مطالعه بیان پروتئین core+1 ویروس هپاتیت C توسط روش میکروسکوپی هم کانون
محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولیحسن نوربازرگان 1 , عطیه هاشمی 2 , محمدرضا آقاصادقی 3 , آرش معمارنژادیان 4 , مهدی آسمار 5 , فرزین روحوند 6
1 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد لاهیجان، گروه میکروبیولوژی
2 - گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران
3 - گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران
4 - گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران
5 - دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، گروه میکروبیولوژی
6 - بانک ژن نوترکیب ایران، انستیتو پاستور ایران
کلید واژه: هپاتیت C, پروتئین Core+1, سلول Huh7,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: پروتئین جدیدی تحت عنوان پروتئینF یاcore+1 شناخته شده است که توسط ژنوم ویروس هپاتیت C (HCV) کد می‌شود. عملکرد این پروتئین هنوز مشخص نشده است، اما به‌نظر می‌رسد در سیکل زندگی و بیماری‌زایی ویروس قش مهمی را داشته باشد. در این مطالعه کلون کردن و بیان ژن HCV core+1 در سیستم یوکاریوتی مورد بررسی قرار گرفت تا نقش این پروتئین در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و مقاومت ویروس به درمان بررسی گردد. مواد و روش‌ها: ابتدا ژن core+1 داخل پلاسمید pIVEX2.3 به‌عنوان یک ناقل پروکاریوتی کلون شد. در ادامه توالی نوکلئوتیدی 6XHis-tag core+1 حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) در سایت‌های آنزیمی NheI/BamHI داخل وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون شد. این پلاسمید به‌وسیله تجزیه آنزیمی و توالی‌یابی مورد تائید قرار گرفت. پس از ساخته شدن رده سلول کبدی Huh7 به وسیله روش الکتروپوریشن و لیپوفکشن ترانسفکت شدند. با ترانسفکشن هم‌زمان پلاسمید pEGFP-N1 و با تکنیک فلوسایتومتری بازده ترانسفکشن مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت بیان و چگونگی استقرار پروتئین core+1 در سلول توسط میکروسکوپ هم‌کانون ارزیابی شد. یافته‌ها: نتایج هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت مراحل کلونینگ را نشان داد. آنالیز فلوسایتومتری بازده بالای روش الکتروپوریشن را در مقایسه با لیپوفکشن برای ترانسفکشن سلول‌های Huh7 نشان داد. هم‌چنین بیان پروتئین core+1 در سلول‌های Huh7 با استفاده از آنتی‌بادی anti-His و میکروسکوپ هم‌کانون مورد تائید قرار گرفت. نتیجه گیری: نتایج این پژوهش بیان یوکاریوتی پروتئین core+1 در سلول‌های Huh7 را نشان داد که به این ترتیب می تواند که ابزار مناسبی را برای مطالعه نقش تداخلی پروتئین در مسیرهای سیگنالینگ سلولی و برهم‌کنش آن با سایر پروتئین‌ها در اختیار ما قرار دهد.
Background and Objectives: Core+1 or F protein is recently identified to be encoded by hepatitis C virus (HCV) genome. Although functional properties of this protein are not still discovered, core+1 seems to play important roles in viral life cycle and pathogenesis. This study seeks to clone and express HCV core+1 gene in a eukaryotic system with the final aim of evaluating its potential roles in cell signaling pathways and resistance of HCV to therapy. Material and Methods: Core+1 gene corresponding to the amino acids 1-162 was PCR-amplified from the original gene of subtype b that was previously cloned in a prokaryotic vector (14). The amplicon harboring 6xHis-tag at C-terminal was subsequently subcloned in the eukaryotic pCDNA3.1+ vector. The Nhe I / BamHI restriction sites, initiation and stop codons as well as kozak sequences were designed in the primers. Constructed plasmid was verified by restriction enzyme analysis and sequencing reactions. Liver cell line of Huh7 was transfected with this plasmid using electroporation and lipofection techniques. Transfection efficiency was checked by co-transfection of pEGFPN1 plasmid and flowcytometry. Finally expression and localization of core+1 protein was evaluated by means of confocal microscopic technique. Results: Restriction enzyme analysis and sequencing reactions indicated the accuracy of cloning procedure. Flow cytometric analysis showed higher electroporation efficiency for transfection of Huh7 cells, in comparison with lipofection method. Finally, results of confocal microscopic microscopy using anti-His antibody confirmed the transcription and expression of core+1 protein in Huh7 cells. Conclusions: Our study resulted in the eukaryotic expression of core+1 protein in Huh7 cells and provided an appropriate tool for future studies on the potential interference of core+1 with intracellular signaling pathways and cellular protein interaction.
1. Demetrious VL, Vijver D, Kostrikis G. Molecular epidemiology of Hepatitis C Infectiom in Cyprus: Evidence of polyphyletic infection. J Med Virol. 2009 (4): 238-248.
2. Chevaliez S, Pawlotasky JM. Hepatitis C Virus serologic and virologic tests and clinical diagnosis of HCV-related liver disease. Int J Med Sci. 2006; 3(2): 35-40.
3. Brass V, Moradpour D, Blum HE., 2006. Molecular virology of hepatitis C virus (HCV). Int J Med. 3(2), 29-34.
4. Guidotti, L. G. and Chisari, F. V. Immunobiology and pathogenesis of viral hepatitis. Annu. Rev. Pathol. 2006 (1): 23–61.
5. Roingeard P, Hourioux C. Hepatitis C virus core protein, lipid droplet and steatosis. J Viral Hepatitis. 2008 (15): 157-164.
6. Branch, A. D., Stump, D. D., Gutierrez, J. A., Eng, F. and Walewski, J. L. The hepatitis C virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift protein, and others. Liver Dis. 2005 (25): 105–117
7. Vassilaki N, Mavromara P. Two alternative translation mechanisms are responsible for the expression of the HCV ARFP/F/Core+1 coding open reading frame. JBC. 2003 (4):03-13.
8. Boulant S, Bwchi M, Penin F, and Lavergne JP. Unusual multiple recoding event leading to alternative form of Hepatitis C virus core protein frome genotype 1b. JBC. 2003 278(4):45785-45792.
9. Brail M, Brakier GL. 2005. Translation of the F protein of hepatitis C virus is initiated at non-AUG codon in a 11 reading frame relative to the polyprotein. Nucleic Acid Res. 2005 (5): 74-86.
10. Basu A, Steele R, Ray R, Ray RB. Functional properties of 16 KDa protein translated from an alternative open reading frame protein of core-encoding genomic region of hepatitis C virus. J Gen virol. 2004 (8): 2299-2306.
11. Branch AD, Walewaski JL, Gutierrez JA. HCV alternative reading frame protein (ARFP) may be virulence factor that help the virus survive adverse conditions. Hepatol.2003 (3): 468A-479A.
12. Branch AD, Walwaski JA, et al. HCV alternative reading frame proteins (ARFP) may be virulence factors that help the virus surive adverse conditions. Hepatol. 2003 (8): 8A-9A.
13. Ratinier M, Boulant S, Crussard S, Maclauchlan J, Lavergne JP. Subcellular localization of the hepatitis C virus alternative reading frame proteins. Virus Res. 2009 (9): 106-110.
14. Roohvand F, Aghasadeghi MR, Sadat SM, Budkowaska A, Khabiri AR. HCV core protein immunization with Montanide/CpG elicits strong Th1/Th2 and long-lived CTL response. BBRC. 2007 (4): 641-649.
15. Canatella PJ, Prausnitz MR. Prediction and optimization of gene transfection and drug delivery by electroporation. Naure Publishing Group. 2001(8): 64-69.
16. Chinnaswamy, S., Yarbrough, I., Palaninathan, S., Kumar, C. T., Vijayaraghavan, V., Demeler, B., Lemon, S. M., Sacchettini, J. C. and Kao, C. C. A locking mechanism regulates RNA synthesis and host protein interaction by the hepatitis C virus polymerase. J. Biol. Chem. 2008 (2): 20535–20546.
17. Mei LT, Chug HC, Chau TY. Interaction of hepatitis C virus F protein with perfoldin 2 perturb tubulin cytoskeleton organization. Biochem Biophys Res Commun. 2006 (1): 271-277.
18. Chang, K. S., Jiang, J., Cai, Z. and Luo, G. Human apolipoprotein e is required for infectivity and production of hepatitis C virus in cell culture. J. Virol. 2007 (1) : 13783–13793.
19. Xu Z, Choi J, Lu W, Ou JH. Hepatitis C virus F protein is short –live protein associated with the endoplasmic reticulum. J Virol. 2003 (2): 1578-1583.