ارزیابی توانایی آنتاگونیستی دو جدایه از قارچ Trichoderma harzianum علیه نماتد ریشه گرهی توتون Meloidogyne incognita در آزمایشگاه
الموضوعات :
1 - محقق گروه بیوتکنولوژی مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش
الکلمات المفتاحية: مهار زیستی, قارچ آنتاگونیست, Nicotiana tabacum, Trichoderma harzianum BI, T. harzianum Iran 2375c,
ملخص المقالة :
نماتدهای ریشهگرهی Meloidogyne spp. بهدلیل نحوه خسارت و دامنه میزبانی وسیع از نظر اقتصادی از مهمترین نماتدهای انگل گیاهی در سطح جهان میباشند. در سالیان اخیر، مهار زیستی نماتدهای ریشهگرهی، با هدف کاهش اثرات خطرناک سموم شیمیایی از جمله تهدید سلامت بشر و آلودگی محیط زیست، یک اولویت بهشمار میرود. آنتاگونیستها یکی از عوامل مؤثر در کنترل زیستی میباشند. یکی از مهمترین آنتاگونیستها، قارچ Trichoderma harzianum بوده که دارای توانایی بسیار زیادی برای مهار زیستی عوامل بیماریزای گیاهی از جمله نماتدها است. بهمنظور مهار زیستی نماتد ریشهگرهی توتون Meloidogyne incognita، اثر آنتاگونیستی دو جدایه از قارچ Trichoderma harzianum در شرایط آزمایشگاه در قالب طرح کاملاً تصادفی در چهار تکرار مورد بررسی قرار گرفت. در مطالعات آزمایشگاهی، تأثیر عصاره کشت دو گونه قارچ تریکودرما به نامهای Trichoderma harzianum BI و Trichoderma harzianum Iran 2375c با غلظت 106 اسپور در میلیلیتر، روی مرگومیر لاروهای جوان سن دوم و نرخ تفریخ تخم نماتد M. incognita در گیاه توتون، طی 48 و 72 ساعت ارزیابی شدند. شرایط آزمایشی تا 14 روز حفظ شدند. نتایج مقایسه میانگینها نشان داد که مؤثرترین تیمار، جدایه T. harzianum BI بود که پس از 14 روز، سبب کاهش 7/86 درصد در نرخ تفریخ تخم و بعد از 72 ساعت، موجب 5/69 درصد مرگومیر روی لاروهای سن دوم نماتد گردید. در مجموع، نتایج بهدست آمده از این پژوهش نشان داد که عصاره کشت هر دو جدایه قارچی از توانایی آنتاگونیستی خوبی علیه نماتد M. incognita برخوردار میباشند.
ابوترابی، ا. و نراقی، ل. 1395. مهار زیستی نماتد ریشه¬گرهی (Meloidogyne javanica) در گوجه¬فرنگی با استفاده از قارچ¬های Talaromyces flavus و Trichoderma harzianum در شرایط گلخانه. مهار زیستی در گیاه¬پزشکی 4(2): 1-9.
ایزدپناه، ک.، اشکان، م.، بنی¬هاشمی، ض.، رحیمیان، ح. و میناسیان، و. 1389. بیماری¬شناسی گیاهی. نشر آییژ. 328 صفحه.
پیری¬پور، ن.، عباسی، خ. و بیگی، س. 1401. ارزیابی آنتاگونیستی برخی جدایه¬های قارچی روی نماتد ریشه¬گرهی خیار (Meloidogyne javanica) در شرایط آزمایشگاه و گلخانه. دو فصلنامه علمی علوم سبزی¬ها 11 (1): 113-127.
حـیدری، ف. و اولـیاء، م. 1396. بـررسی کاربرد جـداگانه و تلفیقی قارچ Trichoderma harzianum i2375c و ورمی¬کمپوست در مهار زیستی نماتد ریشه¬گرهی گوجه¬فرنگی (M. javanica). پژوهش¬های کاربردی در گیاه¬پزشکی 6 (3): 1-12.
صاحبـانی، ن.، روسـتـایـی، ع. و هـادوی، ن. 1385. بررسی کنترل بیولوژیک نماتد مولد گره ریشه (Meloidogyne javanica) توسط قارچ Trichoderma viride. علوم کشاورزی ایران 37(3): 405-411.
ملکی¬زیارتی، ح.، روستایی، ع.، صاحبانی، ن.، اعتباریان، ح.ر. و امینیان، ح. 1388. بررسی امکان کنترل بیولوژیـک نـماتد مـولـد گـره ریـشه گوجه¬فرنگی Meloidogyne javanica (Trube) Chitwood به وسیله قارچ Trichoderma harzianum Rifai در گلخانه و تغییرات کمی ترکیبات فنلی در گیاه. مجله به¬زراعی نـهـال و بذر 25(3): 259-272.
نـاصـری¬نسـب، ف.، صاحبـانـی، ن. و اعتبـاریـان، ح. ر. 1392. مطالعـه اثــر قــارچ آنـتاگونیست Trichoderma harzianum BI بر القای پاسخ دفاعی گیاه گوجه¬فرنگی علیه نماتد مولد گره¬ریشه (Meloidogyne javanica). تحقیقات بیماری¬های گیاهی 1(4): 12–1.
نعیمی، س.، رهنما، ک.، طاهری، ع. و داوران، ت. 1392. بررسی اثر متقابل قارچ Trichoderma spp. با نماتد مولد گره¬ریشه (Meloidogyne spp.) روی گوجه¬فرنگی در شرایط گلخانه¬ای. دومین همایش ملی توسعه پایدار کشاورزی و محیط زیست سالم. صفحه 10.
هاشمی، م.، اولیاء، م. و جمالی زواره، ع. 1397. مهار زیستی نماتد ریشه¬گرهی (Meloidogyne incognita) توسط قارچ Trichoderma harziannum Iran 2375c در خیار. مهار زیستی در گیاه¬پزشکی 6(2): 81-91.
Al-Ameiri, N.S. 2009. Efficiency of Jordanian Trichoderma harzianum (Rifai) isolates against Meloidogyne javanica (Treub) on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Jordan Journal of Agricultural Sciences 5: 446-457.
Al-Fattah, A., Dababat, A. and Sikora, A. 2007. Use of Trichoderma harzianum and Trichoderma viride for the biological control of Meloidogyne incognita on tomato. Jordan Journal Agricultural Sciences 3: 297-309.
Benitez, T., Rincon, M.A., Limon, M.C. and codon, A.C. 2004. Biological mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology 7: 249-260.
Brants, A., Brrown, C.R. and Earir, E.D. 2000. Trichoderma harzianum endochitinase does not provide resistance to Meloidogyne hapla in tobacco. Journal of Nematology 32: 289-296.
Elad, I., Chet, I. and PandKatan, J. 1980. Trichoderma harzianum: A biological agent effective against Sclerotinia rolfsii and Rhizoctinia solani. Phytopathology 70: 119-121.
El-Ghaouth A., Wilson, C.L. and Wisniewski, M. 1998. Ultrastructural and cytochemical aspects of the biological control of Botrytis cinerea by Candida saitoana in apple fruit. Journal of Phytopathology 88: 282-291.
Harman, G.E. 2006. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96(2): 190-194.
Howell, C.R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Disease 87(1): 4-10.
Hussey, R.S and Barker, K.R. 1973. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter 57: 1025-1028.
Irfan, U.D., Saifullah-Khan, H. and Khattak, B. 2005. Biological control of Meloidogyne javanica with Trichoderma harzianum and spent mushroom compost in tomato under field conditions. Pakistan Journal of Phytopathology 17: 144-145.
Jepson, S.B. 1987. Identification of Root–Knot Nematodes Meloidogyne species. Wallingford, UK: CAB International. 265pp.
Khan, T.A. and Saxena, S.K. 1997. Effect of root dip treatment with fungal filtrates on root penetration, development and reproduction of Meloidogyne javanica on tomato. International Journal of Nematology 7: 85-88.
Khattak, B. and Stephen, S.M. 2008. Effect of some indigenous isolates of Trichoderma harzianum on root knot nematode, Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood. Sarhad Journal of Agriculture 24: 285-288.
Meyer, S.L.F., Massoud, S.I., Chitwood, D.J. and Roberts, D.P. 2000. Evaluation of Trichoderma virens and Burkholderia cepacia for antagonistic activity against root knot nematode, Meloidogyne incognita. Nematology 2(8): 871-879.
Samuels, G.J. 1996. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. Mycological Research 100(8): 923-935.
Schuster, A. and Schmoll, M. 2010. Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied Microbiology and Biotechnology 87(3): 787-799.
Saiffullah Khan, H. and Thomas, B.J. 1996. Studies on the parasitism of Globodera rostochiensis by Trichoderma harzianum using low temperature scanning electron microscopy. Afro-Asian Journal of Nematology 6: 117-122.
Sikora, R.A., Niere, B. and Kimenju, J. 2003. Endophytic microbial biodiversity and plant nematode management in African agriculture. pp. 179-192. In: Neuenschwander, P., Borgermeister, C. and Langewald, J. (eds.). Biological Control in IPM Systems in Africa. Wallingford, UK: CABI Publishing.
Sharon, E., Bar-Eyal, M., Chet, I., Herrera-Estrella, A., Kleifeld, O. and Spiegel, Y. 2001. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum. Phytopathology 91(7): 687-693.
Sharon, E., Chet, I., Viterbo, A., Bar-Eyal, M., Nagan, H. and Samuels, G.J. 2007. Parasitism of Trichoderma on Meloidogyne javanica and role of the gelatinous matrix. European Journal of Plant Pathology 118: 247-258.
Siddiqui, I.A., Amer Zareen, M., Javad Zaki, M. and Shaukat, S.S. 2001. Use of Trichoderma species in the control of Meloidogyne javanica, root-knot nematode in the okra and mung bean. Pakistan Journal of Biological Sciences 4(7): 846-848.
Weindling, R. 1932. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology 22(10): 837-845.
Windham, G.I., Windham, M.T. and Williams, W.P. 1989. Effects of Trichoderma spp. on maize growth and Meloidogyne arenaria reproduction. Plant Disease 73: 493-495.
گیاهپزشکی کاربردی، جلد 13، شماره 1، سال 1403
ارزیابی توانایی آنتاگونیستی دو جدایه از قارچ Trichoderma harzianum علیه نماتد ریشهگرهی توتون Meloidogyne incognita در آزمایشگاه
Evaluation of the antagonistic ability of two isolates of Trichoderma harzianum against Tobacco root-knot nematode (Meloidogyne incognita)
مرضیه شازده احمدی*
دریافت: 11/2/1403 پذیرش: 18/4/1403
چکیده
واژگان کلیدی: مهار زیستی، قارچ آنتاگونیست، Nicotiana tabacum، Trichoderma harzianum BI، T. harzianum Iran 2375c
مقدمه
توتون، Nicotiana tabacum L.، یکی از گیاهان مهم زراعی و صنعتی است که توجه به کمیت و کیفیت آن، حائز اهمیت بسیار میباشد. این گیاه، مورد حمله انواع مختلفی از بیماریها و آفات، بهویژه نماتد ریشهگرهی قرار میگیرد. نماتدهای ریشهگرهی جنس Meloidogyne، با توجه به وسعت انتشار و دامنه وسیع میزبانی، از شایعترین و مهمترین نمـاتدهای خسارتزای محصولات کشاورزی در جهان هستند (ایزدپناه و همکاران، 1389). مشخصترین نشانههای این بیماری در قسمتهای زیرزمینی گیاه بهوجود میآید. روی ریشههای آلوده، گالهای گره مانندی ایجاد میشود. قطر ریشههای آلوده به نماتد، دو یا چند برابر قطر ریشههای سالم بوده و گرههای تولید شده در طول ریشه، ظاهری خشن و گرز مانند به آن میدهند.
محقق، بخش بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش، بهشهر، مازندران، ایران
نویسنده مسئول مکاتبات: noshinshazdeahmadi@yahoo.com
علایم این بیماری در اندامهای هوایی، مشابه علایم سایر عوامل بیماریزای ریشه است؛ شامل کاهش رشد اندامهای هوایی، علایمی مشابه کمبود مواد غذایی در برگ، کلروز، پژمردگی و کاهش محصول. شدت این علایم، اغلب به تعداد لاروهای سن دومی که به ریشه نفوذ میکنند، بستگی دارد. عوامل محیطی نیز بر میزان خسارت به گیاه اثر میگذارند. عواملی مانند خشکی یا دمای بالا که باعث ایجاد تنش در گیاه میشوند، میزان خسارت را افزایش میدهند. علایم ایجاد شده در اندامهای هوایی، به میزان تأثیری که نماتد بر جذب آب و مواد غذایی بهوسیله ریشهها و انتقال آنها به سمت بالای گیاه میگذارد، بستگی دارند (Al-Ameiri, 2009).
آگاهی در مورد برهمکنشهای بین نماتد- میزبان، سبب پیشرفت در روشهای نوین مدیریت نماتدها شده و میتواند به راهکارهای موفق در رابطه انگلی نماتدها با میزبان غلبه کند. برای مهار نماتدهای ریشهگرهی، روشهای متفاوتی مانند تناوب زراعی، استفاده از ارقام مقاوم و نماتدکشهای شیمیایی توصیه میشوند. بهطورکلی مدیریت بیماریهای خاکزاد بسیار مشکل بوده و از بین بردن آنها توسط روشهای شیمیایی بسیار هزینهبر و خطرناک است. تا چند سال اخیر کاربرد سموم شیمیایی، رایجترین روش در مدیریت این بیمارگر بوده است، اما در حال حاضر بر اساس توافقات بینالمللی، کاربرد نماتدکشهای شیمیایی در بعضی از کشورها به دلایلی از قبیل اثرات مخرب آنها روی محیط زیست، سرطانزایی در انسان، ماندگاری در خاک و آلودگی آبهای زیرزمینی ممنوع شده است (نعیمی و همکاران، 1392).
در دهههای اخیر، مدیریت زیستی بیمارگرهای گیاهی با استفاده از میکروارگانیسمها، توجه بسیاری از محققان را به خود جلب نموده است. تحقیقات نشان داده که استفاده از آنتاگونیستهای مختلف از جمله قارچ تریکودرما به محیط خاک و ریزوسفر، میتواند از خسارت بیماری تا زیر آستانه زیان اقتصادی بکاهد (پیریپور و همکاران، 1401). موفقیت در مدیریت بیماریهای گیاهی همراه با سلامت محیط زیست، توانسته مدیریت زیستی را یکی از مقبولترین روشها در مدیریت تلفیقی بیماریهای گیاهی معرفی نماید. کنترل زیستی، دارای مکانیسمهای مختلفی میباشد که توسط محققان مختلف مورد بررسی قرار گرفته است. برخی از این مکانیسمها شامل آنتیبیوز، رقابت برای فضا و مواد غذایی (بهخصوص آهن غیر قابل جذب)، تولید آنزیمهای تجزیهکننده و پارازیتیسم، افزایش رشد گیاه و القا مقاومت میباشند (حیدری و اولیاء، 1396). عوامل کنترل زیستی قارچی، در دو دهه اخیر از اهمیت زیادی در مدیریت بیماریهای گیاهی برخوردار شدهاند. آنتاگونیستهای قارچی مانند Trichoderma بهطور چشمگیری برای مدیریت بسیاری از عوامل بیماریزای گیاهی بهکار میروند. گونههای قارچ Trichoderma sp.، از جمله هیفومیستهای خاکزی هستند که بهدلیل تنوع متابولیسمی و قدرت رقابتی در اغلب مناطق از موجودات غالب میکروفلور خاک میباشـند. ایـن قارچ، ترکیبـات متنـوعی با خاصیـت آنتی‌بیوتیـکی تولید میکند؛ برای مثـال، جدایـههای مخـتـلـف این قارچ، بـیـش از یکصد نوع متابـولـیـت با خاصـیـت آنتیبیوتیکی تولید میکنند (Schuster and Schmoll, 2010). قارچ Trichoderma با مواد مترشحه از بذرها که باعث تحریک جوانهزنی اسپور قارچ میشود و نیز برای تصاحب غذا و مکان، با میکروارگانیسمهای ریزوپلان رقابت میکند. گونههای مختلف قارچ Trichoderma بهعنوان محرک رشد و توسعه گیاهان عمل میکنند و باعث بهبود رشد در سیستمهای کنترل شده و طبیعی میگردند (Harman, 2006). تحقیقات متعددی نیز القای مقاومت سیستمیک در گیاه توسط گونههای Trichoderma را تأیید کردهاند. کلونیزه شدن سطح ریشه گیاه توسط قارچ Trichoderma میتواند با ایجاد مقاومت القایی سیستمیک، منجر به کاهش حمله مستقیم عوامل بیماریزا گردد. علاوه بر این ویژگیها، جدایههای این قارچ، با تولید آنزیمها و سایر متابولیتها بهعنوان عوامل قارچی مهم در مهار زیستی مورد توجه قرار گرفتهاند (Samuels, 1996).
در مطالعهای، بیان شد که موفقیت در کنترل بیماریهای گیاهی همراه با سـلـامت محیـط زیـست، توانسته کنترل زیستی را یکـی از مـقبـولتـریـن روشهای کنـتـرل بیماریهای گـیاهی در مـبارزه تـلفـیقـی مـعـرفی نمـاید. در این راستا، استفاده از میـکروارگانـیسـمهای مفید خاک، مانند گـونـههای مخـتلف تریکودرمـا از اهداف کشـاورزی پایدار بهشمار میروند (Siddiqui et al., 2001).
استفاده از گونههای مختلف جنس Trichoderma بهعنوان عوامل کنترل زیستی، نخستین بار توسط ویندلینگ، مطرح و مورد بررسی قرار گرفت (Weindling, 1932). گونههای مختلف قارچ Trichoderma از جمله قارچهاي آزادزی هستند و در تعامل با میکروارگانیسمهای دیگر بوده و تقريباً در تمام زيستگاههاي متنوع وجود دارند. قارچ T. harzianum سازوكارهاي مختلفي، از جمله تأثير مستقيم بر نماتد و تخم آنها دارد و عامل مهمي جهت کنترل زیستی M. arenaria بهشمار ميرود (Windham et al., 1989). گونههای قارچ Trichoderma بهعلت داشتن نرخ تولیدمثلی زیاد علیه عوامل بیماریزا، بهکارگیری مکانیسمهای رقابت، خاصیت انگلی، آنتیبیوز و تولید آنزیمهای خارج سلولی نظیر آنزیمهای آمیلولیتیک، پکتولیتیک، پروتولیتیک، لیپولیتیک، کینولیتیک و سلولیتیک و همچنین، کارآیی در تحریک رشد و القای مقاومت در گیاهان، در زمره عوامل مهم کنترل زیستی بسیاری از عوامل بیماریزا، از جمله نماتدهای انگل گیاهی قرار دارند (Howell, 2003). در تحقیقی مشخص شد که رشد گیاهان گوجهفرنگی تیمار شده با جدایه T. harzianum T-203 پس از کشت در خاکهای آلوده به نماتد ریشهگرهی، افزایش یافته و گالهای ریشه در مقایسه با شاهد (بدون قارچ) کاهش یافت (Sharon et al., 2001). در پژوهشی گزارش شد که تیمار خاک با قارچ T. harzianum T12 و T. koningii منجر به کاهش تولید توده تخـم در نماتد M. arenaria گردید (Windham et al., 1989). با بررسی اثر پارازیتیسم مستقیم بین قارچ T. harzianum و نماتد مولد سیست طلایی سیبزمینی در شرایط آزمایشگاهی، نتیجه گرفتـه شد که قارچ در سیـست و تخـم داخل آن نفـوذ کرده و قادر به از بین بردن لاروهای نماتد میباشد (Saiffullah and Thomas, 1996). مـطالعـه ارتبـاط متقابل بـین مـیسلـیوم قـارچ T. harzianum و مـیـسلـیوم چنـدین قـارچ بـیمارگر گیاهی، مؤیـد قدرت بالای پارازیـتیـسم قـارچ تـریکودرما میباشد (Elad et al., 1980).
هدف از این تحقیق، ارزیابی توانایی آنتاگونیستی دو گونه از قارچ تریکودرما به نامهای Trichoderma harzianum BI و Trichoderma harzianum Iran 2375c برای کنترل نماتد ریشهگرهی توتون Meloidogyne incognita بوده است و اثر آنها روی کاهش خسارت ناشی از این نماتد، در دو آزمایش جداگانه در شرایط آزمایشگاهی بررسی شده است.
مواد و روشها
عامل بیماری
ریشههای توتون آلوده به نماتد ریشهگرهی از سه مزرعه توتون آلوده در اطراف شهرستان گرگان، تهیه و از هر مزرعه، پنج نمونه جمعآوری و به آزمایشگاه گیاهپزشکی مرکز تحقیقات و آموزش توتون تیرتاش منتقل شدند. تکثیر نماتد با روش توده تخم منفرد روی توتون رقم K326 انجام شد. برای شناسایی گونه نماتد، از انتهای بدن نـماتـد ماده، مطابق کلید (Jepson, 1987)، برش تهیه و مشخصات ریختی آن بررسی گردید. پس از چندین دوره تکثیر متوالی نماتد، جمعیت کافی از نماتد خالص M. incognita تولید شد. استخراج تخم و لارو سن دو نماتد با استفاده از روش (Hussey and Barker, 1973) انجام شد.
تهیه جدایههای قارچ آنتاگونیست
دو جدایه از قارچ تریکودرما به نامهای Trichoderma harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c از آزمایشگاه گروه گیاهپزشکی پردیس ابوریحان دانشگاه تهران، بهصورت خالص تهیه شد. به منظور تهیه تک اسپور و تکثیر این دو جدایه، برای هر یک بهطور جداگانه، قطعاتی با اندازه پنج تا هفت میلیمتر از حاشیه فعال پرگنه درون ظروف پتریدیش حاوی محیط کشت PDA=Potato Dextrose Agar قرار داده شد و سپس، بهمدت 48 ساعت، در دمای 28 درجه سلسیوس، درون انکوباتور نگهداری گردیدند. پس از تهیه سوسپانسیون اسپور در آب مقطر استریل، با استفاده از لام گـلبولشمار، غلـظت مؤثر spore/mL 106 از این دو قارچ آنتاگونیست، برای استفاده در آزمایشات، تهیه شد (ناصرینسب و همکاران، 1392).
اثر مستقیم قارچهای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی تفریخ تخم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه
در این آزمایش، پلاکهای پنج میلیمتری از کشت هفت روزه قارچهای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c بهطور جداگانه برای هر جدایه، در وسط ظروف پتری حاوی آب آگار دو درصد قرار داده شد و پس از رسیدن کلنی قارچ به حاشیه پتری (پس از 10 روز)، یک میلیلیتر آب مقطر استریل حاوی جمعیت 50 عدد تخم M. incognita استریل شده توسط هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد به تشتکهای پتری اضافه شد. به پتریهای شاهد، که فقط حاوی آب مقطر استریل و بدون قارچ بودند، نیز به همان نسبت، سوسپانسیون تخم اضافه شد. سپس، پتریها، بهمدت 14 روز در تاریکی و در دمای 28 درجه سلسیوس، نگهداری شدند و بعد از گذشت این زمان، تعداد تخمهای تفریخ شده نماتد در تیمار و شاهد شمارش شدند (Irfan et al., 2005).
اثر مستقیم قارچهای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی مرگومیر لاروهای سن دو نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه
در این آزمایش، از کشت 10 روزه دو جدایه T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c بهطور جداگانه برای هر جدایه، روی محیط آب آگار استفاده شد و سوسپانسیونی از لاروهای تازه تفریخ شده و استریل نماتد با جمعیت حدود 30 لارو در یک میلیلیتر آب مقطر استریل تهیه و به تشتکهای پتری اضافه و سپس، درون انکوباتور با دمای 28 درجه سلسیوس، نگهداری شدند. پس از گذشت 48 و 72 ساعت، میزان مرگومیر لاروها در پتریهای تیمار و شاهد شمارش شدند. پتریهای شاهد، فقط حاوی آب مقطر استریل و بدون قارچ بودند (Irfan et al., 2005).
کلیه آزمایشات، در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار در شرایط آزمایشگاه اجرا شد. دادههای حاصل از این تحقیق، با استفاده از نرمافزار آماری SAS (9.1) آنالیز و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون LSD انجام شد.
نتایج
شناسایی گونه نماتد ریشهگرهی
گونه نماتد با استفاده از خصوصیات ریختشناسی نماتد مـاده و بـا اسـتـفاده از کـلیـد شـنـاسـایی (Jepson, 1987)، M. incognita تشخیص داده شد (شکل 1- a و b).
شکل 1- نماتد ماده ریشهگرهی (M. incognita) با بزرگنمایی × 40 (a) الگوی انتهای بدن نماتد ماده گونه incognita M. (b)
Fig. 1. Root-Knot nematode, M.. incognita X40 (a) Perineal pattern on female M. incognita nematodes (b)
بررسـی اثر مـستـقـیم قارچهای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی تفـریـخ تخم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه
نتایج حاصل از این بررسی، بیانگر نقش مؤثـر و معنیدار دو جدایه از قـارچهـای آنتـاگـونـیسـت T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی عدم تفریخ تخم و هـمچنین، مرگومیر لاروهای سن دوم نـماتـد ریـشهگـرهی تـوتون (M. incognita) بود.
نتایج حاصل از بررسی اثر مستقیم جدایههای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c در شرایط آزمایشگاه، نشـان داد که بـیشـتـرین درصـد تخـمهای تفریـخ نـشده نـماتـد M. incognita پـس از 14 روز، در اثـر تـیمار با جدایه T. harzianum BI بـا حـدود 7/86 درصـد مشـاهـده شـد که در بالاترین گروه آماری قرار گـرفـت و بـعـد از آن، تـیـمار T. harzianum Iran 2375c قرار داشت که دارای 77 درصد تأثیر روی عدم تفریخ تخم این نماتد بود. تیمار شاهد که در آن فقط از آب مقطر استریل علیه تفریخ تخمهای این نماتد استفاده شده بود، با 19 درصد تأثیر، دارای کمترین میزان بوده و در پایینترین گروه آماری نسبت به سایر تیمارها قرار داشت (جدول 1).
جدول 1- اثر جدایههای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c بر تفریخ تخم و مرگومیر لاروهای سن دوم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه
Table 1. The effect of T. harzianum BI and T. harzianum Iran 2375c isolates on the hatching of nematode M. incognita eggs and larval mortality in laboratory conditions
تیمار Treatment | نرخ بازدارندگی از تفریخ تخم پس از 14 روز (%) Suppression rate of egg hatching in 14 days (%) | مرگومیر لاروهای سن دوم (%) Mortality of second stage juvenile (J2) (%) | |
48 ساعت 48 h | 72 ساعت 72 h | ||
T. harzianum BI | b 86.7 | a 59.1 | a 69.5 |
T. harzianum Iran 2375c | b 77 | b 48.2 | b 60.1 |
شاهد Control | c 19 | c 10.8 | 21.3 a |
میانگینهایی که در هر ستون، با حروف مختلف نشان داده شدهاند، با همدیگر دارای اختلاف معنیدار در سطح احتمال یک درصد میباشند.
The averages shown with different letters in each column have a significant difference with each other at the 1% probability level.
بررسی اثر مستقیم قارچهای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی مرگومیر لاروهای سن دو نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه
بررسی نتایج حاصل از اثر مستقیم جدایههای T. harzianum BI و T. harzianum Iran 2375c روی درصد مرگومیر لاروهای سن دوم نماتد M. incognita در شرایط آزمایشگاه، نشان داد که جدایههای مورد استفاده قارچ تریکودرما، توانستند بهخوبی تعداد لاروهای نماتد را کاهش دهند. در این آزمایش، درصد مرگومیر لاروها بعد از گذشت 48 و 72 سـاعت اندازهگیری شد. بیشترین درصد مرگومیر لاروهای نماتد M. incognita در تیمار T. harzianum BI مشاهده شد که بعد از گذشت 72 ساعت، باعث افزایش مرگومیر لاروهـای سـن دوم نمـاتـد بـه میزان 5/69 درصد گردید. بـعـد از آن، تـیـمار T. harzianum Iran 2375c قرار داشت که بعد از گذشت 72 ساعت، باعث افزایش مرگومیر لاروهای سن دوم نماتد به میزان 1/60 درصد شد. کمترین درصد مرگومیر لاروها، مربوط به تیمار شاهد بود که بعد از گذشت 48 ساعت، دارای 8/10 درصد تأثیر و بعد از گذشت 72 ساعت، دارای 3/21 درصد تأثیر روی درصد مرگومیر لاروهای سن دوم نماتد M. incognita بود که در پایینترین گروه آماری قرار گرفت (جدول 1).
بحث
نتایج آزمایشات کنترل زیستی دو جدایه از قارچ T. harzianum علیه نماتد ریشهگرهی توتون در شرایط آزمایشگاه، نشان داد که این آنتاگونیستها، توانایی پارازیته نمودن تخم و همچنین لاروهای سن دوم نماتد در محیط کشت را دارا میباشند. این توانایی میتواند در اثر تولید ترکیبات آنتی‌بیوتیک و متابولیتهای ثانویه و همچنین تولید برخی آنزیمهای تجزیهکننده کوتیکول نماتدها مانند پروتئاز در مقابل لاروهای سن دوم نماتد باشد (Khan and Saxena, 1997). با توجه به نتایج حاصل از تحقیقات متعدد، میتوان استنباط کرد که غلظت 106 اسپور در میلیلیتر از قارچ T. harzianum میتواند بهعنوان یک غلظت مؤثر در مبارزه با نماتد ریشهگرهی در مطالعات انتخاب شود (صاحبانی و همکاران، 1385؛ ملکی زیارتی و همکاران، 1388؛ ناصرینسب و همکاران، 1392). بررسی میزان تأثیر غلظتهای مختلف قارچ T. harzianum علیه نماتد M. javanica نشان داد که وزن تر ریشه در غلظت 106 اسپور در میلیلیتر از این قارچ، نسبت به غلظتهای کمتر و شاهد، اختلاف معنیدار داشت. بررسی مقایسه غلظتهای مختلف قارچ T. harzianum روی وزن تر اندام هوایی نشان داد که غلظت 106 اسپور در میلیلیتر از این قارچ، نسبت به سایر غلظتها و شاهد، اختلاف معنیدار داشت (ملکیزیارتی و همکاران، 1388).
با توجه به وجود کیتین در لایههای میانی پوسته تخم نماتد با ضخامت 4/0 میکرومتر، به نظر میرسد که این دو جدایه از قارچ T. harzianum، توسط تولید آنزیم کیتیناز، مانع از تفریخ تخمهای نماتد میشوند (Brant et al., 2000). در تحقیق مشابهی، متابولیتهای خارج سلولی در آزمایش محیط کشت فیلتر شده تریکودرما توانستند به میزان 8/30 درصد، باعث مرگومیر لاروهای سن دوم نماتد ریشهگرهی در گوجهفرنگی شوند (Al Fattah et al., 2007). در پژوهش دیگری، جدایه Th از قارچ T. harzianum توانست تعداد گالها را بر روی ریشه گیاه گوجهفرنگی کاهش دهد (Khattak and Stephen, 2008). در پژوهش دیگری، جدایه T. virens G1-3 در کاهش جمعیت نماتد ریشهگرهی (M. incognita) مـؤثـر شـناخته شد (Meyer et al., 2000). این جدایه و باکتری Burkholderia cepacia Bc-2 علیه این نماتد مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده گردید که محیط کشت فیلتر شده حاوی ترکیبات خارج سلولی قارچ و باکتری، از تفریخ تخم و حرکت لاروهای سن دوم نماتد جلوگیری کرد. همچنین، آغشته کردن ریشههای گوجهفرنگی به محیط کشت فیلتر شده T. virens باعـث شـد که تعداد تخم و لارو نماتد در گرم ریشه، به میزان 42 درصـد نسـبت به شاهـد، کـاهش یابد. در تحـقـیق حاضر، نیز جـدایه T. harzianum BI روی تفریخ تخم نماتد M. incognita به میزان 7/86 درصد و روی درصد مرگومیر لاروهای سن دوم، بعد از گذشت 48 و 72 ساعت به ترتیب، به میزان 1/59 و 5/69 درصد مؤثر بوده است.
در پژوهش انجام شده توسط هاشمی و همکاران (1397) به منظور مهار زیستی نماتد ریشهگرهی (M. incognita) توسط جدایه قارچ T. harzianum Iran 2375c در گیاه خیار، گزارش شد که بین زمانهای مختلف مورد مطالعه (24، 48 و 72 ساعت)، اختلاف معنیدار وجود داشت و مؤثرترین زمان در مرگومیر لاروهای جوان سن دو و همچنین، عدم تفریخ تخم نماتد، زمان 72 ساعت بود، که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر مطابقت داشت.
در پژوهش دیگری، اثر عصاره کشت سه جدایه Th-3، Th-2 و Th-1 از قارچ T. harzianum علیه لاروهای جوان سن دوم نماتد M. javanica بهکار برده شد و اختلاف معنیداری در مرگومیر لاروهای جوان سن دوم در همه جدایهها، نسبت به شاهد مشاهده گردید (Al-Ameiri, 2009) که با نتایج حاصل از تحقیق حاضر مطابقت داشت. نتایج ارزیابی عدم تفریخ تخم نماتد M. javanica تحت تأثیر دو جدایه از قارچ T. harzianum (شهرکرد و همدان)، بیانگر بیشترین اثر ممانعتکننده بر تفریخ تخم از جدایه شهرکرد طی 24 ساعت بود (حیدری و اولیاء، 1396).
در پژوهـش دیگری جدایه T. harzianum T-12 و T. koningii T-8 در کاهش تولید تخـم و لارو نمـاتـد ریـشـهگـرهی (M. arenaria) در خاک تأثیر داشت (Windham et al., 1989). اثر متقابل بین قارچ T. harzianum و نماتد سیست طلایی سیبزمینی (Globodera rostochiensis) در شرایط آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفت و مشخص گردید که قارچ تریکودرما، سیستهای نماتد طلایی سیبزمینی را کلونیزه کرده و به تخمهای داخل سیست نیز نفوذ کرده و باعث مرگ لاروهای نماتد میگردد (Siffullah and Thomas., 1996). به منظور بررسی کنترل زیستی نماتد ریشهگرهی (M. javanica) توسط قارچ T. harzianum، چندین جدایه از قارچ مذکور مورد آزمایش قرار گرفت و نتایج حاصل مشخص نمود کـه هـمه جـدایههای T. harzianum، تخمها و لاروهای سن دوم نماتد M. javanica را در شرایط آزمایشگاه کلونیزه کردند (Sharon et al., 2007). دو جدایه از گونه T. harzianum به نامهای T- 203 و T-35 بهعنوان عوامل کنترل زیستی موفق علیه نماتدهای ریشهگرهی معرفی شدند که تا حدوی با نتایج حاصل از تحقیق حاضر مطابقت داشت (Sikora et al., 2003). در پژوهش دیگری، که به منظور مهار زیستی نماتد ریشهگرهی (M. javanica) در گوجـهفرنـگـی، با اسـتفـاده از قارچهای Talaromyces flavus و T. harzianum در شرایط گلخانه انجام شد، گزارش شد که بین تیمارهای آزمایش، کمترین تعداد تخم و جمعیت نماتد، متعلق به بوتههای تیمار شده با ترکیب دو گونه قارچ آنتاگونیست بود که اختلاف معنیداری با تیمار شاهد آلوده در سطح احتمال پنج درصد نشان داد و بهطور میانگین، جمعیت نماتد را تا 80 درصد کاهش داد. در بررسی تأثیر هر یک از قارچهای مذکور به تنهایی، قارچهای T. harzianum و T. flavus به ترتیب، باعث 78 و 67 درصد کاهش جمعیت نماتد M. javanica شدند. تیمار T. harzianum نسبت به تیمار T. flavus، تأثیر بیشتری در افزایش رشد رویشی و کاهش جمعیت نماتد داشت، اما اختلاف بین آنها معنیدار نبود (ابوترابی و نراقی، 1395).
عوامل آنتاگونیست، با مکانیسمهای مختلفی، موجب محدودیت رشد و بیماریزایی عوامل بیماریزای گیاهی میگردند. عوامل آنتاگونیست، همراه با رشد سریع در محل ریشه، با بافت گیاه رابطه متقابل دارنـد و تـغییرات بـیوشـیمیایی متفاوتی از قبیـل افـزایش فعـالـیت آنزیمها، تشـکـیل سـدهـای ساخـتمانی و تجمع فیتوالکـسینهـا را در زخـمها القا میکننـد (El- Ghaouth et al., 1998). بهعنوان مثال، قارچ T. harzianum با ایجاد رقابت، خواص مایکوپارازیتیسمی و تولید آنزیم و ترکیبات سمی با عوامل بیماریزا مقابله میکند. این قارچ، دارای مکانیسمهای ایجاد ترکیبات ضدنماتدی و اثر مستقیم روی لاروهای سن دوم و تخم نماتد بوده و همچنین، با کاهش میزان جذب نماتدها توسط ریشه، نفوذ آنها را محدود کرده و علاوه بر این، با القای مکانیسمهای دفاعی گیاه در مقابل حمله نماتد، موجب محدودیت بیماریزایی آن میشود. بهطوریکه میتوان نتیجه گرفت که قارچ T. harzianum با مکانیسمهای مختلفی بر علیه نماتدها مؤثر میباشد (Benitez et al., 2004).
نتیجهگیری و پیشنهاد
با توجه به کنترل موفـق نـمـاتـد ریـشهگـرهـی تـوتـون (M. incognita) در شـرایط آزمایشـگاه، ایـن دو جدایه از قارچ T. harzianum میتوانند بهعنوان عوامل کنترل زیستی موفق علیه نماتد ریشهگرهی بهکار روند. همچنین، با توجه به اینکه بسیاری از عوامل زراعی مانند تناوب، افزایش مواد اصلاحکننده خاک، تغییرات اسیدیته محیط، تغییر بافت خاک و غیره، میتوانند در استقرار آنتاگونیستها مؤثر باشند و اثر آنها را افزایش یا کاهش دهند، لذا پیشنهاد میشود که اثر این دو جدایه قارچی، در شرایط مزرعهای و خاکهای دارای آلودگی طبیعی به نماتد ریشهگرهی توتون به منظور شناسایی تیمارهای برتر و بالا بردن کارایی عوامل کنترل زیستی نیز مورد بررسی قرار گیرد.
سپاسگزاری
از زحمات مدیریت، معاونت تحقیقات و نیز از آقای مهندس سید افشین سجادی در اجرای آزمایشات این پژوهش، تقدیر و سپاسگزاری میگردد.
منابع References
ابوترابی، ا. و نراقی، ل. 1395. مهار زیستی نماتد ریشهگرهی (Meloidogyne javanica) در گوجهفرنگی با استفاده از قارچهای Talaromyces flavus و Trichoderma harzianum در شرایط گلخانه. مهار زیستی در گیاهپزشکی 4(2): 1-9.
ایزدپناه، ک.، اشکان، م.، بنیهاشمی، ض.، رحیمیان، ح. و میناسیان، و. 1389. بیماریشناسی گیاهی. نشر آییژ. 328 صفحه.
پیریپور، ن.، عباسی، خ. و بیگی، س. 1401. ارزیابی آنتاگونیستی برخی جدایههای قارچی روی نماتد ریشهگرهی خیار (Meloidogyne javanica) در شرایط آزمایشگاه و گلخانه. دو فصلنامه علمی علوم سبزیها 11 (1): 113-127.
حـیدری، ف. و اولـیاء، م. 1396. بـررسی کاربرد جـداگانه و تلفیقی قارچ Trichoderma harzianum i2375c و ورمیکمپوست در مهار زیستی نماتد ریشهگرهی گوجهفرنگی (M. javanica). پژوهشهای کاربردی در گیاهپزشکی 6 (3): 1-12.
صاحبـانی، ن.، روسـتـایـی، ع. و هـادوی، ن. 1385. بررسی کنترل بیولوژیک نماتد مولد گره ریشه (Meloidogyne javanica) توسط قارچ Trichoderma viride. علوم کشاورزی ایران 37(3): 405-411.
ملکیزیارتی، ح.، روستایی، ع.، صاحبانی، ن.، اعتباریان، ح.ر. و امینیان، ح. 1388. بررسی امکان کنترل بیولوژیـک نـماتد مـولـد گـره ریـشه گوجهفرنگی Meloidogyne javanica (Trube) Chitwood به وسیله قارچ Trichoderma harzianum Rifai در گلخانه و تغییرات کمی ترکیبات فنلی در گیاه. مجله بهزراعی نـهـال و بذر 25(3): 259-272.
نـاصـرینسـب، ف.، صاحبـانـی، ن. و اعتبـاریـان، ح. ر. 1392. مطالعـه اثــر قــارچ آنـتاگونیست Trichoderma harzianum BI بر القای پاسخ دفاعی گیاه گوجهفرنگی علیه نماتد مولد گرهریشه (Meloidogyne javanica). تحقیقات بیماریهای گیاهی 1(4): 12–1.
نعیمی، س.، رهنما، ک.، طاهری، ع. و داوران، ت. 1392. بررسی اثر متقابل قارچ Trichoderma spp. با نماتد مولد گرهریشه (Meloidogyne spp.) روی گوجهفرنگی در شرایط گلخانهای. دومین همایش ملی توسعه پایدار کشاورزی و محیط زیست سالم. صفحه 10.
هاشمی، م.، اولیاء، م. و جمالی زواره، ع. 1397. مهار زیستی نماتد ریشهگرهی (Meloidogyne incognita) توسط قارچ Trichoderma harziannum Iran 2375c در خیار. مهار زیستی در گیاهپزشکی 6(2): 81-91.
Al-Ameiri, N.S. 2009. Efficiency of Jordanian Trichoderma harzianum (Rifai) isolates against Meloidogyne javanica (Treub) on tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Jordan Journal of Agricultural Sciences 5: 446-457.
Al-Fattah, A., Dababat, A. and Sikora, A. 2007. Use of Trichoderma harzianum and Trichoderma viride for the biological control of Meloidogyne incognita on tomato. Jordan Journal Agricultural Sciences 3: 297-309.
Benitez, T., Rincon, M.A., Limon, M.C. and codon, A.C. 2004. Biological mechanisms of Trichoderma strains. International Microbiology 7: 249-260.
Brants, A., Brrown, C.R. and Earir, E.D. 2000. Trichoderma harzianum endochitinase does not provide resistance to Meloidogyne hapla in tobacco. Journal of Nematology 32: 289-296.
Elad, I., Chet, I. and PandKatan, J. 1980. Trichoderma harzianum: A biological agent effective against Sclerotinia rolfsii and Rhizoctinia solani. Phytopathology 70: 119-121.
El-Ghaouth A., Wilson, C.L. and Wisniewski, M. 1998. Ultrastructural and cytochemical aspects of the biological control of Botrytis cinerea by Candida saitoana in apple fruit. Journal of Phytopathology 88: 282-291.
Harman, G.E. 2006. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96(2): 190-194.
Howell, C.R. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts. Plant Disease 87(1): 4-10.
Hussey, R.S and Barker, K.R. 1973. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp. including a new technique. Plant Disease Reporter 57: 1025-1028.
Irfan, U.D., Saifullah-Khan, H. and Khattak, B. 2005. Biological control of Meloidogyne javanica with Trichoderma harzianum and spent mushroom compost in tomato under field conditions. Pakistan Journal of Phytopathology 17: 144-145.
Jepson, S.B. 1987. Identification of Root–Knot Nematodes Meloidogyne species. Wallingford, UK: CAB International. 265pp.
Khan, T.A. and Saxena, S.K. 1997. Effect of root dip treatment with fungal filtrates on root penetration, development and reproduction of Meloidogyne javanica on tomato. International Journal of Nematology 7: 85-88.
Khattak, B. and Stephen, S.M. 2008. Effect of some indigenous isolates of Trichoderma harzianum on root knot nematode, Meloidogyne javanica (Treub) Chitwood. Sarhad Journal of Agriculture 24: 285-288.
Meyer, S.L.F., Massoud, S.I., Chitwood, D.J. and Roberts, D.P. 2000. Evaluation of Trichoderma virens and Burkholderia cepacia for antagonistic activity against root knot nematode, Meloidogyne incognita. Nematology 2(8): 871-879.
Samuels, G.J. 1996. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. Mycological Research 100(8): 923-935.
Schuster, A. and Schmoll, M. 2010. Biology and biotechnology of Trichoderma. Applied Microbiology and Biotechnology 87(3): 787-799.
Saiffullah Khan, H. and Thomas, B.J. 1996. Studies on the parasitism of Globodera rostochiensis by Trichoderma harzianum using low temperature scanning electron microscopy. Afro-Asian Journal of Nematology 6: 117-122.
Sikora, R.A., Niere, B. and Kimenju, J. 2003. Endophytic microbial biodiversity and plant nematode management in African agriculture. pp. 179-192. In: Neuenschwander, P., Borgermeister, C. and Langewald, J. (eds.). Biological Control in IPM Systems in Africa. Wallingford, UK: CABI Publishing.
Sharon, E., Bar-Eyal, M., Chet, I., Herrera-Estrella, A., Kleifeld, O. and Spiegel, Y. 2001. Biological control of the root-knot nematode Meloidogyne javanica by Trichoderma harzianum. Phytopathology 91(7): 687-693.
Sharon, E., Chet, I., Viterbo, A., Bar-Eyal, M., Nagan, H. and Samuels, G.J. 2007. Parasitism of Trichoderma on Meloidogyne javanica and role of the gelatinous matrix. European Journal of Plant Pathology 118: 247-258.
Siddiqui, I.A., Amer Zareen, M., Javad Zaki, M. and Shaukat, S.S. 2001. Use of Trichoderma species in the control of Meloidogyne javanica, root-knot nematode in the okra and mung bean. Pakistan Journal of Biological Sciences 4(7): 846-848.
Weindling, R. 1932. Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology 22(10): 837-845.
Windham, G.I., Windham, M.T. and Williams, W.P. 1989. Effects of Trichoderma spp. on maize growth and Meloidogyne arenaria reproduction. Plant Disease 73: 493-495.
