بررسی ارتباط میان ضایعات هیستوپاتولوژیک و میزان تغییرات بیومارکرهای قلبی در بره-های مبتلا به بیماری تب برفکی

محورهای موضوعی : آسیب شناسی درمانگاهی دامپزشکی

زهرا جعفرنیا ¹ , محمد هاشم نیا ² , زهرا نیکو صفت ³

1 - دانش‌آموخته دکترای عمومی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.
2 - دانشیارگروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.
3 - استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.

تاریخ دریافت : 1402/11/09 تاریخ پذیرش : 1403/05/01 تاریخ انتشار : 1403/08/30

کلید واژه: بیماری تب برفکی, بره, ضایعات پاتولوژیک, بیومارکرهای قلبی,

چکیده مقاله :

بیماری تب برفکی در بره‌ها باعث مرگ و میر بالا می‌شود که علت آن غالبا آسیب شدید میوكارد است. آزمايش الايزا و روش­های مولکولی از جمله اعمال متداول براي تشخيص حيوانات مبتلا هستند که علی‌رغم کارآمد بودن، معمولا پرهزینه هستند، بنابراین استفاده از روش­های تشخیصی سریع و کم­هزینه حائز اهمیت می­باشد. مطالعه حاضر با هدف ارزیابی میزان تغییرات بیومارکرهای قلبی و ارتباط آن­ها با شدت ضایعات پاتولوژیک در قلب بره‌های مبتلا به بیماری تب برفکی، انجام شد. 25 رأس گوسفند که بر اساس آزمایش الايزا مبتلا به تب برفکی تشخیص داده­شدند به عنوان گروه بیمار و 25 رأس گوسفند سالم به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. برای سنجش بیومارکرهای قلبی، از حیوانات مبتلا و سالم خونگیری بعمل آمد. پس از کالبدگشایی حیوانات مبتلا، نمونه­های بافت قلب جهت تهيه مقاطع ميكروسكوپيك برداشته­شد. در حیوانات بیمار، مهمترین ضایعات قلبی عبارت بودند از دژنراسیون هیالینی، نكروز بافتی، تجمع بینابینی سلول‌های التهابی تک‌هسته­ای، آتروفی عضلانی، التهاب عروق و پرخونی. همچنین در سرم حیوانات مبتلا، ميانگين غلظت تروپونین I، ميوگلوبين و راديكال‌هاي فعال اكسيژن و فعالیت آنزیم‌های کراتین­کیناز و لاکتات­دهیدروژناز در مقایسه با گروه کنترل سالم بیشتر بود (05/0p<). میزان افزایش بیومارکرهای قلبی هم با شدت ضایعات پاتولوژیک ارتباط مستقیم داشت. نتایج نشان داد که سنجش بیومارکرهای قلبی می­تواند شواهدی جامع در مورد آسیب­های قلبي در حیوانات مبتلا به تب­برفکی ارائه دهد. به نظر می‌رسد، اندازه­گیری تروپونین سرم دارای اختصاصیت و حساسیت بالایی برای تشخیص آسیب­ قلبی است و همراه با اخذ تاریخچه و انجام معاینات بالینی، می‌تواند به تشخیص بیماری تب برفکی کمک کند.

چکیده انگلیسی:

Foot-and-mouth disease produces high mortality in lambs, and the cause of their death is often myocardial injury. ELISA test and molecular methods are among the routine methods for diagnosis of infected animals. Although these methods are very efficient, they are usually expensive and time-consuming. This study was designed to evaluate cardiac biomarkers and their relationship with the severity of histopathologic lesions. 25 diseased lambs that were diagnosed based on ELISA test were selected as the disease group and 25 healthy lambs were used as the control. To determine cardiac biomarkers, blood was collected from infected and healthy animals. After necropsy of the affected lambs, samples of the heart tissue were taken to histopathological studies. The main histopathologic findings were hyaline degeneration, necrosis, infiltration of inflammatory cells, muscular atrophy, vasculitis and congestion. Mean troponin I, myoglobin and ROS concentrations and CK and LDH activities were significantly higher in FMD cases compared with controls (p<0.05). The rate of increase in cardiac biomarkers was directly related to the extent and severity of pathologic lesions. These results showed that the increase in the serum level of these biomarkers can potentially provide comprehensive evidence about cardiac lesions in animals with FMD. The increase in cardiac biomarkers, particularly troponin I, was directly related to the severity pathological lesions. It seems that the assay of troponin has high specificity and sensitivity for the diagnosis of cardiac lesions, and together with taking the history of the flock, clinical examinations and necropsy symptoms can help in diagnosing the disease.

منابع و مأخذ:

Aktas, M.S., Ozkanlar, Y., Oruc, E., Sozdutmaz, I. and Kirbas A. (2015) Myocarditis associated with foot-and-mouth disease in suckling calves. Veterinarski Arhiv, 85(3): 273-282.
● Alaour, B., Liew, F. and Kaier, T.E. (2018). Cardiac Troponin - diagnostic problems and impact on cardiovascular disease. Annals of medicine, 50(8): 655-665.
● Alexandersen, S. and Mowat, N. (2005). Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis. Current topics in microbiology and immunology, 288: 9-42.
● Apple F.S. (2001). Cardiac troponin assays: analytical issues and clinical reference range cutpoints. Cardiovascular Toxicology, 1(2): 93-98.
● Aslani, M.R., Mohri, M. and Movassaghi A.R. (2013). Serum troponin I as an indicator of myocarditis in lambs affected with foot and mouth disease. Veterinary Research Forum, 4(1): 59-62.
● Basbugan, Y., Agaouglu, Z. and Yuksek, N. (2010). An Investigation on Serum Troponin Concentration in Healthy Ruminants. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 16(4): 641-645.
● Bozukluhan, K., Atakisi, E. and Atakisi, O. (2013). Nitric Oxide Levels, Total Antioxidant and Oxidant Capacity in Cattle with Foot-and-Mouth-Disease. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 19 (1): 179-181.
● Cornelisse, C.J., Schott, H.C., Olivier, N.B., Mullaney, T.P., Koller, A., Wilson, D.V., et al. (2000). Concentration of cardiac troponin I in a horse with a ruptured aortic regurgitation jet lesion and ventricular tachycardia. Journal of the American Veterinary Medical Association, 217(2): 231-235.
● Costa, T.N., Cassaro Strunz, C.M., Nicolau, J.C. and Gutierrez, P.S. (2008). Comparison of MB fraction of creatine kinase mass and troponin I serum levels with necropsy findings in acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology, 101(3): 311-314.
● Ding, Y.Z., Chen, H.T., Zhang, J., Zhou, J.H., Ma, L.N., Zhang, L., et al. (2013). An overview of control strategy and diagnostic technology for foot-and-mouth disease in China. Virology Journal, 10(1): 78-84.
● Fartashvand, M., Derangian, A. and Kaveh, A. (2013). Evaluation of cardiac troponin I alterationsin dairy cattle with septicmetritis. Veterinary Clinical Pathology, 7(27): 239-248. [In Persian]
● Fllah, M., Fartashvand, M., Kouchakzadehomran, H. and Kaveh, A. (2016). Evaluation of cardiac injury biomarkers in cattle with acute clinical mastitis. Veterinary Clinical Pathology, 10(1): 53-59. [In Persian]
● Ford, I., Shah, A.S., Zhang, R., McAllister, D.A., Strachan, F.E., Caslake, M., et al. (2016). High-Sensitivity Cardiac Troponin, Statin Therapy, and Risk of Coronary Heart Disease. Journal of the American College of Cardiology, 68(25): 2719-2728
● Gunes, V., Atalan, G., Citil, M. and Erdogan, H.M. (2008). Use of cardiac troponin kits for the qualitative determination of myocardial cell damage due to traumatic reticuloperitonitis in cattle. The Veterinary Record, 162(16): 514-517.
● Gunes, V., Ozcan, K., Citil, M., Onmaz, A.C. and Erdogan, H.M. (2010). Detection of myocardial degeneration with point-of-care cardiac troponin assays and histopathology in lambs with white muscle disease. Veterinary Journal, 184(3): 376-378.
● Humann-Ziehank, E., Ganter M., Hennig-Pauka, I. and Binder, A. (2007). Trace mineral status and liver and blood parameters in sheep without mineral supply compared to local roe deer (Copreolus capreolus) popilations. Small Ruminant Research, 75(2-3): 185-191
● Jafari Dehkordi, A., Mohebbi, A.N. and Balali Dehkordi, Sh. (2014). Evaluation of dysrhythmias and myocardial biomarkers in high and low-yielding dairy cows. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 8(2): 101-109.
● Jamal, S.M., and Belsham, G.J. (2013). Foot-and-mouth disease: past, present and future. Veterinary Research, 44(1): 116-130.
● Karapinar, T., Dabak, D.O., Kuloglu, T. and Bulut, H. (2010). High cardiac troponin I plasma concentration in a calf with myocarditis. Canadian Veterinary Journal, 51(4): 397-399.
● Lim, B.K., Shin, J.O., Choe, S.C., Choi, S. W., Jeong, J.O., Seong, I.W., et al. (2005). Myocardial injury occurs earlier than myocardial inflammation in acute experimental viral myocarditis. Experimental & Molecular Medicine, 37(1): 51-57.
● Lu, Z., Yu, S., Wang, W., Chen, W., Wang, X., Wu, K., et al. (2022). Development of Foot-and-Mouth Disease Vaccines in Recent Years. Vaccines, 10(11): 1817-1834.
● O'Brien, P.J. (2008). Cardiac troponin is the most effective translational safety biomarker for myocardial injury in cardiotoxicity. Toxicology, 245(3): 206-218.
● Reef, V.B. and McGuirk, S.M. (2002). Diseases of the cardiovascular system. In: Large Animal Internal Medicine. Smith, B.P. editor. 3rd ed., St. Louis: Mosby Co, pp: 443-478.
● Schwarzwald, C.C., Hardy, J. and Buccellato, M. (2003). High cardiac troponin I serum concentration in a horse with multiform ventricular tachycardia and myocardial necrosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 17(3): 364-368.
● Paton, D.J., Gubbins, S. and King, D.P. (2018). Understanding the transmission of foot-and-mouth disease virus at different scales. Current Opinion in Virology, 28(6): 85-91.
● Phaniendra, A., Jestadi, D.B. and Periyasamy, L. (2015). Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 30(1):11-26.
● Tolouei, M., Daneshvar, A., Tayefi-nasrabadi, H. and Madadgar, O. (2021). Clinical evaluation of the effect of hydroalcoholic extract of Hypericum perforatum on the healing of oral lesions of Foot and mouth disease in cattle. Veterinary Clinical Pathology, 15(1): 61-73. [In Persian]
● Tunca, R., Erdogan, M.H., Sozmen, M., Citil M., Devrim, A.K., Erginsoy, S., et al. (2009). Evaluation of Cardiac Troponin I and Inducible Nitric Oxide Synthase Expressions in Lambs with White Muscle Disease. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences, 33(1): 53-59.
● Tunca, R., Sozmen, M., Erdogan, H., Citil, M., Uzlu, E., Ozen, H., et al. (2008). Determination of cardiac troponin I in the blood and heart of calves with foot-and-mouth disease. Journal of Veterinary Diagnostic, 20(5): 598-605.
Turgut, K. (2000). Veterinary clinic laboratory diagnosis. Ankara Bahcıvanlar Basim Evi. pp, 1143-1153.
● Undhad, V.V., Fefar, D.T., Jivani, B.M., Gupta, H., Ghodasara, D.J., Joshi, B.P., et al. (2012). Cardiac troponin: an emerging cardiac biomarker in animal health. Veterinary World, 5(8): 508-511.
● Varga, A., Schober, K. E., Holloman, C.H., Stromberg, P.C., Lakritz, J. and Rings, D.M. (2009). Correlation of serum cardiac troponin I and myocardial damage in cattle with monensin toxicosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 23(5): 1108-1116.
● Wong, C.L., Yong, C.Y., Ong, H. K., Ho, K.L. and Tan, W.S. (2020). Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Frontiers in Veterinary Science, 7: 477-501.

متن کامل:



آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی                                                                                                              دوره 18، شماره 3، پیاپی 71، پاییز 1403، صفحات: 225-209

 

 

"مقاله پژوهشی"                                                                                            DOI: 10.71499/jvcp.2024.3121449

بررسی ارتباط میان ضایعات هیستوپاتولوژیک و میزان تغییرات بیومارکرهای قلبی در بره­های مبتلا به بیماری تب برفکی

 

زهرا جعفرنیا1، محمد هاشم‌نیا2*، زهرا نیکوصفت3

 

1- دانش‌آموخته دکترای عمومی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.

2- دانشیارگروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.

3- استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه رازي، کرمانشاه، ایران.

*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

(دریافت مقاله: 9/11/1402 پذیرش نهایی: 1/5/1403)

 

 

چکیده

بیماری تب برفکی در بره‌ها باعث مرگ و میر بالا می‌شود که علت آن غالبا آسیب شدید میوكارد است. آزمايش الايزا و روش­های مولکولی از جمله اعمال متداول براي تشخيص حيوانات مبتلا هستند که علی‌رغم کارآمد بودن، معمولا پرهزینه هستند، بنابراین استفاده از روش­های تشخیصی سریع و کم­هزینه حائز اهمیت می­باشد. مطالعه حاضر با هدف ارزیابی میزان تغییرات بیومارکرهای قلبی و ارتباط آن­ها با شدت ضایعات پاتولوژیک در قلب بره‌های مبتلا به بیماری تب برفکی، انجام شد. 25 رأس گوسفند که بر اساس آزمایش الايزا مبتلا به تب برفکی تشخیص داده­شدند به عنوان گروه بیمار و 25 رأس گوسفند سالم به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. برای سنجش بیومارکرهای قلبی، از حیوانات مبتلا و سالم خونگیری بعمل آمد. پس از کالبدگشایی حیوانات مبتلا، نمونه­های بافت قلب جهت تهيه مقاطع ميكروسكوپيك برداشته­شد. در حیوانات بیمار، مهمترین ضایعات قلبی عبارت بودند از دژنراسیون هیالینی، نكروز بافتی، تجمع بینابینی سلول‌های التهابی تک‌هسته­ای، آتروفی عضلانی، التهاب عروق و پرخونی. همچنین در سرم حیوانات مبتلا، ميانگين غلظت تروپونین I، ميوگلوبين و راديكال‌هاي فعال اكسيژن و فعالیت آنزیم‌های کراتین­کیناز و لاکتات­دهیدروژناز در مقایسه با گروه کنترل سالم بیشتر بود (05/0p<). میزان افزایش بیومارکرهای قلبی هم با شدت ضایعات پاتولوژیک ارتباط مستقیم داشت. نتایج نشان داد که سنجش بیومارکرهای قلبی می­تواند شواهدی جامع در مورد آسیب­های قلبي در حیوانات مبتلا به تب­برفکی ارائه دهد. به نظر می‌رسد، اندازه­گیری تروپونین سرم دارای اختصاصیت و حساسیت بالایی برای تشخیص آسیب­ قلبی است و همراه با اخذ تاریخچه و انجام معاینات بالینی، می‌تواند به تشخیص بیماری تب برفکی کمک کند.

 

کلیدواژه‌ها: بیماری تب برفکی، بره، ضایعات پاتولوژیک، بیومارکرهای قلبی.

 

 

مقدمه 

بیماری تب برفکی (Foot and Mouth Disease; FMD) یک بیماری ویروسی ویزیکولار و بشدت واگیردار در حیوانات زوج سم می‌باشد که به لحاظ شدت خسارات اقتصادی یکی از موانع اصلی در تامین بهداشت و تولید دام و فرآورده­های دامی محسوب می­گردد. تب برفکی تقریباً تمامی دام­های زوج سم از جمله گونه­های نشخوارکنندگان اهلی مانند گاو، گاومیش، گوسفند، بز و خوك را درگیر می‌کند، هرچند حساسیت گاو نسبت به سایر دام­ها بیشتر است. شدت واگیری در دام­های حساس، بسیار بالا (۱۰۰ درصد) بوده ولی میزان مرگ و میر معمولاً پایین (2 تا 20 درصد) است (Paton et al., 2018). عامل بيماري مذکور، RNA ويروسي از خانواده پیکورناویریده و جنس آفتوویروس است که شامل هفت سروتیپ با آنتی‌ژنی متفاوت A، C، O، SAT1، SAT2، SAT3 و Asia-1 و همچنین بیش از 60 زیرگروه است که به وسیله آزمایش­های سرولوژیکی از یکدیگر متمایز می‌شوند. این سروتایپ­ها از نظر ایمنی­زایی، با یکدیگر متفاوت هستند و عفونت با یک سروتایپ، سبب مقاومت به دیگر سروتایپ­ها نمی­شود. همچنین، وجود زیرگونه­های آنتی­ژنیک زیادی با درجات بیماری­زایی گوناگون، می­تواند سبب شکست واکسیناسیون و پیدایش بیماری در گله­ها شود. سویه­های گوناگون ویروس، دارای حدت متفاوت بوده و یک سویه، قادر به تغییر حدت است. بیماری­زایی، به عوامل بسیاری مانند تیپ و تحت­تیپ ویروس، مقدار ویروس، گونه حیوان، سن، وضعیت ایمنی و سلامتی دام­ها با توجه ویژه به عفونت­های مخفی، بستگی دارد (Ding et al., 2013; Tolouei et al., 2021). بیماری تب برفکی به دلیل سرعت انتشار و زیان­های اقتصادی فراوانی که به صنعت دامداری وارد می­سازد به عنوان مهمترین بیماری واگیردار دام‌ها‌‌ شناخته شده­است که با جراحات تاولی اروزیونی و زخم در دهان و روی پوزه، سرپستانک­ها، فضای بین­انگشتی و تاج سم مشخص می­شود. ضایعات ممکن است به پیش‌معده­ها، مانند شکمبه و نگاری نیز گسترش یابند.­ در دام­های جوان، شکل بدخیم بیماری رخ می­دهد به­طوری­که در دام­های مذکور وزیکول­ها تشکیل نشده و مرگ ناگهانی شایع است که به دلیل ابتلای ماهیچه­های قلب است. همچنین کانون­های بی‌رنگ تا سفیدرنگ با اندازه­های گوناگون در دیواره بطن­ها و ماهیچه­های پاپیلری قلب دیده می­شود که تحت عنوان نمای قلب ببری (Tiger heart) معروف است. از نظر میکروسکوپی، ضایعهء میوکاردیت حاد به صورت دژنرسانس هیالن و نکروز انعقادی رشته­های ماهیچه­ای قلب همراه با نفوذ خفیف تا متوسط سلول‌های آماسی تک­­هسته­ای مشاهده می‌شود (Jamal and Belsham, 2013).

با توجه به اهمیت بیماری تب برفکی در صنعت دامپروری، کنترل آن یک چالش همیشگی برای مدیران صنعت مذکور می­باشد. کنترل بیماری تب برفکی در مناطق آندمیک با تشخیص، نظارت و واکسیناسیون منظم و بصورت انبوه انجام می‌شود. اما در کشورهای عاری از بیماری تب برفکی، سیاست­های کنترلی بر اساس کاهش جمعیت حیوانات آلوده و در معرض تماس، همراه با ایجاد محدودیت در انتقال حیوانات و محصولات آن­ها می‌باشد. در حال حاضر، واکسن‌های موثر برعلیه ویروس تب برفکی، محافظت قابل قبولی در برابر شکل بالینی بیماری ایجاد می‌کنند، اما از عفونت اولیه مخاط نازوفارنکس جلوگیری نمی‌کنند، بنابراین روندهای کنترل معمولا شامل برنامه­ ریشه­کنی و یا واکسیناسیون و یا ترکیبی از آن­ها می­باشد (Lu et al., 2022). با توجه به این­که اساس برنامه‌های کنترلی و ریشه‌کنی، تشخیص سریع و به موقع بیماری است، لذا تشخیص ویروس در بافت و مایعات و استفاده از روش الایزا، آزمایش تثبیت کمپلمان، تشخیص مولکولی اسید نوکلئیک­ها و روش‌های سرولوژیکی، از مهم­ترین روش‌های تشخیصی این بیماری هستند. مسلما، برخی از این روش‌ها زمان‌بر هستند یا از لحاظ اقتصادی به صرفه نیستند. بنابراین، جستجو برای یافتن روش‌های دیگر بطور مدوام در حال پیگیری است  (Wong et al., 2020).

نظر بر این­که یکی از ضایعات مشخص بیماری تب برفکی به­ویژه در دام­های جوان و مرگ ناگهانی، به دلیل ابتلای ماهیچه­های قلب می­باشد و معمولاً تشخیص میوکاردیت ناشی از بیماری از طریق معاینات بالینی به دلیل کاهش صداهای قلبی معمولاً دشوار است و در موارد متعددی کالبدگشایی دام و تهیه نمونه بافتی جهت انجام آزمایش‌های هیستوپاتولوژی امکان‌پذیر نیست (Reef and McGuirk, 2002)، لذا اخیرا استفاده از بیومارکرها در تشخیص ضایعات قلب مورد بررسی قرار گرفته‌است و به­نظر می‌رسد که استفاده از بیومارکرهای مذکور، تشخیص بیماری‌های قلبی را سریع­تر و آسان‌تر سازد. بیومارکرهای معمول برای تشخیص بیماری قلبی شامل تروپونین (Cardiac Troponin I; CTnI)، میوگلوبین، آسپارتات آمینوترانسفراز (Aspartate aminotransferase; AST)، لاکتات دهیدروژناز (Lactate dehydrogenase; LDH) و کراتین کیناز (Creatine kinase MB; CK-MB) هستند. بیومارکرهای قلبی در واقع شامل آنزیم‌ها و پروتئین‌هایی هستند که در هنگام آسیب دیدن قلب به درون آن آزاد می‌شوند و با اندازه‌گیری مقدار آن­ها می‌توان ضایعات قلبی از جمله سندروم کرونر حاد، اندوکاردیت و اینفارکت میوکارد را تشخیص داد (Undhad et al., 2012; Jafari Dehkordi et al., 2014).

تروپونین کمپلکسی از 3 پروتئین تنظیمی است که در جریان انقباض عضلات اسکلتی و قلبی دخالت داشته، اما در عضلات صاف وجود ندارند. تروپونین‌ها در حالت عادی در سرم وجود نداشته و تنها زمانی که نکروز عضلانی رخ دهد، آزاد می‌شوند. این مولکول­ها در واقع استاندارد طلایی برای تشخیص آسیب میوکارد در انسان و حیوانات هستند و همچنین به عنوان جایگزین برای سایر بیومارکر­های قلبی از جمله میوگلوبین، لاکتات دهیدروژناز و کراتین کیناز متصل به میوگلوبین در نظر گرفته می­شوند، زیرا هم اختصاصیت و هم حساسیت آن در تشخیص آسیب قلبی بیشتر از سایر بیومارکرها است. تغییر غلظت تروپونین در خون 1 تا 2 هفته باقی می­ماند و به همین دلیل یک گسترهء وسیع برای سنجش و تشخیص آسیب قلبی ایجاد می‌کند (Undhad et al., 2012).

هرچند آزمایش­هایی مانند آزمون الايزا، خنثي‌سازي ويروس و روش­های مولکولی از جمله اعمال متداول و بسیار کارآمد برای تشخیص بیماری تب برفکی بوده و حساسیت و ویژگی بالایی دارند ولی معمولا پرهزینه هستند. بنابراین استفاده از روش­های تشخیصی جدید، سریع و کم­هزینه مانند اندازه­گیری بیومارکرهای قلبی در کنار توجه به تاریخچه و علائم بیماری می­تواند در تشخیص سریع بیماری حائز اهمیت باشد (Aslani et al., 2013). 

لذا مطالعه حاضر به منظور بررسی ارتباط میان شدت ضایعات هیستوپاتولوژیک و میزان تغییرات بیومارکرهای قلبی شامل تروپونین I، لاکتات دهیدروژناز، میوگلوبین، کراتین کیناز و راديكال‌هاي فعال اكسيژن در بره‌های مبتلا به بیماری تب برفکی و همچنین تعیین کاربردی‌ترین بیومارکر در این خصوص، انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

در طي مطالعه حاضر، گوسفندان مربوط به کانون‌های مشکوک به تب برفکی در شهرستان کرمانشاه در یک دوره 3­ ماهه (اسفند 1396 و فروردین و اردیبهشت 1397) مورد بررسي قرار­گرفتند. بدین منظور، از گوسفندان زیر یک سال سن مشكوك به فرم حاد بیماری كه واجد علائمی مانند تب شدید، بی­حالی، بی­اشتهایی و آریتمی قلبی بودند، خونگیری توسط سرنگ 10 میلی­لیتری از ورید وداج انجام و حیوانات علامت­گذاری شدند. سپس نمونه‌های خون به آزمایشگاه پاتولوژی شفا (واقع در اسلام آباد غرب) منتقل و پس از جداسازی سرم، 25 رأس گوسفند که بر اساس آزمایش ساندویچ الایزا غیر­مستقیم (با استفاده از کیت آزمایشگاه مرجع جهانی تب برفکی، WRL for FMD-Pirbright) مبتلا به تب برفکی تشخیص داده شدند، انتخاب شدند. با مراجعه مجدد به محل نگهداری دام‌ها و بعد از کسب اجازه از دامداران، مجدداً نمونه خون به میزان 10 میلی­لیتر از هر حیوان اخذ و به‌صورت سیستمیک، عمل کالبدگشایی دام­هاي مبتلا انجام شد. بعد از ارزیابی ضایعات ماکروسکوپیک قلب، نمونه­های مناسب از بافت قلب برداشته­شده و جهت تهيه مقاطع ميكروسكوپيك، در ظروف حاوي فرمالين بافر 10 درصد به آزمايشگاه فرستاده شدند. همچنين تعداد 25 رأس گوسفند سالم هم از مناطق عاری از تب برفکی به عنوان حيوانات گروه کنترل انتخاب شدند و تنها نمونه خون به روش فوق جهت انجام آزمایش‌های بیوشیمیایی از آنها اخذ گردید. پس از انتقال نمونه‌های خون به آزمایشگاه و انجام سانتریفیوژ و سپس جداسازی سرم، نمونه‌ها در فریزر منفی 80 درجه سانتی‌گراد نگه­داری شدند. لازم به ذکر است که انتخاب حیوانات بیمار در نهایت از 3 گله مجزا انجام شد که براساس تاریخچه اخذ شده، واکسن تب­برفکی را دریافت نکرده بودند و سابقه ورود حیوانات جدید به گله بدون در نظر گرفتن موارد بهداشتی و گذراندن دوره قرنطینه وجود داشت.

قابل ذكر است كه طراحی، روش شناسی و اهداف مطالعه حاضر هم به تایید شورای پژوهشی دانشکده دامپزشکی و کمیته اخلاق دانشگاه رازی رسیده است (کد اخلاق: 010-2-396).

- روش تهيه مقاطع آسيب­شناسي بافت قلب بره­ها: 

جهت آماده­سازی بافتی، نمونه­های قلب توسط درجات صعودی الکل (مجللی، ایران) آبگیری­شده و پس از شفاف‌سازی با گزیلل (مجللی، ایران) ، برای مدت 5 ساعت درون پارافین مذاب (Merck،ﺁلمان) با حرارت 60 درجه سلسيوس قرار گرفتند. البته مراحل مذكور به طریقۀ اتوماتیک و با استفاده از دستگاه پاساژ بافتی (مدل DS2080، دید سبز، ایران) انجام گرفت. سپس نمونه­های بافتی در بلوک‌های پارافینی قالب گیری شدند و با استفاده از دستگاه میکروتوم (Rotary Microtomes RAZOR, Germany) برش­هایی به قطر 5 میکرون از آن­ها تهیه شد. به منظور مطالعه برش­هاي نازك تهيه شده، رنگ­آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (شیمی پژوه، ایران) طبق روش متداول انجام و ضایعات بافتی مشاهده شده، بوسیله میکروسکوپ نوری (Leica Galen III, USA) مورد بررسی قرار گرفتند.

- اندازه‌گیری بیومارکرهای قلبی در سرم بره­ها: 

اندازه‌گیری مقدار کمی تروپونین­I توسط روش سنجش‌هاي ايمني آنزيمي با استفاده از کیت شرکتDiaSorin  ایتالیا و با رعایت کلیه شرایط استاندارد انجام شد. در این روش از آنتی‌بادی مونوکلونال موش (متصل‌شونده به اسیدهای آمینه 110-80 مولکول تروپونین قلبی I) برای پوشش فاز جامد (ذرات مغناطیسی) و آنتی­بادی پلی­کلونال بز (متصل‌شونده به اسیدهای آمینه 39-27 مولکول تروپونین قلبی I) برای کانژوگه­کردن استفاده می‌شود. در طی مرحله گرمخانه­گذاري، تروپونین موجود در کالیبراسیون، نمونه سرمی یا کنترل، به آنتی‌بادی مونوکلونال فاز جامد متصل می­شود و سپس آنتی‌بادی پلی­کلونال کانژوگه با تروپونین متصل به فاز جامد­، واکنش نشان می­دهد. بعد از گرمخانه­گذاري­، مواد متصل‌نشده بوسیله شستشو با آب جدا می‌شوند. در مرحله بعد، معرف‌های آغازگر اضافه می‌شوند و یک واکنش شیمیایی کمی‌­لومینسانس ایجاد می‌شود. در نهایت، سیگنال نوری (مقدار آنتی‌بادی ایزولومینول کانژوگه) با استفاده از فوتومولتی پلایر اندازه­گیری می‌شود که نشان‌دهنده غلظت تروپونین موجود در کالیبراسیون، نمونه یا کنترل است.

اندازه­گیری میوگلوبین به کمک روش الایزا و کیت اندازه­گیری DRG (EIA-3955) و دستگاه الایزا ریدر استات فکس (Awareness ,USA) انجام شد. در این روش از آنتی­بادی منوکلونال ضد­میوگلوبین موش برای غیرفعال کردن فاز جامد و از آنتی­بادی ضد­میوگلوبین بز به عنوان محلول کانژوگه­کننده آنتی­بادی-آنزیم (Horseradish Peroxidase) استفاده می‌شود. بدين منظور به نمونه آزمایشی اجازه داده­‌شد تا به طور همزمان با 2 آنتی‌بادی مذكور واکنش دهد و پس از 45 دقیقه گرمخانه­گذاري در دمای اتاق، چاهک‌ها برای جدا­شدن آنتی‌بادی‌های متصل­نشده توسط آب شسته شدند. در مرحله بعد، تتراماتیل- بنزیدین (Tetramethylbenzidine; TMB) اضافه شد و به مدت 20 دقیقه ديگر، عمل گرمخانه­گذاري انجام گرفت که منجر به ایجاد یک رنگ آبی شد. توسعه رنگ با افزودن محلول متوقف كننده (Stop Solution) متوقف شده و تغییر­رنگ به زرد اتفاق ‌افتاد. غلظت ميوگلوبين به طور مستقيم با شدت رنگ نمونه متناسب است. جذب نوري مربوطه، به وسیله روش اسپکتروفتومتری (اسپکتروفتومتر مدل 6305، جنوی انگلستان) در طول­موج 450 نانومتر اندازه­گیری شد.

اندازه‌گیری راديكال‌هاي فعال اكسيژن بر پايه واكنش بين مالون­دی­آلدئید (Malondialdehyde) (محصول بدست آمده از اثر تركيبات راديكال‌هاي فعال اكسيژن با دزوكسي­ريبوز) و معرفي به نام تيوباربيتوريك­اسيد (Thiobarbituric Acid) استوار است. برای انجام این آزمایش به هریک از نمونه‌های سرم 5/0 ميلي­ليتر محلول تري كلرواستيك اسيد 8/2 درصد و 5/0 ميلي­ليتر محلول تيوباربيتوريك اسيد1درصد اضافه شد و به مدت ١٥ دقيقه در بن­ماري در حال جوش قرار داده­شد. بعد از سرد­شدن لوله‌ها، ميزان جذب نوري هريك از آن­ها در طول موج ٥٣٢ نانومتر توسط دستگاه اسپكتروفتومتر  (مدل 6305، جنوی انگلستان)، اندازه­گيري و قرائت شد.

اندازه­گیری لاکتات دهیدروژناز به­وسيلۀ دستگاه اتوآناليزور (مدل 912، هیتاچی ژاپن) با استفاده از كيت­هاي تشخيص آنزيمي شركت پارس آزمون صورت گرفت. در این روش، اندازه­گیری لاکتات دهیدروژناز با استفاده از لاکتات به عنوان سوبسترا و نیکوتین‌آمید­ آدنین دی‌نوکلئوتید (NAD) به عنوان کوآنزیم انجام می‌گردد که در این فرآیند NADH به NAD اکسید می­شود. مقدار کاهش NADH با فعالیت لاکتات دهیدروژناز نسبت مستقیم دارد که به روش اسپکتروتومتری (اسپکتروفتومتر مدل 6305، جنوی انگلستان) در طول­موج 340 نانومتر اندازه­گیری گردید.

اندازه­گیری کراتین کیناز به­وسيلۀ دستگاه اتوآناليزور (مدل 912، هیتاچی ژاپن) با استفاده از كيت­هاي تشخيص آنزيمي شركت پارس آزمون صورت گرفت. در این روش، فعاليت CK-MM (Creatine kinase‐MM) كه قسمت اعظم فعالیت CPK (Creatine phosphokinase) را تشكيل مي دهد و CK-M (Creatine kinase‐M) كه زير مجموعه CK-MB (Creatine kinase‐MB) است توسط يك آنتي بادي اختصاصی بر عليه CK-M  مهار شده و تنها فعاليت CK-B كه نيمي از فعاليت CK-MB را دارا است، اندازه گيري مي‌شود. در نهایت، ميزان تشکيل نیکوتین‌آمید آدنین دی‌نوکلئوتید فسفات (NADPH) که متناسب با میزان فعالیت کراتین­کیناز است، توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 6305، جنوی انگلستان) در طول موج 365­نانومتر اندازه­گیری شد.

- تحلیل آماری داده‌ها: آنالیز نتایج به‌دست‌آمده به کمک نرم‌افزار آماری SPSS ورژن 21 انجام شد. بعد از جمع­آوری داده­ها و وارد­کردن آن­ها به نرم­افزار، برای تعیین توزیع نرمال داده­ها آزمون کولموگروف-اسمیرنوف (Kolmogorov-Smirnov test) مورد استفاده قرار گرفت. داده­های نرمال توسط آزمون تی مستقل (Independent sample t test) و داده‌های غیرنرمال توسط آزمون مان ویتنی (Mann-Whitney U) آنالیز شدند. سطح آماري معني­دار هم، 05/0p< در نظر­گرفته شد.

 

یافته‌ها

- یافته­های ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک قلب:

در بررسی ماکروسکوپیک، ظاهر قلب در گروه کنترل کاملاً طبیعی بود. در حیوانات مبتلا به بیماری تب برفکی، کیسه پریکارد حاوی 30 تا 40 میلی­لیتر مایع و فیبرین بود. عروق خونی و عروق کرونر پرخون بودند. در برخی موارد سطح پریکارد خشن بود. میوکارد از لحاظ قوام، شل و وارفته بود و دارای خطوط یا نقاط پراکنده سفید رنگ بود.

در بررسی میکروسکوپیک، مقاطع بافتی قلب در گروه کنترل ساختار طبیعی داشتند به­طوری­که كارديوميوسيت­ها يكنواخت و هم اندازه و غشاء پلاسما و ديسك­هاي بینابینی در محل اتصال بین سلول‌ها، سالم و دست نخورده بودند (شکل1).

 

 

 

 

شکل 1- نماي ميكروسكوپيك ساختار طبیعی قلب برهء مربوط به گروه کنترل سالم (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگ­نمایی­هاي 720­×­، شکل A­ و 2800­×­ شکل B­).

 

 

در حیوانات مبتلا به تب برفکی، ضایعات قلبی از خفیف تا شدید متغیر بودند. دژنراسیون هیالینی، نكروز بافتی، مینرالیزه شدن فیبرهای میوكارد و تجمع بینابینی سلول‌های التهابی (عمدتاً لنفوسیت و تعداد کمتری ماکروفاژ) و در مواردی نفوذ بافت فیبروبلاستیک در بین رشته‌های ماهیچه‌ایی مشهود بود. دژنراسیون و نكروز میوكارد بصورت کانونی و منتشر هم در محل تجمع سلول‌های التهابی و هم در نواحی نزدیک به این تجمعات مشاهده شد (شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- نماي ميكروسكوپيك از ساختار بافت قلب برهء مربوط به گروه بیمار: A- تراوش شدید سلول‌های تك هسته‌اي (عمدتاً لنفوسیت و تعداد کمتری ماکروفاژ)­، B- نفوذ بافت فیبروبلاستیک در بین رشته‌های ماهیچه‌ای (ستاره­ها)، C- دژنراسیون و نكروز متوسط میوكارد بصورت کانونی، D- دژنراسیون و نكروز شدید میوكارد بصورت منتشر در بافت قلب (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزرگ­نمایی: 720­×­؛ بزرگنمایی تصویر کوچک در شکل A: 2800­×­).

 

 

اما در موارد شدید ابتلا بره­ها به بيماري تب­برفكي، بافت عضلانی قلب کاملاً آتروفیک بود و یا توسط کانون‌های سلول‌های التهابی جایگزین شده­بود. هسته میوسیت‌ها درون کانون­های میوکاردیت بصورت هایپرکروماتیک، پیکنوزه یا تکه­تکه ­شده مشاهده شدند. در مراحل نکروز شدید، اثری از هسته‌ها مشاهده نشد و فیبرهای عضلانی بصورت توده‌های نامنظم ائوزینوفیل و بی‌شکل و بقایای گرانوله مشخص بودند. گرانول‌های معدنی­شده بصورت جداگانه در میان برخی از فیبرهای نکروز­شده پراکنده بودند. علاوه بر این، در برخی مناطق، سارکوپلاسم، حاوی دانه­های بازوفیلیک متراکم بود که نشان­دهنده رسوب کلسیم است. در مواردی، واسکولیت حاد کانونی و نکروز فیبرینوئید همراه با هایپرتروفی عضلات عروق کوچک و پرخونی متوسط تا شدید عروق مشاهده شد (شکل ­3). 

 

 

 

 

شکل 3- نماي ميكروسكوپيك از ساختار بافت قلب برهء مربوط به گروه بیمار: A- آتروفی شدید بافت عضلانی و حضور سلول‌های التهابی بین سلول‌های ماهیچه‌ای قلب، B- هسته‌های پیکنوزه یا تکه­تکه شده همراه با فیبرهای عضلانی بصورت توده‌های نامنظم ائوزینوفیل و بی‌شکل، C- واسکولیت حاد و نکروز فیبرینوئید همراه با هایپرتروفی عضلات عروق و D- پرخونی متوسط تا شدید عروق در بافت قلب (رنگ­آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین: تصاوير A و B بزرگ­نمایی 2800× و تصاوير C و D بزرگ­نمایی 720×).

 

 

- یافته‌های بیوشیمیایی در سرم بره­ها و تقسیم­بندی ضایعات آسیب­شناختی در بافت قلب آن­ها:

برای انجام بررسی‌ دقیق‌تر و یافتن ارتباط بین شدت ضایعات پاتولوژیک و میزان تغییر مارکرهای قلبی، ابتدا ضایعات پاتولوژیک مشاهده­شده در بافت قلب بره­ها، به 3 گروه خفیف (الف)، متوسط (ب) و شدید (د) تقسیم­بندی شد  (Aslani et al., 2013) و سپس هر حیوان مورد مطالعه، با توجه به شدت ضایعات مذکور، در گروه مربوط به خود قرار گرفت (جدول 1).

 

 

 

 

 

جدول 1- تقسیم­بندی ضایعات پاتولوژیک بافت قلب بره­های مبتلا به بیماری تب­برفکی، بر اساس شدت ضایعات

شدت ضایعات	ضایعات خفیف (گروه الف)	ضایعات متوسط (گروه ب)	ضایعات شدید (گروه ج)
توصیف ضایعات	دژنراسیون و نکروز خفیف بافتی، آتروفی خفیف فیبرهای عضلانی، نفوذ سلول‌های التهابی بصورت خفیف تا متوسط، پرخونی خفیف عروق.	دژنراسیون هیالینی متوسط، نكروز متوسط بافتی، نفوذ سلول‌های التهابی بصورت چندکانونی، آتروفی متوسط فیبرهای عضلانی و نفوذ سلول‌های التهابی بین فیبرهای عضلانی، پرخونی شدید عروق.	دژنراسیون هیالینی شدید، نكروز عضلانی گسترده، نفوذ شدید سلول‌های التهابی بصورت چندکانونی و جایگزین شدن با فیبرهای عضلانی، آتروفی شدید فیبرهای عضلانی و نفوذ سلول‌های التهابی و بافت فیبروزه بین فیبرهای عضلانی، واسکولیت.
تعداد حیوانات گروه	8	7	10

 

 

از طرف دیگر، مجموعه یافته‌های بیوشیمیایی در سرم بره­های مورد تحقیق که به شرح زیر می­باشد و نیز ارتباط آن­ها با میزان ضایعات بافتی مشاهده شده در قلب آن­ها هم در جدول2 ارائه گردیده­است:

در بررسی میزان تروپونینI بین دو گروه سالم و بیمار، میزان آنزیم مذکور در سرم بره­های گروه سالم 004/0±02/0 نانوگرم/میلی‌لیتر و در سرم حیوانات گروه بیمار 04/±5/9 نانوگرم/میلی‌لیتر بود و تفاوت مشاهده شده بین دو گروه، از لحاظ آماری معنی‌دار بود (001/0p<). 

میزان آنزیم لاکتات دهیدروژناز در سرم بره­های دو گروه سالم و بیمار هم به­ترتیب 53/7±72/148 واحد/لیتر و 29/24±84/531 واحد/لیتر ثبت شد که تفاوت موجود هم بین دو گروه، از لحاظ آماری معنی‌دار بود (001/0p<). 

در اندازه‌گیری میزان میوگلوبین بین دو گروه سالم و بیمار، میزان سرمی میوگلوبین در گروه سالم 66/0±51/11 نانوگرم/میلی‌لیتر و در گروه بیمار 21/6±40/122 نانوگرم/میلی‌لیتر بود که از نظر آماری، تفاوت ملاحظه شده از این نظر نیز، بین دو گروه معنی‌دار بود (001/0p<).

همچنین میزان سرمی آنزیم کراتین‌کیناز در بره­های دو گروه سالم و بیمار، به­ترتیب 15/3±32/60 واحد/لیتر و 28/21±84/896 واحد/لیتر ثبت شد که تفاوت مشاهده شده بین دو گروه، از لحاظ آماری معنی‌دار بود (001/0p<).­

در بررسی میزان سرمی راديكال‌هاي فعال اكسيژن بین دو گروه حیوانات سالم و بیمار، میزان راديكال‌هاي فعال اكسيژن در گروه سالم 23/23±41/557 میکرومول/لیتر و در گروه بیمار 95/199±91/1898 میکرومول/لیتر بود که در این خصوص نیز تفاوت موجود بین دو گروه، از لحاظ آماری معنی‌دار بود (001/0p<).

از طرف دیگر در مقایسه پارامترهای ذکر شده، بین 3 گروه حیوان مبتلا به تب برفکی، براساس جدول شماره1، بیشترین و کمترین مقدار آنزیم تروپونین I بترتیب در سرم بره­های گروه­های (ج) و (الف) مشاهده شد و تفاوت بین گروه‌ها هم از نظر آماری معنی‌دار بود (001/0p<). همچنین در بررسی سطح آنزیم لاکتات دهیدروژناز، بیشترین مقدار آنزیم در سرم حیوانات گروه (ج) مشاهده شد و به دنبال آن گروه‌های (الف) و (ب) قرار گرفتند، اما در این مورد، تفاوت مشاهده شده بین 3 گروه‌، از نظر آماری معنی‌دار نبود (81/0=p). بیشترین مقدار میوگلوبین سرمی نیز در گروه (ج) و کمترین مقدار آن در گروه (الف) مشاهده شد که این تفاوت هم از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (13/0=p). در بررسی میزان آنزیم کراتین‌کیناز، بیشترین مقدار آن در سرم بره­های گروه (ج) مشاهده شد که اختلاف مقدار مذکور، در مقایسه با میزان مربوط به دو گروه دیگر، معنی‌دار بود (001/0p<). بیشترین مقدار راديكال‌هاي فعال اكسيژن هم به ترتیب در گروه‌های (ج)­، (ب) و (الف) مشاهده شد، هرچند تفاوت بین گروه‌ها در مورد مقادیر فاکتور مذکور، از لحاظ آماری معنی‌دار نبود (39/0=p).

 

 

جدول 2. میزان بیومارکرهای قلبی و ارتباط آن­ها با شدت ضایعات هیستوپاتولوژیک بافت قلب بره­های گروه­های مختلف مبتلا به بیماری تب­برفکی

گروه ها	تروپونینI  (نانوگرم/میلی‌لیتر)	لاکتات دهیدروژناز (واحد/لیتر)	ميوگلوبين (نانوگرم/میلی‌لیتر)	کراتین کیناز (واحد/لیتر)	راديكال‌هاي فعال اكسيژن (میکرومول/لیتر)
گروه (الف)	€1/0±4/7	π28/27±86/459	π06/7±18/108	¥,€35/27±12/819	π64/276±71/1566
گروه (ب)	¥1/0±8/8	π65/36±57/534	π61/11±08/118	¥19/38±71/857	π62/418±66/1821
گروه (ج)	π4/0 ±6/11	π15/45±50/587	π01/11±81/136	π11/18±40/986	π85/339±73/2218
Sig	00/0	81/0	13/0	00/0	39/0

­π، ¥، €: علامت‌های غیر­مشابه نشان دهنده وجود اختلاف آماری معنی­دار بین گروه های مورد مطالعه می­باشد.

* نتایج با لحاظ 05/0p< ارائه شده‌اند.

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که ميانگين غلظت سرمی تروپونین I، ميوگلوبين و راديكال‌هاي فعال اكسيژن و فعالیت آنزیم‌های کراتین­کیناز و لاکتاتدهیدروژناز در حیوانات مبتلا به تب‌برفکی در مقایسه با حیوانات سالم به‌طور معنی‌داری بیشتر است و همچنین میزان افزایش بیومارکرهای قلبی با شدت ضایعات پاتولوژیک ارتباط مستقیم دارد.

مهمترین ضایعات ماکروسکوپی و میکروسکوپی در قلب شامل شل و وارفته بودن قوام میوکارد و وجود خطوط یا نقاط پراکنده سفیدرنگ بویژه در نزدیکی قاعده قلب و دژنراسیون هیالینی، نكروز بافتی، تجمع سلول‌های التهابی در بافت بینابینی و آتروفی سلول های عضلانی بود (شکل‌های 2 و 3) که با نتایج گزارش شده در مطالعات پیشین هم­خوانی داشت. اکتاس و همکاران در سال 2015، ضایعاتی مانند دژنراسیون هیالین و نکروز میوکاردوسیت‌ها همراه با نفوذ سلول‌های تک‌هسته‌ای در بافت بینابینی متشکل از لنفوسیت‌ها، ماکروفاژ‌ها و تعداد کمی نوتروفیل را در بافت قلب گوساله‌های شیرخوار مبتلا به تب برفکی گزارش کردند (Aktas et al., 2015). در مطالعه انجام­شده توسط تونکا و همکاران در سال 2009، نکروز گسترده میوکاردوسیت‌ها، آتروفی فیبرهای عضلانی همراه با نفوذ گسترده سلول‌های التهابی شامل لنفوسیت‌ها و ماکروفاژ‌ها از مهمترین تظاهرات پاتولوژیک گزارش شده در بافت قلب گوساله‌های مبتلا به تب برفکی بود (Tunca et al., 2008). همچنین الکساندرسن و موات در سال 2005، میوکاردیت لنفوسیتوسیتی همراه با دژنراسیون هیالین، نکروز میوسیت‌ها و نفوذ سلول های تک‌هسته‌ای در بافت بینابینی از مهمترین علائم پاتولوژیک در حیوانات مبتلا به تب برفکی برشمردند (Alexandersen and Mowat, 2005).

در بررسی تغییرات سرمی تروپونین I، افزایش معنی‌دار تروپونین در گروه مبتلا به تب برفکی در مقایسه با گروه کنترل سالم مشاهده شد که افزایش مقدار این آنزیم با شدت ضایعات پاتولوژیک ارتباط مستقیم داشت (جدول 2). افزایش سرمی تروپونین قلبی، به دنبال نشت آن از میوکاردوسیت­های آسیب­دیده اتفاق می­افتد. حساسیت 100 درصد این آنزیم برای بافت قلب، تروپونین را به عنوان یک ابزار بیوشیمیایی و ایمونوهیستوشیمیایی برای تشخیص آسیب قلبی معرفی می­کند (Ford, 2016; Alaour et al., 2018). در سال‌‌های اخیر استفاده از تروپونین در دامپزشکی توسعه یافته­است و کارایی و اهمیت اندازه‌گیری آن در مطالعات متعددی به اثبات رسیده است و بسیاری از محققین اندازه‌گیری این آنزیم را در موارد مشکوک به میوکاردیت پیشنهاد داده‌اند. باسبوگان و همکاران در سال 2010، غلظت سرمی تروپونین را در نشخوارکنندگان سالم تعیین کردند. در این مطالعه، غلظت تروپونین I در گاو 0-23/0 نانوگرم/میلی‌لیتر (میانگین 18/0 نانوگرم/میلی‌لیتر)، در گوسفند 0-21/0 نانوگرم/میلی‌لیتر (میانگین 15/0 نانوگرم/میلی‌لیتر) و در بز 0-24/0  نانوگرم/میلی‌لیتر (میانگین 20/0 نانوگرم/میلی‌لیتر) به دست آمد (Basbugan et al., 2010). در گزارش دیگری غلظت تروپونین در نشخوارکنندگان سالم حدود 0-04/0 نانوگرم/میلی‌لیتر گزارش شده‌است که این مقدار در حیوانات مبتلا به پریکاردیت با دلیل نامشخص، تا 89/0 نانوگرم/میلی‌لیتر افزایش می­یابد (Gunes et al., 2008). در مطالعه حاضر، میزان متوسط تروپونین در حیوانات سالم 02/0 نانوگرم/میلی‌لیتر بود که تاییدی  بر سالم بودن حیوانات مورد استفاده می‌باشد  (جدول 2). تونکا و همکاران در سال 2008، در مطالعه‌ای تغییرات تروپونین I در خون و بافت قلب گوساله­های مبتلا به تب برفکی را ارزیابی کردند. در این مطالعه افزایش سطح تروپونین I از 7/11 تا 4/16 نانوگرم/میلی‌لیتر در نمونه­های مبتلا به تب برفکی متغیر بود، در حالی­که میانگین غلظت تروپونین در گوساله­های سالم 24/0 نانوگرم/میلی‌لیتر گزارش شده است. نتایج این تحقیق نشان­دهنده ارتباط مستقیم بین شدت ضایعات پاتولوژیک و افزایش غلظت سرمی تروپونین در حیوانات مبتلا بود (Tunca et al., 2008). در مطالعه دیگری، گونس و همکاران در سال 2010، میزان دژنراسیون میوکارد را با استفاده از سنجش تروپونین و یافته­های هیستوپاتولوژی در بره‌های مبتلا به بیماری عضله سفید مورد ارزیابی قرار دادند. این محققین نشان دادند که کیت‌های انسانی سنجش تروپونین می­توانند به طور موثری آسیب میوکارد را در حیوانات تشخیص دهند و بنابراین توسط دامپزشکان برای تأیید وجود ضایعات قلبی مورد استفاده قرار گیرند (Gunes et al., 2010). همچنین، کاراپینار و همکاران در سال 2010 در مطالعه­ای تغییرات غلظت پلاسمایی تروپونین I را در بره­های مبتلا به میوکاردیت مورد ارزیابی قرار دادند. در این مطالعه، میانگین غلظت پلاسمایی تروپونین قلبی I در بره­های مبتلا و سالم به ترتیب 78/146 و 013/0 میکروگرم/لیتر به دست آمد. این محققین افزایش تروپونین را ناشی از نشت و پارگی سلول‌های قلبی دانستند (Karapinar et al., 2010). وارگا و همکاران در سال 2009، همبستگی غلظت تروپونین I و آسیب قلبی ناشی از مسمومیت با موننسین در گاو را گزارش کردند. در این مطالعه، افزایش قابل‌توجه تروپونین متناسب با شدت ضایعات هیستوپاتولوژیک به خصوص شدت نکروز در میوکارد بود (Varga et al., 2009). علاوه بر مطالعات ذکرشده، افزایش غلظت سرمی تروپونین به دنبال آسیب قلبی در گاوهای مبتلا به ورم پستان حاد و گاوهای شیری مبتلا به متریت سپتیک نیز گزارش شده است (Shaw et al., 2004; Diniz et al., 2008). همچنین افزایش غلظت سرمی تروپونین با طیف بین 3/4 تا 9/5 میکروگرم/لیتر در اسب‌های مبتلا به نکروز چندکانونی میوکارد مشاهده شده­است (Cornelisse et al., 2000; Schwarzwald et al., 2003). از بررسی مطالعات انجام­شده و نتایج مطالعه حاضر چنین می‌توان برآورد کرد که اندازه‌گیری تروپونین علاوه بر داشتن ارزش تشخیصی، از دیدگاه فنی نیز بسیار آسان و ارزان است. همچنین، افزایش غلظت سرمی این آنزیم در بافت مستقیماً مربوط به شدت ضایعات است که خود انعکاسی از شدت دژنراسیون و نکروز سلولی می‌باشد (Lim et al., 2005). نکته حائز اهمیت دیگر تفاوت در سطح نرمال و همچنین تفاوت در غلظت این آنزیم در بیماری‌های مختلف و مطالعات متفاوت است. این تفاوت­ها ممکن است به دلیل تفاوت در روش­های سنجش آنزیم و معیارهای اعمال­شده، استفاده از دستگاه های آنالیزور شیمیایی مختلف یا استفاده از آنتی­بادی­های متفاوت باشد (Apple, 2001).

در بررسی میزان آنزیم لاکتات دهیدروژناز بین دو گروه سالم و بیمار، میزان سرمی آنزیم لاکتات دهیدروژناز در گروه بیمار بصورت معنی‌داری بیشتر از گروه سالم بود. اما در بررسی بین گروه‌های مختلف براساس شدت ضایعات پاتولوژیک، هرچند میزان این آنزیم در گروه دارای ضایعات شدید بیشتر از دو گروه دیگر بود ولی اختلاف بین گروه‌ها معنی‌دار نبود  (جدول 2). لاکتات دهیدروژناز در شرایط ایجاد آسیب در عضلات اسکلتی و قلبی و همچنین آسیب سلول­های کبدی افزایش می­یابد. مقادیر مرجع برای لاکتات دهیدروژناز درگاو 692-1445 واحد/لیتر، در گوسفند 60-440 واحد/لیتر و در بز 123-393 واحد/لیتر ذکر شده­است. هرچند عنوان شده که در گروه­های سنی بالاتر بعلت تغییرات فیزیولوژیک، این مقادیر ممکن است متفاوت باشند  (Turgut, 2000). باسبوگان و همکارن در سال 2010، مقدار نرمال این آنزیم را در گاو، گوسفند و بز بترتیب 4/933، 1/450 و 8/327 واحد/لیتر گزارش کرده‌اند. در این گزارش نیز تغییرات سنی باعث تغییر گسترده‌ای در میزان لاکتات دهیدروژناز شده­است (Basbugan et al., 2010). در مطالعه انجام­شده توسط تونکا و همکاران در سال 2009، مقدار سرمی آنزیم لاکتات دهیدروژناز در بره‌های مبتلا به بیماری عضله سفید، 77/228 واحد/لیتر و در حیوانات سالم 47/125 واحد/لیتر گزارش شده‌است (Tunca et al., 2009). تونکا و همکاران در سال 2008 در مطاله‌ای روی گوساله های مبتلا به تب برفکی مقدار لاکتات دهیدروژناز را در گروه سالم 23±109 واحد/لیتر و در حیوانات بیمار 29±298 واحد/لیتر گزارش کردند (Tunca et al., 2008). همانطور که مشخص است دامنه تغییرات این آنزیم در مطالعات مختلف بسیار متغیر است. همچنین به دلیل کمبود اختصاصیت لاکتات دهیدروژناز و افزایش غلظت این آنزیم در موارد متعددی مانند ضایعات وارد شده به عضلات اسکلتی و قلب و آسیب سلول­های کبدی، تفسیر آن مشکل است.

در بررسی میزان کراتین‌کیناز بین دو گروه سالم و بیمار، میزان سرمی کراتین‌کیناز در گروه بیمار بصورت معنی‌داری بیشتر از گروه سالم بود. همچنین افزایش میزان این آنزیم با شدت ضایعات نسبت مستقیم داشت، به­طوری­که میزان آن در گروه ضایعات شدید از دو گروه دیگر بصورت معنی‌داری بیشتر بود  (جدول 2). کراتین کیناز آنزیمی است که به مقدار زیاد در عضلات مخطط یافت می­شود و افزایش سطح آن در خون نشان دهنده آسیب به عضلات اسکلتی و یا قلبی است. مقدار طبیعی کراتین کیناز در گاو 44-228 واحد/لیتر، در گوسفند 5/97-39 واحد/لیتر و در بز کمتر از 200 واحد/لیتر می­باشد (Humann-Ziehank et al., 2007). هرچند در مطالعه باسبوگان و همکارن در سال 2010، مقدار نرمال این آنزیم در گاو، گوسفند و بز بترتیب 71/56، 57/61 و 96/45 واحد/لیتر گزارش شده است. در مطالعه انجام­شده توسط تونکا و همکاران در سال 2009، مقدار سرمی آنزیم کراتین کیناز در بره‌های مبتلا به بیماری عضله سفید، 16/261 واحد/لیتر گزارش شد (Tunca et al., 2009). همچنین در مطالعه انجام­شده توسط وارگا و همکاران در سال 2009 بر پارامترهای بیوشیمیایی در گاوهای مسموم شده با موننسین، مقدار این آنزیم در 96، 120 و 144 ساعت پس از مسمومیت بترتیب 367، 565 و 2114 واحد/لیتر گزارش شده است. هر چند در مطالعه ذکرشده، افزایش قابل­توجهی در غلظت سرمی کراتین کیناز مشاهده شده، ولی این محققین ارزیابی تروپونین I را ارجح‌تر دانسته‌ و عنوان کرده‌اند که کراتین کیناز اختصاصیت کمی برای تشخیص آسیب قلبی و شدت ضایعات پاتولوژیک دارد (Varga et al., 2009). در مقایسه با کراتین کیناز، CK-MB، یک ایزوآنزیم کراتین کیناز است که دارای اختصاصیت بالاتری برای آسیب‌های میوکارد است (Costa et al., 2008). در مطالعه حاضر، CK-MB اندازه­گیری نشد، بنابراین اظهار نظر در مورد ارزش تشخیصی این آنزیم در بیماری تب برفکی، امکان­پذیر نیست.

هرچند اندازه‌گیری لاکتات دهیدروژناز و کراتین کیناز و ایزوآنزیم­های آن­ها به عنوان بیومارکرهای کلاسیک در ضایعات قلبی مورد استفاده قرار می‌گیرند، ولی باید در نظر داشت که این بیومارکرها اختصاصی نیستند و در آسیب­های مربوط به عضلات اسکلتی نیز افزایش می­یابند و استفاده مؤثر از این آنزیم­ها به دلیل عدم اختصاصیت بافتی و حساسیت پایین، محدود است (O'Brien, 2008).

در بررسی میزان میوگلوبین بین دو گروه سالم و بیمار در مطالعه حاضر، میزان میوگلوبین در گروه بیمار بصورت معنی‌داری بیشتر از گروه سالم بود. در بررسی بین گروه‌های مختلف براساس شدت ضایعات پاتولوژیک، هرچند افزایش میزان میوگلوبین با شدت ضایعات ارتباط مستقیم داشت ولی اختلاف بین گروه‌ها معنی‌دار نبود  (جدول 2). میوگلوبین به میزان قابل توجهی از آنزیم تروپونین کوچکتر است و از این رو قبل از آن در خون آزاد شده و افزایش می‌یابد. با این حال، میوگلوبین دارای نقص اختصاصیت بافتی است و در آسیب‌های عضلانی نیز افزایش می­یابد. بنابراين استفاده از آن به عنوان بيومارکر قلبی، مستلزم حذف ضایعات عضلات اسکلتی است. قابل ذکر است که میوگلوبین در مقایسه با کراتین کیناز و لاکتات دهیدروژناز اختصاصیت و حساسیت بیشتری دارد و بررسی آن نسبت به آنزیم‌های ذکرشده ارجح‌تر است (O'Brien, 2008).

راديكال‌هاي آزاد و در رأس آن­ها تركيبات راديكال‌هاي فعال اكسيژن، جزء مهمترين عوامل شكل‌گيري استرس اكسيداتيو هستند. تولید بیش از حد رادیکال‌های فعال اكسيژن می‌تواند به ماکرومولکول‌هایی مانند اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها و لیپیدها آسیب برساند و سبب تغييرات ساختماني و كاهش فعاليتشان گردد­، که در نهایت منجر به آسیب بافتی در بیماری‌های مختلف مزمن و دژنراتیو می شود (Phaniendra et al., 2015). در مطالعه حاضر، در بررسی میزان راديكال‌هاي فعال اكسيژن بین دو گروه سالم و بیمار، میزان راديكال‌هاي فعال اكسيژن در گروه بیمار بصورت معنی‌داری بیشتر از گروه سالم بود. در بررسی بین گروه‌های مختلف براساس شدت ضایعات پاتولوژیک، هرچند افزایش میزان راديكال‌هاي فعال اكسيژن با شدت ضایعات ارتباط مستقیم داشت ولی اختلاف بین گروه‌ها معنی‌دار نبود  (جدول 2). همسو با این نتایج، تاثیر  افزایش سطح راديكال‌هاي فعال اكسيژن در پاتوژنز بیماری تب برفکی در گاو قبلا به اثبات رسیده­است (Bozukluhan et al., 2013).

به­طور كلي نتایج پژوهش حاضر نشان داد که افزایش سطح سرمی تروپونین I، کراتین کیناز، لاکتات دهیدروژناز، راديكال‌هاي فعال اكسيژن و میوگلوبین می­تواند به طور بالقوه شواهدي جامع در مورد آسیب­های قلبي در طی تب برفکی در بره‌ها ارائه دهد. افزایش بیومارکرهای قلبی در این مطالعه با شدت و وسعت پاتولوژیک ایجاده شده در قلب حیوانات مبتلا نسبت مستقیم داشت و در موارد ضایعات شدید افزایش این پارامترها بویژه تروپونین I، قابل ملاحظه بود. به نظر می‌رسد، اندازه­گیری تروپونین I سرم دارای اختصاصیت و حساسیت بالایی برای تشخیص آسیب­ قلبی در بره‌های مبتلا به تب برفکی است و ممکن است اولین گام مهم در جهت طراحی روش­های جدید برای تشخیص میوکاردیت ناشی از تب برفکی باشد. در حیواناتی که از نظر بالینی مشكوك به میوکاردیت هستند، گرفتن تاریخچه گله، معاینات بالینی دقیق، علائم کالبدگشایی و اندازه­گیری تروپونین I، می‌تواند در تشخیص بیماری کمک کننده باشد.

 

سپاسگزاری

این مقاله برگرفته از پایان نامه خانم زهرا جعفرنیا (کد پایان‌نامه: 21919) در دوره دکتری عمومی دامپزشکی می‌باشد. نویسندگان مراتب سپاس و قدردانی خود را از مسئولان محترم آزمایشگاه پاتولوژی دامپزشکی دانشگاه رازی اعلام می‌نمایند.

 

تعارض منافع

نویسندگان اعلام می دارند که هیچگونه تعارض منافع ندارند.

 

منابع

● Aktas, M.S., Ozkanlar, Y., Oruc, E., Sozdutmaz, I. and Kirbas A. (2015) Myocarditis associated with foot-and-mouth disease in suckling calves. Veterinarski Arhiv, 85(3): 273-282.

● Alaour, B., Liew, F. and Kaier, T.E. (2018). Cardiac Troponin - diagnostic problems and impact on cardiovascular disease. Annals of medicine, 50(8): 655-665.

● Alexandersen, S. and Mowat, N. (2005). Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis. Current topics in microbiology and immunology, 288: 9-42.

● Apple F.S. (2001). Cardiac troponin assays: analytical issues and clinical reference range cutpoints. Cardiovascular Toxicology, 1(2): 93-98.

● Aslani, M.R., Mohri, M. and Movassaghi A.R. (2013). Serum troponin I as an indicator of myocarditis in lambs affected with foot and mouth disease. Veterinary Research Forum, 4(1): 59-62.

● Basbugan, Y., Agaouglu, Z. and Yuksek, N. (2010). An Investigation on Serum Troponin Concentration in Healthy Ruminants. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 16(4): 641-645.

● Bozukluhan, K., Atakisi, E. and Atakisi, O. (2013). Nitric Oxide Levels, Total Antioxidant and Oxidant Capacity in Cattle with Foot-and-Mouth-Disease. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 19 (1): 179-181. 

● Cornelisse, C.J., Schott, H.C., Olivier, N.B., Mullaney, T.P., Koller, A., Wilson, D.V., et al. (2000). Concentration of cardiac troponin I in a horse with a ruptured aortic regurgitation jet lesion and ventricular tachycardia. Journal of the American Veterinary Medical Association, 217(2): 231-235.

● Costa, T.N., Cassaro Strunz, C.M., Nicolau, J.C. and Gutierrez, P.S. (2008). Comparison of MB fraction of creatine kinase mass and troponin I serum levels with necropsy findings in acute myocardial infarction. The American Journal of Cardiology, 101(3): 311-314.

● Ding, Y.Z., Chen, H.T., Zhang, J., Zhou, J.H., Ma, L.N., Zhang, L., et al. (2013). An overview of control strategy and diagnostic technology for foot-and-mouth disease in China. Virology Journal, 10(1): 78-84.

● Fartashvand, M., Derangian, A. and Kaveh, A. (2013). Evaluation of cardiac troponin I alterationsin dairy cattle with septicmetritis. Veterinary Clinical Pathology, 7(27): 239-248. [In Persian]

● Fllah, M., Fartashvand, M., Kouchakzadehomran, H. and Kaveh, A. (2016). Evaluation of cardiac injury biomarkers in cattle with acute clinical mastitis. Veterinary Clinical Pathology, 10(1): 53-59. [In Persian]

● Ford, I., Shah, A.S., Zhang, R., McAllister, D.A., Strachan, F.E., Caslake, M., et al. (2016). High-Sensitivity Cardiac Troponin, Statin Therapy, and Risk of Coronary Heart Disease. Journal of the American College of Cardiology, 68(25): 2719-2728

● Gunes, V., Atalan, G., Citil, M. and Erdogan, H.M. (2008). Use of cardiac troponin kits for the qualitative determination of myocardial cell damage due to traumatic reticuloperitonitis in cattle. The Veterinary Record, 162(16): 514-517.

● Gunes, V., Ozcan, K., Citil, M., Onmaz, A.C. and Erdogan, H.M. (2010). Detection of myocardial degeneration with point-of-care cardiac troponin assays and histopathology in lambs with white muscle disease. Veterinary Journal, 184(3): 376-378.

● Humann-Ziehank, E., Ganter M., Hennig-Pauka, I. and Binder, A. (2007). Trace mineral status and liver and blood parameters in sheep without mineral supply compared to local roe deer (Copreolus capreolus) popilations. Small Ruminant Research, 75(2-3): 185-191

● Jafari Dehkordi, A., Mohebbi, A.N. and Balali Dehkordi, Sh. (2014). Evaluation of dysrhythmias and myocardial biomarkers in high and low-yielding dairy cows. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 8(2): 101-109.

● Jamal, S.M., and Belsham, G.J. (2013). Foot-and-mouth disease: past, present and future. Veterinary Research, 44(1): 116-130.

● Karapinar, T., Dabak, D.O., Kuloglu, T. and Bulut, H. (2010). High cardiac troponin I plasma concentration in a calf with myocarditis. Canadian Veterinary Journal, 51(4): 397-399.

● Lim, B.K., Shin, J.O., Choe, S.C., Choi, S. W., Jeong, J.O., Seong, I.W., et al. (2005). Myocardial injury occurs earlier than myocardial inflammation in acute experimental viral myocarditis. Experimental & Molecular Medicine, 37(1): 51-57.

● Lu, Z., Yu, S., Wang, W., Chen, W., Wang, X., Wu, K., et al. (2022). Development of Foot-and-Mouth Disease Vaccines in Recent Years. Vaccines, 10(11): 1817-1834.

● O'Brien, P.J. (2008). Cardiac troponin is the most effective translational safety biomarker for myocardial injury in cardiotoxicity. Toxicology, 245(3): 206-218.

● Reef, V.B. and McGuirk, S.M. (2002). Diseases of the cardiovascular system. In: Large Animal Internal Medicine. Smith, B.P. editor. 3rd ed., St. Louis: Mosby Co, pp: 443-478.

● Schwarzwald, C.C., Hardy, J. and Buccellato, M. (2003). High cardiac troponin I serum concentration in a horse with multiform ventricular tachycardia and myocardial necrosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 17(3): 364-368.

● Paton, D.J., Gubbins, S. and King, D.P. (2018). Understanding the transmission of foot-and-mouth disease virus at different scales. Current Opinion in Virology, 28(6): 85-91.

● Phaniendra, A., Jestadi, D.B. and Periyasamy, L. (2015). Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases. Indian Journal of Clinical Biochemistry, 30(1):11-26.

● Tolouei, M., Daneshvar, A., Tayefi-nasrabadi, H. and Madadgar, O. (2021). Clinical evaluation of the effect of hydroalcoholic extract of Hypericum perforatum on the healing of oral lesions of Foot and mouth disease in cattle. Veterinary Clinical Pathology, 15(1): 61-73. [In Persian]

● Tunca, R., Erdogan, M.H., Sozmen, M., Citil M., Devrim, A.K., Erginsoy, S., et al. (2009). Evaluation of Cardiac Troponin I and Inducible Nitric Oxide Synthase Expressions in Lambs with White Muscle Disease. Turkish Journal of Veterinary & Animal Sciences, 33(1): 53-59.

● Tunca, R., Sozmen, M., Erdogan, H., Citil, M., Uzlu, E., Ozen, H., et al. (2008). Determination of cardiac troponin I in the blood and heart of calves with foot-and-mouth disease. Journal of Veterinary Diagnostic, 20(5): 598-605.

Turgut, K. (2000). Veterinary clinic laboratory diagnosis. Ankara Bahcıvanlar Basim Evi. pp, 1143-1153.

● Undhad, V.V., Fefar, D.T., Jivani, B.M., Gupta, H., Ghodasara, D.J., Joshi, B.P., et al. (2012). Cardiac troponin: an emerging cardiac biomarker in animal health. Veterinary World, 5(8): 508-511.

● Varga, A., Schober, K. E., Holloman, C.H., Stromberg, P.C., Lakritz, J. and Rings, D.M. (2009). Correlation of serum cardiac troponin I and myocardial damage in cattle with monensin toxicosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 23(5): 1108-1116.

● Wong, C.L., Yong, C.Y., Ong, H. K., Ho, K.L. and Tan, W.S. (2020). Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease. Frontiers in Veterinary Science, 7: 477-501.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

209