اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه درختان گلابی با عامل Phoma glomerata در ایران
محورهای موضوعی : آفات گیاهیپرسا تیموری 1 , سید وحید علوی 2
1 - دانشجوی دکترای بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاهپزشکی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان
2 - دانشیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی مازندران، ساری، ایران
کلید واژه: توالی نواحی ITS, سوختگی سرشاخه, Pyrus communis, Phoma glomerata,
چکیده مقاله :
طی بازدید های انجام شده طی نیمه پایانی زمستان 1397 تا ابتدای بهار 1398 از باغات گلابی در استان مازندران، نشانه هایی مشابه سوختگی در سرشاخه ها و جوانه های جانبی مشاهده شد. به منظور بررسی و شناسایی عامل بیماری، نمونه های دارای علائم به آزمایشگاه منتقل گردید و پس از ضد عفونی سطحی توسط الکل اتانول 70% و محلول هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد در تشتک های پتری حاوی محیط کشت آب آگار (WA) و سیب زمینی دکستروز آگار (PDA) همراه با 5/1 درصد آنتی بیوتیک تتراسایکلین و استرپتومایسین کشت داده شد و در دمای 25 درجه سلسیوس نگهداری گردید. پرگنه قارچ، ابتدا به رنگ کرم تا قهوه ای روشن و سپس به رنگ سبز تیره تغییر رنگ یافت و پس از پنج روز پیکنیدیوم های قارچ در محیط کشت ظاهر شدند. در نهایت خالص سازی جدایه های قارچی به روش نوک ریسه و تک اسپـور انجام و جدایه های خالص درتشتک های حاوی محیط کشت PDA کشت داده شد. پیکنید ها تیره رنگ و تقریباً صاف با گردن نسبتاً بلند بوده و کنیدی های آن اغلب تک سلولی و تقریباً تخم مرغی شکل تا بیضوی و شفاف اما در توده اسپور تیره رنگ بودند. کلامیدوسپور های آن نامنظم و در زنجیره های منشعب و غیرمنشعب به صورت میانی و انتهایی تشکیل شدند. بر اساس خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی قارچ در محیط کشت و طبق توصیف ارائه شده توسط منابع معتبر علمی (Boerema et al., 2004)، گونه Phoma glomerata شناسایی شد. آزمون‌های بیماری‌زایی بر روی ده نهال سالم یک ساله و شاخه های فاقد بیماری انجام شد. سوسپانسیون حاوی اسپور های ثانوی با غلظت (106 × 1 اسپور در میکرو لیتر) روی آن ها پاشیده شد. گیاهان شاهد تنها با آب مقطر سترون آغشته شدند و پس از قرار دادن در محفظه پلاستیکی در دو دامنه دمایی 2 ±15 و 2± 23 درجه سلسیوس و رطوبت نسبی 90%، در گلخانه نگهداری شدند. پس از ده روز علایم بیماری شامل لکه های زرد با حاشیه سوخته مشاهده شد که با علایم ارائه شده در منابع (Chuan and Chand, 1980) مطابقت داشت. گیاهان شاهد فاقد علائم مزبور بودند. به منظور تهیه توده میسلیومی جهت استخراج DNA ژنومی، از محیط غذایی PDB (Potato dextrose broth) استفاده شد. استخراج DNA به روش CTAB انجام گردید (Doyle and Doyle, 1987؛ امیردهی و همکاران، 1396). نواحی ژنومی ITS1-5.8S-ITS2 تکثیر و تعیین توالی شدند. جهت تکثیر این نواحی از ترکیب آغازگر ITS1 با توالی )'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'5) به عنوان آغازگر مستقیم و آغازگر ITS4 به عنوان آغازگر معکوس با توالی ('-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'5) استفاده شد (White and Morgan, 1987؛ White et al., 1990). مخلوط واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرو لیتر شامل 5/6 میکرو لـیتر آب دیونـیزه استریل، 5/13 میـکرو لیتر 2X PCR Master Mix ، 5/0 میکرو لیتر از هـر آغازگر به غلـظت نهـایی 10 پیکـومول و 4 میکرو لیتر DNA طـی واکنش زنجیره‌ای پلی مراز شامل واسرشت سازی اولیه در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت دو دقیقه و سپس 38 چرخه تحت 1- دانشجوی دکتری، گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران 2- دانشیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی مازندران، ساری، ایران نویسنده مسئول مکاتبات: p_teymuri@yahoo.com شرایط واسرشت سازی در 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 50 درجه سلسیوس 30 ثانیه، گسترش در دمای 72 درجه سلسیوس 30 ثانیه و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه در دستگاه ترمـوسایکـلر قرار گرفـت و سپـس محصـول نهـایـی از طـریـق الکتـروفورز در ژل آگـارز 2/1 درصـد ارزیـابی شـد (White et al., 1990). پس از تعیین توالی و همردیف سازی با توالی های موجود در بانک ژن GenBank (NCBI) توسط نرم افزار BLAST مقایسه و شباهت جدایه های مورد نظر با قارچ Phoma glomerata (Corda) Wollenw & Hochapfel در سطح 99 درصد مشخص گردید. قارچ Phoma glomerataاولین بار از کشور هند به عنوان عامل بیماری در فیکوس گزارش گردید Mathur, 1979)). همچنین این قارچ با علائم سرخشکیدگی و سوختگی جوانه های جانبی گلابی نیز برای اولین بار از هند گزارش شد (Chuan and Chand, 1980). در ایران نیز وجود این قارچ اولین بار بر روی گندم (صفایی و همکاران، 1379) گزارش گردید و پس از آن بر روی کدوئیان (حاتمی و همکاران، 1387)، فیکوس (آقاپور و همکاران، 1388)، نارنگی (رستمی و همکاران، 1392)، رزماری (Moshrefi Zarandi et al., 2015) در مناطق مختلف ایران گزارش شد. بنابراین این قارچ تاکنون در ایران بر روی درختان گلابی گزارش نشده است و این اولین گزارش از وقوع سوختگی جوانه و سرشاخه با عامل قارچی Phoma glomerataروی درختان گلابی (Pyrus communis) در ایران است.
Due to the observation of a disease symptoms resembling fire blight in pear orchards of Mazandaran province, sampling of the symptoms of blight of buds took place through winter 2018-spring 2019. Samples from infected bud and blighted twigs were cut into 2- to 3-mm pieces, surface of the leaves was sterilized by 75% ethanol for 10 s followed by drowning 3 min in 0.5% sodium hypochlorite, rinsed three times with sterile distilled water, and cultured on water agar (WA) and potato dextrose agar (PDA) with 1.5% streptomycin and tetracycline. Petri dishes were incubated at 25°C. The cultures were initially pale brown and turned dark green with age. Embedded pycnidia were generally formed after 5 days. The pycnidia were agglutinating, globose to subglobose. Hyphal tip from the growing edge of colonies cultured for 3 days at 25°C was transferred to PDA to obtain pure cultures. The colonies were whitish initially and then became olive green to dark brown. Conidia were long, ellipsoid, single-celled, and hyaline or slightly pigmented. The fungus was identified as Phoma glomerata morphologicaly (Boerema et al., 2004). Koch's postulates was done for pathogenicity test. Symptom-free one year old plants and branches were inoculated with spore suspension (1×106 spores/ml). Sterile water was sprayed on another set of plants as non-inoculated control. Each inoculated branch was wrapped in a plastic bag and maintained in a greenhouse at two temperature ranges of 15 ± 2°C and 23± 2°C with 90% rational humidity. After 10 days, symptoms similar to references (Chohan and Chand, 1980) were observed and the same fungus (P. glomerata) was re-isolated. The species of the fungus was confirmed by extraction of genomic DNA from a single spore isolate (Amirdehi et al., 2017 and Doyle and Doyle, 1987). Then, ITS1, 5.8S, ITS2 were amplified with universal primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') and ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') and maintained at 95°C for 3 min. Thirty eight cycles of PCR were performed by heating at 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, and 72°C for 1 min, followed by a final period at 72°C for 10 min (White et al., 1990). The amplicon was sequenced and analyzed using BLAST software, and showed a homology of 99% with a corresponding sequence of Phoma glomerata (Corda) Wollenw & Hochapfel. The fungus was reported by Mathur (1979) on Ficus elastica for the first time from India. The fungus was also reported with symptoms of wilting and burning of the lateral buds of the pear (Pyrus communis) for the first time by Chohan and Chand (1980) from India. In Iran Phoma glomerata was reported from wheat Triticum aestivum L. and cucumber Cucumis sativus L. (Safaee et al., 2000; Hatami et al., 2008), Ficus elastica (Aghapour et al., 2009), Mandarin (Rostami et al., 2011), Rosemary (Moshrefi et al., 2015). Nevertheless, this species has not been observed on P. communis from Iran. This is the first report of bud and twig blight disease of Pear (P. communis) in Iran caused by the fungus Phoma glomerata.
_||_