ارزیابی تمایزی دو گونه مرزه Satureja avromanicaو Satureja edmondiبا استفاده از مطالعات سیتوژنتیکی وفیتوشیمیایی
محورهای موضوعی : گیاهان داروییمهدیه صالحی وژده نظری 1 * , سمانه سماوات 2
1 - مؤسسه تحقيقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقيقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران
2 - استادیار پژوهش، مؤسسه تحقيقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقيقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران
کلید واژه: اسانس, کروموزوم, تفکیک گونه, گیاه دارویی, GC-MS,
چکیده مقاله :
با توجه به قرابت ظاهری و تشابه خواص جمعیتهای مختلف مرزه (Satureja spp.)، تفکیک گونههای آن از یکدیگر مستلزم انجام مطالعات تکمیلی و دقیق‌تر است. بر این اساس، S. avromanica و S. edmondi به عنوان دو گونه اندمیک ایران، به لحاظ خصوصیات کاریوتیپی و فیتوشیمیایی، مورد مطالعه قرار گرفتند. در مطالعات سیتوژنتیکی، صفات متعددی چون طول کل کروموزوم (TL)، طول بازوی بلند (LA)، طول بازوی کوتاه (SA)، شاخص سانترومری (CI)، درصد شكل کلی کروموزوم (%TF)، اختلاف طول نسبی (DRL)، شاخص عدم تقارن درون کروموزومی (A1)، شاخص عدم تقارن بین کروموزومی (A2)، شاخص پراکندگی (DI)، و فرمول کاریوتیپی (KF) برای جمعیتهای 48 و 55 از مرزه ادموندی و 63 و 67 از مرزه اورامانی اندازه‌گیری و محاسبه شد. بر اساس نتایج، عدد پايه كروموزومي در جمعیتهای اورامانی و ادموندی به ترتیب 12x=، (24x=2n=2) و 15x=، (30 x=2n =2) بود. در تجزیه خوشه‌ای به روش پیوستگی کامل، جمعیتهای 63 و 67 در یک خوشه و جمعیتهای 48 و 55 در خوشه دیگر واقع شدند. همچنین جمعیتهای دو گونه از نظر تمامی صفات کاریوتیپی مورد مطالعه، با یکدیگر اختلاف آماری معنی‌داری داشتند (P<0.01). بر اساس آنالیز GC-MS، به ترتیب 21 و 25 ترکیب مختلف در اسانس مرزه ادموندی و مرزه اورامانی ردیابی شد. ترکيبات اصلی موجود در اسانس مرزه اورامانی، piperitone (%19) و piperitenone (3/%26) بود، در حالی که عمده‌ترین اجزای موجود در اسانس مرزه ادموندی p-cymene (2/%63)، thymol (7/%5) و γ-terpinene (8/%8) بود. بیشترین (36/1%) و کمترین (42/0%) میزان بازده اسانس به ترتیب مربوط به جمعیتهای 63 از مرزه اورامانی و 48 از مرزه ادموندی بود. بنابراین، دو گونه مذکور، به عنوان گونههای مستقل و متمایز از یکدیگر تلقی می‌شوند. همچنین، انجام مطالعات تکمیلی برای بررسی تنوع ژنتیکی این دو گونه به کمک مارکرهای مولکولی مختلف می‌تواند در تأیید نتایج حاضر، نیز حائز اهمیت باشد.
Considering the similarity of morphology and properties of different populations of savory (Satureja spp.), the separation of its species from each other requires additional and more detailed studies. Accordingly, S. avromanica and S. edmondi, two endemic species of Iran, were studied for their karyotypic and phytochemical characteristics. For cytogenetic studies, several traits such as total chromosome length (TL), long-arm length (LA), short-arm length (SA), centromeric index (CI), overall chromosome shape (%TF), relative length difference (DRL), intrachromosomal asymmetry index (A1), interchromosomal asymmetry index (A2), dispersion index (DI), and karyotypic formula (KF) were measured and calculated for populations 48 and 55 from Edmondi savory and 63 and 67 from Oramani savory. Based on the results, the basic chromosomal numbers in Oramani and Edmondi populations were x=12 (2n=2x=24) and x=15 (2n=2x=30), respectively. In cluster analysis based on complete linkage method, populations 63 and 67 were located in one cluster, however, 48 and 55 were placed in another cluster. Furthermore, the populations of the two species had statistically significant differences with each other for all the karyotypic traits (P<0.01). Based on GC-MS analysis, 21 and 25 different compounds were detected in Edmondi and Oramani savory essential oils (EOs), respectively. The main compounds in the EO of Oramani savory were piperitone (19%) and piperitenone (26.3%), while the main components in Edmondi savory EO were p-cymene (63.2%), thymol (5.7%), and γ-terpinene (8.8%). The highest (1.36%) and lowest (0.42%) EO yields were calculated for populations Oramani 63 and Edmondi 48, respectively. Therefore, these two mentioned species are considered as independent and distinct species from each other. Additionally, conducting additional studies to investigate the genetic diversity of these two species by different molecular markers can be important in confirming the present results.
1- امیدبیگی، ر. 1392. تولید و فرآوری گیاهان دارویی. به نشر وابسته به انتشارات آستان قدس رضوی. جلد دوم. چاپ هفتم. 442 صفحه.
2- جم‌زاد، ز. 1389. آویشنها و مرزه‌های ایران. انتشارات مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور. 172 صفحه.
3- جم‌زاد، ز. 1391. فلور ایران: تیره نعنا (Lamiaceae). انتشارات مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور. 1074 صفحه.
4- زارع تیموری، س.، کریم زاده، ق. و شریعت، الف. 1398. تنوع کاریولوژیک و اندازه ژنوم در گیاه دارویی مرزه (Satureja spp.). چهارمین کنگره سالانه بین المللی توسعه کشاورزی، منابع طبیعی، محیط زیست و گردشگری ایران، تبریز. https://civilica.com/doc/972638
5- زارع تیموری، س.، کریم زاده، ق. و شریعت، الف. 1400. تنوع کروموزومی و اندازه ژنوم در گیاه دارویی مرزه .(Satureja spp.) تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران. 29 (2): 236-250.
6- سفیدکن، ف.، جم‌زاد، ز. و برازنده، م م. 1383. اسانس Satureja bachtiarica Bunge. به عنوان منبعی غنی از کارواکرول. تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران. 20 (4): 425-439.
7- هوشیدری، ف.، سفیدکن، ف. و نادری، م. 1396. مقایسه‌ی کمی و کیفی اسانس مرزه‌ی اورامانی Satureja avromanica Maroofi. در رویشگاه و مزرعه. مجله علوم باغبانی ایران (علوم کشاوری ایران)، 48(1 ): 149-159.
8- Levan, A. K, Fredga. and A, Sandberg. 1964. Nomenclature for Centromeric Position on Chromosomes. Hereditas. 52: 201-220.
9- Maroofi, H. 2010. Two New Plant Species from Kurdistan Province, West of Iran. Iranian Journal of Bototanical. 16 (1): 76-80.
10- Romero Zarco, C. 1986. A New Method for Estimating Karyotype Asymmetry. Taxonomy. 36: 526-530.
11- Salehi Vozhdehnazari, M. S M, Hesamzadeh Hejazi, F, Sefidkon, M, Ghanbari Jahromi. and A, Mousavi. 2022a. Karyotype Analysis of Populations in Five Satureja Species from Iran, Journal of
Medicinal plants and By-product. 11(2): 149-158. https://doi:10.22092/jmpb.2021.354602.1360 12- Salehi Vozhdehnazari, M. S M, Hesamzadeh Hejazi, F, Sefidkon, M, Ghanbari Jahromi. and A, Mousavi. 2022b. Variability in Morphology and Essential Oil Profile for 30 Populations of Satureja Species with Respect to Climatic Paramours Using Multivariate Analysis: An Opportunity for Industrial Products. Journal of Essential Oil Bearing Plants. 25(5): 994-1011.
https://doi.org/10.1080/0972060X.2022.2130712 13- Sefidkon, F. and Z, Jamzad. 2006. Essential Oil Analysis of Iranian Satureja edmondi and S.
isophylla. Flavour & Fragrance Journal. 21: 230-233. https://doi.org/10.1002/ffj.1562 14- Simon, JE. AF, Chadwick. and LE, Craker. 1984. Herbs: An Indexed Bioliography.1971-1980.The Scientific Literature on Selected Herbs, and Aromatic and Medicinal Plant of the Temperate
Zone.Archon books,770pp. 15- Stebbins, G L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Edward Arnold Publisher LDT,
London, 216 pp.
گیاه و زیست فناوری ایران Iranian Journal of Plant & Biotechnology (IJPB)
|
مقاله پژوهشی
|
ارزیابی تمایزی دو گونه مرزه Satureja avromanicaو Satureja edmondiبا استفاده از مطالعات سیتوژنتیکی و فیتوشیمیایی
مهدیه صالحی وژده نظری (نویسنده مسئول)1* و سمانه سماوات2
1*- دکتری، مؤسسه تحقيقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقيقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران، mahdiyehsalehi1@gmail.com
2- استادیار، مؤسسه تحقيقات جنگلها و مراتع کشور، سازمان تحقيقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران، ایران، samaneh.samavat@gmail.com
تاریخ دریافت: اردیبهشت 1403 تاریخ پذیرش: تیر 1403
Differentiative assessment between Satureja avromanica and Satureja edmondi using cytogenetic and phytochemical traits
Mahdiyeh Salehi Vozhdehnazari (Corresponding author)1* and Samaneh Samavat2
1- Ph.D., Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran, mahdiyehsalehi1@gmail.com
2- Assistant Professor, Research Institute of Forests and Rangelands, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, Iran, samaneh.samavat@gmail.com
Received: May 2024 Accepted: July 2024
چکیده با توجه به قرابت ظاهری و تشابه خواص جمعیتهای مختلف مرزه (Satureja spp.)، تفکیک گونههای آن از یکدیگر مستلزم انجام مطالعات تکمیلی و دقیق‌تر است. بر این اساس، S. avromanica و S. edmondi به عنوان دو گونه اندمیک ایران، به لحاظ خصوصیات کاریوتیپی و فیتوشیمیایی، مورد مطالعه قرارگرفتند. در مطالعات سیتوژنتیکی، صفات متعددی چون طول کل کروموزوم (TL)، طول بازوی بلند (LA)، طول بازوی کوتاه (SA)، شاخص سانترومری (CI)، درصد شكل کلی کروموزوم (%TF)، اختلاف طول نسبی (DRL)، شاخص عدم تقارن درون کروموزومی (A1)، شاخص عدم تقارن بین کروموزومی (A2)، شاخص پراکندگی (DI)، و فرمول کاریوتیپی (KF) برای جمعیتهای 48 و 55 از مرزه ادموندی و 63 و 67 از مرزه اورامانی اندازه‌گیری و محاسبه شد. بر اساس نتایج، عدد پايه كروموزومي در جمعیتهای اورامانی و ادموندی به ترتیب 12x=، (24x=2n=2) و 15x=، (30x=2n=2) بود. در تجزیه خوشه‌ای به روش پیوستگی کامل، جمعیتهای 63 و 67 در یک خوشه و جمعیتهای 48 و 55 در خوشه دیگر واقع شدند. همچنین جمعیتهای دو گونه از نظر تمامی صفات کاریوتیپی مورد مطالعه، با یکدیگر اختلاف آماری معنی‌داری داشتند (P<0.01). بر اساس آنالیز GC-MS، به ترتیب 21 و 25 ترکیب مختلف در اسانس مرزه ادموندی و مرزه اورامانی ردیابی شد. ترکيبات اصلی موجود در اسانس مرزه اورامانی، piperitone (%19) و piperitenone (3/%26) بود، در حالی که عمده‌ترین اجزای موجود در اسانس مرزه ادموندی p-cymene (2/%63)، thymol (7/%5) و γ-terpinene (8/%8) بود. بیشترین (36/1%) و کمترین (42/0%) میزان بازده اسانس به ترتیب مربوط به جمعیتهای 63 از مرزه اورامانی و 48 از مرزه ادموندی بود. بنابراین، دو گونه مذکور، به عنوان گونههای مستقل و متمایز از یکدیگر تلقی می‌شوند. همچنین، انجام مطالعات تکمیلی برای بررسی تنوع ژنتیکی این دو گونه به کمک مارکرهای مولکولی مختلف می‌تواند در تأیید نتایج حاضر، نیز حائز اهمیت باشد. کلمات کلیدی: اسانس، تفکیک گونه، کروموزوم، گیاه دارویی، GC-MS
فصلنامه گیاه و زیست فناوری ایران سال 1403، دوره 19، شماره 1، صص 58-47 |
|
Considering the similarity of morphology and properties of different populations of savory (Satureja spp.), the separation of its species from each other requires additional and more detailed studies. Accordingly, S. avromanica and S. edmondi, two endemic species of Iran, were studied for their karyotypic and phytochemical characteristics. For cytogenetic studies, several traits such as total chromosome length (TL), long-arm length (LA), short-arm length (SA), centromeric index (CI), overall chromosome shape (%TF), relative length difference (DRL), intrachromosomal asymmetry index (A1), interchromosomal asymmetry index (A2), dispersion index (DI), and karyotypic formula (KF) were measured and calculated for populations 48 and 55 from Edmondi savory and 63 and 67 from Oramani savory. Based on the results, the basic chromosomal numbers in Oramani and Edmondi populations were x=12 (2n=2x=24) and x=15 (2n=2x=30), respectively. In cluster analysis based on complete linkage method, populations 63 and 67 were located in one cluster, however, 48 and 55 were placed in another cluster. Furthermore, the populations of the two species had statistically significant differences with each other for all the karyotypic traits (P<0.01). Based on GC-MS analysis, 21 and 25 different compounds were detected in Edmondi and Oramani savory essential oils (EOs), respectively. The main compounds in the EO of Oramani savory were piperitone (19%) and piperitenone (26.3%), while the main components in Edmondi savory EO were p-cymene (63.2%), thymol (5.7%), and γ-terpinene (8.8%). The highest (1.36%) and lowest (0.42%) EO yields were calculated for populations Oramani 63 and Edmondi 48, respectively. Therefore, these two mentioned species are considered as independent and distinct species from each other. Additionally, conducting additional studies to investigate the genetic diversity of these two species by different molecular markers can be important in confirming the present results. Keywords: Chromosome, Essential oil, GC-MS, Medicinal plant, Species separation
Iranian Journal of Plant & Biotechnology Spring 2024, Vol 19, No 1, Pp 47-58 |
مقدمه و کلیات
جنس مرزه (Satureja) متعلق به تيره نعنا (Lamiaceae) و دارای گونه‌هاي متعدد و ارزشمندی از گیاهان دارویی است. این جنس شامل 16 گونه متفاوت است که 9 گونه آن انحصاري ايران است. مرزه بومي مديترانه شرقي و جنوب غرب آسيا است و در نواحي مختلف ايران به ويژه در دامنه‌هاي كوهستاني آذربايجان، كرمانشاه، خراسان، ارسباران و گيلان به طور طبیعی رویش دارد (Shahnazi et al., 2008). مرزه گياهي علفي و معطر يكساله يا چند ساله با ساقه‌هاي متعدد، افراشته، خيزان يا كماني است که معمولاً پوشيده از كرك است )جم‌زاد، 1391). از آنجایی که اسانس این گیاهان شامل مقادیر قابل توجهی از مواد مؤثره ارزشمندی همچون تیمول و کارواکرول است، در میان انواعی از گیاهان دارویی، از جایگاه ویژه‌ای برخوردار هستند (نورمند مؤید و همکاران، 1402). اسانس مرزه، دارای خواص ضدمیکروبی است و در طب سنتی در درمان مشکلات پوستی، گوارشی، فشار خون، دیابت، سردرد، درد مفاصل و تقویت سیستم ایمنی بدن کاربرد دارد (امیدبیگی، 1392). از بین گونههای مختلف مرزه بومی فلور ایران، در تفکیک دو گونه‌ی مرزه اورامانی با نام علمی S. avromanica Maroofi. و مرزه ادموندیBriq.) (S. edmondi از یکدیگر اختلاف نظر‌هایی وجود دارد. به صورتی که جم‌زاد (1391) در فلور ایران گزارش کرد که این دو گونه از نظر صفات کلی گیاه شناختی شبیه به یکدیگرند و تفکیک این دو را به عنوان گونههای مستقل، منوط به انجام بررسی‌های تکمیلی دانست. همچنین اين دو گونه را به عنوان گونههای سينونيم با یکدیگر نیز به شمار نياورده است. این در حالی است که پیشتر این دو گونه صرفاً بر اساس مطالعات گیاهشناسی توسط دیگر گیاه‌شناسان به عنوان گونههای مستقل از یکدیگر ثبت شده بودندMaroofi, 2010) ، جم‌زاد، 1391). بر این اساس در ادامه به برخی از مهمترین خصوصیات گیاه‌شناختی این دو گونه در فلور ایران پرداخته شده است. مرزه اورامانی گياهی بوته‌ای، به ارتفاع 35 تا 80 سانتیمتر، با ساقه‌های متعدد ساده و یا با انشعابات کم است. برگ‌هایش متقابل و یا دسته‌ای و کاسه گل آن پوشيده از کرك است. این گونه نخستین بار از روستاي بلبر منطقه اورامان كردستان جمع‌آوري شده است و به عنوان گونه جديد و انحصاري جنس مرزه در ايران توسط Maroofi (2010) معرفي گردیده است. اسانس این گیاه دارای مواد مؤثره ارزشمندی چون تیمول، کارواکرول، پاراسیمن، و گاماترپینن است (هوشیدری و همکاران، 1396). مرزه ادموندی گياهي بوته‌اي به ارتفاع 15 تـا 50 سـانتي‌متر، با ساقه‌هاي متعدد نازك و باريك است. برگ‌هـای آن متـراكم يـا تنـك و بدون دمبرگ است. كاسه گل آن دارای دولبه نامشخص و تقريباً بدون كرك و یا با کرک‌های خيلي ريز زگيل مانند است. رويشگاه اصلی این گیاه را شكاف سنگ‌ها و صخره‌ها در مناطق كوهستاني منطقه ايراني-توراني می‌دانند (جم‌زاد، 1391). ترکیبات عمده موجود در اسانس این گونه مرزه نیز شامل پاراسیمن، گاماترپینن، تیمول و آلفا-ترپینئول است (نورمند مؤید و همکاران، 1402). از آنجایی که فنوتیپ گیاهان تا حدود زیادی تحت تأثیر مواد ژنتیکی هسته می‌باشد، یکی از روشهای بررسی تنوع در ارقام و گونههای مختلف گیاهی می‌تواند، انجام مطالعات سیتوژنتیکی باشد. بدیهی است گونه‌هایی که از نظر پارامترهای سیتوژنتیکی به یکدیگر شبیه هستند، قرابت بیشتری با یکدیگر دارند. ضمن اینکه به کمک اطلاعات کروموزومی جمعیتهای گیاهی، مقایسه آن‌ها با یکدیگر نیز امکانپذیر می‌گردد. از آنجایی که گونه‌هاي مختلف مرزه از نظر كاريولوژي و ترکیبات فیتوشیمیایی متفاوت از یکدیگرند، مطالعه این ویژگی‌ها در کنار بررسی سایر صفات مورفولوژیکی آن‌ها، می‌تواند گامی مؤثر برای حـل مشكلات طبقه‌بندی و تفکیک گونههای آن از یکدیگر باشد. لازم به ذکر است که در خصوص تعداد کروموزومها در گونههای مختلف مرزه بومی ایران گزارش‌های محدودی وجود دارد. بر این اساس، تحقیق حاضر با هدف بررسی و مقایسه صفات سیتوژنتیکی و فیتوشیمیایی دو گونه مرزه ادموندی و اورامانی انجام گرفته است تا تأییدی بر تفکیک مؤثر این دو گونه از یکدیگر باشد.
فرآیند پژوهش
در جدول (1) برخی اطلاعات مربوط به مناطق جمع‌آوری چهار جمعيت مورد مطالعه از دو گونه مرزه ادموندی و اورامانی آورده شده است. شناسایی جمعیتهای مورد مطالعه توسط متخصصان گیاه‌شناس مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور انجام شد. به منظور انجام بررسی‌های فیتوشیمیایی سرشاخه‌های گلدار جمعیتهای هر دو گونه با مراجعه به رویشگاه‌های اصلی آن‌ها در شهریور سال 1401 جمع‌آوری گردید. همچنین، جمع‌آوری بذور آن‌ها برای انجام مطالعات سیتوژنتیکی در آبان همان سال انجام شد.
جدول1- مشخصات مناطق جمع‌آوری جمعیتهای مرزه (Satureja spp.)
Table 1- Characteristics of the collected Satureja population localities (Satureja spp.)
نام علمی | کد جمعیت | محل جمع‌آوری | عرض جغرافیایی | طول جغرافیایی | ارتفاع از سطح دریا(m) |
S. edmondi | 48 | کرمانشاه-سنقر-میان راهان | 34°.35'.06''N | 47°.26'.34''E | 1439 |
S. edmondi | 55 | کرمانشاه-کامیاران-حجت آباد | 34°.37'.19''N | 47°.13'.52''E | 1428 |
S. avromanica | 63 | کردستان-اورامان تخت-روستای بلبر | 35°.14'.16''N | 46°.17'.34''E | 990 |
S. avromanica | 67 | کردستان-اورامان تخت- روستای بلبر | 35°.14'.18''N | 46°.17'.22''N | 912 |
مطالعات سیتوژنتیکی
جوانه‌زنی بذور و نمونه‌گیری از ریشه: بذور هر جمعیت، پس از ضدعفونی سطحی با محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد به مدت 10 دقیقه داخل پتری‌دیش و روی کاغذ صافی استریل کشت شدند. شدت نور 1200 لوکس با دوره نوری 12/12 ساعت روشنایی/تاریکی و رطوبت 60% در نظر گرفته شد. پس از جوانه‌زنی و رشد ریشه تا 5/1 سانتیمتر، قسمت انتهایی ریشه جدا شد و به ترتیب مراحل پیش تیمار در آلفا برومو نفتالین 5/0%، تثبیت در محلول لویتسکی (Levitsky) که شامل محلول کرومیوم تری‌اکسید(Chromium trioxide) و فرمالدهید (Formaldehyde) %40 به نسبت برابر بود، انجام شد. نمونه‌ها در محلول هیدروکسید سدیم یک نرمال در دمای OC60 به مدت هشت دقیقه قرار داده شدند تا هیدرولیز شوند. همچنین، مخلوط هماتوکسیلین 4% و یک گرم سولفات آمونیوم فریک برای رنگ‌آمیزی نمونه‌ها استفاده شد. سپس اسلایدهایی برای مشاهده تصاویر کروموزومی توسط میکروسکوپ Olympus BH-2 تهیه شدند. بزرگنمایی تصاویر با استفاده از لنز x100 در سیستم آنالیز تصویری تقریباً 2000 برابر بود. پس از تهيه صفحات متافازی و حـداقل سه كاريوتيـپ بـراي هـر جمعيـت، بـا اسـتفاده از نـرم‌افـزارMicroMeasure 3.3 ، طول کروموزومها اندازه‌گیری شد. براي تعيين نـوع كرومـوزوم‌هـا نيـز از روش Levan et al., (1964) اسـتفاده شـد. جدول دو طرفهStebbins (Stebbins, 1971) یکی از کارآمدترین روشهای دسته‌بندی کاریوتیپ است. این روش ابزار مناسبی برای تعیین جایگاه کاریوتیپ گونه‌ها از لحاظ تکاملی است. تخمین نامتقارن بود کاریوتیپ از شاخص عددی رومرو-زرکو (Romero-Zarco, 1986) استفاده شد. سایر پارامترهاي کاریوتیپی نیز مطابق فرمول‌های ذیل، محاسبه شد.
فرمول (1): طول کل کروموزوم (TL) از مجموع طول بازوی بلند (L) و کوتاه (S) بر حسب میکرومتر(µm) محاسبه شد. 
فرمول (2): شاخص سانترومری (CI) از نسبت S به TL محاسبه شد. 
فرمول (3) درصد شکل کلی (%TF):
فرمول (4): اختلاف درصد طول نسبی کروموزوم DRL)) بیانگر اختلاف حداقل (%RImin) و حداکثر طول نسبی (%RIMax) کروموزومها در یک کاریوتیپ است. = %RIMax-%RImin DRL
مطالعات فیتوشیمیایی: برای این منظور، از سر شاخه گلدار گیاهان در مرحله گل‌دهی کامل، نمونه‌برداری انجام شد. پس از خشک شدن نمونه‌ها در شرایط سایه و دمای OC2±30، 100 گرم از قسمت‌های غيرچوبی گياه خشك شده توسط آسیاب برقی پودر شدند. اسانس‌گیری توسط دستگاه کلونجر به روش تقطير با آب انجام شد. رطوبت احتمالی اسانس‌ها با پودر سولفات سدیم بی آب (Na2SO4)به عنوان ماده جاذب رطوبت، حذف شد. اسانس‌های به دست آمده تا زمان تزریق به دستگاه گاز کروماتوگرافی در یخچال (دمای OC4) نگهداری شدند. بازده اسانس براساس وزن خشک سرشاخه محاسبه شد.
کروماتوگراف گازی فوق سریع (GC-FID): به منظور جداسازی و شناسایی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس هر یک از دو گونه مرزه مورد مطالعه، نمونه‌های اسانس به دستگاه کروماتوگراف گازی فوق سریع (Thermo-UFM) مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله (FID) و داده پرداز با نرم افزار Chrom-Card 2006 مورد استفاده قرار گرفت. دستگاه دارای ستون DB-5 نیمه قطبی (به طول m10، قطر داخلی mm 1/0 و ضخامت لایه فاز ساکن برابر µ 4/0) بود. گاز حامل، هلیوم و فشار آن در ابتدای ستون برابر Kg cm-2 3، دمای قسمت تزریق OC280 و دمای آشکارساز OC280 تنظیم شده بود.
دستگاه GC-MS: گاز کروماتوگراف کوپل شده با طيف سنج جرمی مدل واریان 3400 از نوع تله یونی مجهز به ستون DB-5 به طول m 30 و قطر mm 25/0 ضخامت لایه فاز ساکن در آن µm 25/0 بوده است. برنامi ریزی حرارتی ستون همسان با برنامه ریزی ستون در دستگاه GC بوده است. دمای محفظه تزریق 10 درجه بيش از دمای نهایی ستون تنظيم شده است. گاز حامل هليوم بوده که با سرعت 5/31 سانتیمتر بر ثانيه در در طول ستون حرکت کرده است. زمان اسکن برابر یك ثانيه، انرژی یونيزاسيون 70 الکترون ولت و ناحيه جرمی از40 تا 340 بوده است.
تجزیه و تحلیل آماری: داده‌های حاصل از مطالعات سیتوژنتیکی در قالب طرح آماری کاملاً تصادفی و با سه تکرار تجزیه واریانس شدند. هر تکرار یک سلول از مریستم گیاه است و از هر جمعیت سه اسلاید از مریستم انتهایی سه گیاه مختلف تهیه شده‌است. قبل از تجزیه واریانس آزمون نرمال بودن روی داده‌ها انجام شد و نیازی به تبدیل داده نبود. از نرم افزار آماری SPSS (IBM SPSS Statistics V 22) برای تجزیه واریانس استفاده شد و مقایسه میانگین‌ها به روش LSD (حداقل اختلاف معنی‌دار) انجام گرفت.
نتایج و بحث
مطالعات سیتوژنتیکی: صفات کاریوتیپی چهار جمعیت مورد بررسی از دو گونه مرزه ادموندی و اورامانی در جدول (2) آورده شده‌است. همچنین تصاویر صفحات متافاز میتوزی به همراه کاریوتیپ و ایدیوگرام مربوط به هر یک از جمعیتهای مورد مطالعه در شکل‌های 1 تا 4 نشان داده شده‌است. بر اساس جدول (2)، تمام جمعیت‌ها بر اساس سطح پلوئیدی، ديپلوئيد ((2n هستند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که در گونهS. avromanica عدد پایه کروموزومی 12x=، (24 x=2n =2) است و در گونه S. edmondi 15x= و (30 x=2n =2) است. نتایج حاصل از بررسی تنوع سیتوژنتیکی سایر گونه‌هاي مرزه توسط دیگر محققان حکایت از آن دارد که تعداد کروموزوم در جمعیتهای گونهS. hortensis 48 x=2n =2 و در دو جمعیت مربوط به S. mutica و S. boissieri برابر با 60 x=4n =2 بود (زارع تیموری و همکاران، 1398). همچنین Salehi Vozhdehnazari و همکاران ( a2022) در بررسی 15 جمعیت از پنج گونه مرزه گزارش کردند که وضعیت کروموزومی گونههای S. kermanshahensis و S. macrantha به صورت 2n=2x=24 است و در مورد S. sahendica، S. edmondi و S. khuzistanica به صورت 2n=2x=30 بود. از لحاظ تكامل کاریوتیپی و براساس کلاس تقارن Stebbinsتمام جمعیتهای مورد مطالعه در کلاس 1B قرارگرفتند. Salehi Vozhdehnazari و همکاران ( a2022) نیز گزارش کردند که جمعیت‌هایی از گونههای S. macrantha، S. sahendica، S. edmondi و S. kermanshahensis در گروه1B هستند ولی جمعیتهای S. macrantha (3)، S. khuzistanica وS.sahendica (7) در گروه 2B قرار دارند. بیشترین طول کل کروموزوم (TL) مربوط به جمعیتS. edmondi55 (µm 42/1) و کوچکترین طول کروموزوم در جمعیت S. avromanica 63 (µm 98/0) مشاهده شد. زارع تیموری و همکاران (1400) نیز نشان دادند که میانگین طول کروموزوم در 10 جمعیت گیاه مرزه مربوط به سه گونه S. hortensis، S. mutica وS. boissieri مورد مطالعه µm 46/1 (دامنه µm 71/19-1/1) بود که از µm 19/1 در جمعیت تتراپلوئید S2P1 تا µm 71/1 در جمعیت دیپلوئید S1P1 متغیر بود. Salehi Vozhdehnazari و همکاران (a 2022) نیز گزارش کردند که میانگین طول کروموزوم 15 جمعیت مورد مطالعه از پنج گونه مرزه (S. macrantha، S. sahendica، S. edmondi،S. khuzistanica و S. kermanshahensis) از µm60/0 تا 27/2 می‌باشد. دو پارامتر A1 و %TF به‌عنوان شاخص‌‌های تقارن درون کروموزومی وپارامتر‌های A2 و DRL به‌عنوان شاخص‌‌های بین کروموزومی، تا حدودی جمعیتهای مختلف هر گونه را از لحاظ تقارن و تكامل کاریوتیپ متمایز ساختند. بر این اساس از لحاظ تقارن درون کروموزومی جمعیت S. edmondi48، با داشتن کمترین میزان A1 (15/0) و بیشترین میزان TF(07/%46) از متقارن‌ترین و در عین حال ابتدایی‌ترین کاریوتیپ بوده‌است. در حالیکه جمعیت S. avromanica 67با دارا بودن بالاترین مقدار A1(24/0) و پایین‌ترین مقدار TF (93/%40)، از نامتقارن‌ترین و در عین حال متكامل‌ترین کاریوتیپ برخوردار است. از لحاظ تقارن بین کروموزومی نیز جمعیت S. avromanica 67 با بیشترین میزانA2 (36/0)، کاریوتیپ نامتقارن و گونه‌ای تكامل یافته است. از نظر تیپ کروموزومی، تمام جمعیتهای دو گونه دارای کروموزوم‌‌های متاسنتریک هستند. به منظور اندازه‌گیری تنوعات کاریوتیپی کوچک از پارامترشاخص پراکندگی (Dispersion Index; DI) که از نظر تقارن کاریوتیپی دارای این پتانسیل است که حتی تنوعات کاریوتیپی کوچک را می‌تواند کشف کند، استفاده شد. جمعیت S. avromanica 63(80/13) بیشترین و جمعیت S. edmondi55 (70/9) کمترین مقدار DI را بین جمعیت‌ها دارا بودند. نقش DI در مرتب کردن گونههای داخل یک کلاس مشابه است و هر چه DI بیشتر شود اختصاصی شدن کاریوتیپ بیشتر می‌شود (جدول 2).
جدول 2- صفات کاریوتیپی اندازه‌گیری شده در جمعیتهای مورد مطالعه مرزه
Table 2 - Karyotypic traits measured for the studied populations of Satureja spp.
جمعیت | 2n | TL | LA | SA | CI | %TF | DRL | A1 | A2 | DI | KF |
S. avromanica 63 | 24 | 0.98 | 0.52 | 0.46 | 0.47 | 41.84 | 8.87 | 0.23 | 0.32 | 13.80 | 12m |
S. avromanica 67 | 24 | 1.00 | 0.54 | 0.46 | 0.46 | 40.93 | 9.01 | 0.24 | 0.36 | 12.95 | 12m |
S. edmondi 55 | 30 | 1.42 | 0.78 | 0.64 | 0.45 | 45.87 | 5.58 | 0.16 | 0.21 | 9.70 | 15m |
S. edmondi 48 | 30 | 1.39 | 0.78 | 0.61 | 0.44 | 46.07 | 6.02 | 0.15 | 0.23 | 9.94 | 15m |
طول کل کروموزوم (TL)، طول بازوی بلند (LA)، طول بازوی کوتاه (SA)، نسبت بازو‌ها (AR)، شاخص سانترومری (CI)، درصد شكل کلی کروموزوم (%TF)، اختلاف طول نسبی (DRL)، شاخص عدم تقارن درون کروموزومی (A1)، شاخص عدم تقارن بین کروموزومی (A2)، شاخص پراکندگی (DI)، فرمول کاریوتیپی (KF)
Total chromosome length (TL), long-arm length (LA), short-arm length (SA), centromeric index (CI), overall chromosome shape (%TF), relative length difference (DRL), intrachromosomal asymmetry index (A1), interchromosomal asymmetry index (A2), dispersion index (DI), karyotypic formula (KF)
نتایج به‌دست آمده از تجزیه واریانس داده‌های حاصل از اندازه‌گیری صفات کاریوتیپی نشان داد که بین جمعیت‌ها از لحاظ تمامی صفات کروموزومی مورد مطالعه، اختلاف معنی‌داری در سطح 1% وجود دارد. که این امر بیانگر وجود تنوع اندازه کروموزومها در میان ژرم پلاسم‌های مورد بررسی می‌باشد (جدول 3). بر این اساس، با توجه به اینکه عدد کروموزومی و سایر صفات کاریوتیپی اندازه‌گیری شده برای این دو گونه متفاوت از یکدیگر است و جمعیتهای آن‌ها در خوشه‌های مجزا قرار گرفته‌اند، لذا این دو گونه از هم متفاوت و مستقل هستند.
جدول 3- میانگین مربعات حاصل از تجزیه واریانس صفات کاریوتیپی جمعیتهای مورد مطالعه
منابع تغییرات | درجه آزادی | میانگین مربعات | ||||||||
TL | LA | SA | CI | %TF | DRL | A1 | A2 | DI | ||
جمعیت | 3 | 0.172** | 0.060** | 0.029** | 0.004** | 21.466** | 9.976** | 0.006** | 0.014** | 13.035** |
خطا | 11 | 0.002 | 0.000 | 0.001 | 0.01 | 0.143 | 0.271 | 0.000 | 0.000 | 0.153 |
CV (%) |
| 18.32 | 19.86 | 16.80 | 3.38 | 5.58 | 23.19 | 22.73 | 23.04 | 16.47 |
Table 3- The mean square obtained from the variance analysis of the karyotypic traits of the studied populations
**= معنی‌دار در سطح احتمال 1%
= ** significant at 1% probability level
شکل 1- صفحه متافازی، کاریوتیپ و ایدیوگرام S. avramanica67
Fig 1- Metaphase chromosome plate, karyotype, and ideogram of S. avramanica67
شكل 2- صفحه متافازی، کاریوتیپ و ایدیوگرام S. avramanica63
Fig 2- Metaphase chromosome plate, karyotype, and ideogram of S. avramanica63
شکل 3- صفحه متافازی، کاریوتیپ و ایدیوگرام S. edmondi 55
Fig 3- Metaphase chromosome plate, karyotype, and ideogram of S. edmondi 55
شکل 4- صفحه متافازی، کاریوتیپ و ایدیوگرام S. edmondi 48
Fig 4- Metaphase chromosome plate, karyotype, and ideogram of S. edmondi 48
شکل 5- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه‌ای بر اساس صفات کاریوتیپی جدول 2 (1: 63، 2: 67، 3: 48، 4: 55)
Fig 5- Dendrogram resulting from cluster analysis based on karyotypic traits in Table 2 (1: 63, 2: 67, 3: 48, 4: 55)
مطالعات فیتوشیمیایی: از جمله مهمترين فاكتورهاي فیتوشیمیایی كه براي مطالعه جمعیتهای گیاهان دارویی مورد بررسي قرار می‌گيرد، درصد بازده، نوع و درصد اجزاي تشكيل دهنده اسانس است. مقادیر و نوع ترکیبات اصلی موجود در اسانس جمعیتهای مرزه اورامانی و ادموندی به ترتیب در جداول 4 و 5 آورده شده‌است. بر اساس آنالیز GC-MS اسانس جمعیتهای مورد مطالعه، 21 ترکیب در اسانس مرزه ادموندی و 25 ترکیب در اسانس مرزه اورامانی شناسایی شد. عمده‌ترین ترکيبات موجود در اسانس مرزه ادموندی p-cymene (2/%63)، thymol (7/%5) و γ-terpinene (8/%8) بود. Sefidkon و Jamzad (2006) نیز گزارش کردند که در اسانس مرزه ادموندی 30 ترکیب عمده وجود دارد که بیشترین درصد به ترتیب مربوط به p-cymene (1/%61)، γ-terpinene (6/%9) و thymol (5%) بود که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. ترکيبات اصلی موجود در اسانس مرزه اورامانی piperitone (%19) و piperitenone (3/%26) بود که میزان آن‌ها در دو جمعيت 63 و 67 متفاوت از یکدیگر بود. همچنین بیشترین درصد کارواکرول (7/5%) در اسانس جمعیت 67 از گونه اورامانی ردیابی شد. هوشیدری و همکاران (1396) نیز 2/5% کارواکرول در اسانس مرزه اورامانی ردیابی کردند. بر طبق نتایج، مشخص شد که ترکیباتی چون 1, 8-cineole، menthone، α-terpineol، shisofuran، pulegone، piperitenone oxid، E-Jasmone، β-bourbonene، globulol، β ‐eudesmol، α-cadinol و hexahydrofarnecyl acetone فقط اختصاص به جمعیتهای مرزه اورامانی داشت و در جمعیتهای مرزه ادموندی ردیابی نشدند. این در حالی است که ترکیباتی چون α-thujene، α-pinene، sabinene، camphene، myrcene، α-phellandrene،thymol methyl ether، methyl ether carvacrol، thymol acetate و germacrene D اختصاص به جمعیتهای مرزه ادموندی داشت و در مرزه اورامانی ردیابی نشدند.
جدول 4- ترکیبات اصلی موجود در اسانس دو جمعیت مرزه اورامانی (S. avromanica)
Table 4- The major compounds in the essential oils of two populations of S. avromanica
مقدار (%) | RI | نوع ترکیب | ردیف | |
S. avromanica63 | S. avromanica67 |
| ||
3.80 | 4.0 | 1021 | p-cymene | 1 |
1.6 | 1.4 | 1031 | 1, 8-cineole | 2 |
0.75 | 1.0 | 1058 | γ-terpinene | 3 |
8.2 | 7.1 | 1100 | linalool | 4 |
1.2 | 0.9 | 1148 | menthone | 5 |
1.0 | 2.8 | 1167 | borneol | 6 |
2.6 | 1.9 | 1174 | terpinen-4-ol | 7 |
3.3 | 2.1 | 1186 | α-terpineol | 8 |
1.4 | 0.9 | 1198 | shisofuran | 9 |
3.2 | 2.6 | 1233 | pulegone | 10 |
19.0 | 17.3 | 1249 | piperitone | 11 |
5.0 | 6.1 | 1290 | bornyl acetate | 12 |
1.2 | 1.1 | 1292 | thymol | 13 |
4.3 | 5.7 | 1301 | carvacrol | 14 |
26.3 | 22.6 | 1340 | piperitenone | 15 |
7.6 | 5.5 | 1366 | piperitenone oxid | 16 |
0.6 | 1.9 | 1387 | β-bourbonene | 17 |
2.1 | - | 1390 | E-Jasmone | 18 |
0.8 | - | 1424 | e-caryophyllene | 19 |
3.4 | 1.5 | 1580 | spathulenol | 20 |
1.5 | 8.0 | 1585 | caryophyllene oxide | 21 |
0.6 | - | 1590 | globulol | 22 |
- | 1.9 | 1651 | β‐eudesmol | 23 |
3.7 | 4.2 | 1652 | α-cadinol | 24 |
4.3 | 5.3 | 1856 | hexahydrofarnecyl acetone | 25 |
جدول 5- ترکیبات اصلی موجود در اسانس دو جمعیت مرزه ادموندی (S. edmondi)
Table 5- The major compounds in the essential oils of two populations of S. edmondi
مقدار (%) | RI | نوع ترکیب | ردیف | |
S. edmondi55 | S. edmondi48 |
| ||
0.4 | - | 926 | α-thujene | 1 |
1.8 | 1.5 | 939 | α-pinene | 2 |
0.4 | 0.8 | 951 | sabinene | 3 |
0.9 | 0.4 | 954 | camphene | 4 |
1.2 | 0.4 | 989 | myrcene | 5 |
- | 0.2 | 1003 | α-phellandrene | 6 |
63.2 | 59.8 | 1021 | p-cymene | 7 |
8.2 | 8.8 | 1058 | γ-terpinene | 8 |
0.8 | 1.7 | 1100 | linalool | 9 |
3.0 | 2.7 | 1167 | borneol | 10 |
1.0 | 0.6 | 1174 | terpinen-4-ol | 11 |
0.7 | 1 | 1236 | thymol methyl ether | 12 |
1.9 | - | 1246 | methyl ether carvacrol | 13 |
0.7 | 1.1 | 1290 | bornyl acetate | 14 |
4.9 | 5.7 | 1292 | thymol | 15 |
3.7 | 2.8 | 1301 | carvacrol | 16 |
0.5 | 0.8 | 1349 | thymol acetate | 17 |
0.6 | 0.4 | 1424 | e-caryophyllene | 18 |
0.4 | 0.4 | 1483 | germacrene D. | 19 |
2.0 | 1.1 | 1580 | spathulenol | 20 |
2.5 | 2.4 | 1585 | caryophyllene oxide | 21 |
درصد بازده اسانس جمعیتهای مورد مطالعه بر اساس وزن خشک سرشاخه‌های گلدار، در شکل 5 آورده شده است. در بررسی بازده اسانس جمعیتهای مورد مطالعه مشخص شد که بیشترین (36/1%) و کمترین (42/%0) میزان بازده اسانس به ترتیب مربوط به جمعیتهای 63 از گونه اورامانی و 48 از گونه ادموندی بود (شکل 6). در بررسی صورت گرفته توسط Salehi Vozhdehnazari و همکاران ( b2022) نیز میزان بازده اسانس جمعیتهای مطالعه شده از مرزه ادموندی را از 42/0% تا 08/2% گزارش شد. همچنین هوشیدری و همکاران (1396)، گزارش کردند که میزان بازده اسانس جمعیتهای وحشی از مرزه اورامانی، 4/1% است. به این ترتیب یافته‌های پژوهش حاضر با نتایج سایر محققان مطابقت دارد.
Fig 6- Comparison of the percentage of essential oil yield of the studied populations (S. avramanica (48, 55) and S. edmondi (63, 67)) in terms of dry weight (P<0.01)
نتیجه‌گیری کلی
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که عدد پایه کروموزومی در جمعیتهای دو گونه مرزه ادموندی و اورامانی با سطح پلوئیدی یکسان، متفاوت از یکدیگر است. همچنین جمعیتهای این دو گونه در مطالعات کاریوتیپی و فیتوشیمیایی انجام شده، به طور معنی‌داری متمایز از یکدیگر بودند. لذا معرفی آن‌ها به عنوان گونههای مترادف با یکدیگر بر اساس نظر برخی از گیاه‌شناسان مورد تأیید نمی‌باشد. بر این اساس، دو گونه مذکور، به عنوان گونههای مستقل و متمایز از یکدیگر تلقی می‌شوند. لازم به ذکر است که انجام مطالعات تکمیلی برای بررسی تنوع ژنتیکی این دو گونه به کمک مارکرهای مولکولی مختلف می‌تواند در تأیید نتایج حاضر، نیز حائز اهمیت باشد.
سپاسگزاری
بدین وسیله از زحمات جناب آقای مهندس گلی‌پور برای جمع‌آوری نمونه‌های مرزه از رویشگاه‌های طبیعی و سرکار خانم دکتر سفیدکن برای تفسیر نتایج مربوط به GC-MS، کمال تشکر را داریم.
منابع
2) جم‌زاد، ز. 1391. فلور ایران: تیره نعنا (Lamiaceae). انتشارات مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور. 1074 صفحه.
3) زارع تیموری، س.، کریم زاده، ق و. الف، شریعت. 1398. تنوع کاریولوژیک و اندازه ژنوم در گیاه دارویی مرزه (Satureja spp.). چهارمین کنگره سالانه بین المللی توسعه کشاورزی، منابع طبیعی، محیط زیست و گردشگری ایران، تبریز.
4) زارع تیموری، س.، کریم زاده، ق و. الف، شریعت. 1400. تنوع کروموزومی و اندازه ژنوم در گیاه دارویی مرزه .(Satureja spp.) تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، 29 (2): 236-250.
5) نورمندمؤید، ف.، عباس‌زاده، ب و. ن، ولی‌زاده. 1402. بررسی کارایی مصرف کودهای آلی و شیمیایی در افزایش عملکرد کمّی و کیفی اسانس مرزه سهندی Satureja sahendica Bornm.. تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، 39 (3): 336-351.
6) هوشیدری، ف.، سفیدکن، ف و. م، نادری. 1396. مقایسه‌ی کمی و کیفی اسانس مرزه‌ی اورامانی Satureja avromanica Maroofi. در رویشگاه و مزرعه. مجله علوم باغبانی ایران (علوم کشاوری ایران)، 48(1 ): 149-159.
7) Levan, A. K, Fredga. and A, Sandberg. 1964. Nomenclature for Centromeric Position on Chromosomes. Hereditas, 52: 201-220.
8) Maroofi, H. 2010. Two New Plant Species from Kurdistan Province, West of Iran. Iranian Journal of Bototanical, 16 (1): 76-80.
9) Romero Zarco, C. 1986. A New Method for Estimating Karyotype Asymmetry. Taxonomy. 36: 526-530.
10) Salehi Vozhdehnazari, M. S M, Hesamzadeh Hejazi, F, Sefidkon, M, Ghanbari Jahromi. and A, Mousavi. 2022a. Karyotype Analysis of Populations in Five Satureja Species from Iran, Journal of Medicinal plants and By-product, 11(2): 149-158. https://doi:10.22092/jmpb.2021.354602.1360
11) Salehi Vozhdehnazari, M. S M, Hesamzadeh Hejazi, F, Sefidkon, M, Ghanbari Jahromi. and A, Mousavi. 2022b. Variability in Morphology and Essential Oil Profile for 30 Populations of Satureja Species with Respect to Climatic Paramours Using Multivariate Analysis: An Opportunity for Industrial Products. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 25(5): 994-1011.
12) Sefidkon, F. and Z, Jamzad. 2006. Essential Oil Analysis of Iranian Satureja edmondi and S. isophylla. Flavour & Fragrance Journal, 21: 230-233.
13) Shahnazi, S. F, Khalighi-Sigaroodi, Y, Ajani, D, Yazdani, R, Taghizad–Farid, M, Ahvazi, et al. 2008. The Chemical Composition and Antimicrobial Activity of Essential Oil of Satureja intermedia C. A. Mey. Journal of Medicinal Plants, 7 (25): 85-92.
14) Stebbins, G L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Edward Arnold Publisher LDT, London, 216 pp.