اثر ویتریفیکاسیون بر زنده‌مانی بذور L. Medicago polymorpha نگهداری شده در شرایط فراسرد

محورهای موضوعی : ژنتیک

مه لقا قربانلی ¹ , رکسانا بنیادی ² , عباس قمری زارع ³ , شکوفه شهرزاد ⁴

1 - عضو هیئت علمی‌ گروه زیست‌شناسی دانشگاه آزاد اسلامی‌واحد گرگان
2 - کارشناس ارشد دانشگاه پیام نور تهران
3 - عضو هیئت علمی‌ مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور، تهران
4 - عضو هیئت علمی‌ مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور، تهران

تاریخ دریافت : 1387/02/02 تاریخ پذیرش : 1387/06/18 تاریخ انتشار : 1387/12/25

کلید واژه: بذر, یونجه یکساله, PVS2, نیتروژن مایع, آبگیری, نگهداری بلند مدت بذر, نگهداری در دمای فراسرد, ویتریفیکاسیون,

چکیده مقاله :

در این پژوهش برای دستیـابی بـه روشی موفـق جهت نـگهداری طولانی مدت بـذور در شرایط دمـای فـراسرد از روش ویتریفیکاسیون استفاده شد. بدین منظور از بذور یونجه یکسالهMedicago polymorpha L. که در دمای °C4 سازگاری سرمایی یافته بودند استفاده گشت. بذور با قرار گرفتن در مجاورت سیلیکاژل در دسیکاتور برای 4 روز آبگیری شدند. سپس جهت حفاظت اسمزی به مدت 20 دقیقه در دمای °C25 با محلول گلیسرول M2 در ساکاروز M 6/0 بارگیری گشتند. بذور بارگیری شده به منظور دهیدراتاسیون و حفاظت به کرایوویال‌های حاوی ml 5/0 محلول PVS2 صفر درجه سانتی‌گراد انتقال یافته و بلافاصله در نیتروژن مایع ذخیره شدند. کرایوویال‌های حاوی نمونه پس از یک هفته از نیتروژن مایع خارج گشتند و بلافاصله در حمام آبی C°37 به مدت 2 دقیقه گرمادهی شدند. در مرحله بعد به منظور آبدهی و شستشوی مواد نگهدارنده به ترتیب به مدت 5، 10 و 15 دقیقه در دمای °C 22 در داخل محلول شستشوی حاوی سوکروز M 2/1 در نمک‌های محیط کشت MS قرار گرقتند. بازیابی نمونه‌ها به سه روش صورت گرفت: (الف و ب) قرار دادن بذور به مدت نیم ساعت و 24 ساعت در زیر آب جاری و سپس انتقال آنها بر روی پتری‌دیش‌های حاوی کاغذ صافی مرطوب به منظور تولید دانه‌رست، (ج) استریل بذور با استفاده از هیپوکلریت سدیم 2% و سپـس انتقال آنها به محیـط کشت جامد MS حاوی mg/lit 5/0 GA3. درصد زنده‌مانی بذور نگهداری شده در دمای فراسرد در روش‌های بازیابی الف و ب (به ترتیب 37/94% و 21/98%) در سطح 5% با شاهد (بذوری که تحت تیمار فراسرد قرار نگرفتند) دارای اختلاف بود درحالیکه، این اختلاف در روش ج (زنده‌مانی 16/76%) فاقد اختلاف معنی‌دار بود.

چکیده انگلیسی:

In this research a new method for long term conservation of Medicago polymorpha seeds was developed by using cryopreservation. Two year cold acclimated seeds, collected from Iran rangelands, were desiccated using silica gel for four days and then cryopreserved by vitrification method. Seeds were loaded by loading solution containing 2 M glycerol and 0.6 M sucrose for 20 min and then inserted into cryo-vials containing 0.5 ml PVS2 in 0 °C prior to direct immersed into liquid nitrogen. Seeds were kept in liquid nitrogen for a week then thawed in 37 °C water bath for 2 min. The seeds were rehydrated and detoxified in a solution of MS medium salts containing 1.2 M sucrose respectively for 5, 10 and 15 min in 22 °C. At the final stage of post-treatment, three different procedures were used: (a,b) placing seeds under running water for 30 min and 24 h before being  transferred to petri-dishes containing moist filter paper, (c) sterilization of seeds with 2% hypochloride then placed on MS medium containing 0.5 mg/lit GA3. Germination percentage of cryopreserved seeds in all three post-treatments was higher than control (not cryopreserved seeds). This figure was respectively 94.37% and 98.21% for cryopreserved seeds of post-treatments a and b which was different at 0.05 levels with controls. However, germination percentage (76.16%) of cryopreserved seeds in post-treatment c showed no significant difference with control.

منابع و مأخذ:

Barbara M.R., 2001. Implementing cryogenic storage of clonally propagated plants. Cryo Letters 22 (1): 97-104.

Baust J.G., 2007. Progression of cell and tissue vitrification. Cell preservation technology 5(1): 1-1.

Best B., 2006. Vitrification of cryonics. http://www.benbest.com/cryonics

Finkle B.J., Ulrich J.M., 1982. Cryopreservation removal temperature as a factor in the survival of frozen rice and sugarcane cells. Cryobiology 19(3): 329-335.

Gagliardi R.F., Pacheco G.P., Carneiro L.A, Valls J.F.M., Vieira M.L.C. and Mansur E., 2003. Cryopreservation of Arachis species by vitrification of in vitro-grown shoot apices and genetics stability of recovered plants. CryoLetters 24 (2): 103-110.

Ghamari Zare A., Naderi Shahab M., Shahrzad S. and Asare M., 2007. Conservation of seeds, apical and auxiliary buds and plant cells produced by tissue culture, a method for long term conservation of plant genetic resources. The 5^th Iranian National Biotechnology Congress.

Hirai D., Sakai A., 1998. Cryopreservation of in vitro-grown meristems of potato (Solanum tuberosum L.) by encapsulation-vitrification. Bulletin of Pope Vol. 4, Not 21 November 15, 2002.

Kadkade and Prakash G., 2005. Cryopreservation of plant cells. United States Patent Application 20050158699.

KEW Royal Botanical Gardens web site, 2007. http://www.kew.org

Langis R., Schnabel B., Earle E.D., Steponkus P.L., 1989. Cryopreservation of Brassica campestris L. cell suspensions by vitrification. CryoLetters 10:421-428.

Lipman C.B. and Lewis G.N., 1934. Tolerance of liquid air temperatures by seeds of higher plants for sixty days. Plant Physiology 9: 392-394.

Lipman C.B., 1936. Normal viability of seeds and bacterial spores after exposure to temperatures near the absolute zero. Plant Physiology 11: 201-205.

Martinkova Z., Honek A., 2007. The effect of cryopreservation on germination of Dandelion seeds. Plant Protection Science 43: 63-67.

Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15:473-597.

Na H., Kondo K., 1996. Cryopreservation of tissue-cultured shoot primordial from shoot apices of cultured protocorms in Vanda pumila following ABA preculture and desiccation. Plant Science 118(2): 195-201.

Nag K.K. and Street H.E., 1973. Carrot embryogenesis from frozen cultured cells. Nature 245: 270-272.

Panis B., Lambardi M., 2005. Status of cryopreservation technologies in plants (crops and forest trees), The role of biotechnology. Villa Gualino, Turin, Italy, 5-7 March, 2005.

Panis B., Piette B., Swennen R., 2004. Droplet vitrification of apical meristems: a cryopreservation protocol applicable to all Musaceae. Plant Science 168(1): 45-55.

Paroda R.S., Arora R.K., 1991. Plant genetic resources conservation and management concepts and approaches. International Board for Plant Genetic Resources, Regional office for South and Southeast Asia, c/o NBPGR, Pusa Campus, New Delhi 110 012, India.

Quatrano R.S., 1968. Freeze preservation of cultured flax cells utilizing dimethyl sulfoxide. Plant Physiology 43: 2057-2061.

Sakai A. and Noshiro M., 1975. Some factors contributing to the survival of crop seeds cooled to the temperature of liquid nitrogen. pp. 317-326. In Crop genetic resources for today and tomorrow (Eds., O.H. Frankel and J.G. Hawkes). Cambridge University Press, Cambridge.

Saloma A.N., 2002. Tropical seed species responses to liquid nitrogen exposure. Brazilian Journal of Plant Physiology 14(2): 133-138.

Sant R., Taylor M., Tyagi A., 2006. Cryopreservation of in-vitro grown shoot tips of tropical taro (Colocasia esculenta var. esculenta) by vitrification. Cryo Letters 27(3): 133-42.

 Schmale K., Rademacher T., Fischer R., Hellwig S., 2006. Towards industrial usefulness- cryo-cell-banking of transgenic BY-2 cell cultures. Journal of Biotechnology 124(1): 302-311.

Stanwood P.C., 1985. Cryopreservation of seed germplasm for genetic conservation, pp. 199-226. In Cryoperservation of plant cells and organs (Ed., K.K. Kartha). CRC Press, Boca Raton, Florida.

Towill L.E., 1982. Low temperature (-196° C) storage of the seed from the tuber-bearing Solanums species. American Potato Journal 59: 141-147.

Uragami A., Sakai A., Nagai M., Takahashi T., 1989. Survival of cultured cells and somatic embryos of Asparagus officinalis L. cryopreserved by vitrification. Plant Cell Reports 8: 418-421.

Volk GM., Walters C., 2006. Plant vitrification solution 2 lowers water content and alters freezing behavior in shoot tips during cryopreservation. Cryobiology 52: 48-61.