بررسی تکثیر ژن های vh و vl از منبع RNA تک پلاسماسل انسانی
محورهای موضوعی : مجله پلاسما و نشانگرهای زیستیلعیا عصمتی 1 , جلیل فلاح مهرآبادی 2 , حمیده روحانی نژاد 3 , معصومه بزاز 4
1 - پژوهشکدة علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران
2 - پژوهشکدة علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران
3 - پژوهشکدة علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران
4 - پژوهشکدة علوم و فناوری زیستی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران
کلید واژه: پلاسماسل, ScFv, آنتی بادی مونوکلونال انسانی,
چکیده مقاله :
مقدمه وهدف:نخستین نسل آنتیبادیهای درمانی منوکلونال با منشا موشی موجب برانگیختن پاسخ ایمونولوژیکی در بدن انسان میشود. استفاده از آنتیبادی درمانی کاملاً انسانی علاوه بر کاهش ایمونوژنیسیته، بیشترین کارایی را به دنبال خواهد داشت. امروزه جهت تهیه آنتیبادی انسانی تکنیک های نمایش فاژی و روش‌های مبتنی بر تک سلولB، مورد توجه قرار گرفته است. هدف از این پژوهش تکثیر ژنهای VHو VLاز منبع RNAپلاسماسل انسانی می باشد.روش کار:از واکنش RT-PCRبه منظور جداسازی و تکثیر قطعات ژن VHو VLاز تک پلاسماسل غربالگری شده علیه آنتیژن مورد نظر استفاده شد. در ابتدا با استفاده از بافر لیزکنندهی سلول، پلاسماسلها لیز و جهت ساخت cDNAاستفاده گردیدند. ژنهای آنتیبادی انسانی با استفاده از cDNAحاصل از یک پلاسماسل و مجموعه پرایمرهای آنتیبادی تکثیر وشش جفت پرایمر جهت تکثیر نواحی متغیر زنجیره سنگین (VH) و سبک (VL) مورد استفاده قرار گرفتند. در این پرایمرها جایگاه برش آنزیمهای محدودالاثر جهت کلون نمودن در وکتور مربوطه و توالی لینکر جهت اتصال نواحی VHو VLقرار داده شد. یافتهها:الکتروفورزطی واکنشPCRمشخص نموده کهقطعات VHو VLبه طول حدود bp400 به طور جداگانه تکثیر یافتهاند. توالیهای بهدست آمده از ژنهای آنتیبادی با سایر توالیهای موجود در پایگاه NCBIمشابهت 97 درصدی نشان داد.نتیجهگیری:پرایمرهای مورد استفاده در این پژوهش به گونهای طراحی شدند که دارای توالی لینکر جهت تهیه ScFvو جایگاه برش آنزیمهای NcoIو NotIجهت کلونینگ قطعات VHو VLهستند.
Inroduction and ObjectiveThe first generation of therapeutic monoclonal antibodies was isolated from mouse. One of the disadvantages of them was stimulating immune response in human. Fully human monoclonal antibodies are significantly considered due to their high efficiency and low immunogenic potential. Nowadays different kind of techniques such as phage display and single B cell technology are used to produce fully human mAb. The aim of this project was amplification of VH and VL genes from RNA source of Human plasma cell.Materials and Methods:With the aim of isolation and amplification of VH and VL regions, single cell RT-PCR reaction was performed. Single plasma cells were lysed by using cell lysis buffer. By using synthesized cDNA from plasma cells and antibody specific primers, antibody genes were amplified. Six pair of primers utilized to amplify the variable region of heavy chain (VH) and light chain (VL). Restriction sites and the linker sequences were placed on primer sequences due to respectively cloned in target plasmid and to link VH and VL. Results: Electrophoresis represented VH and VL fragments with 400 bp length were amplified by PCR. The VH and VL gene sequences were BLAST separately and showed 97% similarity among other antibodies gene sequence.Conclusion: Primer sets were selected and designed which contain linker sequence for ScFv construction, NcoI and NotI restriction sites in order to clone directly into an expression vector.