بررسی توالی‌هاي نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها

بررسی توالی‌هاي نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها

محورهای موضوعی : ویروس شناسی

مریم راشکی ¹ , مجتبی مرتضوی ²

1 - تنوع زیستی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان
2 - گروه بیوتکنولوژی، پژوهشکده علوم محیطی، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته،

تاریخ دریافت : 1402/03/13 تاریخ پذیرش : 1402/07/15 تاریخ انتشار : 1402/08/10

کلید واژه: اِنهانسین, باکولوویروس, پردة دور غذا, کدون, نرم‌افزار,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: يكي از گروه‌های ژنی مهم كه در برخی از باکولوویروس‌های بیمارگر حشرات حفاظت‌شده‌اند، ژن‌های ̗انهانسین هستند. در تحقیق حاضر، توالی‌های نوکلئوتیدی و پروتئینی انهانسین و روابط فیلوژنتیک میان آن‌ها همراه با تجزیه‌و‌تحلیل کدونی توالی‌های نوکلئوتیدی و نواحی حفاظت‌شده با استفاده از پایگاه‌های محاسباتی بررسی‌شد. مواد و روش‌ها: شصت و هفت توالي‌ نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای مربوط به ژن ̗انهانسین از بانک‌ژن استخراج و برای رسم درخت فیلوژنتیکی بر مبنای روش حداکثر احتمال استفاده‌شد. توالی‌های نوکلئوتیدی مربوط به نُه ژن منتخب برای بررسی فراوانی کدون‌ها انتخاب و از پایگاه سکوئنس مانیپیولیشن سوئیت استخراج ‌شدند. برای مشاهده نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید‌آمینه‌ای‌ از سایت موتیف‌سرچ استفاده شد. یافته‌ها: درخت رسم‌شده بر اساس توالی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای‌، به ترتيب دو و سه گروه اصلی را به نمایش‌گذاشت. توالي‌هاي آگروتیس سگتومگرانولوویروس، اپروفترا بروماتا نوکلئو‌پلی‌هدر‌ویروس و كوريستونورا فوميفرانا مالتيپل نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس هر كدام در گروه مجزاي خود قرار‌داشتند. در تمام نه توالی نوکلئوتیدی منتخب، کدون‌های فراوان‌تر شامل ATG و TGG بودند که به ترتیب مربوط به اسید‌‌آمینه‌های متیونین و تریپتوفان هستند. در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌، توالی حفاظت‌شدة HEXXH مشخص‌شد. توالی‌های حفاظت نشدة متناظر HAISF، HCMAE، QTLGD، HQXXH و HVXXH در برخی مشاهده‌شدند. نتیجه‌گیری: از آنجا که تولید و ترشح هر چه بیشتر آنزیم انهنسين‌ می‌تواند برای افزایش فعالیت حشره‌کشی باکولوویروس‌ها استفاده شود و بصورت تجاری برای کنترل آفات بکار‌رود، مطالعات بیوانفورماتیک برای پیش‌بینی ویژگی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای پروتئین‌های مذکور در این زمینه بویژه با تولید باکولوویروس‌های نو‌ترکیب می‌تواند بسیار راه‌گشا‌باشد.

چکیده انگلیسی:

Background & Objectives: A number of gene groups are conserved in some entomopathogenic baculoviruses, and one of these groups is the enhancin. In the present research, the nucleotide and protein sequence of enhancin and the phylogenetic relationships between them were investigated along with codon analysis of nucleotide sequences and motifs using computer databases. Materials & Methods: Sixty-seven nucleotide and amino acid sequences related to enhancin gene were extracted from GenBank and used to draw a phylogenetic tree based on the maximum likelihood method. Nucleotide sequences related to nine selected genes were selected and extracted from the Sequence Manipulation Suite database to check the frequency of codons. MOTIF Search site was used to find motifs in amino acid sequences. Results: The tree drawn based on nucleotide and amino acid sequences showed two and three main groups, respectively. The sequences of Agrotis segetum granulovirus, Operophtera brumata nucleopolyhedrovirus, and Choristoneura fumiferana multiple nucleopolyhedrovirus were each in their own separate group. In all nine selected nucleotide sequences, the most abundant codons included ATG and TGG that were associated with methionine and tryptophan, respectively. In the amino acid sequences, the conserved sequence HEXXH was identified. Unconserved sequences corresponding to HAISF, HCMAE, QTLGD, HQXXH and HVXXH were found in some sequences. Conclusion: Since the production and secretion of enhancin enzyme as much as possible can be used to increase the insecticidal activity of baculoviruses and be used commercially for pest control, bioinformatics studies to predict the nucleotide and amino acid characteristics of the mentioned proteins in this field, especially with the production of recombinant baculoviruses, can be helpful.

منابع و مأخذ:

References

1. van Oers MM, Vlak JM. Baculovirus Genomics. Curr Drug Targets. 2007; 8: 1051-1068.
2. Vlak JM. The biology of baculovirus in vivo and in cultured insect cells. In: Vlak JM, Schlaeger EJ, Bernard AR, editors. Baculovirus and recombinant protein production processes. Editiones Roche. Interlakend, Switzerland;1992: 2-10.
3. Tinsley TW, Kelly, DC. Taxonomy and nomenclature of insect pathogenic viruses. In: Maramorosh K, Sherman KE, editors. Viral insecticides for biological control. Academic Press. Orlando, Florida; 1985: 3-25.
4. Del Rincon MC, Ibarra JE. Entomopathogenic viruses. In: Rosas N, editor. Biological Control of Insect Pests. 1st ed. USA. Studium Press LLC; 2011: 29-64.
5. Wang M, Hu Z. Cross-talking between baculoviruses and host insects towards a successful infection. Phil Trans R Soc B. 2019; 374: 20180324.
6. Sugiura N, Ikeda M, Shioiri T, Yoshimura M, Kobayashi M, Watanabe H. Chondroitinase from baculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirusand chondroitin sulfate from silkworm Bombyx mori. Glycobiology; 2013; 23: 1520–1530.
7. Herniou EA, Jehle JA. Baculovirus phylogeny and evolution. Curr Drug Targets. 2007; 8:1043-1050.
8. Slavicek JM. Baculovirus enhancins and their role in viral pathogenicity. In: Adoga, Moses, editors. Molecular virology. Rijeka, Croatia: InTech; 2012: 147-155.
9. Miller LK. Introduction to the Baculoviruses. In: Miller LK, editor. The Baculoviruses. New York, Plenum; 1997: 1-6.
10. Dix DB, Thompson RC. Codon choice and gene expression: synonymous codons differ in translational accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989; 86: 6888-92.
11. Huson DH, Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Mol Biol Evol. 2006; 23(2): 254-267.
12. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987; 4(4):406-25.
13. Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol. 2016; 33(7): 1870-1874.
14. Stothard P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. Biotechniques. 2000; 28(6): 1102-1104.
15. Nguyen LT, Schmidt HA, Von Haeseler A, Minh BQ. IQ-TREE, A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol Biol Evol. 2015; 32: 268-274.
16. Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013; 30: 772-780.
17. Maddison W, Maddison D. Mesquite: a modular system for evolutionary analysis. Version 3.10. 2015; Avaliable from: http://mesquiteproject.
18. Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 2004; 14(6): 1188-1190.
19. Jehle JA, Lange M, Wang H, Zhihong H, Wang Y, Hauschild R. Molecular identification and phylogenetic analysis of baculoviruses from Lepidoptera. Virology. 2006; 346: 180-193.
20. Wang P, Granados RR. An intestinal mucin is the target substrate for abaculovirus enhancin. Proc Natl Acad Sci. USA. 1997; 94:6977-6982.
21. Hashimoto Y, Corsaro BG, Granados RR. Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus. J Gen Virol. 1991; 72:2645-2651.
22. Read TD, Peterson SN, Tourasse N, Baillie LW, Paulsen IT, et al. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature. 2003; 423:81–86.
23. Popham HJ, Bischoff DS, Slavicek JM. Both Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus Enhancin Genes Contribute to Viral Potency. J Virol. 2001; 75: 8639–8648.
24. Harrison RL. Genomic sequence analysis of the Illinois strain of the Agrotis ipsilon multiple nucleopolyhedrovirus. Virus Genes. 2009; 38:155–170.
25. Ignoffo CM, Garcia C. Aromatic/Heterocyclic amino acids and the simulated sunlight-ultraviolet inactivation of the Heliothis/ Helicoverpa baculovirus. Environ Entomol. 1995; 24(2): 480-482.
26. Bannach C, Buck DR, Bobby G, Graves LP, Li S, Chambers AC, Gan E, Arinto-Garcia R, Possee RD, KingL A. Optimizing recombinant baculovirus vector design for protein production in insect cells. Processes. 2021; 9(12): 2118.
27. Novoa EM, de Pouplana RL. Speeding with control: codon usage, tRNAs, and ribosomes. Trends Genet. 2012; 28(11): 574-581.
28. Sosa-Gomez DR, Morgado FS, Correa RF T, SilaL A, Ardisson-Araju DMP, Rodrigues BMP, Oliveira EE, Aguiar RWS, Ribeiro BM. Entomopathogenic viruses in the Neotropics: current status and recently discovered species. 2020. Neotrop Entomol. https://doi.org/10.1007/s13744-020-00770-1.
29. Kumar KK, Sridhar J, Murali-Baskaran RK, Senthil-Nathan S, Kaushal P, Dara SK, Arthurs S. Microbial biopesticides for insect pest management in India: current status and future prospects. J Invertebr Pathol. 2019; 165:74–81.

متن کامل:



بررسی توالی‌هاي نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها 

Investigation of nucleotide and amino acid sequences of enhancin enzyme in baculoviruses‌‌ 

چکیده

سابقه و هدف: يكي از گروه‌های ژنی مهم كه در برخی از باکولوویروس‌های بیمارگر حشرات حفاظت‌شده‌اند، ژن‌های ̗انهانسین هستند. در تحقیق حاضر، توالی‌های نوکلئوتیدی و پروتئینی انهانسین و روابط فیلوژنتیک میان آن‌ها همراه با تجزیه‌و‌تحلیل کدونی توالی‌های نوکلئوتیدی و نواحی حفاظت‌شده با استفاده از پایگاه‌های محاسباتی بررسی‌شد. 

مواد و روش‌ها: توالي‌هاي نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای مربوط به ژن  ̗انهانسین از بانک‌ژن استخراج و برای رسم درخت فیلوژنتیکی بر مبنای روش حداکثر احتمال  استفاده‌شد. توالی‌های نوکلئوتیدی مربوط به نه ژن منتخب برای بررسی فراوانی کدون‌ها انتخاب و از پایگاه سکوئنس مانیپیولیشن سوئیت استخراج‌شدند. برای مشاهدة نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید‌آمینه‌ای‌ از سایت موتیف‌سرچ استفاده شد.

یافته‌ها: درخت رسم‌شده بر اساس توالی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای‌، به ترتيب دو و سه گروه اصلی را به نمایش‌گذاشت. توالي‌هاي آگروتیس‌سگتوم‌گرانولوویروس، اپروفترابروماتانوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس و كوريستونورافوميفرانامالتيپل‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس  هر كدام در گروه مجزاي خود قرار‌داشتند. در تمام نه توالی نوکلئوتیدی منتخب، کدون‌های فراوان‌تر شامل ATG و TGG بودند که به ترتیب با اسید‌‌آمینه‌های متیونین و تریپتوفان ارتباط داشتند. در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌، توالی حفاظت‌شدة HEXXH مشخص‌شد. توالی‌های حفاظت نشدة متناظر HAISF، HCMAE، QTLGD، HQXXH و HVXXH در برخی مشاهده‌شدند.

نتیجه‌گیری: از آنجا که تولید و ترشح هر چه بیشتر آنزیم انهنسين‌ می‌تواند برای افزایش فعالیت حشره کشی باکولوویروس‌ها استفاده شوند و بصورت تجاری برای کنترل آفات بکار‌روند، مطالعات بیوانفورماتیک برای پیش‌بینی ویژگی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای پروتئین‌های مذکور در این زمینه بویژه با تولید باکولوویروس‌های نو‌ترکیب می‌تواند بسیار راه‌گشا‌باشد.

واژگان كليدي: اِنهانسین، باکولوویروس، پردة دور غذا، کدون، نرم‌افزار. 

 

Abstract

Background & Objectives: A number of gene groups are conserved in some entomopathogenic baculoviruses, and one of these groups is the enhancin genes. In the present research, the nucleotide and protein sequences of enhancin and the phylogenetic relationships between them were investigated along with codon analysis of nucleotide sequences and motifs using computer databases.

Materials & Methods: Sixty-seven nucleotide and amino acid sequences related to enhancin gene were extracted from GenBank and used to draw a phylogenetic tree based on the maximum likelihood method. Nucleotide sequences related to nine selected genes were selected and extracted from the Sequence Manipulation Suite database to check the frequency of codons. MOTIF Search site was used to view motifs in amino acid sequences.

Results: The tree drawn based on nucleotide and amino acid sequences showed two and three main groups, respectively. The sequences of Agrotis segtum granulovirus, Operophtera brumata nucleuopolyhedrovirus, and Choristoneura fumiferana multiplenucleopolyhedrovirus were each in their own separate group. In all nine selected nucleotide sequences, the most abundant codons included ATG and TGG that were associated with methionine and tryptophan amino acids, respectively. In the amino acid sequences, the conserved sequence HEXXH was identified. Unconserved sequences corresponding to HAISF, HCMAE, QTLGD, HQXXH and HVXXH were observed in some‌ sequences.

Conclusion: Since the production and secretion of enhancin enzyme as much as possible can be used to increase the insecticidal activity of baculoviruses and be used commercially for pest control, bioinformatics studies to predict the nucleotide and amino acid characteristics of the mentioned proteins in this field, especially with the production of recombinant baculoviruses, can be very helpful.

Keywords: Baculovirus, codon, enhancin, peritrophic membrane, software.

 

مقدمه

باکولوویروس‌ها خانواده‌ای از ویروس‌های بیمارگر حشرات را تشکیل‌می‌دهند و به دو گروه یا جنس اصلی شامل نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها تقسیم‌بندی‌می‌شوند. هر دو گروه حاوی ژنوم دی‌اِن‌اِی (‌DNA) دو رشته‌ای حلقوی از تقریبا 80 تا 180 کیلو باز هستند که داخل نوکلئوکپسید‌ها متراکم‌شده‌اند و پیش‌بینی‌می‌شود که حدود 90 تا 180 ژن را رمزگذاری کنند (1).

نوکلئوکپسید‌های میله‌ای شکل پوشش‌دار، ویریون نام دارند. ویریون‌ها داخل اجسام در‌بر‌گیرنده احاطه‌می‌شوند (به اندازه 2-15 میکرومتر) که به‌طور‌عمده حاوی پروتئین هستند. با‌این‌که بیش از 600 جدایه باکولو‌ویروس از گونه‌های مختلف حشرات گزارش‌شده‌است، 90 درصد این ویروس‌ها دارای میزبان بالپولکدار هستند (2). نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌ها به دو دسته نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌های چندتایی دارای چندین ویریون در هر پوشش، و نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌های تک دارای تنها یک ویریون در هر پوشش تقسیم‌می‌شوند. ویریون‌های نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس تنها در هسته سلول‌های حساس تکثیر‌می‌شوند و اندازه اجسام در‌بر‌گیرنده آن‌ها بین یک و 15 میکرو‌متر متغییر است (3).

باکولوویروس‌ها بیشترین عوامل کنترل بیولوژیک ویروسی مطالعه‌شده و کاربردی هستند. بیش از 700 گونه از حشرات به‌طور‌طبیعی به این ویروس‌ها آلوده و90 درصد آن‌ها از حشرات راسته بال‌پولکداران جداسازی‌شده‌اند. مطالعه ویروس‌های حشرات بخاطر آلودگی و کشتن حشرات آفت زراعی و جنگلی مهم است (4). یکی از پروتئین‌های باکولو‌ویروس اِنهانسین  (enhancin) نام دارد که باعث تجزیه پروتئین‌های موجود درغشاء دور غذا در معده حشرات با نام موسین و افزایش نفوذ‌پذیری باکولوویروس‌ها می‌شود. این پروتئاز در بطن اجسام دربرگیرنده باکولوویروس‌ها وجود دارد و با ایجاد آلودگی در میزبان مرتبط است. همچنین، با پوشش ویریون‌های مشتق شده از ماتریس دریر‌گیرنده آلفاباکو‌لو‌ویرو‌س‌ها نیز مرتبط هستند (5). پروتئین اُ‌دی‌وی 66 (ODV-66) جزء اصلی پوشش ویریون‌های مشتق شده از ماتریس دریر‌گیرنده هستند و نقش مهمی در تخریب پرده دور غذا در حشرات میزبان دارد (6) و در نتیجه باعث تسهیل دسترسی باکولو‌ویروس‌ها به سلول‌های اپیتلیوم معده میانی میزبان می‌شود.

بررسی ژنوم، اساس فهم کامل ویژگی‌های آنزیم اِنهانسین  و استراتژی اولیه برای بررسی رفتار فنوتیپیک آن‌را تشکیل‌می‌دهد. این ویژگی‌ها شامل فاکتور‌های اصلی بیمارگری و زهر‌آگینی است و مکانیسم بیمارگری ویروس را تعیین می‌کند. آنالیز توالی ژنوم ویروس‌های نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها نشان‌دادند که این ویروس‌ها حاوی همولوگ‌های ژنی بسیاری هستند و در تمام باکولو‌ویروس‌ها حفاظت‌شده‌است (7).  تعدادی از گروه‌های ژنی در برخی و نه در تمام نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها حفاظت‌شده‌اند. یکی از این گروه‌ها، ژن‌های معین نام‌دارند که شامل ژن‌های اِنهانسین هستند (8). این ژن‌ها برای تکثیر دی‌اِن‌اِی ضروری نیستند؛ اما یک برتری انتخابی برای یک ویروس فراهم‌می‌کند (9).

همچنین، مطالعات نشان داده‌است که برخی از کدون ها در بیان ژن­ها، با فراوانی بیشتری در بیان پروتئین‌های سلولی استفاده می‌شوند. در‌حالی‌که، از تعدادی کدون­ها تقریباً استفاده­ای نمی­شود (10). در تحقیق حاضر، بررسی توالی‌های نوکلئوتیدی و پروتئینی اِنهانسین  و روابط فیلوژنتیک میان آن‌ها  همراه با تجزیه و تحلیل کدونی توالی‌های نوکلئوتیدی با استفاده از پایگاه‌های محاسباتی انجام‌شد. 

 

مواد و روش‌ها

الف) تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیک توالی‌های نوکلئوتیدی ژن‌های اِنهانسین  در باکولوویروس‌ها: شصت و هشت توالی دی‌اِن‌اِی مربوط به ژن اِنهانسین از بانک ژن جستجو و پس از مرتب‌سازی استخراج شدند. برای همترازی توالی‌های نوکلئوتیدی از برنامه بلاست (BLAST) استفاده‌شد (http:// www.ncbi.nlm.com). سپس، برای بررسی روابط فیلوژنتیکی از برنامه آی‌کیو‌تری (IQtree v.1.6.12) (11) برای رسم درخت فیلوژنتیکی بر مبنای روش حداکثر احتمال استفاده شد (12). درخت ايجاد‌شده با استفاده از نرم‌افزار مگا‌7 (MEGA7) به‌تصویر کشیده‌شد (13).

ب)  تجزیه و تحلیل کدونی توالی‌های نوکلئوتیدی ژن‌های اِنهانسین  در باکولوویروس‌ها: توالی‌های نوکلئوتیدی مربوط به نه ژن اِنهانسین  مستخرج از بانک ژن برای بررسی تعداد، کسر و فراوانی کدون‌های متعلق به هر اسید‌آمینه انتخاب و مورد بررسی قرار گرفت و کدون‌های استفاده‌شده با استفاده از پایگاه سکوئنس مانیپیولیشن سوئیت (Sequence Manipulation Suite) (https://www.bioinformatics.org/sms2/codon_usage.html) استخراج‌شدند (14).

ج) رسم و تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیک توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین  در باکولوویروس‌ها: با استفاده از نرم‌افزار آی‌کیو‌تری (15) درختي با بيش‌ترين احتمال ساخته‌شد تا روابط فيلوژنتيك ميان توالي‌هاي هم‌تراز‌شده باکولوویروس‌ها تعيين‌شوند. برای بررسی روابط فیلوژنتیکی در این پژوهش از برنامه‌های آی‌کیو‌تری و اسپلیت‌تری (SplitsTree v.4.16.1) (11) به ترتیب برای رسم درخت فیلوژنتیکی بر مبنای روش حداکثر احتمال و شبکه فیلوژنتیکی بر مبنای روش نیبور‌جوینینگ (Neighbor-joining) استفاده شد. درخت ايجاد‌شده با استفاده از نرم‌افزار فیگ‌تری (Figtree v.1.4.4)(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) به‌تصویر کشیده‌شد. 

د) بررسی همترازی و نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها: ابتدا با مراجعه به بانک ژن، 67 توالی اسید‌آمینه‌ای مربوط به آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌های نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس‌ و گرانولو‌ویروس‌ جستجو و پس از مرتب‌سازی استخراج شدند. برای شناسایی توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ از برنامه بلاست استفاده‌شد (http:// www.ncbi.nlm.com). برای همردیف سازی توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ از برنامه مفت (MAFFT v.7) روش اِل-آی‌اِن‌اِس (L-INS) استفاده‌شد (16). توالی‌های همردیف سازی‌شده با برنامه مسکوئیت (Mesquite.v.3.04)  (17) تصحیح و بازبینی شدند.

برای مشاهدة نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین مورد بررسی از سایت موتیف سرچ (MOTIF Search) استفاده شد و سپس توالی‌های حفاظت شده با جزئیات بیشتر با برنامه وبلوگو (Weblogo.v.3) بررسی شدند (18). همچنین، ساختار همترازی‌ها شامل فاصله‌ها، طول توالی‌ها و ترتیب آن‌ها با استفاده از نمایشگر ساختار همترازی‌های چند‌گانه نمایش‌داده‌شدند (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/msaviewer/).  همچنین، با استفاده از برنامه کلاستال امگا (Clustal Omega) توالی پروتئینی حفاظت شده کاملا مشخص‌شد (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). 

 

یافته‌ها

 الف) تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیک توالی‌های نوکلئوتیدی ژن‌های اِنهانسین در باکولوویروس‌ها: برای تعیین روابط باکولو‌ویروس‌های مورد مطالعه و به‌دست‌آوردن اطلاعات در مورد تغییرات ژنتیکی رخ‌داده میان آن‌ها، درخت فیلوژنتیکی بر اساس توالی‌های نوکلئوتیدی رسم‌شد (شکل 1).

 

شکل1: درخت رسم‌شده برای بررسی روابط فیلوژنتیک 67 توالی نوکلئوتیدی ژن اِنهانسین بر اساس روش حداکثر احتمالات توسط برنامه آی‌کیو‌تری

درخت رسم‌شده دو گروه اصلی را به نمایش‌گذاشت. گروه اول از سه زیر‌گروه تشکیل‌شد. زیر‌گروه اول شامل دی12617 تریکوپلوزیا نی گرانولوویروس (D12617 TnGV) تا ای‌یو678671 سودا‌لتیا یونی‌پونکتا گرانولوویروس (EU678671 PsunGV) با فاصله کم به زیر‌گروه دوم از اِنسی_040621 اپروفترا بروماتا نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (NC_040621 OpbuNPV) تا جی‌کیو202541 لیمانتریا زایلینا مالتیپل‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس-5_1 (GQ202541 LyxyMNPV-5_1) ‌‌نزدیک بود. زیر‌گروه سوم حاوی توالی‌های کی‌یو377538 لیمانتریا دیسپار مالتیپل‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (KU377538 LdMNPV) تا اِنسی_001973 لیمانتریا دیسپار مالتیپل‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس_2 (NC_001973 LdMNPV_2) بود. توالی اِن‌سی_004778 كوريستونورا فوميفرانا مالتيپل‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (NC_004778 CfMNPV) نیز با فاصله زیاد از زیر‌گروه سوم به تنهایی قرار‌گرفت و به گروه دوم نزدیک‌تر بود. گروه دوم شامل اِن‌سی_043530 میتیمنا‌یونیپونکتا‌‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (NC_043530 MunNPV) تا اِن‌سی_004117 مامسترا کانفیگوراتا‌‌‌نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (NC_004117 Mco NPV) بود که با فاصله زیاد از گرانولوویروس‌ها قرار داشت.

ب) تجزیه و تحلیل کدونی توالی‌های نوکلئوتیدی ژن‌های اِنهانسین در باکولوویروس‌ها: با توجه به روابط فیلوژنتیکی میان توالی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای ویروس‌های باکولوویروس مورد بررسی در این تحقیق، سه گونه باکولو‌ویروس با نام‌های لیمانتریا دیسپار ام ان پی وی (کد دسترسی اِنسی_001973)، آگروتیس سگتوم نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس (کد دسترسی اِنسی_007921) و هلیکوورپا آرمیژرا گرانولو‌ویروس (کد دسترسی اِنسی_010240)  (جدول 1) در مجموع حاوی نه توالی نوکلئوتیدی کد‌کنندة آنزیم اِنهانسین انتخاب و ویژگی‌های نوکلئوتیدی مانند تعداد و فراوانی 61 کدون برای هر اسید‌آمینه مشخص‌شد.

نتایج تجزیه و تحلیل فراوانی کدونی نشان‌داد که برخی کدون‌ها دارای فراوانی بیشتر در برخی ژن‌ها بودند. در تمام نه توالی نوکلئوتیدی مورد بررسی، کدون‌های فراوان‌تر شامل  ATG و  TGG بودند که به ترتیب با اسید‌ آمینه‌های متیونین و تریپتوفان ارتباط‌داشتند. باکولو‌ویروس گونة لیمانتریا دیسپار مالتیپل نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس دارای دو توالی نوکلئوتیدی کد‌کنندة آنزیم اِنهانسین  است که در یکی فراوانی کدون  GAC (مربوط به اسید‌آمینة اسید آسپارتیک) و در دیگری GCG (مربوط به اسید‌آمینة آلانین) بیشتر بود. در گونة آگروتیس سگتوم نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس با داشتن سه توالی نوکلئوتیدی کد‌کنندة آنزیم اِنهانسین ، فراوان‌ترین کدون شامل  GAC (مربوط به اسید‌آمینة اسید آسپارتیک)، AAC و AAC (مربوط به اسید‌آمینة  آسپاراژین) به تفکیک در هر توالی بود. در گونة هلیکوورپا آرمیژرا گرانولوویروس (دارای چهار توالی نوکلئوتیدی کد‌کنندة آنزیم اِنهانسین )، تنها در یک توالی کدون  TAC (مربوط به اسید‌آمینة تیروزین) بیشترین فراوانی را داشت. در‌حالی‌که، در سه توالی‌ دیگر این گونه به تفکیک، کدون AAC (مربوط به اسید‌آمینة  آسپاراژین) فراوان‌تر بود.

ج) تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیک توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها: تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ باکولوویروس‌هایی که تا کنون شناسایی‌شده‌اند، در شکل‌های 2 و 3 آورده‌شده‌است. درخت رسم ‌شده نشان‌داد که کلیه ویروس‌های مورد مطالعه شامل نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها، در سه خوشه مشخص قرار‌می‌گیرند. در شکل، گروهی که با رنگ آبی مشخص‌شده‌است شامل اِنهانسین‌های لیمانتریا دیسپار مالتیپل‌نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس_ VEF1(LdMNPV_VEF1) و لیمانتریا دیسپار مالتیپل نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس_ VEF2 (LdMNPV_VEF2)  است و تمام اِنهانسین ‌های گرانولو‌ویروس‌، بجز آگروتیس سگتوم گرانولوویروس، یک گروه را به رنگ سبز

 

 

 

 

 

 

 

جدول1: ویژگی‌های ترکیب نوکلئوتیدی آنزیم اِنهانسین در ویروس هلیکوورپا آرمیژرا گرانولو‌ویروس (اِن‌سی_010240)

توالی سی‌141226-143697 کسر 1000/ تعداد کدون اسید‌آمینه	سی‌143852-146449 توالی کسر 1000/ تعداد کدون	توالی 149181-146473  کسر 1000/ تعداد کدون	توالی سی158015‌-160585 کسر 1000/ تعداد کدون
Ala GCG 7.00 8.50 0.15 Ala GCA 11.00 13.35 0.23 Ala GCT 14.00 16.99 0.29 Ala GCC 16.00 19.42 0.33   Cys TGT 2.00 2.43 0.25 Cys TGC 6.00 7.28 0.75   Asp GAT 29.00 35.19 0.52 Asp GAC 27.00 32.77 0.48   Glu GAG 10.00 12.14 0.24 Glu GAA 31.00 37.62 0.76   Phe TTT 26.00 31.55 0.81 Phe TTC 6.00 7.28 0.19   Gly GGG 0.00 0.00 0.00 Gly GGA 9.00 10.92 0.29 Gly GGT 11.00 13.35 0.35 Gly GGC 11.00 13.35 0.35   His CAT 10.00 12.14 0.38 His CAC 16.00 19.42 0.62   Ile ATA 22.00 26.70 0.35 Ile ATT 21.00 25.49 0.34 Ile ATC 19.00 23.06 0.31   Lys AAG 6.00 7.28 0.21 Lys AAA 23.00 27.91 0.79   Leu TTG 27.00 32.77 0.30 Leu TTA 21.00 25.49 0.23 Leu CTG 9.00 10.92 0.10 Leu CTA 16.00 19.42 0.18 Leu CTT 7.00 8.50 0.08 Leu CTC 10.00 12.14 0.11   Met ATG 17.00 20.63 1.00   Asn AAT 25.00 30.34 0.46 Asn AAC 29.00 35.19 0.54   Pro CCG 7.00 8.50 0.23 Pro CCA 7.00 8.50 0.23 Pro CCT 9.00 10.92 0.30 Pro CCC 7.00 8.50 0.23   Gln CAG 6.00 7.28 0.19 Gln CAA 25.00 30.34 0.81   Arg AGG 1.00 1.21 0.03 Arg AGA 6.00 7.28 0.19 Arg CGG 2.00 2.43 0.06 Arg CGA 9.00 10.92 0.29 Arg CGT 8.00 9.71 0.26 Arg CGC 5.00 6.07 0.16   Ser AGT 10.00 12.14 0.21 Ser AGC 15.00 18.20 0.31 Ser TCG 5.00 6.07 0.10 Ser TCA 4.00 4.85 0.08 Ser TCT 8.00 9.71 0.17 Ser TCC 6.00 7.28 0.13   Thr ACG 15.00 18.20 0.23 Thr ACA 22.00 26.70 0.33 Thr ACT 20.00 24.27 0.30 Thr ACC 9.00 10.92 0.14   Val GTG 22.00 26.70 0.34 Val GTA 13.00 15.78 0.20 Val GTT 17.00 20.63 0.26 Val GTC 13.00 15.78 0.20   Trp TGG 7.00 8.50 1.00   Tyr TAT 21.00 25.49 0.41 Tyr TAC 30.00 36.41 0.59   End TGA 0.00 0.00 0.00 End TAG 0.00 0.00 0.00 End TAA 1.00 1.21 1.00	GCG 18.00 20.79 0.31 GCA 8.00 9.24 0.14 GCT 19.00 21.94 0.32 GCC 14.00 16.17 0.24   TGT 2.00 2.31 0.40 TGC 3.00 3.46 0.60   GAT 21.00 24.25 0.40 GAC 32.00 36.95 0.60   GAG 12.00 13.86 0.44 GAA 15.00 17.32 0.56   TTT 23.00 26.56 0.52 TTC 21.00 24.25 0.48   GGG 8.00 9.24 0.19 GGA 7.00 8.08 0.17 GGT 10.00 11.55 0.24 GGC 17.00 19.63 0.40   CAT 6.00 6.93 0.38 CAC 10.00 11.55 0.63   ATA 26.00 30.02 0.42 ATT 25.00 28.87 0.40 ATC 11.00 12.70 0.18   AAG 4.00 4.62 0.17 AAA 19.00 21.94 0.83   TTG 21.00 24.25 0.26 TTA 24.00 27.71 0.30 CTG 12.00 13.86 0.15 CTA 9.00 10.39 0.11 CTT 7.00 8.08 0.09 CTC 8.00 9.24 0.10   ATG 21.00 24.25 1.00   AAT 36.00 41.57 0.44 AAC 45.00 51.96 0.56   CCG 12.00 13.86 0.28 CCA 12.00 13.86 0.28 CCT 6.00 6.93 0.14 CCC 13.00 15.01 0.30   CAG 9.00 10.39 0.23 CAA 31.00 35.80 0.78   AGG 6.00 6.93 0.13 AGA 14.00 16.17 0.31 CGG 3.00 3.46 0.07 CGA 7.00 8.08 0.16 CGT 5.00 5.77 0.11 CGC 10.00 11.55 0.22   AGT 16.00 18.48 0.33 AGC 5.00 5.77 0.10 TCG 3.00 3.46 0.06 TCA 4.00 4.62 0.08 TCT 7.00 8.08 0.15 TCC 13.00 15.01 0.27   ACG 13.00 15.01 0.28 ACA 12.00 13.86 0.26 ACT 9.00 10.39 0.20 ACC 12.00 13.86 0.26   GTG 24.00 27.71 0.38 GTA 9.00 10.39 0.14 GTT 15.00 17.32 0.23 GTC 16.00 18.48 0.25   TGG 10.00 11.55 1.00   TAT 17.00 19.63 0.31 TAC 38.00 43.88 0.69   TGA 0.00 0.00 0.00 TAG 0.00 0.00 0.00 TAA 1.00 1.15 1.00	GCG 13.00 14.40 0.28 GCA 9.00 9.97 0.20 GCT 13.00 14.40 0.28 GCC 11.00 12.18 0.24   TGT 4.00 4.43 0.50 TGC 4.00 4.43 0.50   GAT 22.00 24.36 0.39 GAC 34.00 37.65 0.61   GAG 19.00 21.04 0.41 GAA 27.00 29.90 0.59   TTT 31.00 34.33 0.58 TTC 22.00 24.36 0.42   GGG 3.00 3.32 0.07 GGA 6.00 6.64 0.14 GGT 21.00 23.26 0.50 GGC 12.00 13.29 0.29   CAT 9.00 9.97 0.31 CAC 20.00 22.15 0.69   ATA 25.00 27.69 0.43 ATT 21.00 23.26 0.36 ATC 12.00 13.29 0.21   AAG 8.00 8.86 0.29 AAA 20.00 22.15 0.71   TTG 25.00 27.69 0.29 TTA 20.00 22.15 0.23 CTG 18.00 19.93 0.21 CTA 10.00 11.07 0.12 CTT 4.00 4.43 0.05 CTC 9.00 9.97 0.10   ATG 16.00 17.72 1.00   AAT 24.00 26.58 0.35 AAC 44.00 48.73 0.65   CCG 20.00 22.15 0.39 CCA 9.00 9.97 0.18 CCT 8.00 8.86 0.16 CCC 14.00 15.50 0.27   CAG 12.00 13.29 0.35 CAA 22.00 24.36 0.65   AGG 6.00 6.64 0.12 AGA 9.00 9.97 0.18 CGG 4.00 4.43 0.08 CGA 7.00 7.75 0.14 CGT 6.00 6.64 0.12 CGC 19.00 21.04 0.37   AGT 7.00 7.75 0.17 AGC 10.00 11.07 0.25 TCG 14.00 15.50 0.35 TCA 6.00 6.64 0.15 TCT 2.00 2.21 0.05 TCC 1.00 1.11 0.03   ACG 16.00 17.72 0.29 ACA 11.00 12.18 0.20 ACT 12.00 13.29 0.22 ACC 16.00 17.72 0.29   GTG 37.00 40.97 0.55 GTA 12.00 13.29 0.18 GTT 10.00 11.07 0.15 GTC 8.00 8.86 0.12   TGG 14.00 15.50 1.00   TAT 25.00 27.69 0.46 TAC 29.00 32.12 0.54   TGA 0.00 0.00 0.00 TAG 1.00 1.11 1.00 TAA 0.00 0.00 0.00	GCG 10.00 11.67 0.24 GCA 9.00 10.50 0.22 GCT 7.00 8.17 0.17 GCC 15.00 17.50 0.37   TGT 3.00 3.50 0.38 TGC 5.00 5.83 0.63   GAT 17.00 19.84 0.38 GAC 28.00 32.67 0.62   GAG 19.00 22.17 0.51 GAA 18.00 21.00 0.49   TTT 26.00 30.34 0.62 TTC 16.00 18.67 0.38   GGG 4.00 4.67 0.09 GGA 9.00 10.50 0.21 GGT 15.00 17.50 0.35 GGC 15.00 17.50 0.35   CAT 14.00 16.34 0.48 CAC 15.00 17.50 0.52   ATA 14.00 16.34 0.29 ATT 20.00 23.34 0.42 ATC 14.00 16.34 0.29   AAG 5.00 5.83 0.22 AAA 18.00 21.00 0.78   TTG 24.00 28.00 0.28 TTA 15.00 17.50 0.17 CTG 12.00 14.00 0.14 CTA 20.00 23.34 0.23 CTT 6.00 7.00 0.07 CTC 10.00 11.67 0.11   ATG 19.00 22.17 1.00   AAT 19.00 22.17 0.35 AAC 35.00 40.84 0.65   CCG 10.00 11.67 0.29 CCA 11.00 12.84 0.31 CCT 5.00 5.83 0.14 CCC 9.00 10.50 0.26   CAG 15.00 17.50 0.41 CAA 22.00 25.67 0.59   AGG 6.00 7.00 0.14 AGA 8.00 9.33 0.18 CGG 6.00 7.00 0.14 CGA 8.00 9.33 0.18 CGT 7.00 8.17 0.16 CGC 9.00 10.50 0.20   AGT 18.00 21.00 0.29 AGC 16.00 18.67 0.25 TCG 8.00 9.33 0.13 TCA 6.00 7.00 0.10 TCT 6.00 7.00 0.10 TCC 9.00 10.50 0.14   ACG 18.00 21.00 0.28 ACA 16.00 18.67 0.25 ACT 14.00 16.34 0.22 ACC 17.00 19.84 0.26   GTG 32.00 37.34 0.42 GTA 15.00 17.50 0.19 GTT 16.00 18.67 0.21 GTC 14.00 16.34 0.18   TGG 13.00 15.17 1.00   TAT 22.00 25.67 0.48 TAC 24.00 28.00 0.52   TGA 1.00 1.17 1.00 TAG 0.00 0.00 0.00 TAA 0.00 0.00 0.00

تشکیل‌دادند که شامل گرانولو‌ویروس_ VEF1(GV_VEF1)، گرانولو‌ویروس_ VEF2 (GV_VEF2)، گرانولو‌ویروس_ VEF3 (GV_VEF3) و گرانولو‌ویروس_ VEF4 (GV_VEF4) بود. گروه خاکستری رنگ، خود به زیر‌گروه‌های نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس _ VEF1(NPV_VEF1)، نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس_ VEF2 (NPV_VEF2)، نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس _ VEF3 (NPV_VEF3)، مامسترا براسیکه مالتیپل‌نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس (MbMNPV) تا مامسترا کانفیگوراتا نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس- A (McNPV-A) و میتیمنا یونیپونکتا‌ نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس (MuNPV) تقسیم شد. علاوه بر آگروتیس سگتوم گرانولوویروس، توالي‌هاي ديگر متعلق به اپروفترا بروماتا نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (ObNPV) و كوريستونورا فوميفرانا مالتيپل نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس (ChfMNPV) نيز هر كدام در گروه مجزاي خود قرار‌داشتند.

د) بررسی همترازی و نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها: نتایج همترازی 67 توالی اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین  در شکل 4 نشان داد که قسمت دوم (احاطه‌شده در کادر قرمز رنگ) بسیار متغیر‌تر از قسمت اول است و قسمت اول حاوی توالی‌های حفاظت‌شده بسیار بیشتری از اسید آمینه‌‌های‌ آنزیم اِنهانسین  است. همچنین، این تفاوت در قالب فاصله‌های ایجاد شده در شکل 5 قابل مشاهده است. توالی حفاظت‌شدة HEXXH در جدول 2 به رنگ سبز و توالی متناظر غیر حفاظت‌شده در تعداد کمی اِنهانسین  به رنگ آبی نشان‌داده‌شده‌اند.

 

شکل 2: درخت فیلوژنتیک رووت‌نشده بر اساس روش حداکثر احتمالات با استفاده از برنامه کیو‌تری برای 67 توالی اسید‌آمینه‌ای باکولوویروس‌ها

 

شکل 3: درخت فیلوژنتیک رووت‌شده بر اساس روش حداکثر احتمالات براي 67 توالی اسید‌آمینه‌ای انهنسين در باکولوویروس‌ها (تنها عدد بوتسترپ‌هاي زير 100 نزديك گره‌ها نمايش داده‌شده‌است)

 

 

شكل 4: الگوي حفاظت‌شده 67 توالي اسيد‌آمينه پروتئين انهنسين با استفاده از وبلوگو 3

 

شكل 5: نمایش ساختار همترازی چندگانه 67 توالی‌ اسید‌آمینه‌ای باکولوویروس‌ها شامل فاصله‌ها، طول توالی و ترتیب آن‌ها

 

جدول 2: نتایج بررسی همترازی و نواحی حفاظت‌شده در 67 توالی‌ اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین در باکولوویروس‌ها

کد دسترسی توالی اسید‌آمینه

توالی حاوی نواحی حفاظت شده (HEXXH)(سبز)/حفاظت نشده متناظر (آبی)

YP_529798.1                         NVLSLQRMFFNFTPRNFTLLHAISFLYNCYFENS-KSV         AAZ38294.1                         NVLSLQRMFFNFTPRNFTLLHAISFLYNCYFENS-KSV         AKR17537.1             DAYYNSNWLAMCRTDLGNFLIPTLPSNWLVLHCMAEAYNYGFTKYHT--         ACH69520.1            AYYSSNWLAMSQSDLGKFLEPSF-TNWLVLQTLGDAYNYGFTRYDT--         YP_009506228.1             AYYSSNWLAMSQSDLGKFLEPSF-TNWLVLQTLGDAYNYGFTRYDT--         YP_001649146                                       AYYSSNWLAMSQSDLSYFLVPSY-TNWLVLQTLGDAYNFGFTREHT--         AKR17534.1                      NCDDTLG-PFLQTTITNWPVLHQIGHGYDHTFANH-T--         YP_001649133                                              IANSADTLG-PFLLSTITNWPALHQIGHGYDLNFTNH-T--         ACH69507.1 ------------------YIANSANTLG-PFLLSTITNWPALHQIGHGYDHHFTNN-T--        38 YP_009506217.1 ------------------YIANSANTLG-PFLLSTITNWPALHQIGHGYDHHFTNN-T--        38 YP_009666739.1 ------ISGPGGGYYAQFFMGESYSSIKAFYLTFEASNFGCLHEIGHSFDTYFTRS-HQI        53 AUV65345.1 ------ISGPGGGYYAQFFMGESYSSIKAFYLTFEASNFGCLHEIGHSFDTYFTRS-HQI        53 ACI28784.1 ------------------FMGASSQSMARFFLNLTPLNWGGLHEIGHSFDLVFTRNTSQL        42 YP_002268112.1 ------------------FMGASSQSMARFFLNLTPLNWGGLHEIGHSFDLVFTRNTSQL        42 YP_529745.1 --------------------GESSASMRSFYLRPTPLNWGCLHEISHSLDIYFRHNSEQV        40 AAZ38241.1 --------------------GESSASMRSFYLRPTPLNWGCLHEISHSLDIYFRHNSEQV        40 YP_529746.1 ----------------TWYMGESYETMKSFYLTPSTLNWGALHEMAHSFDIYFARNTIQV        44 AAZ38242.1 ----------------TWYMGESYETMKSFYLTPSTLNWGALHEMAHSFDIYFARNTIQV        44 YP_009049908.1 ---------------------QSNSTMSRFFLTPQVSNWGCLHETAHSYDAHFTRHTTQV        39 NP_613172.1 --------------------GESNPSMRRFYLTPSKFNWGCLHEIAHSFDAYFTWNYAHA        40 ACU46624.1 ---------------------ESSPSMRRFYLTPSKFNWGCLHEIAHSFDAHFTSNYIHA        39 NP_689263.1 --------------------AESSPSMRRFYLTPSKFNWGCLHEIAHSFDAHFTSNYIHA        40 AKN63340.1 MFFKQDLSGSGAAYYGPFWIGVTTQSFD-LFYNVSISNWIMLHVMGHAYDFEFANS-KS-        57 AHN92105.1 MFFKQDLSGSGAAYYGPFWIGVTTQSFD-LFYNVSISNWIMLHVMGHAYDFEFANS-KS-        57 AFP66947.1 --------GAGVAFYSRYWMGFSDNTLG-SYIRPQADDWLALHEIGHGYEFEFINS-VP-        49 AMO27831.1 ---ADAGS-GAAAFYGRHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        53 AHC69672.1 ---ADAGS-GAAAFYGRHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        53 QPD02138.1 ---ADAGS-GAAAFYGRHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        53 ADD73862.1 ---ADASSVAGIAFYGQHWLGASTNTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AOW42752.1 ---ADAGRGAGTAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AMO28018.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AMO27658.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AIX48001.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AJR20435.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AAC70346.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 AQQ80177.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 NP_047797.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFAFVGT-AP-        54 QCQ67730.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFVFVGT-AP-        54 QCQ67572.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFVFVGT-AP-        54 QCQ67412.1 --KADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFVFVGT-AP-        55 QIT08213.1 ---ADAGSGAGIAFYGQHWIGASANTLL-RYLNVDADPWLILHEIGHGHEFVFVGT-AP-        54 NP_848341.1 --------GSGAAYYNNLTMGQSNSSVEHFYLRPLPTNWGGLHEIAHAYDFHFVRS-GPV        51 YP_00164913                            FFAKADAGGPGAAYYGGSWTANSQSVLG-NYLQVRPGNWLVFHEIGHAYDLVFTQG-T--        56 AKR17469.1 ---KADAGGPGGSYYGPFWTASASASLD-DYIKVSPTNWMVLHELGHAYDFVFTVN-T--        53 BAA05908.1 ---KADGGGPGGAYYGAFWTAPASTNLG-EYLRVSPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 YP_00164913                            ---KADGGGPGGAYYGAFWTAPASTNLG-EYLRVSPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 BAA03587.1 ---KADAGGPGGAYYGPFWTAPASSNLG-DYLRISPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 ACH69509.1 ---KADAGGPGGAYYGPFWTAPASSNLG-DYLRISPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 BAA02141.1 ---KADAGGPGGAYYGPFWTAPASSNLG-DYLRISPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 YP_009506219.1 ---KADAGGPGGAYYGPFWTAPASSNLG-DYLRISPTNWMVIHELGHAYDFVFTVN-T--        53 YP_009552689.1 ------TNGPGIAYYGLSHIGISLPSMA-RALDITPTNWLMLHEIGHSYDFLFVSN-YP-        51 AUA60360.1 ------TNGPGIAYYGLSHIGISLPSMA-RALDITPTNWLMLHEIGHSYDFLFVSN-YP-        51 ADD73771.1 -----DSNGVGVAYYGREWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFVIN-TP-        52 AAC58526.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFVSN-TP-        52 AMO27920.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFVSN-TP-        52 AAC70251.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFVSN-TP-        52 NP_047702.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFVSN-TP-        52 AHC69563.1 -----DSNGAGAAYYDRNWTAQTNVSMT-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 QPD02034.1 -----DSNGAGAAYYDRNWTAQTNVSMT-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 QCQ67637.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 QCQ67478.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 QCQ67318.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 AIX47905.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMS-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 AMO27564.1 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMT-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52 AJR20340.2 -----DSNGVGAAYYDRNWTAQTNVSMT-RYLQPRATNWLVLHEIGHAYDFQFAGN-TP-        52

 

 

 

بحث

ویروس‌های خانوادة باکولوویرید به چهار جنس تقسیم‌بندی‌ می‌شوند: آلفاباکولوویروس (نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌های ویژة بالپولکداران)، بتایاکولوویروس‌ها (گرانولو‌ویروس‌های ویژة بالپولکداران)، گاماباکولوویروس (نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌های ویژة بال‌غشائیان) و دلتاباکولوویروس‌ها (نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌های ویژة دوبالان) (19). اِنهانسین ، پروتئین باکولوویروس‌ها، که باعث تجزیه پروتئین‌های گلیکولیز‌شده در غشاء اطراف غذا و افزایش نفوذ‌پذیری غشاء نسبت به باکولوویروس‌ها می‌شود در بتایاکولوویروس‌ها و آلفاباکو‌لو‌ویرو‌س‌ها وجود‌دارد (20). اولین ژن کد‌کنندة آنزیم اِنهانسین در ویروس گونة تریکوپلوزیا نی گرانولوویروس  شناسایی و توالی‌یابی‌شد (21). در تحقیق حاضر، برای بررسی روابط فیلوژنتیکی از تمامی توالی‌های نوکلثوتیدی ژن اِنهانسین  باکولوویروس‌های ثبت‌شده در بانک‌ژن استفاده‌شد. شصت و هشت توالی نوکلئوتیدی بررسی‌ و نتایج نشان‌داد که دو زیر‌گروه از نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها (اکثراً متعلق به گونة لیمانتریا دیسپار) از لحاظ فیلوژنی به زیر‌گروه گرانولو‌ویروس‌ها بخصوص گونه‌های تریکوپلوزیا نی گرانولوویروس  و  آگروتیس سگتوم گرانولوویروس نزدیک‌تر بودند و با آ‌ن‌ها در یک گروه قرار‌گرفتند. در‌حالی‌که، گروه باقی‌مانده از نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها (اکثراً متعلق به جنس آگروتیس) کلاً در یک گروه مجزا جای گرفت. همان‌گونه که مشاهده می‌شود تعدادی از نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها حاوی ژن‌های چندگانه اِنهانسین  هستند. بطوری‌که، ویروس هلیکوورپا آرمیژرا گرانولو‌ویروس دارای چهار و بیشترین ژن کد‌کنندة پروتئین اِنهانسین  بود. البته لازم به ذکر است که این ژن، علاوه بر باکولوویروس‌ها در ژنوم سایر میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها نیز شناسایی‌شده‌است (22).

ژنوم باکولوویروس‌ها دستخوش میزان بالایی از جهش شده‌است که نتیجة از دست دادن و تکثیر دوتایی ژن، نوآرایی همولوگ (homologous) و انتقال ژن از سایر ژنوم ویروس‌ها، باکتری‌ها و یوکاریوت‌ها است (8). تجزیه و تحلیل توالی ژنوم نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها و گرانولو‌ویروس‌ها نشان‌داد که این ویروس‌ها حاوی 29 ژن پایه هستند که در تمام باکولوویروس‌های تواالی یابی‌شده حفظ‌شده‌اند (7).  با توجه به درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده و وجود شباهت بالا میان توالی‌های نوکلئوتیدی ژن اِنهانسین ، به نظر می‌رسد نواحی حفاظت‌شدة بسیاری در ژنوم این 68 توالی وجود‌داشته باشد که نقش مهمی در عملکرد باکولوویروس‌ها خواهند داشت. البته، بررسی ژنتیکی ویروس‌های بیمارگر حشرات بسیار پیچیده و سخت است؛ زیرا بسیاری از ژنوم ویروس‌ها ممکن است به بزرگی 300 کیلو‌باز باشند (7).

بررسی ژنوم آگروتیس سگتوم نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس نشان داد که به‌طور غیر معمول دارای سه ژن اِنهانسین  است. ژنوم لیمانتریا دیسپار مالتیپل نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس دو ژن اِنهانسین  دارد که هر دو برای زهر‌آگینی مطلوب علیه لارو‌های شب‌پرة لیمانتریا دیسپار ضروری هستند (23).درحالی‌که، گونة آگروتیس اپسیلون مالتیپل نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس تنها یک از سه ژن اِنهانسین را در مقایسه با آگروتیس سگتوم نوکلئوپلی‌هدرو‌ویروس نگه‌داشته‌است که البته با این وجود، میزان بیمارگری آن علیه لارو‌های آکروتیس ایپسیلون و آگروتیس سگتوم بسیار بیشتر است (24). درخت رسم‌شده بر اساس هر دو توالی نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای نشان داد که توالی‌های دو باکولوویروس فوق نسبت به سایر توالی‌های موجود در گروه خودشان، شباهت زیادی با یکدیگر دارند. با اين‌حال، تفاوت‌هاي مشاهده‌شده در توالي‌هاي اسيد‌آمينه‌اي و قرار‌گرفتن آن‌ها در شاخه‌هاي متفاوت مانند آگروتیس سگتوم گرانولوویروس، اپروفترا بروماتا نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس و كوريستونورا فوميفرانا مالتيپل نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس، نشان از سطح بالای ناهمگنی در آنزيم انهنسين دارد كه پيش‌تر دليل آن ايجاد ژن‌هاي مربوطه از منابع مستقل ذكر‌شده‌است (8).

به دلیل نقش مهمی که  کدون‌های استفاده‌شده در توالی‌های نوکلئوتیدی در زمینه ساختار نهایی آنزیم مربوطه دارا هستند، در این تحقیق فراوانی این کدون‌ها بررسی‌شد و ارتباط کدون‌های فراوان‌تر با اسید‌آمینه‌های متیونین و تریپتوفان، اسید آسپارتیک، آلانین و آسپاراژین به‌دست‌آمد. تریپتوفان محافظت قابل توجهی از باکولوویروس ها در برابر غیرفعال شدن توسط اشعه ماوراء بنفش خورشید ایجاد می‌کند (25). منطقه 32 جفت باز در پایین دست کدون ATG کد‌کنندة متیونین نیز در بسیاری از ناقل‌های انتقال باکولوویروس گنجانده شده است (26). به طور کلی، کدون ها توسط تی‌آر‌اِن‌آ‌های (tRNA) با فراوانی بالا خوانده می‌شوند و برای اطمینان از صحت ترجمه با سرعت مطلوب ترجمه می‌شوند. از سوی دیگر، کدون های کمیاب توسط تی‌آر‌اِن‌آ‌های بافراوانی پایین ترجمه می‌شوند و این فرکانس متفاوت باعث تغییر در سرعت ترجمه می شود (27). 

در بررسی همترازی و نواحی حفاظت‌شده در توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین  در باکولوویروس‌ها، توالی حفاظت‌شدة HEXXH مشخص‌شد. سایر توالی‌های حفاظت نشدة متناظر شامل HAISF، HCMAE، QTLGD، HQXXH و HVXXH نیز در برخی توالی‌های اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین  مشاهده‌شدند. الگوی مهم، HEXXH، برای گروه‌بندی یک پروتئین در ابرخانواده متالوپروتئاز کافی است؛ به‌طوری‌که، بیشتر انهنسين باکولوویروس‌ها دارای این دامنه متالوپروتئاز حفاظت‌شده متصل شونده به عنصر روی هستند (8). چندین باقیمانده اسید آسپارتیک و گلوتامیک بین 20 تا 120 اسيد‌آمينه از توالی HEXXH وجود دارد که در انهنسين های باکولوویروس وجود دارد، که هر یک می تواند به عنوان لیگاند سوم اتصال به عنصر روی در پروتئین های انهنسين عمل کند (8). از 12 توالی‌ حفاظت نشدة متناظر بررسي شده در 67 توالي انهنسين، تنها دو مورد متعلق به نوکلئو‌پلی‌هدرو‌ویروس‌ها بودند و مابقی در گرانولو‌ویروس‌ها یافت‌شدند که برخی حاوی یک باقیمانده گلوتامین یا والین به جای اسید گلوتامیک در ناحيه حفاظت‌شده HEXXH (HQXXH/HVXXH) بودند كه مشابه يافته‌هاي اسلاويسك بود كه تنها با 26 توالي اسید آمینه‌ای‌ آنزیم اِنهانسین  بررسي‌شده‌بود (8).

نتیجه‌گیری

تکامل باکولوویروس‌ها مکانیسم‌هایی را برای غلبه بر سد غشای دور غذا به آن‌ها اعطا کرده است، زیرا تخریب و افزایش نفوذپذیری غشای دور غذا در لارو حشرات آلوده به باکولوویروس گزارش شده است. پروتئین‌های باکولوویروس معروف به اِنهانسین ، تجزیه پروتئین‌های گلیکوزیله غشای دور غذا به نام موسین را ارتقاء مي‌دهند، بطوري‌كه، با افزایش نفوذپذیری غشای دور غذا به عفونت باکولوویروس کمک می‌کند (28). برنامه های متعددی برای تشویق استفاده از ویروس‌های بیمارگر حشرات در سراسر جهان توسعه یافته است و ویروس های متعددی در چندین کشور مانند آرژانتین، استرالیا، کانادا، کلمبیا، آلمان، هند، ژاپن، پرو، آفریقای جنوبی و ایالات متحده آمریکا ثبت شده است (29). از آنجا که تولید و ترشح هر چه بیشتر آنزیم انهنسين‌ می‌تواند برای افزایش فعالیت حشره کشی باکولوویروس‌ها استفاده شوند و بصورت تجاری برای کنترل آفات بکار‌روند، مطالعات بیوانفورماتیک برای بررسی و پیش‌بینی ویژگی‌های نوکلئوتیدی و اسید‌آمینه‌ای پروتئین‌های مذکور در این زمینه بویژه با تولید باکولوویروس‌های نو‌ترکیب می‌تواند بسیار راه‌گشا‌باشد.

تشکر و قدردانی 

این پژوهش در قالب طرح پژوهشی شمارة 3136/00/ص/7 با استفاده از اعتبارات پژوهشی پژوهشگاه علوم و تكنولوژي پيشرفته و علوم محيطي، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، كرمان، ايران انجام شده‌است.

تعارض در منافع

وجود ندارد.

References

 

1.       van Oers MM, Vlak JM. Baculovirus Genomics. Curr Drug Targets. 2007; 8: 1051-1068.

2.       Vlak JM. The biology of baculovirus in vivo and in cultured insect cells. In: Vlak JM, Schlaeger EJ, Bernard AR, editors. Baculovirus and recombinant protein production processes. Editiones Roche. Interlakend, Switzerland;1992: 2-10.

3.       Tinsley TW, Kelly, DC. Taxonomy and nomenclature of insect pathogenic viruses. In: Maramorosh K, Sherman KE, editors. Viral insecticides for biological control. Academic Press. Orlando, Florida; 1985: 3-25.

4.       Del Rincon MC, Ibarra JE. Entomopathogenic viruses. In: Rosas N, editor. Biological Control of Insect Pests. 1st ed. USA. Studium Press LLC; 2011: 29-64.

5.       Wang M, Hu Z. Cross-talking between baculoviruses and host insects towards a successful infection. Phil Trans R Soc B. 2019; 374: 20180324.

6.       Sugiura N, Ikeda M, Shioiri T, Yoshimura M, Kobayashi M, Watanabe H. Chondroitinase from baculovirus Bombyx mori nucleopolyhedrovirusand chondroitin sulfate from silkworm Bombyx mori. Glycobiology; 2013; 23: 1520–1530.

7.       Herniou EA, Jehle JA. Baculovirus phylogeny and evolution. Curr Drug Targets. 2007; 8:1043-1050.

8.       Slavicek JM. Baculovirus enhancins and their role in viral pathogenicity. In: Adoga, Moses, editors. Molecular virology. Rijeka, Croatia: InTech; 2012: 147-155.

9.       Miller LK. Introduction to the Baculoviruses. In: Miller LK, editor. The Baculoviruses. New York, Plenum; 1997: 1-6.

10.       Dix DB, Thompson RC. Codon choice and gene expression: synonymous codons differ in translational accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989; 86: 6888-92.

11.       Huson DH, Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Mol Biol Evol. 2006; 23(2): 254-267.

12.       Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987; 4(4):406-25.

13.       Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol Biol Evol. 2016; 33(7): 1870-1874.

14.       Stothard P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. Biotechniques. 2000; 28(6): 1102-1104.

15.       Nguyen LT, Schmidt HA, Von Haeseler A, Minh BQ. IQ-TREE, A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Mol Biol Evol. 2015; 32: 268-274.

16.       Katoh K, Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol. 2013; 30: 772-780.

17.       Maddison W, Maddison D. Mesquite: a modular system for evolutionary analysis. Version 3.10. 2015; Avaliable from: http://mesquiteproject.

18.       Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 2004; 14(6): 1188-1190.

19.       Jehle JA, Lange M, Wang H, Zhihong H, Wang Y, Hauschild R. Molecular identification and phylogenetic analysis of baculoviruses from Lepidoptera. Virology. 2006; 346: 180-193.

20.       Wang P, Granados RR. An intestinal mucin is the target substrate for abaculovirus enhancin. Proc Natl Acad Sci. USA. 1997; 94:6977-6982.

21.       Hashimoto Y, Corsaro BG, Granados RR. Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the Trichoplusia ni granulosis virus. J Gen Virol. 1991; 72:2645-2651.

22.       Read TD, Peterson SN, Tourasse N, Baillie LW, Paulsen IT, et al. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria. Nature. 2003; 423:81–86.

23.       Popham HJ, Bischoff DS, Slavicek JM. Both Lymantria dispar Nucleopolyhedrovirus Enhancin Genes Contribute to Viral Potency. J Virol. 2001; 75: 8639–8648.

24.       Harrison RL. Genomic sequence analysis of the Illinois strain of the Agrotis ipsilon multiple nucleopolyhedrovirus. Virus Genes. 2009; 38:155–170.

25.       Ignoffo CM, Garcia C. Aromatic/Heterocyclic amino acids and the simulated sunlight-ultraviolet inactivation of the Heliothis/ Helicoverpa baculovirus. Environ Entomol. 1995; 24(2): 480-482.

26.       Bannach C, Buck DR, Bobby G, Graves LP, Li S, Chambers AC, Gan E, Arinto-Garcia R, Possee RD, KingL A. Optimizing recombinant baculovirus vector design for protein production in insect cells. Processes. 2021; 9(12): 2118.

27.       Novoa EM, de Pouplana RL. Speeding with control: codon usage, tRNAs, and ribosomes. Trends Genet. 2012; 28(11): 574-581.

28.       Sosa-Gomez DR, Morgado FS, Correa RF T, SilaL A, Ardisson-Araju DMP, Rodrigues BMP, Oliveira EE, Aguiar RWS, Ribeiro BM. Entomopathogenic viruses in the Neotropics: current status and recently discovered species. 2020. Neotrop Entomol. https://doi.org/10.1007/s13744-020-00770-1.

29.       Kumar KK, Sridhar J, Murali-Baskaran RK, Senthil-Nathan S, Kaushal P, Dara SK, Arthurs S. Microbial biopesticides for insect pest management in India: current status and future prospects. J Invertebr Pathol. 2019; 165:74–81.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12

 

---