همسانه سازی و بیان ژن کد کننده آلفا آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس و تعیین ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم نوترکیب
محورهای موضوعی : باکتری شناسی
اشرف کریمی نیک
1
,
کبری سعیدی
2
1 - دانشجوی دکتری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمان، گروه میکروب شناسی
2 - دانشجوی دکتری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد کرمان، گروه میکروب شناسی
کلید واژه: آلفا آمیلاز, پروتئین نوترکیب, (pET-26b(+), BL21(DE3,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: آلفا آمیلاز یک اندونوکلئاز می باشد که با شکستن پیوند داخلی آلفا 1 و 4 آمیلوز، آمیلوپکتین و گلیکوژن را هیدرولیز می نماید. امروزه گونه های مختلف جنس باسیلوس منبع مهمی در تولید این آنزیم به شمار می روند. این مطالعه با هدف همسانه سازی و بیان ژن کد کننده آلفا آمیلاز (amyS) از باکتری باسیلوس لیکنیفورمیس و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم نوترکیب انجام شد. مواد و روش ها: توالی ژن مربوط به آنزیم آلفا آمیلاز با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلی مراز در باسیلوس ردیابی و جداسازی گردید. قطعات مورد نظر در ناقل بیانیpET-26b(+) وارد شدند. پس از توالی یابی قطعات، ناقلین نوترکیب به باکتری بیانی اشرشیا کلی BL21(DE3) منتقل و بیان شدند.به منظور خالص سازی آنزیم نوترکیب از فیلتر آمیکون و کیسه دیالیز استفاده شد. برای اندازه گیری فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز از روش دی نیترو سالیسیلیک اسید استفاده گردید. یافته ها: نتایج این تحقیق نشان دهنده بیان فراوان آنزیم آلفا آمیلاز در سیستم های بیانی غیر از خود باکتری باسیلوس بود. بر اساس الکتروفورز بر روی ژل SDS-PAGE، وزن مولکولی آنزیم نوترکیب معادل 54 کیلو دالتون گزارش گردید. همچنین آنزیم دارای فعالیت نسبی 4.77 واحد در میلی لیتر بود. نتیجه گیری: نتایج این تحقیق بیانگر بیان فراوان این آنزیم در سیستم های بیانی دیگر می باشد. اهمیت این سیستم به دلیل وجود پروموتر قوی T7 است. به دلیل بیان ترشحی آنزیم مورد نظر و در نتیجه تاخوردن صحیح و حفظ فعالیت آنزیم، استفاده از این سیستم در مقیاس صنعتی پیشنهاد می گردد.
Background & Objectives: α-amylase, is an endoamylase to hydrolyses amylase, amylopectin and glycogen by randomly cleavage of internal alpha 1, 4 linkages. Genus Bacillus is one of the most common microbial sources of α-amylase production. The aim of the present study is identification, overexpression and activity analysis of Bacillus licheniformis α-amylase (amyS). Materials & Methods: A polymerase chain reaction was used to identify and isolate α-amylase gene in Bacillus sp. The fragments were introduced into expression vector pET-26 (+). After sequencing, the recombinant vectors were introduced into E. coli BL21 (DE3) for expression. The recombinant enzyme were purified using amicon filter and dialysis bags. α-amylase activity was measured using di-nitro salicylic acid technique. Results: Based on the results, the α-amylase gene was over-expressed in an expression system beyond the native host (Bacillus sp.). Based on the SDS-PAGE electrophoresis, the molecular weight of this enzyme was predicted 54 KDa. The α-amylase showed an enzyme activity about 4.77 U/ml. Conclusion: These results indicated a high expression of this enzyme in an expression system beyond the host, which was due to existence of a strong promoter used in this study, T7promoter. As a result, employment of this system in an industrial scale is recommended due to the secretion of the target enzyme, a proper folding of the enzyme and maintenance of its activity.