بررسی اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) دخیل در تولید پارتنولید در گیاه بابونه کبیر در شرایط گلخانه ای
سیده سمانه موسوی خورشیدی
1
(
دانشجوی دکتری، گروه زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان
)
کلید واژه: پارتنولید, بابونه کبیر, تنش خشکی, TpPTS, TpGAS,
چکیده مقاله :
فورفیو (تاناستوم پارتنیوم) گیاهی است علفی با تاثیرات ضدعفونی ـ ضدمیکروبی ضدانگلی و ضدالتهابی، مهمترین ماده تشکیل دهنده از میان 30 سزکوئی ترپن لاکتون شناخته شده در فورفیو پارتنولید میباشد. پارتنولید یک ژرماکرونولید است که فعالیت فارماکولوژی آن بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر برگ‌های جوان فورفیو که در شرایط گلخانه‌ای تحت سطوح مختلف تنش خشکی قرار داشتند به منظور مطالعه تغییرات بیان ژن‌های کلیدی مسیر بیوسنتزی پارتنولید شامل ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفتند و میزان پارتنولید به روش عصاره گیری و با دستگاه HPLC و به وسیله منحنی استاندارد پارتنولید سنجیده شود. نتایج نشان دهنده افزایش معنی دار (در سطح یک درصد) بیان ژرماکرن A سنتتاز و پارتنولید سنتتاز در برگ‌های گیاهان تحت تنش خشکی نسبت به گیاهان شاهد بود و بیشترین بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز و پارتنولید سنتتاز در حالتی صورت گرفت که گیاه تحت تنش خشکی شدید (7 روز یکبار آبیاری) قرار گرفته بود. همچنین روند تغییرات میزان بیان ژن با روند تغییرات میزان پارتنولید تولید شده در برگها مطابقت داشت.
چکیده انگلیسی :
Feverfew (Tanacetum parthenium) is a herbaceous plant with antimicrobial, antiseptic, anti-parasitic and anti-inflammatory effects. Parthenolide is the most important ingredient of 30 known sesquiterpene lactone in feverfew. Parthenolide is a germacranolide that its pharmacological activity is highly regarded. In the present study, young leaves of feverfew that were under different levels of stress were investigated in order to study key genes expression changes of parthenolide biosynthetic pathway includes germacrene A synthase (TpGAS) and parthenolide synthase (TpPTS) by Real time PCR. The parthenolide amount was measured through the extraction method with HPLC and parthenolide standard curve. The results showed a significant increase in gene expression of germacrene A synthase and parthenolide synthase in the leaves of plants under drought stress showed a significant increase than the control plants. The highest expression of germacrene A synthase and parthenolide synthase was occurred while the plant was under severe drought stress (irrigation once every 7 days). The changes trend in gene expression was consistent with the changes trend of parthenolide amount.
_||_
بررسی اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS)
و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) دخیل در تولید پارتنولید در گیاه بابونه کبیر در شریط گلخانه‌ای
چکیده
فورفیو (تاناستوم پارتنیوم) گیاهی است علفی با تاثیرات ضدعفونی ـ ضدمیکروبی ضدانگلی و ضدالتهابی، مهمترین ماده تشکیل دهنده از میان 30 سزکوئی ترپن لاکتون شناخته شده در فورفیو پارتنولید میباشد. پارتنولید یک ژرماکرونولید است که فعالیت فارماکولوژی آن بسیار مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر برگ‌های جوان فورفیو که در شرایط گلخانه‌ای تحت سطوح مختلف تنش خشکی قرار داشتند به منظور مطالعه تغییرات بیان ژن‌های کلیدی مسیر بیوسنتزی پارتنولید شامل ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفتند و میزان پارتنولید به روش عصاره گیری و با دستگاه HPLC و به وسیله منحنی استاندارد پارتنولید سنجیده شود. نتایج نشان دهنده افزایش معنی دار (در سطح یک درصد) بیان ژرماکرن A سنتتاز و پارتنولید سنتتاز در برگ‌های گیاهان تحت تنش خشکی نسبت به گیاهان شاهد بود و بیشترین بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز و پارتنولید سنتتاز در حالتی صورت گرفت که گیاه تحت تنش خشکی شدید (7 روز یکبار آبیاری) قرار گرفته بود. همچنين روند تغییرات میزان بیان ژن با روند تغییرات میزان پارتنولید تولید شده در برگها مطابقت داشت.
واژگان کلیدی: پارتنولید، بابونه کبیر، تنش خشکی، TpPTS, TpGAS
The effect of different levels of drought stress in greenhouse condition on the expression of Germacron A synthase (TpGAS) and Parthenolide synthetase (TpPTS) genes involved in the production of Parthenolide in Tanacetum parthenium L.
Seyyedeh Samaneh Mousavi Khorshidi1, Arian Sateii2, Sakineh Saeedi Sar3, Maziar Ahmadi Golsefidi4, Abulghasem Mohammadi,
1. Ph.D. Student, Islamic Azad University, Branch of Damghan, Damghan, Iran
2. Department of Biology, Faculty Member of Islamic Azad University, Branch of Gorgan, Gorgan, Iran
3. Department of Biology, Faculty Member of Islamic Azad University, Branch of Damghan, Damghan, Iran
4. Department of Microbiology, Faculty Member of Islamic Azad, Branch of Gorgan, Gorgan, Iran
5. Department of Chemistry, Faculty Member of Islamic Azad University, Branch of Gorgan, Gorgan, Iran
Abstract
Feverfew (Tanacetum parthenium) is a herbaceous plant with antimicrobial, antiseptic, anti-parasitic and anti-inflammatory effects. Parthenolide is the most important ingredient of 30 known sesquiterpene lactone in feverfew. Parthenolide is a germacranolide that its pharmacological activity is highly regarded. In the present study, young leaves of feverfew that were under different levels of stress were investigated in order to study key genes expression changes of parthenolide biosynthetic pathway includes germacrene A synthase (TpGAS) and parthenolide synthase (TpPTS) by Real time PCR. The parthenolide amount was measured through the extraction method with HPLC and parthenolide standard curve. The results showed a significant increase in gene expression of germacrene A synthase and parthenolide synthase in the leaves of plants under drought stress showed a significant increase than the control plants. The highest expression of germacrene A synthase and parthenolide synthase was occurred while the plant was under severe drought stress (irrigation once every 7 days). The changes trend in gene expression was consistent with the changes trend of parthenolide amount.
Key words: Parthenolide, Tanacetum parthenium L., TpPTS, TpGAS, Drought Stress
مقدمه
بابونه کبیر با نام علمی تاناستوم پارتنیوم به تیره استراسه تعلق دارد و یکی از پرمصرف ترین گیاهان دارویی در جهان است و از قدیم برای درمان قلب، میگرن، دندان درد، دل درد، مشکلات مربوط به قاعدگی و کاهش دردهای زایمان، آلرژی، تنگی نفس، سرگیجه و ... استفاده می‌شد. همچنین از ترکیبات دفاعی مهم علیه پاتوژن و حشرات میباشد (Pareek et al., 2011). قزاقستان، آسیای میانه و نواحی مدیترانه به عنوان خاستگاه این گیاه معرفی می‌گردد. در ایران در مناطق مختلف شمال غرب، نواحی کوهستانی، مناطق مرکزی و شرقی کشور انتشار دارد (Kherad, 2011). ترکیبات ثانویه فراوانی در این گیاه یافت میشود که از جمله این ترکیبات که تاثیرات دارویی این گیاه را می‌توان به آنها نسبت داد، سزکوئی ترپن لاکتون‌ها هستند که از مهمترین آنها پارتنولید است (Chappell, 2010). پارتنولید یک ژرماکرنولید است که فعالیت فارماکولوژی آن به عنوان مثال ضدمیگرنی، ضدسرطانی و ضداسپاسم دارای اهمیت میباشد (Cheng et al., 2007).
پارتنولید مانع تجمع پلاکت ها و ترشح پروتئین و سایر ترکیبات التهابزا از پلاکتها می شود. این ترکیب همچنین اثر ضداسپاسم داشته و حساسیت و واکنش عضلات های دیواره رگهای خونی مغز را نسبت به بعضی ترکیباتها از جمله سروتنین و پروستاگلندینها از بین میبرد که در نتیجه همه این اثرات باعث بروز اثر پیشگیری کننده از میگرن میشود (Dermarderosian, 2001). گزارش شده که فعالیت ضدمیگرنی پارتنولید تا حدی به جلوگیری از فعالیت نیتریک اکسید سنتتاز در سیستم عصبی مرکزی و مانع شدن آزادسازی NO برمی‌گردد (Fiebich et al., 2002). پارتنولید در برگها، کرت‌های ترشحی، گلها و ساقه این گیاه به فراوانی وجود داشته، ولی ریشه‌ها فاقد این ترکیب بوده و یا مقدار کمی از آن را تولید می‌کند (Majdi, 2014).
رابطه مستقیم بین میزان رونوشت های یک ژن در مراحل انتهایی مسیر مانند (GAS) و میزان متابولیت مربوطه (مانند پارتنولید) به عنوان فاکتور کارآمد در جهت افزایش متابولیت عمل می کند. به عنوان مثال، در تحقیقی روی الگوی بیوشیمیایی و مولکولی در بیوسنتز ترپنها بر روی سه رقم ریحان که قابلیت متفاوتی در سنتز ترپن ها داشتند، مشخص شد که در رقمی که لینالول تولید می کرد، میزان رونوشت ژن لینالول سنتتاز خیلی بیشتر بود (Ijima et al., 2004). مسیرهای (MEP) متیل ارتیرول فسفات در پلاستیدها و موالونیک اسید (MVA) در سیتوسول دو مسیری است که مسئول بیوسنتز ترپنها می‌باشند (Rohmer et al., 1993; Zeng et al., 2011). این دو مسیر با یکدیگر در ارتباط بوده و در نتيجه در بیوسنتز ترکیبات سزکوئی‌ترپن لاکتونی مانند پارتنولید مهم میباشد (Majidi, 2011 & 2014).
طبق نتایج Majidi و همکاران (2011) بر روی گیاه بابونه کبیر، بیشترین مقدار پارتنولید در گلها و به دنبال آن در برگها و ساقه مشاهده شد و پارتنولیدی در ریشه فورفیو تعیین نشد. همچنین عنوان شد که بیان ژن TpGAS دقيقاً در ارتباط با بيوسنتز پارتنوليد است و بالاترين بيان ژن TpGAS در گلها و کرکهای ترشحی مشاهده شد و تمرکز پارتنولید در کرکها نشان داد که کرکها سایت ویژهای برای سنتز و اسیمیلاسیون پارتنولید میباشد.
دلایل اثبات شده اي مبنی بر نحوه واکنش متابولیت‌هاي ثانویه گیاهان دارویی به تنش خشکی وجود ندارد. تنها دو فرضیه در مورد نحوه تاثیر شرایط محیطی بر متابولیت‌هاي ثانویه این گیاهان تکوین یافته است. فرضیه اول با عنوان موازنه کربن عناصر غذایی (CNB)، میزان هزینه کربن براي تولید متابولیت‌هاي ثانویه را به عنوان موازنه بین فتوسنتز و رشد توضیح می‌دهد (Bryant et al., 1983؛ Gershenzon 1984؛ Tuomi et al., 1984). بر اساس این فرضیه هنگامی که عناصر غذایی در دسترس باشند گیاه کربن را براي رشد اختصاص می‌دهد. کمبود عناصر غذایی رشد را بیش از فتوسنتز محدود می‌کند و منجر به تشکیل هیدرات‌هاي کربنی میشود که متابولیت‌هاي ثانویه ي کربن دار را تولید می‌کنند.
فرضیه دوم یا موازنه رشد ـ تمایز عنوان می‌کند تا زمانی که شرایط اجازه تقسیم و گسترش سلولی را بدهد کربن صرف رشد میشود. با وقوع تنش کم آبی رشد متوقف شده، سلول‌ها تمایز یافته و مخازن متابولیت‌هاي ثانویه را تشکیل می‌دهند و گیاه کربن را به تولید مواد موثره دارویی اختصاص می‌دهد (Lorio, 1986). Herms and Mattson (1992) عنوان کردند که هر کمبودي که رشد را بیش از فتوسنتز محدود کند، تولید متابولیت‌هاي ثانویه را افزایش می‌دهد. افزایش درصد اسانس گیاهان دارویی نعناع (Simon et al., 1992)، مرزنگوش (Rhizopoulous and Diamatoglon, 1991) و آویشن (Letchamo et al., 1994) تحت تنش کم آبی نیز تایید کننده مطالب فوق میباشد.
با وجود آنکه اثر تنشهای غیرزیستی بر عملکرد ویژگیهای رشدی و فیزیولوژیک گیاهان به فراوانی مورد بررسی قرار گرفته است، اما تاثیر اولیه این تنشها بر رفتارهای بیوشیمیایی و مولکولی به خوبی مطالعه نشده است، لذا به نظر میرسد آگاهی از پاسخهای مولکولی گیاهان به تغییر محیط پیرامون تنشهای غیرزیستی یکی از حوزههای مهم در پژوهشها به شمار می رود. این آگاهی میتواند منجر به بکارگیری فناوری زیستی به منظور ایجاد ارقام متحمل به تنش گردد.
در این تحقیق الگوی بیان ژن بر روی دو ژن کلیدی بیوسنتز پارتنولید (GAS) و (PTS) در برگ‌های مربوط به مرحله رویشی که تحت تنش خشکی در 4 سطوح مختلف (بدون تنش، ملایم، متوسط و شدید) قرار داشتند، مورد بررسی قرار گرفت و همچنین میزان پارتنولید در برگ‌های گیاه فورفیو تحت تنش توسط دستگاه HPLC سنجش شد.
شکل 1: مسير بيوسنزي پارتوليد و موقعيت ژن هاي GAS و PTS (Majdi, 2014)
مواد و روشها
اين تحقيق به منظور بررسي اثر سطوح مختلف تنش خشكي بر بيان دو ژن درگير در مسير بيوسنتزي پارتنوليد در گياه بابونه كبير (تاناستوم پارتنونيوم) در سال 1395 در گلخانه دانشگاه آزاد اسلامي گرگان انجام شد. اين تحقيق در قالب طرح فاكتوريل كاملاً تصادفي با 3 تكرار اجرا گرديد. تيمار شامل تنش خشكي در چهار سطح (بدون تنش، ملايم، متوسط و شديد) بود. بذر بابونه كبير از شركت پاكان اصفهان تهيه گرديد و در گلدان‌هاي پلاستيكي با بستر كشت شامل ماسه، خاك برگ، كود حيواني، خاك مزرعه انتقال يافت. در اوايل مرحله رويشي اعمال تنش خشكي در چهار سطح بدون تنش و تنش ملايم (3 روز آبياري به مقدار 400 سي‌سي آب) تنش متوسط (5 روز يكبار آبياري) و تنش شديد (7 روز يكبار آبياري) صورت گرفت. بعد از گذشت 30 روز اعمال تنش، نمونه‌برداري از برگ‌هاي جوان صورت گرفت. نمونه‌هاي برگي در فريزر oC80- نگهداري شدند. براي انجام واكنش Real Time PCR با استفاده از دستگاه Step-one شركت ABI استفاده شد. هر مرحله تكثيري كامل توسط يك مرحله تفكيك كه شامل oC95 به مدت 5 دقیقه و 45 سیکل به صورت 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانيه، oC60 به مدت 60 ثانيه اجرا گرديد. پس از اتمام چرخه‌هاي PCR منحني ذوب با برنامه دماي oC3/0 در هر چرخه و بين دماي oC95-65 به منظور بررسي اختصاصيت واكنش PCR گرديد. نرخ بیان ژن‌های مورد مطالعه با استفاده از روش دلتا دلتا محاسبه شد. بر این اساس، ابتدا هر نمونه برای هر نمونه میانگین سیکل آستانه ΔCT (حاصل از دو تکرار محاسبه) سپس همین عمل برای ژن House-Keeping مربوط به هر نمونه اجرا شد و در نهایت میزان بیان ژن موردنظر با استفاده از فرمول زیر حاصل میشود:
Gene expression: 2-Δ(House-Keeping Gene) – ΔCT (Target Gene)
همچنین برای شناسایی و تعیین درصد پارتنولید عصاره از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) استفاده شد. دستگاه HPLC مذکور دارای ستون:
Agilent zorbox xDB C18 (طول: 150 میلیمتر؛ قطر: 4.6 میلیمتر)
Agilent 1200 series پمپ
VWD agilent 1200, 210nm; ورتکتور
میباشد. همچنین فاز متحرک با نسبت 60 به 40 به ترتیب آب و اتانول تهیه شد و با جریان ml/min1 وارد ستونت گردید. بدین منظور 4 گرم از پودر خشک شده برگ‌های بابونه کبیر (برگها به مدت یک هفته در فضای آزاد و سایه خشک شدند) به مدت 24 ساعت درون دستگاه سوکسله قرار دادیم. در قسمت بالن دستگاه از 450 میلی لیتر تیرولیوم اتر استفاده نموده و دما را بین 50-40 درجه سانتیگراد تنظیم کردیم. بعد از 24 ساعت، نتيجه استخراج را در روتاری در شرایط خلا و دمای 40 درجه به مدت 2 ساعت خشک نموده تا حلال تیرلیوم اتر بخار شود و ماده استخراجی غلیظ تر شود. عصاره استخراج شده با 20 سی سی استوتیریل حل نموده و با فیلتر 45/0 میکرومتر فیلتر کرده و بعد به دستگاه HPLC تزریق نمودیم. سپس داده‌ها به کمک نرم افزار آماری SPSS مورد تجزیه واریانس قرار گرفت و میانگین‌ها توسط آزمون فاکتوریل کاملاً تصادفی مقایسه شدند.
نتایج
نتایج تجزیه واریانس با لحاظ 3 تکرار به منظور بررسی میزان بیان ژن‌های مسیر بیوسنتزی پارتنولید سنتتاز (TpPTS) و ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) در برگ‌های جوان بابونه کبیر نشان داد که بین تیمارهای مختلف (سطوح مختلف خشکی) در سطح 1% از نظر آمای تفاوت معنی داری وجود دارد. بیان ژن‌های TpPTS و TpGAS در برگ‌های جوان تحت سطوح مختلف خشکی (ملایم، متوسط و شدید) نسبت به شاهد افزایش معنی داری را نشان داد بیشترین میزان بیان ژن‌های TpGAS مربوط به تیمار خشکی شدید (7 روز یکبار آبیاری) و بیشترین میزان بیان ژن TpPTS مربوط به تیمارهای خشکی متوسط و شدید بود (شکل 1 و 2).
شکل 2: الگوي بيان ژن GAS در مسير بيوسنتزي پارتنوليد در برگ‌هاي جوان بابونه كبير (مرحله اول رويشي)
شکل 3: الگوي بيان ژن PTS در مسير بيوسنتزي پارتنوليد در برگ‌هاي جوان بابونه كبير (مرحله اول رويشي)
با توجه به نتایج حاصل از این پژوهش، بیشترین میزان ماده موثره پارتنولید در برگ‌های جوانی که تحت تاثیر تنش شدید خشکی (7 وز یکبار آبیاری) بودند، مشاهده شد (mg/g53/0) و کمترین میزان پارتنولید مربوط به شاهد بود (mg/g2/0) (شکل 3 و 6). همچنین اختلاف معنیداری در میزان پارتنولید در برگ‌های جوان تحت تنش ملایم (3 روز یکبار آبیاری) و تنش متوسط (5 روز یکبار آبیاری) مشاهده نشد و میزان پارتنولید به ترتیب mg/g30/0 و mg/g35/0 بوده است (شکل 4 و 5).
شكل 4: گراف حاصل از تزريق عصاره برگ بابونه كبير (بدون اعمال تنش خشكي)
شكل 5: گراف حاصل از تزريق عصاره برگ بابونه كبير تحت تنش خشكي ملايم
شكل 6: گراف حاصل از تزريق عصاره برگ بابونه كبير تحت تنش خشكي متوسط
شكل 7: گراف حاصل از تزريق عصاره برگ بابونه كبير تحت تنش خشكي شديد
شکل 8: مقايسه ميزان پارتنوليد
نمودارهای همبستگی
شكل 9: نمودار همبستگی پارتنولید با ژن TpPTS مرحله اول
شكل 10: نمودار همبستگی پارتنولید با ژن TpGAS مرحله اول
جدول 1: همبستگی بین پارتنولید، ژن PTS و GAS
Correlations | ||||
|---|---|---|---|---|
|
| Part | GAS | PTS |
Part | Pearson Correlation | 1 | .955** | .888** |
Sig. (2-tailed) |
| .000 | .000 | |
N | 12 | 12 | 12 | |
GAS | Pearson Correlation | .955** | 1 | .940** |
Sig. (2-tailed) | .000 |
| .000 | |
N | 12 | 12 | 12 | |
PTS | Pearson Correlation | .888** | .940** | 1 |
Sig. (2-tailed) | .000 | .000 |
| |
N | 12 | 12 | 12 | |
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed). | ||||
همبستگی‌ها
طبق نمودارهای همبستگی (شکل 9و 10)، پارتنولید با ژن های TpGAS و TpPTS همبستگی مثبت در سطح 1% نشان داد.
بحث
در تحقیق حاضر، روند تغییرات میزان بیان ژن با روند تغییرات میزان پارتنولید تولید شده در برگها مطابقت داشت، به طوري كه بيشترين ميزان بروز ژن مربوط به خشكي شديد (7 روز يكبار آبياري) و بيشترين مقدار پارتنوليد توليد شده در برگ نيز در همين تيمار مشاهده شد و همبستگي مثبت بين بيان ژن‌هاي TpGAS و TpPTS و مقدار پارتنوليد وجود داشت. بنابراین تنش خشکی به عنوان القا کننده باعث افزایش بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) و افزایش پارتنولید در گیاه بابونه کبیر میشود. محققین زیادی میزان مواد موثره فعال گیاهان دارویی (فنل، فلاونوئید، آلکالوئید ترپن) را به عوامل ژنتیک و محیط مربوط نمودند که میزان آنها و عملکردهای دارویی آنها نیز در رویشگاه‌های مختلف متغیر گزارش شده است. متابولیت‌های ثانویه گیاهان دارویی نتیجه بارز تنشها میباشد. بنابراین محصولات دارویی برخلاف محصولات کشاورزی که در اوضاع تنشی از نظر تولید صدمه می‌بینند. در این شرایط تولید شیمیایی بیشتر و در نتیجه بازده اقتصادی برتری پیدا می‌کنند. بنابراین در پرورش این گیاهان همانقدر که وجود آب یکی از امکانات مهم زیست محیطی است کمبود آب هم یک واقعیت است که توان افزایش مواد موثره را دارا میباشد (Andalibi, 2011).
با آنالیز ترکیبات گیاه بابونه کبیر مشخص شد که برگها و گلها (اندام هوایی) این گیاه دارای مواد آنتی اکسیدان و ضدالتهاب مانند سزکوئی ترپن لاکتون‌ها (پارتنولید، آرتیکانین و سانتامارین) میباشد. مطالعاتی که بر روی این گیاه صورت گرفته، نشان داده که گیاه بابونه کبیر به دلیل داشتن این ترکیبات در کاهش درد و التهاب نقش دارد (Mahmoodzadeh, 2016). بیش از 12% سزکوئی ترپن‌های بابونه کبیر را پارتنولید تشکیل می‌دهد و به عنوان مهمترین ماده موثره این گیاه محسوب میشود (Davis, 2000). ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز (TpGAS) و پارتنولید سنتتاز (TpPTS) از ژن‌های مهم و کلیدی در مسیر بیوسنتزی پارتنولید میباشد که طبق تحقیقات Majdi و همکاران (2014) و Mosavi و همکاران (2016) همبستگی مثبت بين بروز ژن‌هاي مسير بيوسنتزي با میزان پارتنولید تولید شده در گیاه بابونه کبیر دارد که با گزارشات ما در پژوهش حاضر همخوانی دارد.
با توجه به تحقیقات حاضر، شرایط تنشی بر بیان ژن‌های مسیر بیوسنتزی پارتنولید و همچنین بر میزان پارتنولید تولید شده در برگ‌های گیاه بسیار موثر بوده، به طوری که بیشترین بیان ژن‌های مورد مطالعه و بیشترین میزان پارتنولید در تیمار شدید تنش خشکی (7 روز یکبار آبیاری) مشاهده شد. بنابراین تنش خشکی را می‌توانیم به عنوان یک القا کننده مثبت بر تولید ماده موثره پارتنولید درنظر بگیریم. Petropoulos و همکاران (2008) اظهار داشتند که خشکی میتواند در برخی از ترکیبات و عملکرد متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی و معطر اثر بگذارد. Holtzer و همکاران (1998) هم معتقدند بر اثر تنش خشکی بر کاهش یا افزایش سطوح متابولیت‌های ثانویه میباشد. ترپنوئیدها که از بزرگترین گروه متابولیت‌های ثانویه هستند، در بابونه کبیر به فراوانی وجود دارد، به صورتی که بیش از 12% سزکوئی ترپن‌های بابونه کبیر را پارتنولید تشکیل می‌دهد و به عنوان مهمترین ماده موثره این گیاه است که دارای فعالیت بیولوژیکی بسیاری میباشد (Davis, 2000). در گزارشی از Majdi (2014) در بررسی بیان ژن‌های مسیر بیوسنتزی پارتنولید در بابونه کبیر عنوان شد که میزان بیان ژن‌ها میتواند تحت تاثیر مرحله رشدی و ژنوتیپ تغییر کند. همچنین در گزارش دیگری از Majdi (2011) بیشترین میزان همبستگی بین میزان پارتنولید و میزان رونوشت ژن Tp GAS مشاهده شد.
Mosavi و همکاران (2016) در بررسی خود بر روی بابونه کبیر عنوان نمودند که تنش خشکی به عنوان القا کننده باعث افزایش بیان ژن‌های ژرماکرن A سنتتاز (Tp GAS) و پارتنولید سنتتاز (Tp PTS) و افزایش پارتنولید در گیاه میشود. بنابراین با توجه به نتایج بدست آمده از این تحقیق می‌توان گفت که بیان ژن‌های GAS و PTS تحت تاثیر مراحل رشد و سطوح مختلف خشکی قرار می‌گیرد و تنش موجب افزایش ماده موثره مهم این گیاه که پارتنولید میباشد، میشود، به طوری که با افزایش تنش بیان ژن‌های مسیر بیوسنتزی پارتنولید به ميزان بیشتری بیان می‌شوند. بنابراین می‌توان گفت کمبود آب یک واقعیت است که توان افزایش مواد موثر را دارا میباشد. با این تلقی محدودیت آب نه تنها یک عامل نامساعد، بلکه راهکاری بدون هزینه برای نوعی تولید میباشد.
نتیجه گیری نهايي
در تحقیق حاضر، تاثیرات سطوح مختلف تنش خشکی بر تغییرات بیان ژن‌های کلیدی موثر بر مسیر بیوسنتزی پارتنولید (GAS, PTS) در مرحله رویشی برگ‌های جوان توسط Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق افزایش بیان ژن‌های مورد بررسی را در تیمارهای تحت تنش خشکی نسبت به شاهد، نشان داد بیشترین میزان بیان ژن TpGAS مربوط به تیمار تنش خشکی شدید (7 روز یکبار آبیاری) بود و بیشترین میزان TpPTS در تیمارهای تنش شدید و متوسط خشکی مشاهده گردید. میزان پارتنولید به روش عصاره گیری و با دستگاه HPLC به وسیله منحنی استاندارد پارتنولید سنجیده شد و بیشترین میزان پارتنولید در برگ‌های جوانی که تحت تاثیر تنش خشکی شدید بود، مشاهده شد (mg/g53/0). در نتیجه می‌توان تنش خشکی را به عنوان یک القاکننده مثبت بر تولید ماده موثره پارتنولید درنظر گرفت.
منابع
Andalibi, B., Zehtab Salmasi, S., Ghassemi Gholezani, K. and Saba, J. (2010). Changes in Essential Oil Yield and Composition at Different Parts of Dill (Anethum graveolens L.) Under Limited Irrigation Conditions. Quarterly Journal of Agricultural Science. 21(2); 11-22.
Bryant, J.P., Chapin, F.S., and Klein, D.R. (1983). Carbon / nutrient balance of boreal plants in relation to vertebrate herbivory. Oikos, 40: 357 – 368.
Chappell, J., Coates, R.M., Lew, M. and Hung-Wen, L. (2010). Sesquiterpenes. Comprehensive Natural Products II. Elsevier, Oxford, pp. 609–641.
Cheng, A.X., Lou, Y.G., Mao, Y.B., Lu, S., Wang, L.J. and Chen, X.Y., (2007). Plant terpenoids: biosynthesis and ecological functions. Journal of Integrative Plant Biology. 49, 179–186.
Davies, N.W. (1998). Gas chromatographic Retention index of monoterpenes and sesquiterpenes on methyl and carbowax 20 M Phases Journal of Chromatography. 503, Pp 1-24.
Dermarderosian, A. (2001). A guid to popular natural prosucts. Facts and Comparisions a Wolters Kluwer Company. p 90-92.
Fiebich, B.L., Lieb, K., Engels, S. and Heinrich, M. (2002). Inhibition of LPS – induced P42/44 Mapk kinase activation and iNOS/NO synthesis by parthenolide in rat primary microglial cells. Journals of Journal of Neuroimmunology; 132(1): 18-24.
Gershenzon, J. (1984). Changes in levels of plant secondary metabolites under water and nutrient stress. In: B.N. Timmermann, C. Steelink, and F.A. Leowus, (eds.), Phytochemical adaptation to stress, Plenum Press, Pp.273 – 320.
Herms, D.A. and Mattson, W.J. (1992). The dilemma of plants: To grow or defend. The Quarterly Review of Biology. 67: 283-325.
Holtzer, T.O., Archer, T.L. and Norman, J.M. (1988). Host plant suitability in relation to water stress. In: Heinrichs, E.A. (ed.), Plant Stress- Interactions, Pp: 111-137.
Ijima, Y., Davidovich-Rikanati, R., Fridman, E., Gang, D.R., Bar, E., Lewinsohn, E. and Pichersky, E. (2004). The biochemical and molecular basis for the divergent patterns in the biosynthesis of terpenes and phenylpropenes in the peltate glands of three cultivars of basil. Plant Physiology, 136: 3724-36.
Kherad, M. (2011). The effect of oak and oak leaf soil on quantitative and qualitative yield of Tanacetum parthenium L. Master Science Thesis. International University of Shiraz. 136p.
Letchamo, W. and Gosselin, A. (1996). Transpiration, essential oil glands, epicuticular wax and morphology of Thymus vulgaris are influenced by light intensity and water supply. Journal of Horticultural Science, 71 (1): 123 – 134.
Lorio, P.L. (1986). Growth - differentiation balance: A basis for understanding southern pin beetle-tree interaction. Forest Ecology Management, 14: 259 – 273.
Mahmoodzadeh, Y., Mazani, M., Rezagholizadeh, L., Abbaspour, A., Zabihi, E. and Pourmohammad, P. (2017). Effect of Tanacetum parthenium Extract on Total Antioxidant Capacity of Tissues Damaged by Carbon Tetrachloride in Rats. Journal of Ardabil University of Medical Sciences. 16(4): 363-373.
Majdi, M., Karimzade, Gh. and Malboobi, M.A. (2014). The Study of Relative Gene Expression of Key Genes of Terpene Biosynthesis in Tissues and Different Developmental Stages of Feverfew (Tanacetum parthenium) Genotypes Using Real-Time PCR. Journal of Plant Genetic Research. 1(2): 25-32.
Majdi, M., Karimzadeh, G. and Malboobi, M.A. (2014). Spatial and developmental expression of key genes of terpene biosynthesis in feverfew (Tanacetum parthenium). Biologia plantarum. 58: 379–384.
Majdi, M., Qing, L., Karimzadeh, G., Malboobi, M.A., Beekwilder, J., Cankar, K., De Vos, R., Todorović, S., Simonović, A. and Bouwmeester, H. (2011). Biosynthesis and localization of parthenolide in glandular trichomes of feverfew (Tanacetum parthenium L. Schulz Bip.). Phytochemistry, 72: 1739-1750.
Mousavi, H., Mahdi Nezhad, N., Fakheri, M., Majdi, B. and Heidari, F. (2016). Effects of some nanoparticles on expression of germacrene A synthase (TpGAS) and parthenolide synthase (TpPTS) genes in Tanacetum parthenium L. under water deficit stress. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 33(2): 314-324.
Pareek, A., Suthar, M., Rathore, G.S and Bansal, V. (2011). Feverfew (Tanacetum parthenium L.). Phytopharmacological Review; 5(9): 103 110.
Petropoulos, S.A., Daferera, D., Polissiou, M.G. and Passam, H.C. (2008). The effect of water deficit stress on the growth, yield and composition of essential oils of parsley. Scientia Horticulturae. 115: 393-397.
Rhizopoulous, S. and Diamatoglon, S. (1991). Water stress induced diurnal variations in leaf water relations, stomatal conductance, soluble sugars, lipids and essential oil content of Origanum majorana L. Journal of Horticultural Science. 66 (1): 119 – 125.
Rohmer, M., Knani, M., Simonin, P., Sutter, B. and Sahm, H. (1993). Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate. Biochemistry Journal. 295: 517-524.
Simon, J.E., Reiss-Buhenheinra, D., Joly, R.J. and Charles, D.J. (1992). Water stress induced alterations in essential oil content and composition of sweet basil. Journal of Essential Oil Research, 4(1): 71-75.
Tuomi, J., Niemela, P., Haukioja, E. and Neuvonen, S. (1984). Nutrient stress an explan- at ion for plant anti - herbivore responses to defoliation. Oecologia, 61: 208–210.
Zeng, Q.P., Zeng, X.M., Yang, R.Y. and Yang, X.Q. (2011). Singlet oxygen as a signaling transducer for modulating artemisinin biosynthetic genes in Artemisia annua. Biologia Plantarum. 55: 669-674.
