ساخت وکتور بیانی با ویژگی تنظیم منفی پایدار مسیر تولید استات در باکتری اشریشیاکلی به وسیله‌ی آنتی‌سنسRNA
محورهای موضوعی : بیوتکنولوژی و میکروبیولوژی کاربردی
کلید واژه: اشریشیاکلی, RNAی آنتی‌سنس, استات, پروتئین نوترکیب, استات کیناز, فنسفوترنس استیلاز,
چکیده مقاله :
یکی از مشکلات استفاده از باکتری اشریشیاکلی برای تولید انبوه پروتئین نوترکیب، ترشح استات در محیط کشت است که سبب کاهش طول عمر باکتری و به دنبال آن کاهش بیان پروتئین نوترکیب می شود. در این مقاله ما از فناوری RNAی آنتی سنس به عنوان ابزاری سودمند در مهندسی متابولیک برای مهار جزئی بیان ژن های مربوط به دو آنزیم اصلی مسیر استات، یعنی فسفوترانس استیلاز (PTA) و استات کیناز (ACK)، استفاده کردیم. یک پلاسمید نوترکیب که حاوی ژن های آنتی سنسی است که هر دو ژن ackA و pta را مورد هدف قرار می دهد، ساخته شد. قطعات مربوط به کاست آنتی سنس در ناقل مورد نظر کلون شده و عملکرد آن با اندازه گیری سطح mRNAی مربوط به هر دوژن با روش RT-PCR و سنجش فعالیت آنزیم های آن هابا روش واکنش های جفت شده براون و همکارانش مورد ارزیابی قرار گرفت. بیان کاست، سبب کاهش سطح mRNAی مربوط به هر دوژن و فعالیت آنزیم های آن ها شد. میزان این کاهش فعالیت در مورد استات کیناز، 17 درصد در مورد فنسفوترنس استیلاز 15 درصد محاسبه شد. با مشاهده این اثر امیدهای تازه ای برای جلوگیری از مرگ زودهنگام باکتری و افزایش بازدهی تولید داروی نوترکیب در باکتری اشریشیاکلی به وجود می آید.
A problem with the use of Escherichia coli to produce foreign proteins is that although endogenously produced acetate is physiologically indispensable, it inhibits protein expression. Here we employed an antisense RNA strategy as an elaborate metabolic engineering tool to partially block biosynthesis of two major acetate pathway enzymes, phosphotransacetylase (PTA) and acetate kinase (ACK). A recombinant plasmid containing antisense genes targeting both of pta and ackA were constructed. We used RT-PCR technique and enzyme assay for measurement of mRNA transcription level and enzyme activity. It has been found that the antisense method partially reduced mRNA levels of target enzyme genes and specific activity of their proteins. Observation of these effects demonstrating that, the antisense strategy can be applied successfully to practical recombinant protein production processes.
_||_