرور IEDB Conformational B cell prediction Tool Ellipro و ابزار  Discotope - Prediction of epitopes from protein structure و حد آستانه پیش فرض 7/7- با اختصاصیت 75% استفاده شد. برای شناسایی اپی‌توپ‌های فضایی نمی توان از توالی خطی پروتئین استفاده کرد. بنابراین ساختار کریستالوگرافی شده پروتئین‌ها از پایگاه داده‌ پروتئین‌ها مانند پایگاه داده Uniprot (PDB) جهت پیش‌بینی مورد نیاز است. در صورتی که پروتئین هدف کریستالوگرافی نشده (مانند پروتئین مورد مطالعه در این تحقیق)، از ساختار سه بعدی پیش‌بینی شده استفاده می‌شود.

پیش‌بینی آلرژنسیتی، توکسیستی و آنتی‌ژنیسیتی

جهت پیش بینی آلرژنیسیتی، حلالیت و آنتی‌ژنیسیتی پروتئین Loa22 توالی آمینواسیدی این پروتئین قبل و بعد از بهینه سازی مورد ارزیابی قرار گرفت.

میزان آلرژن بودن پروتئین بر اساس الگوریتم‌های دو سرور AllergenFP وAllerTop  مورد ارزیابی قرار گرفت. این دو سرور هم بر اساس متد مورد استفاده جهت پیشگویی و نیز درصد صحت عمل آنها متفاوت هستند. صحت پیش‌بینی سرور AllergenFP  حدود 9/87 % و سرور AllerTop حدود 7/87 % است.

بررسی و پیش‌بینی نواحی توکسیک در پروتئین اصلی و توترکیب Loa22 با استفاده از سرور ToxinPred براساس روش SVM (Swiss-Prot) با حد آستانه صفر و E-value برابر با 1/0 انجام شد.

برای پیش‌بینی آنتی‌ژنیستیتی یا میزان تحریک سیستم ایمنی این پروتئین، از سرور Vaxijen (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/) استفاده شد که پیش بینی خود را بر اساس خواص فیزیکوشیمیایی پلی‌پپتید انجام می‌دهد. صحت پیش بینی این سرور در حدود 89-70 % عنوان شده است.

تجزیه و تحلیل پارامترهای فیزیکی و شیمیایی و پیش‌بینی حلالیت

با استفاده از سرور ProtParam (https://web.expasy.org/protparam /)، خواص فیزیکی و شیمیایی از جمله pH ایزوالکتریک، وزن مولکولی، نیمه عمر آنتی‌ژن و همچنین حلالیت پروتئین اصلی و نوترکیب هر کدام بصورت جداگانه با استفاده از سرور SolPro  (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)  مورد بررسی و پیش‌بینی قرار گرفت.

ترجمه معکوس، تعیین جایگاه های برشی و بهینه سازی کدون

بر اساس مطالعات فیلوژنی پس از همترازی توالی‌های مورد مطالعه، توالی نهایی با حداکثر انطباق با سرووارهای بومی لپتوسپیرا و پس از حذف توالی سیگنال، بصورت توالی نوکلئوتیدی با استفاده از نرم افزار EditSeq ترجمه معکوس شد. این توالی به لحاظ جایگاه‌های برشی آنزیم‌های اندونوکلئاز در راستای انتخاب آنزیم‌های مناسب جهت وارد کردن قطعه نهایی در ناقل (Vector)، جهت جلوگیری از برش‌های ناخواسته بدلیل وجود سایت برشی مشابه، مورد بررسی قزار گرفت. در نهایت برای بهینه‌سازی کدونهای ژنی برای بیان در میزبان E.coli از ابزار آنلاین GeneSmart™  (https://www.genscript.com/gensmart-free-gene-codon-optimization html) استفاده شد.

نتایج

آنالیز توالي پروتئین Loa22 

بر اساس نتایج همترازی توالی‌های آمینواسیدی سرووارهای بومی و غیربومی مورد مطالعه، تنها جایگزینی در 5 آمینواسید در توالی‌های مختلف پروتئین Loa22 مشاهده شد. این تغییرات شامل؛ سه آمینواسید آلانین37، آلانین87 و والین185 در میان سرووارهای گریپوتیفوزا بود که بترتیب با آمینواسیدهای ترئونین37، پرولین87 و آلانین185 در دیگر سرووارها جایگزین شده‌ بودند. از میان دو مورد دیگر یک مورد در سرووار کانیکولا مشاهده شد که آمینواسید هیستیدین در موقعیت 58 با آمینواسید اسپارتیک‌اسید در سایر سرووارها متفاوت بود و مورد دیگر آمینواسید گلوتامین در موقعیت 129 در سرووار آتومنالیس با گلوتامیک اسید در دیگر سرووارها متفاوت بود.

تعیین قالب صحیح خوانش پروتئین Loa22

برای بررسی چارچوب صحیح باز خوانش (ORF) از سرور ExPasy استفاده شد. از میان انواع قالب ORF شناسایی شده، قالب 195 آمینواسیدی (5'-3' Frame 1)، قالب کامل و در برگیرنده تمام طول پروتئین Loa22 بود.

بررسی سیگنال پپتید در ساختار پروتئین Loa22

با استفاده از سروور آنلاین SMART و ابزار SignalP، حضور سیگنال پپتید در انتهای آمینی توالی مورد نظر نشان داده شد. جایگاه برشی توالی سیگنال بین آمینواسیدهای Cys24 و Ser25 پیش‌بینی شد (شکل1الف).

 

شکل1.  پیش‌بینی موقعیت و نحوه قرارگیری پروتئین Loa22 و توالی سیگنال آن در ساختار غشاء

الف. پیش‌بینی توالی سیگنال توسط سرور SignalP-5.0

ب. پیش‌بینی موقعیت و نحوه قرار گیری پروتئین Loa22 و جایگاه سیگنال پپتید با استفاده از سرور DeepTMHMM

 

پیش بینی ساختار دو بعدی

بر اساس نتایج پیش‌بینی سرور GOR4 از توالی آمینواسیدی پروتئین Loa22؛ 67 آمینواسید(5/33%) درتشکیل مارپیچ آلفا، 29 آمینو اسید (5/14%) در ساختار رشته توسعه یافته (Extended Strand) و 104 آمینواسید (52%) در پیچش‌های تصادفی(Random Coil) شرکت دارند (شکل2).

 

 

شکل2. پیش‌بینی ساختار ثانویه پروتئین Loa22 با استفاده از سرور GOR4

پیش بینی ساختار سه بعدی

بهترین مدل پیش‌بینی شده از ساختار سه بعدی پروتئین هدف با استفاده از سرور alphafold پس از محاسبات و آنالیز داده‌های سرور Dali، بیشترین تشابه را با ساختارهای کریستالوگرافی شده پروتئین‌های خانواده OMP نشان داد که پروتئین Loa22 نیز عضوی از این خانواده پروتئینی می باشد (شکل3).

تعیین محل و نحوه قرارگیری پروتئین Loa22 در ساختار غشاء

نتایج محاسبات سرور DeepTMHMM، از موقعیت و نحوه قرارگیری این پروتئین در غشاء لپتوسپیرا، پروتئین  Loa22 بصورت کامل خارج غشایی و فاقد مارپیچ‌ گذرنده از عرض غشاء پیش‌بینی شد. همچنین این سرور، یک سیگنال پپتید در انتهای آمینی (آمینواسیدهای 1-24) پیش بینی کرد (شکل 1ب).

بررسی اپی‌توپ‌های سلولهای T در ساختار پروتئین Loa22

براساس نتایج سرور NetCTL با حد آستانه 5/0 و بر اساس امتیاز مجموع (Combination Score) و نتایج

سرور IEDB با IC50 کمتر از 200 شمار متعددی از اپی‌توپ‌های سلولهای T مربوط به MHC-I پیش‌بینی شد.

در میان سوپرتایپ‌های سرورNetCTL، سوپرتایپ‌های A1، B7 و B8 و سپس B62 و B58  بیشترین قابلیت انطباق با پپتیدهای پیش‌بینی شده در ساختار پروتئین Loa22 را داشتند. در این میان و بر اساس مقادیر امتیاز مجموع پپتیدهای پیش بینی شده، هجده پپتید با حد آستانه بیش از یک شناسایی شد که توالی پپتیدی DAKNRRVTF (آمینواسیدهای 188-180) با عدد 80/1 ایمونوژن‌ترین پپتید پیش‌بینی شده بود. همچنین توالی پپتیدی FRFATSAPQ با عدد 53/1 (آمینواسیدهای 197-189)، توالی FRYPDGLTR با عدد 42/1(آمینواسیدهای 79-71)، توالی LTRPGFSY با عدد 40/1 (آمینواسیدهای 85-77) و توالی YSELRANAV با عدد 2/1 (آمینواسیدهای 149-141) محتمل‌ترین اپی‌توپ‌های پیش‌بینی شده بودند.

از سوی دیگر، نتایج سرور IEDB از اپی‌توپ‌های سلولهای T برای آلل‌های مربوط به MHC-I بر اساس فراوانی آلل های منطبق بر توالی پپتیدی پیش بینی شده؛ اپی‌توپ‌های FTLCSSAEK با انطباق با 8  سوپرتایپ و FSFTLCSSA،  FATSAPQQL و FRFATSAPQ هر کدام با 7 سوپرتایپ و YSELRANAV و FRYPDGLTR نیز هر کدام با 6 سوپرتایپ بیشترین تعداد انطباق را داشتند.

بررسی اپی‌توپ‌های سلولهای T برای لوکوس HLA-DRB متصل شونده به مولکول‌های MHC-II در ساختار پروتئین Loa22 30 پپتید با مقادیر IC50 کمتر از 200 با استفاده از سرور IEDB شناسایی شد که در این میان هسته اپی‌توپیک VKKILNLIL در شش موقعیت متفاوت در بازه توالی پپتیدی 15-1 بیشترین احتمال اتصال به آلل‌های MHC-II (HLA-DRB1,4,5,8) را داشت. همچنین هسته YSELRANAV با شش موقعیت متفاوت در بازه آمینواسیدهای 150-136، هسته LILLGAIAF نیز در شش موقعیت مختلف در بازه پپتیدی 21-7 و هسته FRFATSAPQ  در سه موقعیت مختلف در بازه آمینواسیدهای 200-184 با بیشترین احتمال امکان قرارگیری در شیار آلل‌های مختلف MHC-II را داشتند (جدول1).

در مجموع توالی های پپتیدی پیش‌بینی شده، 17 توالی مشترک با امکان تطابق و قرارگیری در شیار HLA های هر دو کلاس MHC  یافت شد که با یک بررسی سختگیرانه‌تر، بر اساس امتیاز مجموع و فراوانی آلل‌های انطباق یافته، توالی‌های پپتیدی FRFATSAPQ، FRYPDGLTR، FTLCSSAEK، YSELRANAV و RRVTFRFAT با بیشترین احتمال حضور داشتند. محتمل‌ترین سوپرتایپ برای هر یک از این پپتیدهای پیش‌بینی شده در جدول به همراه امتیازات مربوط به آن آورده شده است.

پیش‌بینی اپی‌توپهای خطی سلولهای B در ساختار پروتئین Loa22 نتایج پیش‌بینی اپی‌توپ‌های خطی سلولهای B در ساختار پروتئین Loa22  با استفاده از سرور BepiPred-3.0 در مجموع 5 توالی پپتیدی ( به استثناء اپی‌توپ‌ پیش‌بینی شده در ناحیه سیگنال پپتید) را بعنوان توالی اپی‌توپیک نشان داد(جدول2).

همچنین بر اساس پیش بینی، آمینواسیدها با بیشترین احتمال درگیری در میانکنش اپی‌توپ‌های خطی با سلولهای B به رنگ زرد و در رده بعدی به رنگ نارنجی و به همین ترتیب آمینواسیدهای کمتر موثر با رنگ بنفش در شکل4 نمایش داده شده‌اند. در گراف بدست آمده از سرور DiscoTope - 3.0 بر اساس ساختار سه بعدی پیش‌بینی شده با استفاده از سرور alphafold برای پروتئین Loa22 مناطق سبز رنگ اپی‌توپ های فضایی پیش‌بینی شده را نشان می‌دهد. (شکل 5 و جدول 2).

تعیین آنتی‌ژنسیته، توکسیسیته و آلرژن بودن پروتئین

بر اساس پیش‌بینی سرور Vaxigen این پروتئین خاصیت تحریک کنندگی سیستم ایمنی را داشته و آنتی‌ژننستیه این پروتئین را 8026/0 پیش‌بینی کرد که به میزان دو برابر بیشتر از حد آستانه تعیین شده(4/0) برای مدل های باکتریایی بود.

از آنجائی که سازه ایمنی‌زا اگر آلرژیک باشد، ممکن است باعث ایجاد واکنش های ایمنی متقاطع خاص آلرژن مانند تحریک و التهابات پوستی و مخاطی در بدن میزبان شود. بنابراین پروتئین Loa22 قبل و بعد از بهینه سازی با استفاده از هر دو سرور AllerTOP و AllergenFP مورد بررسی و نتیجه هر دو ارزیابی، این پروتئین را فاقد ویژگی‌های آلرژیک پیش‌بینی کردند. همچنین بر اساس پیش بینی سرور Toxinpred به لحاظ سمیت و توکسیسیته، بی خطر گزارش شد (جدول3).

بررسی خواص فیزیکوشیمیایی آنتی ژن و حلالیت

خواص فیزیکوشیمیایی پروتئین Loa22 در سرور ProtParam قبل و بعد از بهینه سازی بررسی شد. وزن مولکولی قطعه مورد نظر قبل از بهینه سازی حدودkDa  22، نقطه ایزوالکتریک حدود 9/8 و نیمه عمر تخمین زده شده در سیستم پروکاریوتی تنها حدود 3 دقیقه بود که در دسته پروتئین های ناپایدار قرار می گیرد. اما پس بهینه سازی و حذف توالی سیگنال وزن مولکولی به حدودkDa  2/19 ( 173 آمینواسید) و نقطه ایزوالکتریک 6 و نیمه عمر تخمین زده شده در سیستم پروکاریوتی به حدود 10 ساعت تغییر کرد که در این حالت پروتئین پایدار بشمار می‌آید (جدول3). ترجمه معکوس، تعیین جایگاه های برشی و بهینه سازی کدون بر اساس مطالعات فیلوژنی پیشین و همترازی توالی‌های مورد مطالعه، توالی نهایی با حداکثر انطباق با سرووارهای بومی لپتوسپیرا و پس از حذف توالی سیگنال، بصورت توالی نوکلئوتیدی با استفاده از نرم افزار EditSeq ترجمه معکوس شد. جهت وارد کردن قطعه ژن در وکتور مورد نظر، دو جایگاه برشی NcoI (CCATGG) و XhoI (CTCGAG) به دلیل عدم وجود سایت برشی مشابه در درون ژن loa22 جهت جلوگیری از تداخل در بیان پروتئین نوترکیب در اثر برش ناخواسته، انتخاب شد (شکل 6). در نهایت پس از بهینه سازی کدونهای ژنی برای بیان در میزبان E.coli، توالی نهایی با طول 539 جفت باز پس از اطمینان از نتایج مطلوب آزمایشگاهی در بانک ژنی NCBI با شماره دسترسیOR134515 ثبت گردید.

 

 

شکل3. الف؛ بهترین مدل سه بعدی پیش‌بینی شده پروتئینLoa22 . ب؛ تصویر حاصل از ارزیابی شاخص های plDDT، PAE و Coverage ساختار سوم پروتئین Loa22 با استفاده از سرور Alphafold. ج؛ مشابه‌ترین ساختارها به ساختار پیش‌بینی شده پروتئین Loa22 با استفاده از سرور Daliserver.

 

 

شکل4. پیش‌بینی آمینواسیدهای موثر در نواحی اپی‌توپ‌های خطی غیر ممتد سلولهای B در ساختار پروتئین Loa22 با استفاده از سرور BepiPred-3.0. محور x و y بترتیب موقعیت توالی پروتئین و امتیازات اپی توپ ها را نشان می دهد. آمینواسیدهایی که امتیاز بالاتری دارند بعنوان بخشی از اپی توپ سلول B با رنگ زرد مشخص شده‌اند.

جدول1. بررسی و مقایسه پپتیدهای برتر MHC-I، پیش‌بینی شده با سرور IEDB  و NetCTL و اشتراک با MHC-II

IC50	MHC-II	امتیاز	MHC-I NetCTL	IC50	MHC-I IEDB	پایان	شروع	پپتید	ردیف
18.00	HLA-DRB5*01:01	1.54	HLA-B27	9.4	HLA-C*03:03	197	189	FRFATSAPQ	1
--	--	0.65	HLA-A1	5.6	HLA-C*03:03	200	192	ATSAPQQLL	2
18.00	HLA-DRB1*07:01	0.69	HLA-B39	1.3	HLA-C*12:03	199	191	FATSAPQQL	3
27.00	HLA-DRB5*01:01	1.42	HLA-B27	10.2	HLA-C*03:03	79	71	FRYPDGLTR	4
--	--	1.46	HLA-A3	4.8	HLA-A*30:01	85	77	LTRPGFSYK	5
9.00	HLA-DRB1*01:01	1.23	HLA-B62	30.7	HLA-C*03:03	20	12	LILLGAIAF	6
--	--	0.93	HLA-A2	4.7	HLA-C*03:03	24	16	GAIAFSFTL	7
65.00	HLA-DRB5*01:01	0.54	HLA-A2	7.5	HLA-C*12:03	28	20	FSFTLCSSA	8
59.00	HLA-DRB5*01:01	1.21	HLA-A3	4.8	HLA-C*03:03	30	22	FTLCSSAEK	9
--	--	0.62	HLA-A1	7.1	HLA-C*12:03	68	60	IADSLNEKL	10
--	--	1.00	HLA-A1	7.8	HLA-C*12:03	130	122	HTDAIGPEQ	11
6.00	HLA-DRB1*01:01	1.20	HLA-B8	9.0	HLA-C*15:02	149	141	YSELRANAV	12
--	--	0.59	HLA-B39	5.8	HLA-C*03:03	117	109	LGLPDSYAL	13
--	--	1.80	HLA-B8	5.6	HLA-C*12:03	189	181	DAKNRRVTF	14
--	--	--	--	19.3	HLA-C*12:03	192	184	NRRVTFRFA	15
152.0	HLA-DRB1*07:01	1.46	HLA-B27	32.3	HLA-C*12:03	193	185	RRVTFRFAT	16
--	--	--	--	3.7	HLA-C*07:03	57	49	NRNVDVNSP	17
--	--	--	--	4.8	HLA-C*12:03	59	51	NVDVNSPEA	18
--	--	--	--	6.4	HLA-C*03:03	90	82	FSYKKADVT	19
--	--	--	--	6.6	HLA-C*12:03	35	27	SAEKKEESA	20

 

جدول2. اپی‌توپ‌های خطی و فضایی پیش‌بینی شده در ساختار پروتئین Loa22 با استفاده از سرور BepiPred

نوع اپی‌توپ	شروع	پایان	پپتید	امتیاز	طول پپنید
خطی	27	61	SAEKKEESAAPEPSTQEQSAAANRNVDVNSPEAIA	0.275	35
	68	77	LKDFRYPDGL	0.277	10
	126	139	IGPEQAEGAKKGNI	0.291	14
	174	182	VSGLDAKDA	0.288	9
	194	198	SAPQQ	0.257	4
فضایی	25	57	CSSAEKKEESAAPEPSTQEQSAAANRNVDVNSP	0.875	36
	75	87	DGLTRPGFSYKKA	0.527	13
	109	114	GKLPDS	0.644	6
	125	138	DAIGPEQAEGAKKG	0.705	14
	177	181	LDAKD	0.538	5
	194	200	SAPQQLE	0.703	7

        جدول3. بررسی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، آنتی‌ژنیسیته، توکسیسیته و آلرژنیسیته پروتئین Loa22  قبل و بعد از بهینه سازی

پروتئین  Loa22 بهینه شده	پروتئین اصلی Loa22	ویژگی ها
180	200	طول توالی آمینواسیدی
2/19~	6/21~	وزن مولکولی
حدود 10 ساعت	3 دقیقه	نیمه عمردر باکتری E.coli
6~	88/8	نقطه ایزوالکتریک
8026/0	7456/0	آلرژنیسیتی (سرور VaxiJen v.2.0)
Not Allergen	Not Allergen	آنتی‌ژنیسیتی (سرور Aller TOP v.2.0)
منفی	منفی	توکسیسیته
0.926586 (محلول)	0.918793 (محلول)	حلالیت (سرور Scratch )

 

 

 

شکل 5. گراف اپی‌توپ های فضایی پیش‌بینی شده با سرور IEDB

 

 

شکل6. بررسی توالی نهایی ژن  loa22از نظر جایگاه های برشی (540 bp)

 

بحث

لپتوسپیروز یک بیماری مشترک بین انسان و دام با پیامدهای سلامت جهانی است که توسط سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا ایجاد می شود و تهدیدی قابل توجه برای سلامت عمومی در سراسر جهان است (Hidalgo et al., 2020). تمرکز بر توسعه روش‌های تشخیصی سریع برای تسهیل تشخیص زود هنگام بیماری و  توسعه واکسنی جهانی مسائل کلیدی اصلی برای فائق شدن بر بسیاری از جنبه های زیان آور بیماری لپتوسپیروز هستند. پروتئین‌های غشاءی خارجی(OMPs)  لپتوسپیرا، اعضای خانواده‌ی بزرگی از پروتئین‌ها هستند که ارتباط مستقیمی با بیماریزایی دارند، بطوریکه می توانند نقش مهمی را در اتصال، عفونت اولیه و در نتیجه ایجاد بیماری ایفا کنند (Haake and Zückert, 2015). 

یکی از لیپوپروتئین‌های غشاءء خارجی در لپتوسپیراهای بیماریزا Loa22 است که اولین بار توسط محققان ژاپنی شناسایی شد (Koizumi and Watanabe, 2003) و در ادامه نقش آن در بیماریزایی لپتوسپیرا با استفاده از سویه موتانت loa22  که از طریق موتاژنز تصادفی ترانسپوزون Himar 1 ایجاد شد، نشان داده شد(Ristow et al., 2007). 

این تحقیق با هدف مطالعه ویژگی‌های ساختاری و عملکردی پروتئین Loa22، ارزیابی پتانسیل آن به عنوان یک واکسن کاندید بر علیه لپتوسپیروز با استفاده از ابزارها و پایگاه‌های اطلاعاتی بیوانفورماتیک و مطالعات ایمونوانفورماتیک و در نهایت، بهینه سازی توالی آن جهت بیان مطلوب در میزبان E.coli انجام شد.

ابزارهای تجزیه و تحلیل توالی مانند BLAST را می توان برای شناسایی پروتئین های همولوگ با ساختارها یا عملکردهای شناخته شده مورد استفاده قرار داد و بینش هایی را در مورد مناطق حفاظت شده ارائه کرد که ممکن است به عنوان اپی‌توپ‌های بالقوه عمل کنند. برای تحقق اهداف مطالعه، 36 توالی آمینواسیدی مربوط به پروتئین Loa22 از سرووارهای بیماریزای بومی و غیر بومی لپتوسپیرا مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس آنالیز همترازی چندگانه(Multiple alignment)، تشابه توالی در سطح آمینواسیدی، بین 100-98 درصد در میان تمامی سرووارها گزارش شد که نشان می‌دهد، مطابق با مطالعات پیشین، توالی Loa22 بسیار حفاظت شده است (Yan et al., 2010, Mohammadi et al., 2022). تفاوت در میان سرووارهای کرشنری با دیگر سرووارهای بیماریزای مورد مطالعه تنها مربوط به تغییر در سه آمینواسید در طول توالی Loa22 بود. دو آمینواسید غیرقطبی آلانین (Ala87) و والین (Val165) در سرووارهای گریپوتیفوزا بترتیب جایگزین دو آمینواسید غیرقطبی پرولین(Pro87) و آلانین (Ala165) و آمینواسید غیرقطبی آلانین (Ala37) در سرووارهای گریپوتیفوزا جایگزین آمینواسید قطبی ترئونین (Thr37) در میان دیگر سرووارهای شده که در مجموع تغییر قابل ملاحظه ای در شکل فضایی و اپی‌توپ های پیش بینی شده در ساختار پروتئین Loa22 ایجاد نکرده است.

بر اساس مطالعات بیوانفورماتیک، نتایج پیش‌بینی ساختمان و ساختار پروتئین Loa22، با نتایج مطالعات میکروسکوپ الکترونی، اتمی و کانفوکال از موقعیت و نحوه قرارگیری این پروتئین در غشاء لپتوسپیرا منطبق بود (Hsu et al., 2021) و این پروتئین دارای یک توالی سیگنال می باشد (Balamurugan et al., 2021). در این مطالعه، با استفاده از سرور آنلاین SignalP موقعیت قرارگیری پروتئین Loa22  بصورت خارج غشایی پیش‌بینی شد و همچنین بر اساس پیش‌بینی این سرور و نیز سرور TMHMM، یک توالی سیگنال در انتهای آمینی با جایگاه برش بین آمینواسیدهای Cys24 و Ser25 حضور دارد. بر اساس مطالعات پیشین، پروتئینLoa22، یک لیپید اصلاح شده متصل به آمینواسید Cys21 و یک جایگاه برش در بین آمینواسیدهای 21 و 20 برای حذف سیگنال پپتید و ایجاد لیپوپروتئین بالغ دارد که با همترازی توالی این پروتئین در این مطالعات، آمینواسیدهای جایگاه برش، یکسان و بر هم منطبق بودند (Kaur et al., 2014, Hsu et al., 2021).

همچنین بر اساس پیش‌بینی‌، حذف توالی سیگنال از توالی پروتئین Loa22، منجر به یک پروتئین بالغ با حلالیت بیشتر می‌شود که همسو با مطالعات تجربی، از این نظر حمایت می‌کند که پروتئین بالغ، بدون پپتید سیگنال، در بخش محلول باقی می‌ماند (Zhang et al., 2010, Gharakhani et al., 2022). بهترین حالت بیان پروتئین در میزبان E.coli بصورت محلول می باشد که در ادامه نیاز به مراحل محلول سازی نباشد. بیان پروتئین‌ها به صورت محلول در اشرشیا‌کلی نقطه عطفی در تولید پروتئین است (Clark and Pazdernik, 2016).

ارزیابی سایر ویژگی های پروتئین Loa22، بر اساس تجزیه و تحلیل فیزیکوشیمیایی، مدل‌سازی همسانی و یافته‌های حاصل از مطالعات فیلوژنتیک، نشان داد که توالی بهینه شده این پروتئین، بقاء و پایداری بیشتری نسبت به توالی اصلی آن داشت، بطوریکه پس از بهینه سازی توالی، پایداری و نیمه عمر آن در میزبان پستاندار و E.coli افزایش قابل ملاحظه‌ای نشان داد.

ساختار سه بعدی پیش‌بینی شده برای پروتئین Loa22، بر اساس نتایج بدست آمده با استفاده از سرور Dali، بیشترین تشابه با ساختارهای کریستالوگرافی شده پروتئین های خانواده OMP در باکتری‌های دیگر مانند E.coli بوده که این پروتئین نیز عضوی از این خانواده می باشد. البته درصد تشابه پروتئینی بدلیل تفاوت آمینواسیدها، حدود 30% است ولی عددRMSD  حدود عدد 2(گستره 2-0 ایده آل است) بود که عدد قابل قبولی می‌باشد و عدد  Z در بهترین حالت حدود 14 بود که به دلیل وجود دنباله‌ای در انتهای آمینی این پروتئین است که ساختار آن قابل پیش بینی تبوده و تقریبا با هیچ ساختاری منطبق نمی شود. این موضوع نیز به این دلیل که در کریستالوگرافی اشعه x، یک چنین دنباله های طویلی، بدلیل نوسان بالا، اصولا در تعیین ساختار نمی گنجد.

بر اساس مطالعات ایمونوانفورماتیک، پروتئین Loa22 آنتی‌ژنیسیتی بالایی داشته و در عین حال غیر توکسیک و فاقد ویژگی‌های آلرژیک بود که مجموع این ویژگی ها، آن را بعنوان کاندید مناسبی برای طراحی واکسن مطرح می‌کند.  هدف نهایی واکسیناسیون در برابر بیماری های عفونی ایجاد یک پاسخ حافظه ایمونولوژیک موثر طولانی مدت متشکل از حافظه اختصاصی آنتی ژن T (ایمنی سلولی) و سلول های B (ایمنی هومورال) است (Grassmann et al., 2017). عفونت با لپتوسپیرا عمدتاً منجر به تولید آنتی‌بادیهای اختصاصی توسط سلول B می‌شود (Adler and Faine, 1977). از آنجا که سلولهای T در هر دو پاسخ ایمنی همورال و سلولی نقش دارند؛ لذا حضور اپی‌توپهای سلول B و اپی‌توپهای سلول T کمکی در میان توالی یک پروتئین می تواند موجب تحریک هر دو ایمنی سلولی و در نهایت افزایش ایمنی شود. بنابراین در این مطالعه پیشگویی اپی‌توپهای سلولهای B و T به صورت تواماً انجام شد.

الگوریتم‌های مختلفی مانند روش‌های مبتنی بر BepiPred، ABCpred و SVM می‌توانند اپی‌توپ‌های سلول B را بر اساس ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی یا الگوهای توالی پیش‌بینی کنند. الگوریتم‌های پیش‌بینی اپی توپ سلول T مانند NetMHCpan یا NetCTLpan می‌توانند پپتیدهای بالقوه اتصال MHC کلاس I یا II را شناسایی کنند که پاسخ‌های ایمنی سلولی را فعال می‌کنند.

پیش تر Xu’ai Lin و همکارانش تاثیر واکسن مولتی اپی‌توپ r4R، متشکل از اپی‌توپ‌های سلول‌ B و T پیش‌بینی شده در توالی پروتئین های غشاء بیرونی لپتوسپیرا شامل؛ OmpL1  LipL32,و LipL21  در القا، پاسخ ایمنی بر علیه لپتوسپیرا مورد بررسی و نتایج امیدوار کننده‌ای بدست آورده بودند (Lin et al., 2016). در ایران نظیفی و همکاران اپی توپ های ایمونوژن پروتئین های LipL32  و OmpL1 از سرووارهای بیماریزای لپتوسپیرا با قابلیت تحریک هر دو سلول T (MHCI و MHCII) و سلول B را جهت طراحی واکسنی نوترکیب بر اساس اپی توپ های کایمریک با استفاده از ابزار ایمونوانفورماتیک مورد بررسی قرار دادند(Nazifi et al., 2018).

در مطالعه حاضر با استفاده از سرورهای IEDB و NetCTL و با در نظر گرفتن تمامی احتمالات، بر اساس رتبه صدک و حد آستانه آنها ، توالی‌های FRFATSAPQ، FRYPDGLTR،FTLCSSAEK  و YSELRANAV پپتیدهای پیش بینی شده با احتمال بالای انطباق با HLAهای هر دو کلاس MHC بودند. علاوه بر این، توالی DAKNRRVTF و FTLCSSAEK برای انطباق باHLA های مربوط به MHC-I و توالی VKKILNLIL و LILLGAIAF نیز محتملترین پپتیدها برای قرارگیری در شیار MHC-II بودند. ویکتور و همکارانش چهار اپی‌توپ سلول‌های B  در توالی پروتئین Loa22 پیش بینی کردند که با اپی‌توپهای DAIGPEQAEGAKKG, MVKKILNLI, VSGLDAKDA و FTLCSSAEKE،  پیش بینی شده در این مطالعه همپوشانی کامل داشتند (Victor et al., 2015). 

در مجموع نتایج بدست آمده از بررسی توالی پروتئین Lo22، چندین اپی‌توپ شاخص با ضریب اطمینان بالا در هر دو گروه سلول های B و T پیش بینی شد که در برخی نواحی این اپی‌توپ‌ها همپوشانی داشتند. این نکته از این جهت حائز اهمیت است که در مطالعات دانگ و لین نشان داده شد که ظرفیت بالای القای پاسخ Th-1 در موش‌های BALB/C و تولید IgG2a می‌تواند بدلیل حضور ترکیبی از اپی‌توپ‌های سلول‌های B و T در دومین‌های حفاظت‌شده پروتئین‌های LipL41 و OmpL1 باشد(Dong et al., 2008, Lin et al., 2013). 

نتیجه‌گیری نهایی

در سال های اخیر، بیوانفورماتیک و ایمونو انفورماتیک به عنوان ابزار قدرتمندی برای طراحی واکسن ظاهر شده اند. این رویکردهای محاسباتی انتخاب و بررسی ساختار پروتئین‌های ایمونوژن و نیز غربالگری سریع اپی‌توپ های بالقوه موثر را با در نظر گرفتن ایمنی زایی، پروفایل ایمنی و حفاظت شدگی آنها در میان سویه‌ها یا گونه‌های مختلف امکان پذیر می‌کند. ادغام این فن‌آوری‌ها با اعتبارسنجی تجربی، نویدبخش توسعه واکسن‌های نوترکیب مبتنی بر پروتئین‌های غشایی و یا واکسنی مرکب از اپی‌توپ‌های ایمونوژن این پروتیئن‌ها، مؤثر علیه لپتوسپیروز و در عین حال کاهش زمان و هزینه‌ تحقیقات آزمایشگاهی است.

سپاسگزاری

این مقاله قسمتی از طرح تحقیقاتی ارزیابی ایمنی‌زایی پروتئین‌های سطحی لپتوسپیرا مصوب موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی با کد 96045-105-18-18-01 و کد اخلاق IR.IAU.RASHT.REC.1402.042  مصوب دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان می باشد.

تعارض منافع

نویسندگان هیچ گونه تعارض منافعی را در این پژوهش شناسایی نکردند.

منابع

1.        Adler, B. (2015). Vaccines against leptospirosis. Leptospira and leptospirosis, 251-272. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-45059-8_10

2.       Adler, B. & Faine, S. (1977). Host immunological mechanisms in the resistance of mice to leptospiral infections. Infect Immun, 17, 67-72. https://doi.org/10.1128/iai.17.1.67-72.1977

3.       Balamurugan, V., Thirumalesh, S., Alamuri, A., SowjanyaKumari, S., Vinod Kumar, K., Linshamol, L., et al. (2021). Evaluation of the diagnostic potential of recombinant leptospiral OMP A‐like protein (Loa22) and transmembrane (OmpL37) protein in latex agglutination test for serodiagnosis of leptospirosis in animals. Lett Appl Microbiol, 72, 730-740. https://doi.org/10.1111/lam.13461

4.       Cerqueira, G. M., Souza, N. M., Araújo, E. R., Barros, A. T., Morais, Z. M., Vasconcellos, S. A., et al. (2011). Development of transcriptional fusions to assess Leptospira interrogans promoter activity. PLoS One, 6, e17409. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017409

5.       Clark, D. P. & Pazdernik, N. J. (2016). Recombinant Proteins. Biotechnology. Second Edition ed. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-385015-7.00001-6

6.       Clifford, J. N., Høie, M. H., Deleuran, S., Peters, B., Nielsen, M. & Marcatili, P. (2022). BepiPred‐3.0: Improved B‐cell epitope prediction using protein language models. Protein Science, 31, e4497. https://doi.org/10.1002/pro.4497

7.       Dellagostin, O. A., Grassmann, A. A., Rizzi, C., Schuch, R. A., Jorge, S., Oliveira, T. L., et al. (2017). Reverse vaccinology: an approach for identifying leptospiral vaccine candidates. Int J Mol Sci, 18, 158. https://doi.org/10.3390/ijms18010158

8.       Dhayabaran, V., Chidambaram, D. & Krishnaswamy, P. R. (2020). Identification of compounds for improved growth of Leptospira in culture and isolation. Diagn Microbiol Infect Dis, 96, 114923. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2019.114923

9.       Dong, H., Hu, Y., Xue, F., Sun, D., Ojcius, D. M., Mao, Y., et al. (2008). Characterization of the ompL1 gene of pathogenic Leptospira species in China and cross-immunogenicity of the OmpL1 protein. BMC Microbiol, 8, 1-12. https://doi.org/10.1186/1471-2180-8-223

10.       Fraser, T. & Brown, P. D. (2017). Temperature and Oxidative Stress as Triggers for Virulence Gene Expression in Pathogenic Leptospira spp. Front Microbiol, 8, 783. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.00783

11.       Gharakhani, M., Ghasemi, M. F., Khaki, P., Esmaelizad, M. & Tebianian, M. (2022). Improvement the Expression and Purification of Loa22: A Lipoprotein with OmpA domain from Pathogenic Leptospira Serovars. https://doi.org/10.18502/ijm.v15i5.13873

12.       Grassmann, A. A., Souza, J. D. & McBride, A. J. A. (2017). A universal vaccine against leptospirosis: are we going in the right direction? Front Immunol, 8, 256. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00256

13.       Haake, D. A. & Matsunaga, J. (2010). Leptospira: a spirochaete with a hybrid outer membrane. Molecular microbiology, 77, 805-814. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2010.07262.x

14.       Haake, D. A. & Zückert, W. R. (2015). The leptospiral outer membrane. Leptospira and Leptospirosis, 187-221. https://doi.org/10.1007/978-3-662-45059-8_8

15.       Hallgren, J., Tsirigos, K. D., Pedersen, M. D., Almagro Armenteros, J. J., Marcatili, P., Nielsen, H., et al. (2022). DeepTMHMM predicts alpha and beta transmembrane proteins using deep neural networks. BioRxiv, 2022.04. 08.487609. https://doi.org/10.1101/2022.04.08.487609

16.       Hidalgo, J., Rodriguez-Vega, G. M. & Arriaga, P. (2020). Leptospirosis. Evidence-Based Critical Care: A Case Study Approach. Cham: Springer International Publishing. 10.1007/978-3-030-26710-0_66

17.       Hsu, S.H., Chang, M.Y., Lin, S.M., Ko, Y.-C., Chou, L.-F., Tian, Y.-C., et al. (2021). Peptidoglycan mediates Leptospira outer membrane protein Loa22 to toll-like receptor 2 for inflammatory interaction: a novel innate immune recognition. Scientific reports, 11, 1-16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-79662-8

18.       Hsu, S.H. & Yang, C.W. (2022). Insight into the structure, functions, and dynamics of the leptospira outer membrane proteins with the pathogenicity. Membranes, 12, 300. https://doi.org/10.3390/membranes12030300

19.       Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., et al. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature, 596, 583-589. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2

20.       Kaur, D., Verma, R., Kumar, B., Deka, D. & Agrawal, R. K. (2014). Cloning, Phylogenetic Analysis and Expression of Recombinant LipL41, Loa22 and LipL21 Proteins from Leptospira interrogans. Int J Environ Agric Biotechnol, 7, 409-420. http://dx.doi.org/10.5958/2230-732X.2014.01345.X

21.       Koizumi, N. & Watanabe, H. (2003). Molecular cloning and characterization of a novel leptospiral lipoprotein with OmpA domain. FEMS Microbiol Lett, 226, 215-219. https://doi.org/10.1016/S0378-1097(03)00619-0

22.       Lin, M.H., Chang, Y.C., Hsiao, C.D., Huang, S.-H., Wang, M.-S., Ko, Y.-C., et al. (2013). LipL41, a hemin binding protein from Leptospira santarosai serovar Shermani. PLoS One, 8, e83246. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0083246

23.       Lin, X. a., Xiao, G., Luo, D., Kong, L., Chen, X., Sun, D., et al. (2016). Chimeric epitope vaccine against Leptospira interrogans infection and induced specific immunity in guinea pigs. BMC Microbiol, 16, 1-9. https://doi.org/10.1186/s12866-016-0852-y

24.       Mohammadi, Y. M., Khaki, P., Bidhendi, S. M. & Nofeli, M. (2022). Evaluation of the Presence of Gene Encoding Loa22 in Pathogenic Leptospira Serovars. Iran J Med Microbiol, 16(5), 392-398. http://dx.doi.org/10.30699/ijmm.16.5.392

25.       Monaris, D., Sbrogio-Almeida, M., Dib, C., Canhamero, T., Souza, G., Vasconcellos, S., et al. (2015). Protective immunity and reduced renal colonization induced by vaccines containing recombinant Leptospira interrogans outer membrane proteins and flagellin adjuvant. Clin Vaccine Immunol, 22, 965-973. https://doi.org/10.1128/CVI.00285-15

26.       Nazifi, N., Mousavi, S. M., Moradi, S., Jaydari, A., Jahandar, M. H. & Forouharmehr, A. (2018). In Silico B Cell and T Cell epitopes evaluation of lipL32 and OmpL1 proteins for designing a recombinant multi-epitope vaccine against leptospirosis. International Journal of Infection, 5. https://doi.org/10.5812/iji.63255

27.       Raja, V. & Natarajaseenivasan, K. (2015). Pathogenic, diagnostic and vaccine potential of leptospiral outer membrane proteins (OMPs). Crit Rev Microbiol, 41, 1-17. https://doi.org/10.3109/1040841X.2013.787387

28.       Ristow, P., Bourhy, P., McBride, F. W. d. C., Figueira, C. P., Huerre, M., Ave, P., et al. (2007). The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog, 3, e97. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.0030097

29.       Victor, A. A. R., Abraham, S., Tennyson, J. & Pradhan, N. (2015). In silico prediction and threading based epitope mapping of OmpA-like outer membrane Leptospiral Lipoprotein Loa22. Int J Sci Eng Res, 6, 477-485.

30.       Yan, W., Faisal, S. M., McDonough, S. P., Chang, C.-F., Pan, M.-J., Akey, B., et al. (2010). Identification and characterization of OmpA-like proteins as novel vaccine candidates for Leptospirosis. Vaccine, 28, 2277-2283. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2009.12.071

31.       Zhang, Y., Bao, L., Zhu, H., Huang, B. & Zhang, H. (2010). OmpA-like protein Loa22 from Leptospira interrogans serovar Lai is cytotoxic to cultured rat renal cells and promotes inflammatory responses. Acta Biochim Biophys Sin, 42, 70-79. https://doi.org/10.1093/abbs/gmp109 

 

 

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

In Silico Designing and Optimization of Loa22 Protein in Pathogenic Leptospira Serovars for Use in Recombinant Vaccine

Mehdi Gharakhani1, Mohammad Faezi Ghasemi2, Pejvak khaki3*, Majid Esmaelizad4, Majid Tebianian5

1. PhD Student, Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, Iran 

2. Associate Professor, Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Lahijan Branch, Islamic Azad University, Lahijan, Iran

3. Associate Professor, Department of Microbiology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran 

4. Associate Professor, Department of Research and Development, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran 

5. Associate Professor, Department of Immunology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran  

Abstract

Leptospirosis, caused by pathogenic Leptospira species, is a globally prevalent zoonotic disease with significant public health implications. Developing an effective vaccine against leptospirosis remains a challenge due to the complex nature of the pathogen and its outer membrane proteins (OMPs). The outer membrane protein Loa22 has been proposed as a potential vaccine due to its immunogenic properties. The study aims to explore the application of bioinformatics and immunoinformatics in studying the Loa22 protein, elucidating its structural and functional characteristics, and assessing its potential as a vaccine candidate for leptospirosis. Based on the findings of multiple sequence alignment, Loa22 protein showed more than 99% convergence in different strains of pathogenic leptospira. The evaluation of different features of this protein showed it to be an immunogenic, non-toxic, and non-allergenic antigen that can induce immune responses against Leptospira infection. Also, based on the predictions, it was shown that Loa22 protein is a stable structure, soluble, and has antigenic areas of T and B cell epitopes, which are conserved in all pathogenic serovars and can be used in the design of the recombinant vaccine or the use of its immunogenic epitopes in the combination with the immunogen epitopes of other conserved proteins of Leptospira outer membrane should be used in the design of multi-epitope vaccine.

Keywords: Leptospirosis, Leptospira, Protein Loa22, Bioinformatics, Immunoinformatics 

*Corresponding author: Pejvak khaki

Address: Department of Microbiology, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education andExtension Organization (AREEO), Karaj, Iran

E. mail: [e-mail]