مطالعه تاثیر فارگسین (Fargesin) بر آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی کلیه در موش¬های صحرایی نر
محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی
محمدامین نظری
1
,
داریوش مهاجری
2
,
مهبد باژبان
3
1 - دانش¬آموخته دکترای حرفه¬ای دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2 - استاد گروه پاتوبيولوژي، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
3 - دانش¬آموخته دکترای حرفه¬ای دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
کلید واژه: ایسکمی- بازخونرسانی, فارگسین, کلیه, موش صحرایی.,
چکیده مقاله :
آسیب ناشی از ایسکمی- بازخونرسانی کلیه یکی از مهم‌ترین عوامل نارسایی حاد کلیوی به شمار می‌رود. فارگسین ترکیبی گیاهی است که دارای خواص ضد التهابی میباشد. هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی اثرات فارگسین بر آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیه در موشهای صحرایی بود. بدین منظور 21 سر موش صحرایی نر ویستار بهطور تصادفی به 3 گروه هفت‌تایی شامل گروههای شاهد، القاء ایسکمی- بازخونرسانی و ایسکمی- بازخونرسانی بههمراه تیمار با فارگسین (mg/kg 50 بهصورت گاواژ به مدت 12 هفته پس از ایجاد ایسکمی درکلیه سمت چپ) تقسیم شدند. در پایان دوره و پس از ایجاد بیهوشی، ابتدا از ورید دمی همه موشها جهت سنجش کراتینین و اوره سرم خونگیری شد و سپس همگی آسانکشی شدند. در ادامه جهت بررسی فعالیت آنتیاکسیدانی و پارامترهای التهابی در کلیه از تکنیک الایزا استفاده شد. آسیبشناسی بافتی نیز با روش معمول صورت گرفت. یافتهها نشان داد که القاء ایسکمی- بازخونرسانی منجر به افزایش معنیدار سطوح کراتینین و اوره خون موشها نسبت به مقدار آن در خون حیوانات گروه شاهد شده (05/0>p)، ولی تجویز فارگسین موجب کاهش معنیدار فراسنجههای مذکور گردید (05/0>p). همچنین ظرفیت آنتیاکسیدانی بافت کلیه در گروه ایسکمی- بازخونرسانی بهطور معنیداری کاهش، اما در موشهای تیمارشده با فارگسین افزایش یافت (05/0>p). نیز تجویز فارگسین موجب کاهش معنیدار IL-1 و TNF-α در مقایسه با گروه ایسکمی-بازخونرسانی در بافت کلیه شد (05/0>p). نتایج آسیبشناسی بافتی هم یافتههای بیوشیمیایی تحقیق را تایید کرد. بهنظر میرسد که فارگسین میتواند اثرات محافظتی در آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیه داشته باشد که احتمالاً از طریق کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب در بافت کلیه ایجاد میشود.
Renal ischemia-reperfusion (IR) injury is one of the most important causes of acute renal failure. Fargesin has anti-inflammatory properties and most recent studies have focused on its anti-inflammatory effects. The aim of the present study was to evaluate the effect of Fargesin on renal ischemia-reperfusion injury in rats. For this purpose, 21 male Wistar rats were randomly divided into three groups of seven rats each including: Sham operated group, IR group and IR plus Fargesin treatment. Fargesin (50 mg/kg) was administered through gavage for 12 weeks after left renal IR induction. After anesthesia, blood was taken from the tail vein to measure serum creatinine and urea, thereafter all rats were euthanized. The ELISA technique was used to evaluate the antioxidant status of renal tissue and inflammatory parameters. Histopathological studies were carried out by routine methods. Renal IR resulted in a significant increase in creatinine and blood urea levels compared to sham group (p<0.05), whereas administration of Fargesin significantly reduced these parameters (p<0.05). The antioxidant activity of renal tissue significantly decreased in the IR group but increased in the Fargesin treated rats (p<0.05). Fargesin significantly reduced IL-1 and TNF-α compared to IR group in renal tissue (p<0.05). Histopathology confirmed the biochemical findings. The results obtained showed that Fargesin has a beneficial and protective effect on renal IR injury. These effects of Fagersin may be due to the reduction of oxidative stress and inflammation in renal tissue.
آسیبشناسی درمانگاهی دامپزشکی دوره 18، شماره 2، پیاپی 70، تابستان 1403، صفحات: 142-127
"مقاله پژوهشی" DOI: 10.71499/jvcp.2024.3121447
مطالعه تاثیر فارگسین (Fargesin) بر آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی کلیه در
موشهای صحرایی نر
محمدامین نظری1، داریوش مهاجری2*، مهبد باژبان3
1– دانشآموخته دکترای حرفهای دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
2- استاد گروه پاتوبيولوژي، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
3– دانشآموخته دکترای حرفهای دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.
*نویسنده مسئول مکاتبات: daryoushmohajeri@yahoo.com
(دریافت مقاله: 22/9/1402 پذیرش نهایی: 17/1/1403)
چکیده
آسیب ناشی از ایسکمی- بازخونرسانی کلیه یکی از مهم‌ترین عوامل نارسایی حاد کلیوی به شمار می‌رود. فارگسین ترکیبی گیاهی است که دارای خواص ضد التهابی میباشد. هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی اثرات فارگسین بر آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیه در موشهای صحرایی بود. بدین منظور 21 سر موش صحرایی نر ویستار بهطور تصادفی به 3 گروه هفت‌تایی شامل گروههای شاهد، القاء ایسکمی- بازخونرسانی و ایسکمی- بازخونرسانی بههمراه تیمار با فارگسین (mg/kg 50 بهصورت گاواژ به مدت 12 هفته پس از ایجاد ایسکمی درکلیه سمت چپ) تقسیم شدند. در پایان دوره و پس از ایجاد بیهوشی، ابتدا از ورید دمی همه موشها جهت سنجش کراتینین و اوره سرم خونگیری شد و سپس همگی آسانکشی شدند. در ادامه جهت بررسی فعالیت آنتیاکسیدانی و پارامترهای التهابی در کلیه از تکنیک الایزا استفاده شد. آسیبشناسی بافتی نیز با روش معمول صورت گرفت. یافتهها نشان داد که القاء ایسکمی- بازخونرسانی منجر به افزایش معنیدار سطوح کراتینین و اوره خون موشها نسبت به مقدار آن در خون حیوانات گروه شاهد شده (05/0>p)، ولی تجویز فارگسین موجب کاهش معنیدار فراسنجههای مذکور گردید (05/0>p). همچنین ظرفیت آنتیاکسیدانی بافت کلیه در گروه ایسکمی- بازخونرسانی بهطور معنیداری کاهش، اما در موشهای تیمارشده با فارگسین افزایش یافت (05/0>p). نیز تجویز فارگسین موجب کاهش معنیدار IL-1 و TNF-α در مقایسه با گروه ایسکمی-بازخونرسانی در بافت کلیه شد (05/0>p). نتایج آسیبشناسی بافتی هم یافتههای بیوشیمیایی تحقیق را تایید کرد. بهنظر میرسد که فارگسین میتواند اثرات محافظتی در آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیه داشته باشد که احتمالاً از طریق کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب در بافت کلیه ایجاد میشود.
کلید‌واژه‌ها: ایسکمی- بازخونرسانی، فارگسین، کلیه، موش صحرایی.
مقدمه
یکی از علل شایع نارسایی حاد کلیوی، ایسکمی است که اگر به مدت کافی برقرار بماند، باعث ایجاد آسیب در توبولهای کلیوی شده، همچنین کاهش در فیلتراسیون گلومرولی رخ میدهد (Legrand et al., 2008; Ávila et al., 2019; Tanyeli et al., 2019). آسیب ناشی از ايسكمی بافتها معضلی است بسیار مهم که خونرسانی مجدد متعاقب آن، منجر به آسیبهای بافتی شدیدتر نیز میشود. اين فرآيند که منجر به تخریب گسترده بافتها میشود تحت عنوان آسيب ايسكمي- بازخونرساني (ischemia-reperfusion injury) شناخته میشود. در این پدیده، در خصوص علت اصلی آسیب میتوان به تولید گونههای فعال اکسیژن (reactive oxygen species; ROS) مانند سوپراكسيد و راديكال هيدروكسيل اشاره نمود که در واقع در روند توسعه آسیب ایسکمی - بازخونرسانی کلیوی نقش دارند چرا که برقراری مجدد جریان خون، سبب فراهم شدن میزان زیادی اکسیژن برای بافت دچار ایسکمی میشود که این افزایش غلظت اکسیژن سبب فعالشدن ماکروفاژها در دیواره عروق شده و به دنبال آن رادیکالهای فعال اکسیژن آزاد میشوند. مرگ سلولی هم به دنبال آسیب ایسکمی- بازخونرسانی در ارتباط نزدیک با تولید رادیکالهای آزاد و پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از آن میباشد، بدین ترتیب که با برقراري مجدد خون، سلولهای آماسی باعث آزادسازي فاكتورهاي التهابی مانند اينترلوكينها و راديكالهاي آزاد در بافت دچار ایسکمی میشوند (Thurman, 2007; Legrand et al., 2008; Mohajeri et al., 2013). آسیب ایسکمی باعث افزایش بیان مولکولهای چسبندگی و تولید واسطههای التهابی مثل سایتوکاینها و کموکاینها توسط اندوتلیوم عروق و توبولها شده که منجر به جذب لوکوسیتها به کلیه میشوند. مولکولهای چسبندگی مثل اینتگرین و سلکتین در کنار سایتوکاینهای پیشالتهابی آسیب سلولی را افزایش میدهند (Garcia-Criado et al., 1998; Thurman, 2007; Li et al., 2016).
رادیکالهای آزاد اکسیژن بافتها را از طریق پراکسیداسیون لیپیدی تحت تاثیر قرار داده و ساختار‌های سلولی، پروتئینها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک آنها را تخریب کرده و با آسیب رساندن به غشاهای سلولی باعث رهاشدن اجزای سلولی شده و در نتیجه آسیب بافتی ناشی از ایسکمی را تشدید میکنند (Minutoli et al., 2016). در ایسکمی-بازخونرسانی کلیوی مالوندیآلدئید (malondialdehyde; MDA)، محصول پراکسیداسیون لیپیدی، افزایش و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی بهعنوان دفعکننده رادیکالهای آزاد اکسیژن کاهش می‌یابد (Legrand et al., 2008).
داروهای شیمیایی متعددی برای کاهش صدمات ناشی از آسیب ایسکمی-بازخونرسانی مورد استفاده میباشد، ولی با توجه به بروز عوارض متعدد و اغلب جبران‌ناپذیر در پی مصرف آنها از یکسو و همچنین فراوانی و دسترسی آسان به گیاهان داروئی و تمایل به استفاده از داروهای سنتی، امروزه گرایش برای تولید داروهای جدید با منشأ طبیعی که مؤثرتر و سازگارتر با بدن موجودات زنده باشد، بیشتر شده است .
فارگسین (Fargesin) یک نوع نئولیگنان (neolignan) مشتقشده از گونههای گیاه ماگنولیا (Magnolia) نظیر Magnolia biondiiand و Magnoliae flos میباشد (Zhao et al., 2007; Shen et al., 2008) که طب سنتی از آن برای درمان گرفتگی بینی، سردرد و سینوزیت در کشورهای شرق آسیا مانند چین و ژاپن استفاده میشود. بیشتر مطالعات اخیر در مورد فارگسین هم بر اثرات ضدالتهابی آن متمرکز شدهاست (Lee et al., 2012; Choi et al., 2013). این ماده دارای اثراتی همچون کاهش استرس اکسیداتیو، سرکوب آپوپتوز میوکارد، بهبود متابولیسم لیپیدی و گلوکز از طریق مهار فعالسازی سیگنالینگ NF-kB (Nuclear factor kappa B) هم میباشد (Pham et al., 2017). همچنین فارگسین از طریق سرکوب مسیر PKC (Protein Kinase-C) از جمله مسیر پاییندستی ژانوس کیناز (Janus kinases)، فاکتورهای هسته‌ایAP-1 و NF-kβ اثرات ضد التهابی خود را نشان میدهد. این نتایج حاکی از آن است که فارگسین دارای خواص ضد التهابی با کاربردهای بالقوه در ایجاد دارو علیه اختلالات التهابی است (Pham et al., 2017). طبق مطالعات بیان شده است که یکی از مکانیسمهای اثر فارگسین ممکن است به فعالیت آنتی اکسیدانی آن مربوط باشد. ROS یا گونه آزاد اکسیژن، با فعالیت طبیعی سلولها تولید میشود و توسط گزانتین اکسیداز (XOD)، نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) اکسیداز، گلوکز اکسیداز و سیکلوکسیژناز (COX) تنظیم میشود (Nishiyama et al., 2004; Mansour et al., 2011).
تحت شرایط پاتولوژیک همچون آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیوی، افزایش تولید ROS منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال، پراکسیداسیون لیپید و افزایش رسوب پروتئین‌های‌ماتریکس خارج سلولی میشود که از فاکتورهای مهم آسیب کلیوی هستند (Diep et al., 2002). مالوندیآلدئید (MDA)، یک نشانگر زیستی برای استرس اکسیداتیو میباشد که به طور قابل توجهی در نتیجه ایسکمی افزایش می‌یابد (Han et al., 2008). سوپراکسید دیسموتاز (SOD) یکی از آنزیمهای آنتیاکسیدانی میباشد که با تسریع در تبدیل گونههای فعال اکسیژن (ROS) به پراکسید هیدروژن (H2O2)، رادیکال سوپراکسید را از بین می‌برد و کاتالاز (CAT) در تجزیه H2O2 به آب و اکسیژن عمل میکند. طی مطالعات انجام شده، بیان کردهاند که فارگسین میتواند از طریق اثر روی فعالیت آنزیمهای استرس اکسیداتیو، روند تخریب بافتها را بهبود بخشد (Sha et al., 2016).
با توجه به اهمیت مطالب ارائه شده، مطالعه حاضر جهت ارزیابی تاثیر فارگسین بر آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی تجربی کلیه در موش صحرایی نر انجام گردید.
مواد و روشها
مطالعه حاضر از نوع تجربي آزمايشگاهي بوده که در سال 1400 در مركز تحقيقات دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تبریز انجام شده و در طی آن كليه ملاحظات اخلاقي و روشهای كار بر روي حيوانات آزمايشگاهي مورد تائيد كميته نظارت بر حقوق حيوانات آزمايشگاهي، رعایت گردیدهاست (Anonymous, 2004).
برای انجام مطالعه، از تعداد 21 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 20±۲۰۰ گرم استفاده شد. شرایط تغذیه و نگهداری برای تمام گروهها یکسان و به صورت ۱۲ ساعت روشنایی/ تاریکی و دمای 2±21 درجه سلسیوس بود. جیره غذایی یکسان و آب نیز به طور آزاد در دسترس همه موشها قرار گرفت و پس از یک هفته عادت دادن به شرایط جدید، آزمایش شروع شد. همه تیمارها بین ساعت ۱ تا ۶ بعد از ظهر از چرخه روشنایی اجرا شد.
در طی دوره آزمایش تحقیق، موش‌ها‌به طور تصادفی به 3 گروه مساوی 7 تائی به این شرح تقسیم شدند که گروه اول به عنوان شم (Sham) یا شاهد جراحی در نظر گرفته شد و در آنها فقط محل جراحی را برش داده و سپس بخیه زده شد. در گروه دوم به عنوان گروه القاء ایسکمی- بازخونرسانی (Ischemia-Reperfusion; I/R) پس از القاء ایسکمی کلیوی، 30 دقیقه بعد عمل بازخونرسانی انجام شد. در مورد موشهای گروه سوم هم به عنوان گروه القاء ایسکمی- بازخونرسانی بهعلاوه تیمار با فارگسین (I/R + Fargesin)، پس از القاء ایسکمی کلیوی، 30 دقیقه بعد عمل بازخونرسانی انجام و سپس فارگسین (سیگما-آمریکا) با دوز mg/kg50 به صورت خوراکی به مدت 12 هفته گاواژ شد (Wang et al., 2020). لازم به ذکر است که قبل از ایجاد ایسکمی و برقراری مجدد خونرسانی، همه گروهها توسط تزریق داخل صفاقی کتامین (mg/kg 90) و زایلازین (mg/kg 10) بی‌هوش شدند (Sancaktutar et al., 2014) و پس از ضدعفونی ناحیه جراحی، خط وسط در قسمت میانی شکم برش داده شد. البته در گروه شاهد جراحی فقط دست‌کاری عروق کلیه چپ اکتفا کرده و در سایر گروهها عروق کلیه چپ به مدت 30 دقیقه به‌وسیله گیره غیرضربه‌ای عروقی مسدود شد (Kirkby et al., 2007). پس از برداشتن گیره و رفع انسداد، بر روی حفره شکمی بخیه زدهشد و سپس حیوانات به قفس‌های خود بازگردانده شدند.
- پروتکل نمونهبرداری از موشها و آزمایشات بیوشیمائی مورد نظر
جهت اندازهگیری برخی فاکتورهای بیوشیمیایی شامل کراتینین و اوره سرم، نمونه خون از ورید دمی اخذ گردید. سپس سرم نمونههای خون توسط عمل سانتریفیوژ (HB705, Iran) با سرعت 3000 دور در دقیقه و به مدت 15 دقیقه جدا شده و میزان اوره و کراتینین سرم طبق دستورالعمل کیت تجاری (پارس آزمون) و به روش رنگ سنجی و با استفاده از دستگاه اتوآنالایزر (Cobas 8000, Roche) اندازهگیری گردید.
در ادامه تحقیق همه موشها همزمان با ایجاد دررفتگی در مهرههای گردن آسانکشی شدند و بلافاصله کلیه چپ آنها جدا و خارج شد. برای سنجش فاکتورهای آنتیاکسیدانی و التهابی، قسمتی از بافت کلیه همه موشها بصورت مجزا سریعاً جدا و در سالین بسیار سرد شستشو دادهشد و از آن هموژنات بافتی ۱۰ درصد در15/1درصد (w/v) کلرورپتاسیم تهیه گردید. در ادامه هموژنات مذکور با سرعت 7۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سلسیوس سانتریفیوژ شده و مایع رویی بدست آمده از نمونههای بافتی هموژنیزه، برای اندازهگیری میزان IL-1 و TNF-α و همچنین سنجش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آنزیمهای کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) و نیز اندازهگیری میزان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی (MDA) در بافت کلیه مورد استفاده قرار گرفت.
برای اندازهگیری میزان IL-1 و TNF-α از کیت‌های الایزای مربوطه بر اساس پروتکل شرکت سازنده (Nanjing Giancheng Bioengineering Institute, Nanjijng, China) استفاده شد. فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی مورد مطالعه و میزان MDA نیز با استفاده از کیت‌های‌تجاری موجود (Nanjing Giancheng Bioengineering Institute, Nanjijng, China) و طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده کیت انجام شد. مقدار MDA بافتی به صورت نانومول مالوندیآلدئید (nmol) در میلیگرم پروتئین و فعالیت آنتی اکسیدانی به صورت واحد‌های‌قراردادی در میلیگرم پروتئین عنوان گردید.
فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز نیز توسط روش نیشیکیمی و همکاران تعیین گردید (Nishikimi et al., 1972) که بدین منظور مقدار ۵ میکروگرم از پروتئین‌های تام هر یک از هموژناتهای کلیه با بافر پیروفسفات سدیم، فنازین متوسولفات (phenazine methosulfate; PMS) و نیترو-بلوتترازولیوم (Nitro-blue Tertazilium; NBT) مخلوط گردید. واکنش با افزودن نیکوتینآمید-آدنین دینوکلئوتید (Nicotinamide-adenine dinucleotide; NADH) آغاز شد. مخلوط مذکور در دمای ۳۰ درجه سلسیوس به مدت ۹۰ ثانیه گرمخانهگذاری شده و سپس با افزودن 1 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال (Merck, Germany) واکنش در مخلوط فوق، متوقف گردید و بلافاصله شدت جذب مخلوط رنگزای تشکیل شده در طول موج 560 نانومتر اندازهگیری شد و در نهایت هر واحد از فعالیت سوپراکسید دیسموتاز به صورت غلظت آنزیم مورد نیاز برای ممانعت از تولید رنگ تا ۵۰ درصد در 1 دقیقه، تحت شرایط مطالعه، تعیین گردید.
همچنین فعالیت آنزیم کاتالاز توسط روش کلایبورن و بر اساس تجزیه پراکسید هیدروژن در طول موج 240 نانومتر، مورد سنجش قرار گرفت (Claiborne, 1985). بدین منظور، مخلوط مورد سنجش متشکل از 95/1 میلیلیتر بافر فسفات (M, pH=705/0)، 1 میلیلیتر پرکسید هیدروژن (M 019/0) و 50/0 میلیلیتر PMS (۱۰ درصد) در حجم نهایی ۳ میلیلیتر بود و تغییرات در جذب نوری، در طول موج 240 نانومتر اندازهگیری شده و به شکل "فعالیت کاتالاز در دقیقه" محاسبه و ثبت گردید.
فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز هم با استفاده از روش روتراک و همکاران (Rotruck et al., 1973) و بر اساس واکنش ذیل مورد سنجش قرار گرفت:
H2O2+2GSH (گلوتاتیون احیاء) → 2H2O + GSSG (گلوتاتیون اکسید)
مطابق واکنش بالا، گلوتاتیون پراکسیداز در هموژنات بافتی تهیه شده، گلوتاتیون را اکسیده کرده و بطور همزمان پراکسید هیدروژن به آب احیاء میگردد. لازم به ذکر است که بدین منظور، مخلوط واکنشگر مربوطه متشکل از 2/0 میلیلیتر اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (ethylenediamine tetra-acetic acid; EDTA) mM 8/0، 1/0 میلیلیتر آزید سدیم (sodium azide) mM10، 1/0 میلیلیتر پراکسیدئیدروژن mM 5/2 و 2/0 میلیلیتر هموژنات بود که در دمای ۳۷ درجه سلسیوس به مدت ۱۰ دقیقه گرمخانهگذاری گردید. واکنش حاصله پس از ۱۰دقیقه، توسط تری کلرواستیک اسید متوقف و گلوتاتیون باقیمانده توسط محلول دی تیوبیس نیتروبنزوئیک اسید (Dithiobis nitrobenzoic acid; DTNB) مجدداً فعال گردیده و منجر به تشکیل ترکیب رنگی گردید که حذب نوری آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 420 نانومتر اندازهگیری شد. واکنش با افزودن 5/0 میلیلیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد متوقف و لولهها با ۲۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ شد. ۳ میلیلیتر دی سدیم هیدروژن mM 8/0 و 1/0 میلیلیتر DTNB 04/0 درصد به محلول شناور افزوده شد و بلافاصله رنگ حاصله در mM۴۲۰ اندازهگیری شد. در نهایت فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز به صورت میلیگرم پروتئین/ دقیقه/ میکرومول گلوتاتیون اکسید محاسبه و ثبت گردید.
در نهایت هم سنجش سطح پراکسیداسیون لیپیدی در بافت کلیه با روش رنگ سنجی (calorimetrically) به وسیله اندازهگیری TBARS (thiobabituric acid reacting substances) طبق روش فراگا و همکاران انجام شد (Fraga et al., 1988) که بدین‌منظور بهطور خلاصه 1/0 میلیلیتر هموژنات بافتی با 2 میلیلیتر معرف TCA-Hcl (trichloroacetic acid) TBA-(Thiobarbituric acid) (37 درصد TBA، 25/0 مول HCl و 15 درصدTCA ، به نسبت 1:1:1) مخلوط و پس از ۱۵ دقیقه قرارگیری در بن ماری جوشان، خنک گردید و در شتاب g3500 به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شد. شدت جذب نوری محلول رویی شفاف در طول موج ۵۳۵ نانومتر در مقابل بلانک اندازهگیری گردید و مقادیر بدست آمده به صورت نانومول در ۱۰۰ گرم بافت کلیه محاسبه و ثبت شد.
- بررسی آسیب بافتی در کلیه موشها
بدین منظور، در مرحله آسانکشی موشها، همزمان کلیه راست آنها نیز خارج گردید و پس از ثبوت در فرمالین 10 درصد (Merck, Germany) مقاطع بافتی مورد نظر با استفاده از تکنیک متداول رنگآمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیه گردید (Luna, 1968). در ادامه مشاهدات ریزبینی در 5 ميدان ميکروسکوپي از هر برش بافتی، بهطور تصادفي و با استفاده از ميكروسكوپ نوري Nikon (مدلECLIPSE E200، ساخت كشور ژاپن) انجام شد. بررسي مقاطع آسيب‌شناسي توسط يك مقياس نيمه كمّي (semiquantitative scale) و بهصورت دوسو كور جهت ارزيابي از لحاظ تغییرات پاتولوژیک شامل: الف) آسیب گلومرولها به شکل "گلومرولیت، آتروفی گلومرولی، فیبروز گلومرولی و اتساع فضای ادراری، ب) آسيب بينابيني به شکل پرخونی، خونریزی، ادم، ارتشاح بینابینی سلولهای آماسی و فیبروز بينابيني و ج) آسيب توبولي به شکل اتساع توبولی، تغییرات دژنراتیو و نکروز سلولهای توبولی، پهن و مسطح شدن سلولهای توبولی و مشاهده کستهای هیالنی داخل توبولها مورد ارزیابی قرار گرفتند. همچنین از لحاظ شدت هم آسیبهای بافتی مشاهده شده، بر اساس روش بهالودیا و همکاران به صورت عدم وجود آسیب (-) آسیب ملایم (+)، آسیب متوسط (++) و آسیب شدید (+++) رتبه بندی شدند (Bhalodia et al., 2009).
-تحليل آماری دادهها
براي تحليل داده‌های جمعآوری‌شده از نرم‌افزار SPSS-17 استفاده شد. داده‌هاي به‌دست‌آمده كمّي، به صورت میانگین±انحراف استاندارد (mean±SEM) ارائه و اختلاف معني‌دار بين گروهها توسط آزمون آماري آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA) و آزمون تعقيبي توكي (Tukey) مورد بررسي قرار گرفت. همچنین اختلافات در سطح 05/0p< معني‌دار تلقي شدند.
-مقادیر فاکتورهای بیوشیمیایی مربوط به عملکرد کلیوی
تغییرات فاکتورهای بیوشیمیایی عملکرد کلیوی در سرم موشهای صحرایی گروههای مورد مطالعه در جدول 1 ارائه شده است که مشاهده میگردد در گروه موشهای القاء ایسکمی- بازخونرسانی، ایجاد ایسکمی- بازخونرسانی موجب افزایش معنیدار سطح اوره و کراتینین سرم موشها نسبت به گروه شاهد شدهاست (05/0p<). همچنین در موشهای گروه تیمار شده با فارگیسین نیز تیمار با فارگسین موجب کاهش معنیدار اوره و کراتینین سرم موشها نسبت به گروه موشهای القاء ایسکمی- بازخونرسانی گردیدهاست (05/0p<).
گروه آزمایشی | مقدار فراسنجه‌هاي بيوشيميايي بررسی شده (mean±S.E.M) | ||
اوره (mg/dl) | کراتینین (mg/dl) | ||
شاهد جراحی | 37/0±11/28 | 10/0±21/1 | |
ایسکمی-/بازخونرسانی | *58/0±32/41 | *24/0±63/2 | |
ایسکمی-/بازخونرسانی + فارگسین | 66/0±19/30 | 17/0±24/1 | |
*: نشانگر اختلاف آماری معني‌دار با مقادیر مربوط به گروه شاهد میباشد.
- سطوح بافتی سایتوکاینهای التهابی
تغییرات سطوح سایتوکاینهای التهابی در بافت کلیه موشهای صحرایی گروههای مورد مطالعه هم در جدول 2 ارائه شده است که ملاحظه میگردد در گروه موشهای القاء ایسکمی- بازخونرسانی(I/R)، انجام عمل ایسکمی-بازخونرسانی موجب افزایش معنیدار مقادیر مارکرهای پیش التهابی IL-1 و TNF-α نسبت به گروه شاهد شدهاست (05/0p<). اما در گروه موشهای تیمار شده با فارگیسین، تجویز فارگسین موجب کاهش تولید مارکرهای پیش التهابی ذکر شده در مقایسه با گروه I/R گردیدهاست(05/0p<).
جدول 2- تاثير فارگسین بر تغييرات سطوح بافتی سایتوکاینهای التهابی در آسیب ایسکمی بازخونرسانی کلیه در موش صحرايي
گروه آزمایشی | مقدار فراسنجه‌هاي بيوشيميايي بررسی شده (mean±S.E.M) | |
IL-1 (pg/ml) | TNF-α (pg/ml) | |
شاهد جراحی | 41/5±63/115 | 13/6±19/111 |
ایسکمی-/بازخونرسانی | *69/9±51/271 | *27/11±55/230 |
ایسکمی-/بازخونرسانی + فارگسین | 77/6±11/119 | 19/7±22/118 |
*: نشانگر اختلاف آماری معني‌دار با مقادیر مربوط به گروه شاهد میباشد.
- میزان فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانی و شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در بافت کلیه
تغییرات فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی و میزان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در بافت کلیه موشهای صحرایی گروههای مورد مطالعه در جدول 3 ارائه شده است. در گروه IR ایجاد ایسکمی و بازخونرسانی موجب کاهش معنیدار آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آنزیمهای کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) بافت کلیه گردید (05/0p<) و همچنین موجب افزایش معنیدار میزان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی (مالوندیآلدئید) در بافت کلیه شد (05/0p<). در گروه I/R + Fargesin تیمار با فارگسین موجب افزایش معنیدار آنزیمهای آنتیاکسیدانی سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آنزیمهای کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) بافت کلیه و کاهش معنیدار میزان مالوندیآلدئید (MDA) بافت کلیه در مقایسه با گروه I/R شد (05/0p<).
جدول 3- مقایسه تغییرات اکسیدانی/آنتیاکسیدانی بافت کلیه در موشهای صحرایی گروههای موردمطالعه
گروه آزمایشی | فراسنجه‌هاي بيوشيميايي (mean±S.E.M) | |||
مالون‌دي‌آلدئيد (nmol/g protein) | سوپراكسيد دیسموتاز (U/mg protein) | كاتالاز (U/mg protein) | گلوتاتيون پراكسيداز (U/mg protein) | |
شاهد جراحی | 18/0±74/4 | 61/0±13/18 | 92/4±14/70 | 18/1±19/24 |
ایسکمی/بازخونرسانی | *65/0±61/6 | *57/0±45/12 | *15/2±64/50 | a15/1±38/16 |
ایسکمی/بازخونرسانی + فارگسین | 32/0±59/4 | 32/0±92/17 | 35/3±89/67 | b20/1±77/22 |
مقادیر بهصورت ميانگين ± انحراف استاندارد برای 7 سر موش صحرایی در هر گروه ارائه شده است.
*: نشانگر اختلاف معني‌دار با گروه شم
- ارزیابی آسیب شناختی بافت کلیه موشها
در مطالعات ریزبینی نمونههای مربوط به موشهای گروه شاهد جراحی، ساختار بافت کلیهها کاملاً سالم و طبیعی بود (اشکال 1و 2).
شکل 1- نماي ريز‌بيني بافت کلیه موش صحرايي از گروه شم که ساختار آن طبيعي است (رنگ آمیزی هماتوكسيلين- ائوزين، بزرگنمايي 100×).
شکل 2- نماي ريز‌بيني بافت کلیه موش صحرايي از گروه شم که ساختار آن طبيعي است (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 600×).
در نمونههای بافتی مربوط به گروه موشهای القاء ایسکمی- بازخونرسانی، آسیب بافت کلیه بهصورت تغییرات دژنراتیو سلولهای توبولی، نکروز حاد توبولها، ادم، پرخونی و خونریزی شدید بینابینی مشاهده گردید. همچنین تغییرات نکروز، آتروفی، اتساع فضای ادراری، پرخونی و خونریزی شدید نیز در گلومرولها بسیار واضح بود (اشکال 3 و 4).
شکل 3- نماي ريز‌بيني از بافت کلیه یک موش صحرايي از گروه IR که در آن تغییرات شدید و گسترده نکروز سلولهای اپیتلیال توبولی و همچنین نکروز (پیکان ضخیم) و آتروفی گلومرولی (پیکان باریک) و پرخونی و خونریزی در کلافه مویرگی گلومرول (نوک پیکان) و بافت بینابینی کلیه (پیکان خمیده) مشخص مي‌باشد (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 100×).
شکل 4- نماي ريز‌بيني با درشتنمایی بیشتر از بافت کلیه یک موش صحرايي از گروه IR که در آن تغییرات شدید و گسترده نکروز سلولهای اپیتلیال توبولی (پیکان ضخیم) و همچنین نکروز و آتروفی گلومرولی (پیکان باریک) و پرخونی و خونریزی در بافت بینابینی کلیه (نوک پیکان) مشخص مي‌باشد (رنگ آمیزی هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 600×).
در نمونههای بافتی گروه (I/R + Fargesin) بهبود قابل توجهی در بروز تغییرات پاتولوژیک مشاهده گردید. تغییرات پاتولوژیک مشاهده شده در این گروه شامل پرخونی و ادم جزعی و تغییرات ملایم دژنراتیو همراه با نکروز خفیف و پراکنده سلولهای اپیتلیال توبولی بود (شکلهای 5 و 6). تغييرات آسيب‌شناسي بافتي تمامي گروهها در جدول 4، درجه‌بندي و مقايسه گرديده است.
شکل 5- نماي ريز‌بيني از بافت کلیه یک موش صحرايي از گروه I/R + Fargesin که از شدت آسیب بافتی کاسته شده و آسیبها عمدتاً به شکل تغییرات دژنراتیو خفیف در سلولهای پوششی توبولها (پیکان ضخیم) و پرخونی و ادم در بافت بینابینی (پیکان باریک) مشاهده میشود (هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 100×).
شکل 6- نماي ريز‌بيني از بافت کلیه یک موش صحرايي با درشتنمایی بیشتر از گروه I/R + Fargesin که از شدت آسیب بافتی کاسته شده و آسیبها عمدتاً به شکل تغییرات دژنراتیو خفیف در سلولهای پوششی توبولها (پیکان) مشاهده میشود (هماتوكسيلين-ائوزين، بزرگنمايي 100×).
جدول 4- تاثير فارگسین بر آسيب ایسکمی/بازخونرسانی بافت کلیه در موش صحرايي
آسیب بافتی | آسیب گلومرولی | تورمحاد سلولی | پرخونی و خونریزی | اتساع توبولی | نکروز سلولهای پوششی توبولها |
گروهها | |||||
شم | - | - | - | - | - |
ایسکمی/بازخونرسانی | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
ایسکمی/بازخونرسانی + فارگسین | +,- | + | + | + | +,- |
علامت (-) نشانگر عدم وجود آسیب، علامت (+) نشانگر آسیب پاتولوژیک ملایم، (++) آسیب متوسط و (+++) آسیب شدید میباشد.
بحث و نتیجه‌گیری
در شرایط بالینی یکی از آسیبهای حاد کلیوی، آسیب ایسکمی-بازخونرسانی میباشد که میتواند موجب آسیب غیرقابل برگشت کلیه، اختلال در عملکرد ارگان‌های‌دور همچون کبد، مغز و قلب و همچنین مرگ و میر شود. از آنجایی که استرس اکسیداتیو و التهاب در کلیه و سایر اندام‌ها دیگر مشخصه آسیب ناشی از ایسکمی-بازخونرسانی میباشد، مداخلاتی که این فرآیند‌ها‌را هدف قرار میدهند در کنترل اثرات مضر ایسکمی-بازخونرسانی مفید خواهد بود (Patschan et al., 2012). تولید رادیکالهایآزاد اکسیژن به مقدار زیاد، در کلیه که دچار ایسکمی- بازخونرسانی شده، منجر به آسیب میشود که روندی اجتناب ناپذیر در تروما، عفونت و پیوند کلیه میباشد (El-Abhar et al., 2003).
نتایج مطالعه حاضر بیان کرد که متعاقب آسیب ناشی از ایسکمی-یازخونرسانی کلیوی، میزان کراتینین و اوره سرمی افزایش پیدا کرده که افزایش سطوح این مواد نشانگر آسیب کلیوی میباشد. همچنین نتایج آسیب شناسی بافتی، آن را تایید کرد. همانطور که بیان شد، از مکانیسم‌های‌آسیب متعاقب ایسکمی-یازخونرسانی کلیوی میتوان به افزایش استرس اکسیداتیو و همچنین فاکتورهای التهابی اشاره نمود که در این مطالعه به دنبال ایجاد ایسکمی-یازخونرسانی، سطوح فعالیت آنزیمهایSOD، GPx و CAT کاهش پیدا کرده و میزان MDA افزایش یافت. از طرفی متعاقب تیمار با فارگسین، فاکتور‌های‌مذکور بهبود معنی داری را نشان دادند. مکانیسم دیگر اشاره شده، التهاب بافتی میباشد که با افزایش میزان فاکتورهایIL-1 و TNF-α مشخص شد. فارگسین با اثرات ضد التهابی خود توانست این فاکتورها را نیز بهبود بخشد. در گروه دریافت کننده فارگسین میزان فعالیت کلیوی بهبود پیدا کرد و سطوح سرمی اوره و کراتنین کاهش معنی داری را نشان داد. نتایج آسیب شناسی بافتی نیز آن را تایید کرد. کلیهها کراتینین و اوره را به عنوان یک محصول متابولیکی زائد دفع میکنند، از این رو سطح پلاسمایی این پارامتر‌ها‌می‌تواند عملکرد کلیه را منعکس کند. در این مطالعه سطح سرمی کراتنینین و اوره در گروه I/R بیشتر از گروه شم بود. همسو با نتایج مطالعه کیرکبای و همکاران در سال 2007 و ابوطالب و همکاران در سال 2019 آسیب ایسکمی-بازخونرسانی بافت کلیه موجب افزایش کراتینین و اوره شده و موجب کاهش عملکرد کلیه گردیده است (Kirkby et al., 2007; Aboutaleb et al., 2019). تجویز فارگسین موجب کاهش غلظت اوره، و کراتینین بوده است که نشان دهنده اثر بهبود دهنده این ترکیب میباشد. این اثرات ممکن است مربوط به فعالیت ضد التهابی و ضد اکسیدانی ماده فارگسین باشد. چندین مطالعه گزارش کرده اند که برخی از گیاهان با خواص ضد اکسیدانی میتواند آسیب کلیه ناشی از استرس اکسیداتیو در وضعیت ایجاد ایسکمی، کاهش و عملکرد کلیه را ارتقا بخشد (Szcześniak et al., 2016; Yaribeygi et al., 2019). بنابراین اغلب از آنتی‌اکسیدان‌ها‌به عنوان یکی از روشهای درمانی استفاده میشود و گزینه‌ای‌مناسبی جهت محافظت از سلول‌ها‌در برابر رادیکالهایآزاد و آسیب‌های‌اکسیداتیو میباشد. پراکسیداسیون لیپیدها منجر به کاهش استحکام و افزایش آسیب‌پذیری غشاء سلولها میشود. مکانیسم‌‌های‌دفاعی آنتیاکسیدانی، از تشکیل رادیکالهایآزاد اضافی جلوگیری میکنند. از طرفی یون سوپراکسید (-O2) و رادیکال هیدروکسیل (•OH) از مواردی هستند که منجر به صدمات قابل توجهی در بافتها و اندام‌ها میشوند (Fang et al., 2002). بنابراین، حذف یون‌‌های سوپراکسید و
رادیکالهای هیدروکسیل احتمالاً یکی از موثرترین مکانیسم‌‌های‌تدافعی در برابر انواع بیماری‌ها است. افزایش فعالیت‌‌های و CAT، دو آنزیمی که به ترتیب یون‌‌های‌سوپراکسید و یون‌‌های‌هیدروکسیل را پاکسازی میکنند، به طور قابل توجهی منجر به بهبود عوارض استرس اکسیداتیو میشوند. بنابراین کاهش فعالیت آنزیمهای و CAT منجر به تجمع رادیکالهای آزاد شده و نهایتاً باعث القاء اثرات مضر مانند از بین رفتن یکپارچگی غشای سلول و عملکرد غشا میشود (Vijayakumar et al., 2004). طبق مطالعات انجام شده، تیمار با ادویهجات مختلف، با بهبود سطح SOD و CAT میتواند تأثیر مثبتی بر پراکسیداسیون لیپیدها در سیستم‌‌های‌بیولوژیکی داشته باشد (Jeyakumar et al., 1999; Shobana and Akhilender Naidu, 2000). GSH (Glutathione) یک آنزیم مهم درون زاد در برابر تخریب پراکسیدانها در غشاهای سلولی است. GSH میتواند برای سمزدایی در مقابل گونههای اکسیژن فعال مانند H2O2 و یا کاهش پراکسیدهای چربی عمل کند. (GSH) یک پاککننده رادیکال آزاد مستقیم نیز است. این آنزیم به عنوان یک بستر برای GPx (Glutathione peroxidase) و GST (Glutathione S-transferases) عمل میکند. نتایج این مطالعه حاکی از آن بوده است که ایجاد ایسکمی و بازخونرسانی موجب کاهش سطح CAT، SOD و GPx و همچنین افزایش میزان MDA در بافت کلیه گشته است. به دنبال تجویز فارگسین در گروه تیمار موجب افزایش و بهبودی پارامتر‌های‌آنتی اکسیدانی و کاهش میزان مالون در آلدئید گردیده است. کاهش میزان مالون دی آلدئید به عنوان یکی از شاخص‌های‌مهم استرس اکسیداتیو، نشان دهنده فعالیت آنتی اکسیدانی فارگسین میباشد. همچنین میتوان استنباط کرد که افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانی بافت کلیه موجب کاهش تولید رادیکالهایآزاد میگردد که مطابق با نتایج مشاهدات قبلی میباشد (Zolali et al., 2015). در مطالعه‌ای وانگ و همکاران بیان کردند که فارگسین با بهبود آنزیم‌های‌استرس اکسیداتیو همچون افزایش فعالیت SOD، GPx و GSH و همچنین کاهش میزان MDA منجر به کاهش عوارض قلبی ناشی از ایسکمی قلبی شده است که این نتایج همسو با نتایج حاضر بود (Wang et al., 2015). پاسخ التهابی نشان دهنده دفاع بیولوژیکی از سیستم ایمنی بدن برای بازگرداندن به وضعیت اصلی پس از ایجاد آسیب میباشد. تعیین سطح اینترلوکین 1 (IL-1) و فاکتور نکروز دهنده آلفا (TNF-α) به عنوان یکی شاخص مهم در حالت التهابی بدن با توجه به نتایج بدست آمده، موش‌های‌صحرایی ناشی از I/R در گروه کنترل جراحی سطح بالاتری از سیتوکاین‌های‌پیش التهابی را داشتند. در مطالعه زانگ و همکاران نتایج نشان داد ایجاد ایسکمی به مدت 30 دقیقه موجب افزایش معنی دار میزان کراتینین، اوره و TNF- α در موش‌های‌صحرایی تحت جراحی ایسکمی کلیه در مقایسه با گروه شم گردیده است (Zhang et al., 2016). مطالعه‌ای‌نشان داده است که فارگسین میتواند تولید و بیان mRNA TNF-α را در مخاط روده بزرگ موش‌های‌مبتلا به کولیت کاهش دهد. به عنوان یک واسطه مهم التهاب، TNF-α نقش مهمی در پاتوژنز IBD ایفا میکند (Wang et al., 2018).
نتیجه نهائی اینکه بر اساس یافتههای مطالعه حاضر و نیز سایر محققین، میتوان اظهار داشت که تجویز 12 هفته فارگسین قادر است اثرات مفید و محافظتی در آسیب ایسکمی- بازخونرسانی کلیه داشته باشد که این اثرات احتمالاً از طریق کاهش و تداخل در یک سری از فراینده‌ها از جمله استرس اکسیداتیو و التهاب در بافت کلیه ایجاد میشود. البته برای اعلام نظر دقیق و قاطع، انجام مطالعات آتی با مدت زمان تیمار طولانیتر و با دوز‌های بیشتر دارو بر روی موش‌های‌صحرایی تحت القا ایسکمی- بازخونرسانی با مدت زمان بازخونرسانی بیشتر، توصیه میگردد.
سپاسگزاری
نویسندگان از آقای دکتر ناظری برای همکاری در انجام این تحقیق قدردانی مینمایند.
تعارض منافع
نویسندگان اعلام میدارند که هیچگونه تضاد منافعی ندارد.
منابع
· Aboutaleb, N., Jamali, H., Abolhasani, M. and Toroudi, H.P. (2019). Lavender oil (Lavandula angustifolia) attenuates renal ischemia/reperfusion injury in rats through suppression of inflammation, oxidative stress and apoptosis. Biomedicine & pharmacotherapy, 110: 9-19.
· Anonymous .(2004). Australian code of practice for the care and use of animals for scientific purposes, 7th ed., http://www.nhmrc.gov.au/publications/synopse (access in 2011).
· Ávila, C., Líbano, L., Rojas, I. and Rodrigo, R. (2019). Role of ischemia-reperfusion in oxidative stress-mediated injury during kidney transplantation. Clinical Research, 5:1-4.
· Bhalodia, Y., Kanzariya, N., Patel, R., Patel, N., Vaghasiya, J., Jivani, N., et al. (2009). Renoprotective activity of benincasa cerifera fruit extract on ischemia/reperfusion-induced renal damage in rat. I J K D, 3(2): 80-85.
· Choi, S.S., Cha, B.Y., Choi, B.K., Lee, Y.S., Yonezawa, T., Teruya, T., et al. (2013). Fargesin, a component of Flos Magnoliae, stimulates glucose uptake in L6 myotubes. Journal of natural medicines, 67: 320-326.
· Claiborne, A. (1985). Catalase activity. In: Greenwald, R.A. editor, Hand Book of Methods for Oxygen Radical Research. CRC Press. Boca Raton, Florida, pp: 84-86.
· Diep, Q.N., Amiri, F., Touyz, R.M., Cohn, J.S., Endemann, D., Neves, M.F., et al. (2002). PPARα activator effects on Ang II–induced vascular oxidative stress and inflammation. Hypertension, 40(6): 866-871.
· El-Abhar, H.S., Abdallah, D.M. and Saleh, S. (2003). Gastroprotective activity of Nigella sativa oil and its constituent, thymoquinone, against gastric mucosal injury induced by ischaemia/reperfusion in rats. Journal of ethnopharmacology, 84(2-3): 251-258.
· Fang, Y.Z., Yang, S. and Wu, G. (2002). Free radicals, antioxidants, and nutrition Nutrition, 18: 872-879.
· Fraga, C.G., Leibovitz, B.E. and Tappel, A.L. (1988). Lipid peroxidation measured as thiobarbituric acid-reactive substances in tissue slices: characterization and comparison with homogenates and microsomes. Free Radical Biology and Medicine, 4(3): 155-161.
· Garcia-Criado, F.J., Eleno, N., Santos-Benito, F., Valdunciel, J.J., Reverte, M., Lozano-Sanchez, F.S., et al. (1998). Protective effect of exogenous nitric oxide on the renal function and inflammatory response in a model of ischemia-reperfusion. Transplantation, 66(8): 982-90.
· Han, X., Pan, J., Ren, D., Cheng, Y., Fan, P. and Lou, H. (2008). Naringenin-7-O-glucoside protects against doxorubicin-induced toxicity in H9c2 cardiomyocytes by induction of endogenous antioxidant enzymes. Food and Chemical Toxicology, 46(9): 3140-3146.
· Jeyakumar, S.M., Nalini, N. and Menon, V.P. (1999). Antioxidant activity of ginger (Zingiber officinale Rosc) in rats fed a high fat diet. Medical science research, 27(5): 341-344.
· Kirkby, K., Baylis, C., Agarwal, A., Croker, B., Archer, L. and Adin, C. (2007). Intravenous bilirubin provides incomplete protection against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. American Journal of Physiology-Renal Physiology, 292(2): F888-F894.
· Lee, Y.S., Cha, B.Y., Choi, S.S., Harada, Y., Choi, B.K., Yonezawa, T., et al. (2012). Fargesin improves lipid and glucose metabolism in 3T3‐L1 adipocytes and high‐fat diet‐induced obese mice. Biofactors, 38(4): 300-308.
· Legrand, M., Mik, E.G., Johannes, T., Payen, D. and Ince, C. (2008). Renal hypoxia and dysoxia after reperfusion of the ischemic kidney. Molecular medicine, 14: 502-516.
· Li, J., Hong, Z., Liu, H., Zhou, J., Cui, L., Yuan, S., Chu, X., et al. (2016). Hydrogen-rich saline promotes the recovery of renal function after ischemia/reperfusion injury in rats via anti-apoptosis and anti-inflammation. Frontiers in pharmacology, 7: 106.
· Luna, L.G. (1968). Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. InManual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, pp: xii-258).
· Mansour, S.M., Bahgat, A.K., El-Khatib, A.S. and Khayyal, M.T. (2011). Ginkgo biloba extract (EGb 761) normalizes hypertension in 2K, 1C hypertensive rats: role of antioxidant mechanisms, ACE inhibiting activity and improvement of endothelial dysfunction. Phytomedicine, 18(8-9): 641-647.
· Minutoli, L., Puzzolo, D., Rinaldi, M., Irrera, N., Marini, H., Arcoraci, V., et al. (2016). ROS‐mediated NLRP3 inflammasome activation in brain, heart, kidney, and testis ischemia/reperfusion injury. Oxidative medicine and cellular longevity, 2016(1): 2183026.
· Mohajeri, D., Gharamaleki, M.N., Hejazi, S.S. and Nazeri, M. (2013). Preventive effects of turnip (Brassica rapa L.) on renal ischemia-reperfusion injury in rats. Life Science Journal, 10(1): 1165-1170.
· Nishikimi, M., Rao, N.A. and Yagi, K. (1972). The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochemical and biophysical research communications, 46(2): 849-854.
· Nishiyama, A., Yao, L., Nagai, Y., Miyata, K., Yoshizumi, M., Kagami, S., et al. (2004). Possible contributions of reactive oxygen species and mitogen-activated protein kinase to renal injury in aldosterone/salt-induced hypertensive rats. Hypertension, 43(4): 841-848.
· Patschan, D., Patschan, S. and Müller, G.A. (2012). Inflammation and microvasculopathy in renal ischemia reperfusion injury. Journal of transplantation, 2012(1): 764154.
· Pham, T.H., Kim, M.S., Le, M.Q., Song, Y.S., Bak, Y., Ryu, H.W., et al. (2017). Fargesin exerts anti-inflammatory effects in THP-1 monocytes by suppressing PKC-dependent AP-1 and NF-ĸB signaling. Phytomedicine, 24: 96-103.
· Rotruck, J.T., Pope, A.L., Ganther, H.E., Swanson, A.B., Hafeman, D.G. and Hoekstra, W. (1973). Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 179(4073): 588-590.
· Sancaktutar, A.A., Bodakci, M.N., Hatipoglu, N.K., Soylemez, H., Basarılı, K. and Turkcu, G. (2014). The protective effects of pomegranate extracts against renal ischemia-reperfusion injury in male rats. Urology annals, 6(1): 46-50.
· Sha, S., Xu, D., Wang, Y., Zhao, W. and Li, X. (2016). Antihypertensive effects of fargesin in vitro and in vivo via attenuating oxidative stress and promoting nitric oxide release. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 94(999): 900-906.
· Shen, Y., Li, C.G., Zhou, S.F., Pang, E.C., Story, D.F. and Xue, C.C. (2008). Chemistry and bioactivity of Flos Magnoliae, a Chinese herb for rhinitis and sinusitis. Current medicinal chemistry, 15(16): 1616-1627.
· Shobana, S. and Naidu, K.A. (2000). Antioxidant activity of selected Indian spices. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids (PLEFA), 62(2): 107-110.
· Szcześniak, K.A., Ostaszewski, P., Ciecierska, A. and Sadkowski, T. (2016). Investigation of nutriactive phytochemical–gamma‐oryzanol in experimental animal models. Journal of animal physiology and animal nutrition, 100(4): 601-617.
· Tanyeli, A., Eraslan, E., GÜLER, M., Kurt, N. and Akaras, N. (2020). Gossypin protects against renal ischemia-reperfusion injury in rats. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 26(1).
· Thurman, J.M. (2007). Triggers of inflammation after renal ischemia/reperfusion. Clinical immunology, 123(1): 7-13.
· Vijayakumar, R., Surya, D. and Nalini, N. (2004). Antioxidant efficacy of black pepper (Piper nigrum L.) and piperine in rats with high fat diet induced oxidative stress. Redox Report, 9(2): 105-110.
· Wang, G., Gao, J.H., He, L.H., Yu, X.H., Zhao, Z.W., Zou, J., et al. (2020). Fargesin alleviates atherosclerosis by promoting reverse cholesterol transport and reducing inflammatory response. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 1865(5): 158633.
· Wang, X., Cheng, Y., Xue, H., Yue, Y., Zhang, W. and Li, X. (2015). Fargesin as a potential β1 adrenergic receptor antagonist protects the hearts against ischemia/reperfusion injury in rats via attenuating oxidative stress and apoptosis. Fitoterapia, 105: 16-25.
· Wang, Z., Wu, X., Wang, C.L., Wang, L., Sun, C., Zhang, D.B., et al. (2018). Tryptanthrin protects mice against dextran sulfate sodium-induced colitis through inhibition of TNF-α/NF-κB and IL-6/STAT3 pathways. Molecules, 23(5): 1062.
· Yaribeygi, H., Simental‐Mendía, L.E., Butler, A.E. and Sahebkar, A. (2019). Protective effects of plant‐derived natural products on renal complications. Journal of cellular physiology, 234(8): 12161-12172.
· Zhang, H., Deng, A., Zhang, Z., Yu, Z., Liu, Y., Peng, S., et al. (2016). The protective effect of epicatechin on experimental ulcerative colitis in mice is mediated by increasing antioxidation and by the inhibition of NF-κB pathway. Pharmacological reports, 68: 514-520.
· Zhao, W., Zhou, T., Fan, G., Chai, Y. and Wu, Y. (2007). Isolation and purification of lignans from Magnolia biondii Pamp by isocratic reversed‐phase two‐dimensional liquid chromatography following microwave‐assisted extraction. Journal of separation science, 30(15): 2370-2381.
· Zolali, E., Asgharian, P., Hamishehkar, H., Kouhsoltani, M., Khodaii, H. and Hamishehkar, H. (2015). Effects of gamma oryzanol on factors of oxidative stress and sepsis-induced lung injury in experimental animal model. Iranian journal of basic medical sciences, 18(12): 1257.
· Zweier, J.L. and Talukder, M.H. (2006). The role of oxidants and free radicals in reperfusion injury. Cardiovascular research, 70(2): 181-190.
