جداسازی، کشت و شناسایی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ

محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی

داود کاظمی ^{1 *} , کریم شمس اسنجان ² , نیما دهدیلانی ³ , حامد پارسا ⁴ , علی اکبر موثق پور اکبری ⁵ , پروین اکبرزاده ⁶

1 - گروه علوم درمانگاهی دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2 - مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران.
3 - مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران.
4 - مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران.
5 - مرکز تحقیقات هماتولوژی و انکولوژی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران.
6 - گروه آموزشی بیوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، تبریز، ایران.

تاریخ دریافت : 1394/11/10 تاریخ پذیرش : 1395/04/10 تاریخ انتشار : 1395/05/01

کلید واژه: سگ, سلول‌های بنیادی مزانشیمی, مغز استخوان,

چکیده مقاله :

هدف از این مطالعه جداسازی، تکثیر و شناسایی سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ بود. بدین منظور نمونه خون مغز استخوان 15 قلاده سگ نر بالغ جمع آوری گردید و پس از سانتریفیوژ، سلول های تک هسته ای جدا شده در محیط استاندارد کشت داده شدند. سلول های چسبنده به محیط کشت جدا گردیده و پس از سه بار پاساژ ماهیت مزانشیمی آنها با استفاده از مرفولوژی سلولی، ارزیابی آنتی ژن های سطحی و تمایز به رده سلول های استخوانی و چربی مورد تأیید قرار گرفت. پس از 4 روز کشت، سلول های دوکی شکل شبیه فیبروبلاست یا همان سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان ظاهر گردید و با گذشت زمان بر تعداد آنها افزوده شد و تراکم سلولی افزایش پیدا کرد. میانگین مدت زمانی که طول کشید تا سلول ها به تراکم بیش از 75 درصد در پاساژ سوم برسند، برابر با 75/5±89/22 روز بود. نتایج آنالیز فلوسیتومتری نشان داد که این سلول ها از نظر بیان شاخص های CD34 و CD45 منفی بوده و در مقابل بیان شاخص های CD44 و CD105 آنها مثبت بود. کشت در محیط های القایی استئوسیتی و آدیپوسیتی به مدت یک ماه منجر به تبدیل شدن این سلول ها به رده های سلولی استخوانی و چربی گشت که نشانگر قدرت تمایز این سلول ها می باشد. افزایش بیان ژن های VDR، COL1A1، BGLAP و SPARC نشانگر تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی جداشده از مغز استخوان سگ به سلول های استخوانی در محیط کشت القایی می باشد. این یافته ها می تواند مبنایی برای انجام مطالعات بالینی آتی به ویژه در ارتباط با نوزایش بافت های استخوانی و غضروفی با استفاده از سلول های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سگ باشد.

چکیده انگلیسی:

The purpose of the present study was to isolate, culture expand and characterize canine bone marrow derived mesenchymal stem cells. Bone marrow aspirates of 15 adult male dogs were collected to this end and their mononuclear cells isolated by centrifugation and cultured in standard media. The adherent cells were isolated and their mesenchymal origin was confirmed at 3rd passage by cellular morphology, expression of surface antigens and differentiation to osteogenic and adipogenic lineage. After 4 days, spindle shaped fibroblast like cells which were apparently bone marrow derived mesenchymal stem cells appeared in culture medium and their numbers increased over time. The cells reached 3rd passage with over 75% confluent after a mean of 22.89±5.75 days. Flow cytometric analysis revealed that the cells negatively expressed CD34 and CD45 antigens while positively expressing CD44 and CD105 antigens. Differentiation into osteogenic and adipogenic lineage had taken place after one month culture in induction medium. VDR, COL1A1, BGLAP and SPARC gene expression indicated that mesenchymal stem cells isolated from canine bone marrow had differentiated into osteogenic lineage. These findings can form the basis of any forthcoming clinical studies involving the use of canine mesenchymal stem cells particularly in the field of bone and cartilage regeneration.

منابع و مأخذ:

• · Bernardo, M.E., Avanzini, M.A. and Perotti, C. (2007). Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches: further insights in the search for a fetal calf serum substitute. Journal of Cellular Physiology,211: 121-130.


• · Bianco, P., Robey, P.G. and Simmons, P.J. (2008). Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell stem cell, 2(4): 313-319.


• · Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B. and Middleton, J. (2007). Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem cells, 25(11): 2739-2749.


• · de Bakker, E., Van Ryssen, B., De Schauwer, C. and Meyer, E. (2013). Canine mesenchymal stem cells: state of the art, perspectives as therapy for dogs and as a model for man. Veterinary Quarterly, 33(4): 225-233.


• · Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F.C., Krause, D.S., et al. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 8(4): 315-317.


• · Friedenstein, A.J., Petrakova, K.V. and Kurolesova, A.I. (1968). Heterotopic of bone marrow: analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation, 6: 230-247.


• · Hodgkiss-Geere, H.M., Argyle, D.J., Corcoran, B.M., Whitelaw, B., Milne, E., Bennett, D., et al. (2012). Characterisation and differentiation potential of bone marrow derived canine mesenchymal stem cells. The Veterinary Journal, 194(3): 361-368.


• · Horwitz, E.M., Le Blanc, K. and Dominici, M. (2005). Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 7: 393-395.


• · Kang, M.H. and Park, H.M. (2014). Evaluation of adverse reactions in dogs following intravenous mesenchymal stem cell transplantation. Acta Veterinaria Scandinavica, 56(1): 1-8.


• · Kisiel, A.H., McDuffee, L.A., Masaoud, E., Bailey, T.R., Gonzalez, B.P.E. and Nino-Fong, R. (2012). Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. American Journal of Veterinary Research, 73(8): 1305-1317.


• · Krampera, M., Pizzolo, G., Aprili, G. and Franchini, M. (2006). Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone, 39(4): 678-683.


• · Kulterer, B., Friedl, G., Jandrositz, A., Sanchez-Cabo, F., Prokesch, A., Paar, C., et al. (2007). Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow during expansion and osteoblast differentiation. BMC genomics, 8(1): 70.


• · Pountos, I., Corscadden, D., Emery, P. and Giannoudis, P.V. (2007). Mesenchymal stem cell tissue engineering: techniques for isolation, expansion and application. Injury, 38: S23-S33.


• · Punwar, S. and Khan, W.S. (2011). Suppl 2: Mesenchymal Stem Cells and Articular Cartilage Repair: Clinical Studies and Future Direction. The Open Orthopaedics Journal, 5: 296-301.


• · Rezaei, M., Jamshidi, S., Saffarpour, A., Ashouri, M., Sharifi, D., Zamankhan Malayeri, H., et al. (2013). Isolation, characterization and transduction of canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (cBM-MSCs). Iranian Journal of Veterinary Medicine, 7(3): 193-199.


• · Takemitsu, H., Zhao, D., Yamamoto, I., Harada, Y., Michishita, M. and Arai, T. (2012). Comparison of bone marrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells. BMC Veterinary Research, 8(1): 150.


• · Tharasanit, T., Phutikanit, N., Wangdee, C., Soontornvipart, K., Tantrajak, S., Kaewamatawong, T., et al. (2011). Differentiation potentials of canine bone marrow mesenchymal stem cells. The Thai Journal of Veterinary Medicine, 41(1): 79-86.


• · Volk, S.W. and Theoret, C. (2013). Translating stem cell therapies: the role of companion animals in regenerative medicine. Wound Repair and Regeneration, 21(3): 382-394.


• · Wan, C., He, Q., McCaigue, M., Marsh, D. and Li, G. (2006). Nonadherent cell population of human marrow culture is a complementary source of mesenchymal stem cells (MSCs). Journal of Orthopaedic Research, 24(1): 21-28.