مطالعه درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگیهای پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره ای
محورهای موضوعی : علوم آبزیانطیبه دهاز 1 , مهدی زارعی 2 , هدی جاسمیان فرد 3
1 - گروه شیلات، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران.
2 - باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد بوشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، بوشهر، ایران
3 - گروه فراوری محصولات شیلاتی موسسه آموزش عالی خرد- بوشهر-ایران.
کلید واژه: عناصر معدنی, پروتئین هیدرولیز شده, درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز, ضایعات ماهی کپور نقره&rlm, ای,
چکیده مقاله :
هدف از تحقیق حاضر، بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی های پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقره ای (Hypophthalmichthys molitrix) می باشد. برای این منظور، پروتئین های هیدرولیز شده با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز (به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلن مایر حاوی نمونه ها افزوده شد)تولید شد و آزمایش های اندازه گیری مقدار پروتئین کل، رطوبت، چربی، خاکستر، پروتئین محلول، اندازه گیری درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقادیر عناصر معدنی و شاخص های رنگ سنجی (روشنایی، قرمزی و زردی) بر نمونه های تولیدی انجام گرفت. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم به سوبسترا مقادیر رطوبت، چربی، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی افزایش و مقادیر خاکستر، شاخص روشنایی و زردی دچار کاهش شدند. بطور کلی، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش می یابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایش های دیگر شد.
The aim of this study was to investigate the characteristics of the protein hydrolyzate from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) viscera using different percentages of Alcalase. For this purpose, hydrolyzed proteins were produced using different percentages of Alcalase and the samples were analyzed for the amount of total protein, moisture, fat, ash, soluble protein, hydrolisis degree, nitrogen recovery, amounts of minerals and color parameters (brightness, redness and yellowness). According to the results, increased the amounts of percentage of enzyme to substrate led to increase the amounts of moisture, fat, nitrogen recovery and red index and decrease the amounts of ash, brightness and yellowness index. In general, by increasing the percentage of Alcalase to the substrate, to a specified amount, that in this study was 1.5 percent, the degree of hydrolysis increased, but then, a further increase in the amount of the enzyme led to reduce the degree of hydrolysis and had negative effects on the other experiments.
_||_
بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگیهای پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقرهای (Hypophthalmichthys molitrix)
چکیده
هدف از تحقیق حاضر، بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگیهای پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقرهای (Hypophthalmichthys molitrix) میباشد. برای این منظور، پروتئینهای هیدرولیز شده با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز (به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلنمایر حاوی نمونهها افزوده شد)تولید شد و آزمایشهای اندازهگیری مقدار پروتئین کل، رطوبت، چربی، خاکستر، پروتئین محلول، اندازهگیری درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقادیر عناصر معدنی و شاخصهای رنگسنجی (روشنایی، قرمزی و زردی) بر نمونههای تولیدی انجام گرفت. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم به سوبسترا مقادیر رطوبت، چربی، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی افزایش و مقادیر خاکستر، شاخص روشنایی و زردی دچار کاهش شدند. بطور کلی، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش مییابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایشهای دیگر شد.
کلمات کلیدی: پروتئین هیدرولیز شده، درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز، عناصر معدنی، ضایعات ماهی کپور نقرهای.
مقدمه
امعاء و احشاء ماهیان یکی از مهمترین ضایعات صنعت فراوری محصولات شیلاتی است که منبعی غنی از پروتئین و اسیدهای چرب چندغیراشباعی با قابلیت ماندگاری پایین است. با کاربرد تکنولوژی بازیافت پروتئین از ضایعات ماهی، به نظر میرسد امکان تولید طیف گستردهای از ترکیبات غذایی یا محصولات صنعتی برای رنج وسیعی از کاربردها وجود دارد. در این زمینه استفاده از ضایعات ماهیان، مواد خام و همچنین گونههای ماهی کم مصرف، مطرح میباشد. امعاء و احشاء ماهیان یکی از مهمترین ضایعات صنعت فراوری محصولات شیلاتی است که منبعی غنی از پروتئین و اسیدهای چرب چندغیراشباعی با قابلیت ماندگاری پایین است. تغییرات و تعدیلات آنزیمی پروتئینها با استفاده از آنزیمهای پروتئولیتیک انتخابی برای شکستن باندهای مخصوصی از پپتیدها بطور گستردهای در صنایع غذایی استفاده میشود (چالامیاه1 و همکاران، 2012). تغییرات و تعدیلات آنزیمی پروتئینها با استفاده از آنزیمهای پروتئولیتیک انتخابی برای شکستن باندهای مخصوصی از پپتیدها بطور گستردهای در صنایع غذایی استفاده میشود (چالامیاه و همکاران، 2012).
پروتئین هیدرولیز شده ماهیان دارای کاربردهای وسیعی هستند. این مواد به دلیل داشتن پپتیدهای زیست فعال، کندروتین سولفات و خواص ضد اکسایشی، از جمله مواد مناسب برای درمان سرطان میباشند. از طرف دیگر به دلیل کوتاه بودن زنجیره پپتیدی، دارای قابلیت هضم بالایی هستند و میتوانند به عنوان مکمل پروتئینی در تغذیه انسان، دام و آبزیان مورد استفاده قرار بگیرند. همچنین نقش موثر پروتئین هیدرولیز شده به عنوان منبع نیتروژن در محیطهای کشت باکتریایی به اثبات رسیده است. معمولترین پروتئازهایی که برای هیدرولیز پروتئین ماهی استفاده میشوند از منابع گیاهی مانند پاپائین، یا منابع جانوری مانند پپسین، کیموتریپسین و تریپسین میباشند. آنزیمهایی با منشاء میکروبی نیز برای هیدرولیز پروتئین ماهی استفاده میشوند. در مقایسه با آنزیمهایی با منشاء گیاهی یا جانوری، آنزیمهای با منشاء میکروبی دارای مزیتهایی از جمله فعالیت کاتالیتیکی با تنوع زیاد، پایداری بالا در دما و pH میباشند (اویسیپور و همکاران، 2009). بطور کلی، مناسب بودن آنزیم آلکالاز به دلیل اینکه میتواند در طی مدت کوتاهی تحت شرایط کنترل شده pH، درجات بالایی از هیدرولیز را ایجاد کند، در مقایسه با آنزیمهای خنثی یا اسیدی، گزارش شده است (بهاسکار و همکاران، 2008). پروتئین هیدرولیز شده باعث بهبود جذب رودهای شده و همچنین به عنوان منبع نیتروژن در فرمولاسیون محیط کشت میکروبی کاربرد دارد (کریستینسون و راسکو، 2000). بنابراین، تحقیق حاضر در جهت بررسی درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگیهای پروتئین هیدرولیز شده ضایعات ماهی کپور نقرهای انجام گردید.
مواد و روش ها
امعاء و احشاء و سر ماهی کپور نقرهای به عنوان ماده خام اولیه، بصورت تازه از استخر پرورش ماهی واقع در بوشهر تهیه شد و با یخپوشی مناسب در یونولیت به آزمایشگاه منتقل گردید. پس از پاکسازی و شستشوی، نمونهها بستهبندی شده و تا زمان انجام آزمایش در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای انجام آزمایش، نمونهها در دمای 4 درجه سانتیگراد انجمادزدایی گردید.
به منظور آمادهسازی نمونهها، ابتدا امعاء و احشاء و سر منجمد شده در دمای 4 درجه سانتیگراد انجمادزدایی شده و با استفاده از دستگاه چرخگوشت، چرخ شده و کاملاً یکنواخت و همگن شدند. برای کلیه تیمارها 50 گرم نمونه هموژن شده در ارلنمایر 250 میلیلیتر ریخته و پس از افزودن بافر فسفات به نسبت 2 به 1 (بافر فسفات به سوبسترا) برای مدت 20 دقیقه درون حمام آبی در دمای 85 درجه سانتیگراد جهت غیر فعال شدن آنزیمهای داخلی قرار داده شدند (اویسیپور و همکاران، 2009). پس از خنک شدن، با استفاده از سود N 2/0 تنظیم pH معادل 5/8 برای آنزیم آلکالاز انجام گردید و به ترتیب 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد مقدار پروتئین نمونه، آنزیم به ارلنمایر حاوی نمونهها افزوده شد.
ارلنمایرهای حاوی نمونههای تیمارها، به مدت 2 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 55 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. در پایان، به منظور غیر فعال کردن آنزیم آلکالاز، نمونهها به مدت 10 دقیقه در حمام آبی با دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شده و پس از آن سرد گردیدند. سپس جهت جداسازی مواد غیر محلول از پروتئینهای محلول، نمونهها تحت دمای 4 درجه سانتیگراد و به مدت 20 دقیقه با دورrpm 8000 سانتریفیوژ شدند. سوپرناتانت جدا شده از مرحله سانتریفیوژ جمعآوری و با استفاده از اسپریدرایر خشک گردیدند و آزمایشات شیمیایی، اندازهگیری غلظت پروتئین محلول، درجه هیدرولیز، بازیافت نیتروژنی، مقدار مواد معدنی و رنگسنجی بروی آنها انجام گردید.
روش تجزیه و تحلیل داده ها
از تیمارهای تولیدی به شکل تصادفی نمونهبرداری انجام گردید. بررسی نرمال بودن دادهها با آزمون كولموگراف_اسميرنوف2 انجام شده و نتایج حاصل از آزمایشات شیمیایی با استفاده از آنالیز یکطرفه3 با کمک نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل شد. برای مقایسه میانگین دادهها از آزمون چند دامنهای دانکن4 در سطح احتمال 05/0= α استفاده شد. نمودارهای مربوطه در نرمافزار اکسل5 رسم گردیدند.
نتایج و بحث
4-1-نتایج حاصل از پروتئین محلول
نتایج میانگین مقدار پروتئین ضایعات ماهی کپور معمولی 11/18 درصد پروتئین بود که از این مقدار پروتئین برای محاسبه میزان آنزیم مورد نیاز جهت فرایند هیدرولیز استفاده گردید. از آنجا که استفاده از آنزیمهای تجاری جهت تولید پروتئین هیدرولیز شده بسیار معمول شده است، در این تحقیق از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز برای تولید پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای استفاده شد. طبق نتایج حاصله در جدول 4-1، میزان پروتئین محلول در تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده تولیدی اختلاف معنیداری به نمایش گذاشت (05/0˂p). بالاترین میزان پروتئین محلول در تیمارهای تولیدی با استفاده از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان پروتئین محلول در تیمار تولیدی با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل 1). تیمار تولید شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مقدار پروتئین محلول بالاتر از 5/1 درصد و کمتر از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان داد.
شکل ۱- مقادیر پروتئین محلول در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
به نظر میرسد کاربرد مقادیر بالاتر آنزیم طی فرایند هیدرولیز منجر به بالا رفتن مقادیر پروتئین در پروتئین هیدرولیز شده تولیدی میگردد، اما این نتیجه درباره مقدار 5/1 درصد آنزیم صدق نکرد و پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز کمترین مقدار پروتئین را نشان دادند. نتایج مربوط به مقدار پروتئین، حاکی از افزایش بسیار زیاد میزان پروتئین در محصول هیدرولیز شده میباشد که میتواند به عنوان منبعی از پروتئینهای ضروری در نظر گرفته شود. مقادیر بالای پروتئین در نتیجهی حلالیت پروتئین طی فرایند هیدرولیز، حذف ترکیبات نامحلول غیرپروتئینی که طی فرایند هیدرولیز هضم نشدهاند و همچنین حذف جزئی چربی پس از فرایند هیدرولیز نسبت داد (بنجاکول6 و موریسی7، 1997). مقدار حلالیت پروتئین به میزان چربی موجود در ماده خام اولیه بستگی دارد، بطوریکه مواد خامی که مقادیر بالایی از چربی را دارا باشند، درصد کمتری پروتئین محلول خواهند داشت. به همین دلیل در برخی مطالعات چربیزدایی مواد خام اولیه از طریق تیمار این مواد با ایزوپروپانول انجام میگردد (تیانسیلاکول و همکاران، 2007). این افزایش مقدار پروتئین در واقع نوعی غنیسازی پروتئین به حساب میآید. نتایج پژوهشهای دیگر نیز حاکی از میزان بالای پروتئین در محصولات هیدرولیز شدهی پروتئینی میباشد (اویسیپور و همکاران، 2009؛ کریستینسون و راسکو، 2000).
4-2-نتایج حاصل از درجه هیدرولیز
نتایج حاصل از محاسبه درصد درجه هیدرولیز ، وجود اختلاف معنیدار میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز را نشان میدهد (05/0˂p) (شکل 2). تیمارهای تولیدی با استفاده از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان پروتئین محلول و تیمار تولیدی با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین میزان پروتئین محلول را نشان دادند (شکل 2). تیمار تولید شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مقدار پروتئین محلول کمتر از 5/1 درصد و بالاتر از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان داد.
شکل 2- مقادیر درصد هیدرولیز در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
به نظر میرسد با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، در مقایسه با درصد کم آن در نمونههای تولیدی از 5/0 درصد آنزیم، مقدار درجه هیدرولیز افزایش مییابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز شد. در نمونههای حاصل از 1 درصد آنزیم ترتیب خاصی در اثر آنزیم بکار رفته نسبت به سوبسترا بر درجه هیدرولیز مشاهده نشد. در تحقیق حاضر نسبت 5/1 درصد آنزیم آلکالاز به عنوان نسبت بهینه بدست آمد. بنابراین با افزایش غلظت سوبسترا، آنزیم اشباع شده و فعالیت آنزیم به سمت حداکثر پیش میرود. اما افزایش نسبت آنزیم به سوبسترا بطور همیشگی دلیل بر کارایی بیشتر نمیباشد و در یک نقطه یا محدوده بهینه کارایی آنزیم حداکثر خواهد بود. در نتیجه مشخص میگردد که افزایش بیشتر آنزیم مصرفی نمیتواند منجر به تولید پروتئین با حداکثر درجه هیدرولیز شود. مطالعات دیگر مانند اویسیپور و همکاران (2012) بر بهینهسازی هیدرولیزی ضایعات ماهی تون نیز ثابت کرد که افزایش میزان آنزیم با افزایش فعالیت آنزیمی همراه است، تا زمانی که به نقطه بهینه برسد، ولی افزایش میزان آنزیم بالاتر از نقطهی بهینه منجر به کاهش میزان فعالیت آنزیم میگردد و به موجب آن میزان درجه هیدرولیز کاهش مییابد. در مطالعه پاچئو-آگولار و همکاران (2008) با بررسی ویژگیهای عملکردی پروتئین هیدرولیز شده از گوشت ماهی Merluccius productus شاهد افزایش درجه هیدرولیز و درجه حلالیت پروتئین بودند. درجه هیدرولیز بالا منجر به تولید پپتیدهایی با وزن مولکولی کمتر شده و در نتیجه مقدار حلالیت آنها افزایش پیدا میکند.
4-3-نتایج حاصل از رطوبت
میزان رطوبت میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز وجود اختلاف معنیداری میان تیمارها نشان داد (05/0˂p) (شکل 3). طبق شکل 3 تیمارهای حاصل از 5/0 و 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین مقدار رطوبت و تیمار حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان رطوبت را به نمایش گذاشتند (شکل 3). تیمار پروتئین هیدرولیز شده با استفاده از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار رطوبت بالاتر از تیمار 1 درصد و رطوبت کمتری نسبت به تیمارهای 5/0 و 2 درصد نشان داد.
شکل 3- مقادیر رطوبت در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
اویسیپور و همکاران (1389) با بررسی پروتئین هیدرولیز شده از امعاء و احشاء ماهی تون زردباله با استفاده از آنزیمهای پروتئاز میکروبی آلکالاز، پروتامیکس و فلاورزایم به این نتیجه رسیدند که پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از آنزیم آلکالاز درجه هیدرولیز بالاتری نسبت به پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از دو آنزیم دیگر داشت اما هیچ اختلاف معنیداری از لحاظ میزان چربی، رطوبت و خاکستر میان نمونههای تولیدی وجود نداشت. پاچئو-آگولار و همکاران (2008) نیز با بررسی ویژگیهای عملکردی پروتئین هیدرولیز شده از گوشت ماهی Merluccius productus بیان نمودند مقادیر رطوبت، پروتئین و خاکستر میان نمونههای تولیدی اختلاف معنیداری نداشتند. نتایج تحقیق حاضر با نتایج حاصل از تحقیقات اخیر مغایرت داشت بطوریکه در تحقیق حاضر، اختلاف معنیدار میان فاکتورهای ترکیبات تقریبی رطوبت، پروتئین و خاکستر مشاهده شد.
4-4-نتایج حاصل از چربی
بررسی نتایج مقدار چربی در تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای ثابت کرد که اختلاف معنیداری میان تیمارهای مختلف وجود دارد (05/0˂p) (شکل ۴). با افزایش درصد آنزیم آلکالاز استفاده شده، مقدار چربی تیمارها روند صعودی را نشان داد، بطوریکه پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین و پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بیشترین مقدار چربی را نشان دادند (شکل ۴).
شکل 4- مقادیر چربی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
احتمالاً کاربرد مقادیر کمتر آنزیم اثر بهتری بر شکسته شدن پیوندهای پپتیدی پروتئینها داشته است که میتوان نتیجه حاصل را به آن نسبت داد. همچنین نتایج کاهش قابل توجه چربی را در محصول پروتئین هیدرولیز شده نشان میدهد که، این موضوع میتواند به دلیل شکسته شدن پیوندهای پپتیدی و سانتریفیوژ نمونهها باشد که باعث میشود در طی سانتریفیوژ با دور بالا، چربی به پروتئینهای نامحلول متصل شده و همراه آنها رسوب کند. نتایج سایر محققین نیز بیانگر مقادیر کم چربی در محصول هیدرولیز شده میباشد که برخی از آنها میزان چربی محصول را زیر 1 درصد گزارش کردهاند (سلزیت8 و همکاران، 2005). پروتئین هیدرولیز شده به طور معمول به عنوان یک فراورده کمچرب محسوب میگردد که به دلیل ویژگی آنتیاکسیدانی میتواند سبب جلوگیری یا کاهش اکسیداسیون چربی و پروتئین در ماهی در زمان نگهداری شود (نیکو و همکاران، 2014). در تحقیق حاضر کمترین مقدار چربی 44/10 درصد چربی بود که در تیمار حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد و سایر تیمارها مقدار چربی نزدیک به ماده خام اولیه (ضایعات ماهی کپور نقرهای) دارا بودند. علت این تفاوت را میتوان در نحوه تولید پروتئین هیدرولیز شده دانست. سلزیت و همکاران (2005) بیان نمودند که زمانی که در فرایند تولید پروتئین هیدرولیز شده از حرارت برای غیرفعال کردن آنزیمهای داخلی استفاده میشود، امولسیونهای پایداری از چربی و پروتئین شکل میگیرند که منجر به افزایش چربی در فراورده نهایی میگردند.
4-5-نتایج حاصل از خاکستر
تفاوت آماری میزان خاکستر میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز معنیدار بود (05/0˂p) (شکل 5). بالاترین میزان خاکستر در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان خاکستر در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل ۵). تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقادیر متوسطی از میزان خاکستر را در مقایسه با تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز به نمایش گذاشتند.
شکل ۵- مقادیر خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
همانطور که نتایج نشان دادند، میزان خاکستر در نمونههای هیدرولیز شده نسبت به ماده خام اولیه با اختلاف معنیداری افزایش یافت. علت این امر میتواند به دلیل افزایش میزان ماده خام خشک و نیز کاربرد بافر برای ثابت نگه داشتن pH در طی واکنش باشد. مقادیر بالای خاکستر به عنوان مانعی در کاربرد پروتئین هیدرولیز شده میتواند نقش داشته باشد زیرا باعث محدود شدن کاربردهای پروتئین هیدرولیز شده میگردد (شهیدی و همکاران، 1995). در مطالعات مختلفی که در خصوص هیدرولیز بافت ماهیان با استفاده از آنزیمهای پروتئازی انجام گرفته است قید شده که خصوصیات عملکردی و ارزش غذایی پروتئین هیدرولیز شده به عوامل زیادی از جمله نوع ماهی، نوع و مقدار آنزیم مورد استفاده، pH، دما، درجه هیدرولیز و زمان هیدرولیز بستگی دارد (چالامیاه9 و همکاران، 2012). علت افزایش میزان خاکستر میتواند به دلیل افزایش مادهی خشک و نیز کاربرد اسیدکلریدریک و هیدروکسید سدیم برای تنظیم pH در طی واکنش باشد (مشگینفر، 1393). اویسیپور و همکاران (1389) نشان دادند که میزان خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده امعاء و احشاء ماهی تون زردباله با استفاده از هر سه آنزیم آلکالاز، فلاورزایم و پروتامیکس افزایش داشته است. که نتیجهی تحقیق حاضر را تایید میکند. در تحقیق راتاناپورناریسکول10 و همکاران (2005) میزان خاکستر در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات سر یک گونه میگو با استفاده از دو آنزیم آلکالاز و فلاورزایم دچار کاهش شد، این نتیجه که با نتیجه تحقیق حاضر مغایرت داشت را میتوان به دلیل استفاده از ترکیب آب مقطر و بافر فسفات نسبت داد.
4-6-نتایج حاصل از بازیافت نیتروژنی
مقادیر بازیافت نیتروژنی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز در جدول 6 نشان داده شده است. جدول 6 وجود اختلاف معنیدار مقدار بازیافت نیتروژنی میان تیمارهای مختلف را به نمایش گذاشت(05/0˂p). بالاترین میزان بازیافت نیتروژنی در تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز و کمترین میزان بازیافت نیتروژنی در تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مشاهده شد (شکل 6). تیمار پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار متوسطی از میزان بازیافت نیتروژنی را در مقایسه با تیمارها به نمایش گذاشت.
شکل ۶- مقادیر بازیافت نیتروژنی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
نتایج بازیافت نیتروژنی نشان میدهد که رابطه مثبتی میان افزایش میزان آنزیم به سوبسترا و مقدار بازیافت نیتروژنی وجود دارد بطوریکه، پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین مقدار بازیافت نیتروژنی را نشان دادند. کمترین میزان بازیافت نیتروژنی مربوط به پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بودند و پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 1 درصد آنزیم آلکالاز حد وسط مقدار بازیافت نیتروژنی را نشان دادند. به نظر میرسد تیمارهای تولید شده با استفاده از 1 درصد آنزیم آلکالاز از این قائده مستثنی بوده و مقدار بازیافت پروتئینی بیشتری نسبت به تیمارهای تولیدی از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز نشان دادند. اویسیپور و همکاران (1389) طی تحقیقی که بر هیدرولیز آنزیمی پروتئینهای امعاء و احشاء تاس ماهی ایرانی انجام دادند بیان نمودند که بیشترین میزان بازیافت نیتروژنی مربوط به آنزیم آلکالاز میباشد. علت این امر را میتوان در قدرت و میزان فعالیت پروتئولتیکی بالای آنزیم آلکالاز نسبت داد.
4-7-نتایج حاصل از میزان مواد معدنی
نتایج مقدار مواد معدنی در پروتئین هیدرولیز شده در جدول ۱ آورده شده است. طبق نتایج حاصل، با افزایش درصد آنزیم آلکالاز مورد استفاده، مقادیر عناصر معدنی منیزیوم، کلسیم، نیکل، پتاسیم و گوگرد نیز افزایش پیدا کرد، بطوریکه پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین و پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بیشترین مقادیر این عناصر را نشان دادند. مقادیر آهن، مس، سدیم، پتاسیم، منگنز و کادمیوم در پروتئینهای هیدرولیز شده بدست آمده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز، تغییرات مختلفی نشان دادند.
جدول ۱- مقادیر مواد معدنی موجود در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
عناصر | 5/0 درصد آلکالاز | 1 درصد آلکالاز | 5/1 درصد آلکالاز | 2 درصد آلکالاز |
کلسیم Ca | 663 | 830 | 866 | 962 |
کادمیوم Cd | 19/0 | 19/0 | 18/0 | 2/0 |
مس Cu | 3 | 9 | 6 | 6 |
آهن Fe | 195 | 166 | 186 | 175 |
پتاسیم K | 7854 | 9164 | 9112 | 8912 |
منیزیوم Mg | 136 | 478 | 506 | 612 |
منگنز Mn | 5˂ | 5˂ | 5˂ | 5˂ |
سدیم Na | 17146 | 19821 | 20525 | 18799 |
نیکل Ni | 4050 | 6111 | 6150 | 6453 |
فسفر P | 4050 | 6111 | 6150 | 6453 |
گوگرد S | 3374 | 4972 | 5114 | 6903 |
پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز دارای ترکیبات مختلفی از مواد معدنی میباشد که در جدول 1نشان داده شده است (جدول کامل عناصر معندی تیمارها در قسمت پیوست آورده شده است). سدیم، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در سطوح بالایی مشاهده شدند در حالیکه میزان مس و منگنز بسیار پایین بود. مقدار بالای سدیم مربوط به استفاده و کاربرد بافر فسفات برای آمادهسازی نمونه جهت فرایند هیدرولیز است. مقدار آهن نیز در حد متوسطی بود. این فلزات مشاهده شده میتوانند به عنوان پرو-اکسیدان در پروتئین هیدرولیز شده عمل کرده و شرایط اکسیداسیون این ترکیب را فراهم نمایند. نقل و انتقال یونهای فلزی مخصوصاً مس و آهن، یکی از عوامل اصلی کاتالیزروهای فرایند اکسیداسیون میباشند (تیانسیلاکول و همکاران، 2007). میزان عناصر منیزیم، کلسیم، نیکل، پتاسیم، فسفر و گوگرد در پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل با افزایش درصد آنزیم آلکالاز مورد استفاده افزایش یافتند اما تغییرات سایر عناصر دیگر در رابطه با افزایش درصد آنزیم آلکالاز از روند خاصی پیروی نکردند. ساتیول11 و همکاران (2003) با بررسی ویژگیهای عملکردی و بیوشیمیایی ضایعات ماهی هرینگ12 گزارش نمودند که عناصر پتاسیم، منیزیم، پتاسیم، سدیم، گوگرد و کلسیم در پروتئین هیدرولیز شده شگ ماهیان و ضایعات حاصل از ماهیان فراوان بوده و با توجه به سوبسترای مورد استفاده مقادیر آنها ممکن است متفاوت بوده و تغییر کند. همچنین پروتئین هیدرولیز شده به دلیل نمکگذاری جهت نگهداری یا تنظیمات pH در طول تنظیم مقدار pH برای انجام فرایند هیدرولیز، دارای مقادیر متناسبی از NaCl میباشند که این مقدار میتواند کاربرد پروتئین هیدرولیز شده را محدود نماید (پیکوت13 و همکاران، 2006). با بررسی ترکیبات، ویژگیهای عملکردی و فعالیت آنتیاکسیدانی پروتئین هیدرولیز شده ماهی اسکاد14، تیانسیلاکول و همکاران (2007) بیان نمودند که میزان عناصر سدیم، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در پروتئین هیدرولیز شده حاصل در مقادیر بالایی یافت شده در حالیکه عنصر نیکل مشاهده نشد.
4-8-نتایج حاصل از شاخصهای رنگسنجی
طبق نتایج نشان داده شده در جدول ۲، مقدار شاخص روشنایی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز اختلاف معنیداری نشان دادند (05/0˂p).
جدول ۲- تجزیه واریانس میزان روشنایی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
مقدار روشنایی L* | درجه آزادی | مجموع مربعات | میانگین مربعات | F | Sig |
تیمار | 3 | 108/537 | 179/36 | 225/82 | **00 |
خطا | 8 | 520/3 | 440/0 |
|
|
کل | 11 | 057/112 |
|
|
|
نتایج مقدار شاخص قرمزی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز نشان از وجود اختلاف معنیدار میان تیمارهای مختلف پروتئین هیدرولیز شده حاصل داشت (05/0˂p) (جدول ۳).
جدول ۳- تجزیه واریانس میزان قرمزی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
مقدار قرمزی a* | درجه آزادی | مجموع مربعات | میانگین مربعات | F | Sig |
تیمار | 3 | 853/4 | 618/1 | 067/6 | *019/0 |
خطا | 8 | 133/2 | 267/0 |
|
|
کل | 11 | 987/6 |
|
|
|
جدول ۴ ثابت کرد که شاخص زردی در تیمارهای مختلف پروتئینی هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز اختلاف معنیدار به نمایش گذاشت (05/0˂p).
جدول ۴- تجزیه واریانس میزان زردی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
مقدار زردی *b | درجه آزادی | مجموع مربعات | میانگین مربعات | F | Sig |
تیمار | 3 | 949/5 | 983/1 | 449/6 | **016/0 |
خطا | 8 | 460/2 | 307/0 |
|
|
کل | 11 | 409/8 |
|
|
|
طبق دادههای مشاهده شده در جدول ۵، تیمارهای پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از 5/0 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز مقدار شاخص روشنایی بالاتری نسبت به تیمارهای حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نشان دادند. مقدار شاخص قرمزی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 2 درصد آنزیم آلکالاز بالاتر از پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز بود و تیمارهای حاصل از 1 و 5/1 درصد آنزیم آلکالاز اختلاف معنیداری با تیمارهای حاصل از 5/0 و 2 درصد آنزیم آلکالاز نداشتند (جدول ۵). پروتئین هیدرولیز شده حاصل از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز کمترین میزان شاخص زردی را در مقایسه با سایر تیمارها نشان داد و در میان سایر تیمارها اختلاف معنیداری مشاهده نشد (جدول 4-11).
جدول ۵- مقادیر شاخصهای رنگسنجی در پروتئین هیدرولیز شده حاصل از ضایعات ماهی کپور نقرهای با استفاده از درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز
تیمارها | L* | a* | b* |
5/0 درصد آنزیم آلکالاز | a4/0±2/81 | c0±7/4 | b23/0±26/12 |
1 درصد آنزیم آلکالاز | b13/0±76/74 | ab26/0±76/5 | a26/0±56/13 |
5/1 درصد آنزیم آلکالاز | a35/0±13/80 | bc26/0±96/4 | a26/0±83/13 |
2 درصد آنزیم آلکالاز | b53/0±63/74 | a46/0±3/6 | a46/0±1/14 |
به نظر میرسد هر چه درجه هیدرولیز بالاتر باشد میزان شاخص روشنایی نیز بالاتر میرود. در مقایسه میزان درجه هیدرولیز با مقدار شاخص روشنایی، پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 1 و 2 درصد آنزیم آلکالاز کمترین مقدار درجه هیدرولیز و کمترین میزان روشنایی را نشان دادند. مقادیر شاخصهای قرمزی و زردی در پروتئینهای هیدرولیز شده با استفاده از 1، 5/1 و 2 درصد بالاتر از پروتئینهای هیدرولیز شده با استفاده از 5/0 درصد آنزیم آلکالاز بودند. بر اساس نتایج حاصل میتوان بیان نمود که افزایش درصدهای آنزیم آلکالاز منجر به افزایش شاخصهای قرمزی و زردی و کاهش شاخص روشنایی گردید. از طرف دیگر، با افزایش درجه هیدرولیز میزان شاخص روشنایی افزایش و میزان شاخصهای زردی و قرمزی کاهش یافت که بر خلاف تحقیقات گذشته بود که بیان میکردند با افزایش درجه هیدرولیز مقدار شاخص روشنایی و زردی کاهش و مقدار شاخص قرمزی افزایش پیدا میکند. دلیل این نتیجه میتواند به علت حد بهینه فعالیت آنزیم آلکالاز باشد که با افزایش میزان درصد آنزیم نسبت به سوبسترا دچار تغییر شد. همانطور که در بحث مربوط به درجه هیدرولیز بیان شد، با افزایش غلظت سوبسترا، آنزیم اشباع شده و فعالیت آنزیم به سمت حداکثر پیش میرود، اما فعالیت آنزیم در یک نقطه یا محدوده بهینه کارایی خود را خواهد داشت و مشخص میگردد که افزایش بیشتر آنزیم مصرفی نمیتواند منجر به تولید پروتئین با حداکثر درجه هیدرولیز شود و منجر به تغییرات بیان شده بر شاخصهای رنگسنجی گردید. بطور کلی، پارامتر روشنایی (L*) با افزایش مدت زمان هیدرولیز کاهش و پارامترهای قرمزی (a*) و زردی (b*) افزایش مییابند (دونگ15 و همکاران، 2008). افزایش زمان هیدرولیز باعث افزایش درجه هیدرولیز شده و به موجب آن واکنشهای قهوهای شدن و همچنین باعث اکسیداسیون رنگدانهها میشود که باعث کاهش میزان روشنایی شده و ظاهر تیرهای را ایجاد میکند (واسوا و همکاران، 2007). همچنین رنگ تیره پروتئین هیدرولیز شده نتیجه واکنشهای اکسیداسیون میوگلوبینها و وجود رنگدانههای ملانین در ماده خام است و به هر میزان که مقدار میوگلوبین در گوشت بیشتر میباشد، رنگ پروتئین هیدرولیز شده تیرهتر میگردد (دونگ و همکاران، 2008). بنابراین تفاوت موجود در رنگ پروتئینهای هیدرولیز شده به ترکیب مواد خام اولیه و شرایط فرایند هیدرولیز بستگی دارد.
5-2- نتیجهگیری کلی
در مطالعه حاضر اثر درصدهای مختلف آنزیم آلکالاز بر ویژگی پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از فرایند هیدرولیز ضایعات ماهی کپور نقرهای مورد بررسی قرار گرفت. پروتئینهای هیدرولیز شده حاصل از 5/1 درصد آنزیم آلکالاز بالاترین میزان درجه هیدرولیز و شاخص روشنایی و زردی و کمترین مقادیر پروتئین محلول، بازیافت نیتروژنی و شاخص قرمزی را نشان دادند. علاوه بر آن، این تیمار حدود متوسط مقادیر رطوبت و خاکستر را دارا بودند. به نظر میرسد با افزایش درصد آنزیم آلکالاز نسبت به سوبسترا، تا یک مقدار مشخص که در این تحقیق 5/1 درصد آنزیم بود، مقدار درجه هیدرولیز افزایش مییابد اما پس از آن، افزایش بیشتر در مقدار آنزیم منجر به کاهش درجه هیدرولیز و اثر منفی بر سایر آزمایشهای دیگر شد.
منابع
1. Benjakul, S., and Morrissey, M.T. 1997. Protein hydrolysates from Pacific whiting solid wastes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45: 3423−3430.
2. Bhaskar, N., Benila, T., Radha, C., and Lalitha, R.G. 2008. Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla (Catla catla) for preparing protein hydrolysate using a commercial protease. Journal of Bioresource Technology, 99: 4105- 4111.
3. Chilamaiah, M., Kumar, B.D., Hemalatha, R., Jyothirmayi, T. 2012. Fish protein hydrolysates: proximate composition, amino acid composition, antioxidant activities and applications: A review. Journal of Food Chemistry, 135: 3020- 3038.
4. Dong, S., Zeng, M., Wang, D., Liu, Z., Zhao, Y., and Yang, H. 2008. Antioxidant and biochemical properties of protein hydrolysates prepared from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of food chemistry, 107: 1485-1493.
5. Kristinsson, H.G., and Rasco, B.A. 2000. Fish protein hydrolysates: Production, biochemical and functional properties. Journal of Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40: 43–81.
6. Mehregan Niko, A., Sadeghi Mahonak, A., Ghorbani, M., Taheri, A., and Alami, M. 1392. Optimization of effective factors in the antioxidant activity of hydrolyzed protein of Carassius carassius by response surface methodology. Journal of Food Processing and Preservation, Volume 5, Number 1, 110-95.
7. Meshginfar, N., Sadeghi Mahonak, A., Ziaeifar, AM, Ghorbani, M., and Kashaninejad, M. 2014. Optimization of hydrolyzed protein production from meat industry by-products by response surface methodology. Journal of Food Industry Research, Volume 24, Number 2, 225-215.
8. Oveysipour, M., Abedian Kanari, A., Motamedzadegan, A., and Nazari, R.M. 2010. Investigation of properties of hydrolyzed visceral proteins of Thunnus albacares using commercial enzymes. Iranian Journal of Food Science and Technology Research, Volume 6, Number 1, 68-76.
9. Ovissipour, M., Abedian, A., Motamedzadegan, A., Rasco, B., Safari, R., and Shahiri, H. 2009. The effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the properties of protein hydrolysates from Persian sturgeon (Acipenser persicus) viscera. Journal of Food Chemistry, 115: 238-242.
10. Ovissipour, M., Rasco, B., Ghorban Shiroodi, S., Modanlow, M., Gholami, S., and Nemati, M. 2012. Anioxidant activity of protein hydrolysates from whole anchovy sprat (Clupeonella engrauliformis) prepared using endogenous enzymes and commercial proteases. Journal of Science and Food Agricultural, 93: 1718- 1726.
11. Pacheco-Aguilar, R., Angel, M., Manzano, M., and Ramire-Suarez, J.C. 2008. Functiona properties of fish protein hydrolysates from Pacific whiting (Merluccius productus) muscle produced by a commercial protease. Food Chemistry, 109: 782–789
12. Picot, L., Bordenave, S., Didelot, S., Fruitier-Arnaudin, I., Sannier, F., Thorkelsson, G. 2006. Antiproliferative activity of fish protein hydrolysates on human breast cancer cell lines. Process Biochemistry, 41, 1217–1222.
13. Ruttanapornvarecsakul, Y., Ikeda, M., Hara, K., Osako, K., Kongpun, O., and Nozaki, Y. 2005. Effect of shrimp head protein hydrolysates on the state of water and denaturation of fish myofibrils during dehydration. Journal of Fisheries Science, 71: 220-228.
14. Shahidi, F., Han, X.Q., and Synowiecki, J. 1995. Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin (Mallotus villosus). Journal of Food Chemistry, 53: 285–293.
15. Slizyte, R., Dauksas, E., Falch, E., Storro, I., Rustad, T. 2009. Characteristics of protein fractions generated from cod (Gadus morhua) by-products. Journal of Process Biochemistry, 40: 2021–2033.
16. Thiansilakul, Y., Benjakul, S., and Shahidi, F. 2007. Composition, functional properties and antioxidative activity of protein hydrolysates prepared from round scad (Decapterus maruadsi). Journal of Food Chemistry, 103: 1385-1394.
17. Vasileva-Tonkova, E., Nustorova, M., and Gushterova, A. 2007. New protein hydrolysates from collagen wastes used as peptone for bacterial growth. Journal of Current Microbiology, 54: 54-57.
18. Wu, H.C., Chen, H.M., Shiau, C.Y. 2003. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus). Journal of Food Research International, 36: 949- 957.
Effects of different percentage of alcalase enzyme on the fish protein hydrolysate properties from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) viscera
Abstract:
The aim of this study was to investigate the characteristics of the protein hydrolyzate from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) viscera using different percentages of Alcalase. For this purpose, hydrolyzed proteins were produced using different percentages of Alcalase and the samples were analyzed for the amount of total protein, moisture, fat, ash, soluble protein, hydrolisis degree, nitrogen recovery, amounts of minerals and color parameters (brightness, redness and yellowness). According to the results, increased the amounts of percentage of enzyme to substrate led to increase the amounts of moisture, fat, nitrogen recovery and red index and decrease the amounts of ash, brightness and yellowness index. In general, by increasing the percentage of Alcalase to the substrate, to a specified amount, that in this study was 1.5 percent, the degree of hydrolysis increased, but then, a further increase in the amount of the enzyme led to reduce the degree of hydrolysis and had negative effects on the other experiments.
Key words: Fish protein hydrolysate, Different percentage of Alcalase, Amounts of mineral, Silver carp viscera.
[1] - Chalamaiah
[2] - Kolomogorav – Smirnov
[3] - One-way ANOVA
[4] - Dancan's test
[5] - Excel
[6] - Benjakul
[7] - Morrissey
[8] - Slizyte
[9] - Chalamaiah
[10] - Ruttanapornvareesakul
[11] - Sathivel
[12] - Clupea harengus
[13] - Picot
[14] - Decapterus maruadsi
[15] - Dong