جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از موشهای موجود در یک دامداری‌ دارای راکتور سلی استان تهران

محورهای موضوعی : باکتری شناسی

خشایار منصوری ¹ , نادر مصوری ² , مهدی بابائی ³ , شجاعت دشتی پور ⁴

1 - دکترای حرفه‌ای دامپزشکی، دانشكده دامپزشکی، واحد گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی، گرمسار، سمنان، ایران
2 - 2- دانشیار میکروبیولوژی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
3 - کارشناس ارشد بیوشیمی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران
4 - کارشناس ارشد بیوتکنولوژی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

تاریخ دریافت : 1399/12/13 تاریخ پذیرش : 1403/05/17 تاریخ انتشار : 1402/12/28

کلید واژه: سل, موش, مایکوباکتریوم, RFLP-PCR , RD-تایپینگ,

چکیده مقاله :

کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، عامل بیماری سل می‌باشد که باعث عوارض و مرگ و میر به ویژه در کشورهای در حال توسعه است. بررسی احتمال سرایت مایکوباکتریوم به حیواناتی مانند موش حائز اهمیت می‌باشد، چرا که در اثر انتقال باکتری به موش، جمعیت موش‌های آلوده در دامداری زیاد می‌شود و امکان حذف کل جمعیت دامی واحد را فراهم می‌سازد. از این رو، ابزار انگشت نگاری DNA برای بهبود تشخیص سل توسعه یافته‌اند و از تکنیک‌های تایپینگ مولکولی برای تشخیص و پیگیری گسترش آن استفاده می‌شود. هدف از این مطالعه جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم از موش‌های موجود در دامداری‌های دارای راکتور سلی بود. پنج عدد موش از گاوداری آلوده به مایکوباکتریوم بوویس در سال 1397 انتخاب شدند. جهت بررسی وجود مایکوباکتریوم، نمونه‌ها در محیط لوین‌اشتاین-جانسون کشت داده شدند. برای تعیین هویت جدایه‌ها از تکنیک  PCR براساس قطعه16S rRNA  وIS6110  استفاده گردید. در نهایت، با استفاده از RD-تایپینگ گونه مایکوباکتریوم تعیین هویت شد. با کشت نمونه‌ها و بررسی لام حاصل از آن مشخص شد که پنج موش آلوده با مایکوباکتریوم بودند. PCR  برای16S rRNA  و IS6110 به ترتیب باند 543 و 245 جفت‌باز را نشان داد که تعلق جدایه‌ها به کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را اثبات نمود. تکنیک RD-تایپینگ وجود مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در جدایه‌ها را تایید کرد. از این مطالعه نتیجه گیری شد که حیواناتی مانند موش می‌توانند باعث انتقال گونه‌های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به فارم‌ها و سایر موجودات زنده شوند.

چکیده انگلیسی:

Mycobacterium tuberculosis complex, the agent of tuberculosis, causes morbidity and mortality particularly in developing countries. It is important to investigate the possibility of mycobacterium transmission to animals such as mice, because as a result of the bacterial transmission to mice, the population of infected mice increases in animal husbandry and makes it possible to eliminate the entire livestock population.

DNA-fingerprinting tools have been developed to improve tuberculosis case detection and control. Molecular typing techniques allow to detect and follow M. tuberculosis complex. The aim of this study was to isolate and identify of Mycobacterium from mice with tuberculosis reactors. Five mice are selected from a Mycobacterium bovis-infected farm in 2019. To investigate the presence of Mycobacterium, the samples are cultured in Löwenstein-Jensen medium. PCR technique based on 16S rRNA and IS6110 fragment is used to identity of the isolates.  Finally, Mycobacterium species are identified using RD-typing. After examining the resulting slide from the cultured samples, it is found that five mice are infected with Mycobacterium. Results of 16S rRNA and IS6110 PCR analysis shows the presence of 543 and 245 bp bands respectively, which supports that the isolates belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex. The RD-typing technique confirms the presence of Mycobacterium tuberculosis in isolates. Animals such as mice can transmit various species of Mycobacterium tuberculosis complex to other farm animals and living organisms.

منابع و مأخذ:

Akbarein, H., Bahonar, A., Bokaie, S., Mosavar, N., Rahimi-Foroushani, A., Sharifi, H., Makenali, A.S., Rokni, N.D., Marhamati-Khameneh, B. and Broumanfar, S. (2014). Determinants of bovine Tuberculosis in dairy farms covered by the tuberculin screening test: A herd level case control study. Iranian Journal of Epidemiology, 10: 15-24.
Alizadeh, K., Mosavari, N. and Nazari, R. (2018). Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis complex from rodents of infected cattle husbandry. Veterinary Researches and Biological Products, 31: 74-86. https://doi.org/10.22092/vj.2017.110383.1302
Barberis, I., Bragazzi, N.L., Galluzzo, L. and Martini, M. (2017). The history of tuberculosis: from the first historical records to the isolation of Koch's bacillus. Journal of Preventive Medicine and Hygiene, 58: 9-12. PMCID: PMC5432783
Costello, E., O'Grady, D., Flynn, O., O'Brien, R., Rogers, M., Quigley, F., Egan, J. and Griffin, J. (1999). Study of restriction fragment length polymorphism analysis and spoligotyping for epidemiological investigation of Mycobacterium bovis infection. Journal of Clinical Microbiology, 37: 3217-3222. https://doi.org/10.1128/JCM.37.10.3217-3222.1999
Ereqat, S., Nasereddin, A., Levine, H., Azmi, K., Al-Jawabreh, A., Greenblatt, C.L., Abdeen, Z. and Bar-Gal, G.K. (2013). First-time detection of Mycobacterium bovis in livestock tissues and milk in the West Bank, Palestinian Territories. PLoS neglected tropical diseases, 7: 1-7. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002417
Kipar, A., Burthe, S.J., Hetzel, U., Rokia, M.A., Telfer, S., Lambin, X., Begon, M. and Bennettet, M. (2014). Mycobacterium microti tuberculosis in its maintenance host, the field vole (Microtus agrestis): characterization of the disease and possible routes of transmission. Veterinary Pathology, 51: 903-914. https://doi.org/10.1177/0300985813513040
Lekko, Y. M., Ooi, P. T., Omar, S., Mazlan, M., Ramanoon, S.Z., Jasni, S., Jesse, F. and Che-Amat, A. (2020). Mycobacterium tuberculosis complex in wildlife: Review of current applications of antemortem and postmortem diagnosis. Veterinary world, 13, 1822-1836. https://doi.org/10.14202/vetworld.2020.1822-1836. PMID: 33132593
Loni, R., Mosavari, N., Tadayon, K., Keshavarz, R., Ghaem-Maghami, S., Dashtipour, S. and Mohammad Taheri, M. (2017). Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria from rodents of infected cattle farms in Khuzestan province. Journal of Veterinary Microbiology, 13: 109-119.
Moradi, E., Mosavari, N., Tebianian, M., Tadayon, K., Ghaderi, R., Soleymani-Babadi, K., Mohammad Taheri, M., Dashtipour, S., Loni, R., Moradi Garavand, M., Keshavarz, P., Azarvandi, A. and Aref Pajoohi, R. Pest rodents as the essential elements of Mycobacterium bovis controlling programs. International Journal of Mycobacteriology, 4: 137-144. https://doi.org/10.1016/j.ijmyco.2014.09.007
Moravkova, M., Slany, M., Trcka, I., Havelkova, M., Svobodova, J., Skoric, M., Heinigeova, B. and Pavlik, I. (2011). Human-to-human and human-to-dog Mycobacterium tuberculosis transmission studied by IS6110 RFLP analysis: a case report. Veterinární Medicína, 56: 314-317.
Mosavari, N., Karimi, A., Tadayon, K., Shahhosseini, G., Zavaran Hosseini, A. and Babaie, M. (2021). Evaluation of heating and irradiation methods for production of purified protein derivative (PPD) of Mycobacterium tuberculosis. Archives of Razi Institute, 75: 439-449. https://doi.org/10.22092/ari.2019.123082.1238
Palmer, M.V. (2006). Mycobacterium bovis infection in animals and humans. Emerging Infectious Disease, 12: 1306-1310. https://doi.org/10.3201/eid1208.060526
Quinn, P.J., Markey, B.K., Carter, M.E., Donnelly, W.J. and Leonard, F.C. (2002). Veterinary microbiology and microbial disease. 2st Edition. Iowa State University Press: 44-56.
Tortoli, E., Gitti, Z., Klenk, H.P., Lauria, S., Mannino, R. and Mantegani, P. (2013). Survey of 150 strains belonging to the Mycobacterium terrae complex and description of Mycobacterium engbaekii sp. nov., Mycobacterium heraklionense sp. nov. and Mycobacterium longobardum sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63: 401-411. https://doi.org/10.1099/ijs.0.038737-0
van Soolingen, D., de Haas, P.E., Kremer, K. (2001). Restriction fragment length polymorphism typing of mycobacteria. Methods in Molecular Medicine, 54: 165-203. https://doi.org/10.1385/1-59259-147-7:165. PMID: 21341076.
Warren, R.M., Gey van Pittius, N.C., Barnard, M., Hesseling, A., Engelke, E., de Kock, M., Gutierrez, M.C., Chege, G.K., Victor, T.C., Hoal, E.G. and van Helden, P.D. (2006). Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex by PCR amplification of genomic regions of difference. The International Journal of Tuberculosis And Lung Disease, 10: 818-822. PMID: 16850559

متن کامل:



 

 

 

نشریه میکروبیولوژی‌ دامپزشکی دوره نوزدهم، شماره دوم،پاییز و زمستان 1402،  پیاپی 47: 75-66

 

 

 

 

مقاله پژوهشی

جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از موش‌های موجود در یک دامداری‌ دارای راکتور سلی استان تهران

خشایار منصوری1، نادر مصوری2، مهدی بابائی3، شجاعت دشتی‌پور4

1-       دکترای حرفه‌ای دامپزشکی، دانشكده دامپزشکی، واحد گرمسار، دانشگاه آزاد اسلامی، گرمسار، سمنان، ایران

2-       دانشیار میکروبیولوژی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

3-       کارشناس ارشد بیوشیمی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

4-       کارشناس ارشد بیوتکنولوژی، آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

تاریخ دریافت: 13 / 12 / 1399  تاریخ پذیرش: 17 / 05 / 1403

چکیده

کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، عامل بیماری سل می‌باشد که باعث عوارض و مرگ و میر به ویژه در کشورهای در حال توسعه است. بررسی احتمال سرایت مایکوباکتریوم به حیواناتی مانند موش حائز اهمیت می‌باشد، چرا که در اثر انتقال باکتری به موش، جمعیت موش‌های آلوده در دامداری زیاد می‌شود و امکان حذف کل جمعیت دامی واحد را فراهم می‌سازد. از این رو، ابزار انگشت نگاری DNA برای بهبود تشخیص سل توسعه یافته‌اند و از تکنیک‌های تایپینگ مولکولی برای تشخیص و پیگیری گسترش آن استفاده می‌شود. هدف از این مطالعه جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم از موش‌های موجود در دامداری‌های دارای راکتور سلی بود. پنج عدد موش از گاوداری آلوده به مایکوباکتریوم بوویس در سال 1397 انتخاب شدند. جهت بررسی وجود مایکوباکتریوم، نمونه‌ها در محیط لوین‌اشتاین-جانسون کشت داده شدند. برای تعیین هویت جدایه‌ها از تکنیک  PCR براساس قطعه16S rRNA  وIS6110  استفاده گردید. در نهایت، با استفاده از RD-تایپینگ گونه مایکوباکتریوم تعیین هویت شد. با کشت نمونه‌ها و بررسی لام حاصل از آن مشخص شد که پنج موش آلوده با مایکوباکتریوم بودند. PCR  برای16S rRNA  و IS6110 به ترتیب باند 543 و 245 جفت‌باز را نشان داد که تعلق جدایه‌ها به کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را اثبات نمود. تکنیک RD-تایپینگ وجود مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در جدایه‌ها را تایید کرد. از این مطالعه نتیجه گیری شد که حیواناتی مانند موش می‌توانند باعث انتقال گونه‌های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به فارم‌ها و سایر موجودات زنده شوند.

کلمات کلیدی: سل، موش، مایکوباکتریوم،RFLP-PCR ، RD-تایپینگ

* نویسنده مسئول : نادر مصوری 

آدرس: آزمایشگاه رفرانس سل گاوی، موسسه تحقیقات واكسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (تات)، کرج، ایران

پست الکترونیک: [e-mail]

مقدمه

سل یک بیماری مشترک بین انسان و دام است که سالانه باعث مرگ و میر بسیاری در سراسر جهان شده است و امروزه نیز یکی از معضلات بهداشت جهانی می‌باشد (3). از آنجا که کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در انسان باعث بیماری می‌شود. بنابراین، تشخیص آنها بسیار حیاتی می‌باشد. گونه‌های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، مایکوباکتریوم بویس، مایکوباکتریوم بویس BCG، مایکوباکتریوم میکروتی، مایکوباکتریوم افریکانوم، مایکوباکتریوم کانتی، مایکوباکتریوم کاپری، مایکوباکتریوم پنی‌پدی، مایکوباکتریوم مونژی، مایکوباکتریوم اوریگیس، مایکوباکتریوم سوریکاته هستند که کند رشد بوده و کلنی‌های آنها رنگدانه ندارند (7). همچنین از نظر ژنومی در سطح نوکلئوتید 9/99 درصد شبیه به هم هستند و بیشترین تفاوت آنها در پلی‌مورفیسم توالی‌های بزرگ ژنی می‌باشد (12). تقسیم‌بندی اعضاء کمپلکس بر اساس پاتوژنیستی، جغرافیای متفاوت، مقاومت و حساسیت به آنتی بیوتیک‌ها می‌باشد (1).

سل گاوي در ایران هایپواندمیک بوده و کنترل آن محدود به گاوداري‌هاي صنعتی و نیمه صنعتی است و تنها بخش محدودي از گاوهاي کل کشور تحت پوشش برنامه تست و کشتار می‌باشند. از طرفی نسبت بالایی از مسلولان انسانی مبتلا به شکل خارج ریوي سل هستند. به دلیل عدم ایجاد پاسخ در برخی از حالت‌هاي بیماري، شیوع و گسترش آن در سطح گله به شکل پنهان اتفاق است و در اثر انتقال باکتری توسط حیوانات کوچکی مانند موش بوده است. به طوری که اگر جمعیت موش‌های آلوده در دامداری زیاد گردد، در یک غفلت ناگهانی امکان حذف کل جمعیت دامی واحد را فراهم می‌سازد (1).

مایکوباکتریوم بوویس عامل حدود 1/3 درصد سل انسانی، 1/2 درصد سل ریوی و 4/9 درصد سل غیر ریوی در جهان، می‌باشد (5). گونه موش ول (Vol) و برخی از حیوانات وحشی مخزن بیماری سل می‌باشند و همین تعدد گونه ریشه‌کنی را با مشکل روبرو کرده است (1، 6 و 14). کنترل سل بخصوص سل گاوي در کشور ما محدود به گاوداري‌هاي صنعتی و نیمه صنعتی است و تنها بخش محدودي از گاوهاي کل کشور تحت پوشش برنامه تست و کشتار می‌باشند. شناسایی عوامل مؤثرمانند اندازه گله، سطح سواد دامدار، حصارکشی اطراف گاوداري، امکان ورود حیوانات وحشی به فارم، رفت و آمد آزادانه حیوانات اهلی (سگ و گربه) در فارم، وضعیت بهداشتی فارم و وجود موش، بر آلودگی گاوداري‌هاي تحت پوشش برنامه‌ غربال‌گري حائز اهمیت است. در این راستا، افزایش همه جانبه برنامه غربال‌گري بر اساس فرضیات این تحقیق، اهرم‌هاي دیگر کنترل بیماري علاوه بر تأکید بر لزوم تداوم برنامه تست و کشتار (با در نظر گرفتن حداکثر ممکن جمعیت تحت پوشش) در مناطق اقلیمی مختلف توصیه می‌شود (8).

از آنجایی که مایکوباکتریوم‌های پاتوژن دوره انکوباسیون طولانی دارند، تشخیص آزمایشگاهی آنها با مشکلاتی مواجه است به نحوی که تعیین هویت و حساسیت دارویی بین باکتری‌ها، مستلزم گذشت مدت زمان 2 تا 4 ماه می‌باشد. لذا به کارگیری روش‌های نوین جهت تشخیص سریع و دقیق این بیماری و گونه‌های مختلف آن بسیار حائز اهمیت است.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در ژنوم خود نواحی کد کننده و غیر کد کننده زیادی را از دست داده است که از این تغییرات به وجود آمده می‌توان برای شناسایی بین سویه‌های مختلف باکتری شناسایی شود. بنابراین برای آگاه شدن از خط سیر میکروارگانیسم و سویه‌ها می‌توان از تفاوت‌های ژنتیکی آنها استفاده نمود (2). در این رابطه، می‌توان از روش‌هایی مانند RD-تایپینگ استفاده نمود. با بررسی‌های انجام گرفته، مشخص شده است که در ژنوم مایکوباکتریوم‌ها مناطقی به نام منطقه حذف شده (RD) وجود دارد که وجود یا فقدان این مناطق ژنتیکی از نظر تکاملی معنا‌دار و به صورت هدفمند انجام می‌پذیرد و براساس آن می‌توان سیر تکاملی پیدایش گونه‌های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را از یک نمونه اجدادی بیان کرد. با انجام PCR و به کار گیری لوکوس‌های RD1، RD4، RD9 و RD12 امکان تشخیص افتراقی میان اعضاء کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به صورت قطعی فراهم می‌گردد (16).

امروزه تکنیک‌های جدید مولکولی زیادی وجود دارند که به شناسایی دقیق و متمایز نمودن جدایه‌های مایکوباکتریوم با ویژگی و حساسیت بالا کمک می‌کنند که در این میان می‌توان به روش‌های انگشت نگاری DNA یا آنالیز به روش پلی‌مورفیسم طولی قطعات محدود شونده (RFLP) اشاره کرد (2). با استفاده از تکتیر ژن توسط قطعه IS6110 می‌توان عضویت آن‌ها را در کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مشخص نمود. لذا هدف از این مطالعه جداسازی و تعیین هویت مایکوباکتریوم از موش‌های موجود در یک دامداری‌ دارای راکتور سلی در استان تهران می‌باشد.

مواد و روش ها

نمونه‌ها

نمونه‌ها شامل پنج عدد موش (رت وحشی) از دامداری آلوده به سل استان تهران بدست آمد که در سال 1397 تست توبرکولین گاوهای آن مثبت اعلام شده بود. نمونه‌های موش در دمای ۴ تا 8 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

کشت

به دلیل خطرناک بودن مایکوباکتریوم‌ها، کشت در آزمايشگاه رفرانس سل گاوی موسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی کرج با سطح 3 ايمني زيستي و با استفاده از هود بيولوژيك با رعايت تمامی روش‌هاي صحيح ميكروب شناسي و آزمايشگاهي (GLP) صورت گرفت. پس از انجام کشت تمام مواد آلوده ضدعفوني يا اتوکلاو شدند. ابتدا کبد، ریه و طحال از تمامی نمونه‌ها جداسازی شد و بعد از همگن‌شدن، آلودگی‌زدایی و خنثی‌سازی، بر روی محیط کشت لوین‌اشتاین‌-جانسون حاوی گلیسیرین و پیروات کشت داده شدند و سپس به مدت هشت هفته در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. با گذشت زمان انکوباسیون و ظاهرشدن به تدریج کلونی‌ها در سطح محیط‌های کشت، از تمامی کلونی‌ها لام تهیه شد و وجود باسیل‌های اسیدفست با روش ذیل نلسون توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسي قرار گرفت (11 و 13).

استخراج DNA

به روش ون‌سولينگن و همکاران DNA ژنومی نمونه‌های رشد یافته بدون هیچ‌گونه شکستگی استخراج شد (15). در این روش ابتدا سوسپانسیون تهیه شده از کلونی‌های رشد یافته تحت اثر آنزیم لیزوزیم قرار گرفتند. سپس با استفاده از سدیم دودسیل سولفات و آنزیم پروتئیناز K پیکره باکتری تخریب و DNA باکتری آزاد شد. به هر میکروتیوب سدیم کلرید 5 مولار و ستیل تری‌متیل-آمونیوم بروماید اضافه شد. در مرحله بعد ایزوآمیل الکل-کلروفرم به هر میکروتیوب اضافه گردید. سپس میکروتیوب‌ها سانتریفیوژ شدند و فاز رویی که حاوی DNA است به میکروتیوب جدید انتقال یافت. در ادامه با استفاده از ایزوپروپانول و اتانول 70 درصد سرد کلاف‌های DNA در کف میکروتیوب رسوب داده شد. در نهایت DNA استخراج شده برای استفاده در مراحل بعدی ذخیره شد. ارزیابی کیفی و کمی استخراجDNA ، به ترتیب با استفاده از الکتروفورز (Bio-Rad, USA) و دستگاه نانودراپ (Thermo scientific nanodrop 1000, USA) انجام گرفت.

آزمون‌های تعیین هویت

برای اطمینان از لحاظ جنس و قرارگيري باكتري‌های جداشده در کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، از روش PCR با تکثیر قطعه16S rRNA  و IS6110 استفاده شد (15). تکثیر در 30 چرخه، برای مراحل واسرشت سازی اولیه (95 درجه سانتی‌گراد، 10 دقیقه)، واسرشت سازی (94 درجه سانتی‌گراد، یک دقیقه)، اتصال (60 درجه سانتی‌گراد، یک دقیقه) طویل سازی (72 درجه سانتی‌گراد، یک دقیقه) و طویل سازی نهایی (72 درجه سانتی‌گراد، یک دقیقه) صورت گرفت.

در آزمون‌RD-تایپینگ‌، هر میکروتیوب شامل هفت میکرولیتر مستر میکس (آمپلیکون)، یک میکرولیتر پرایمر پیشرونده (با غلظت 5 پیکومول در هر میکرولیتر)، یک میکرولیتر پرایمر معکوس (با غلظت 5 پیکومول در هر میکرولیتر)، دو میکرولیتر DNA الگو (با غلظت 350 نانوگرم در هر میکرولیتر) و 1 میکرولیتر آب مقطر استریل با حجم نهایی در هر واکنش برابر با 12 میکرولیتر بود. تکثیردر چرخه دمایی، با دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه برای واسرشت سازی اولیه شروع شد و با دمای واسرشت سازی 94 به مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمر 62 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه و دمای طویل سازی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه ادامه یافت. این چرخه 45 مرتبه تکرار شد و با دمای نهایی طویل سازی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه پایان یافت. در آزمون های تعیین هویت، کنترل مثبت شامل مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و کنترل منفی مایکوباکتریوم اویوم بود.

آزمون RD-typing جهت تمایز اعضای کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس با استفاده از نواحی متغیر RD  که شامل چهار ناحیه RD1،  RD4،  RD9 و     RD12 می‌باشند. توالی پرایمرها (4 دسته 3 تایی) و اساس کار به روش Warren انجام گرفت (16).

یافته‌ها

 جداسازی کبد، ریه و طحال تمامی نمونه‌ها با موفقیت انجام گرفت (شکل 1). با كشت نمونه‌ها در محيط لوین‌اشتاین‌-جانسون مقادير كافي از توده باكتري بدست آمد. رشد کلنی باکتری با ظاهری خشن، مومی، فاقد رنگدانه، مورد تأیید قرار گرفت (شکل 2).

 

شکل 1- جداسازی کبد، ریه و طحال تمامی نمونه‌های موش

با استفاده از روش PCR با تکثیر قطعه16S rRNA  و IS6110، مشخص گردید که 5 نمونه کشت مثبت، به ترتیب متعلق به جنس مایکوباکتریوم (با باندی در محدوده 543 جفت باز؛ شکل 3) و کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (با باندی در محدوده 245 جفت باز؛ شکل 4) بودند.

 

شکل 2- کشت نمونه‌ها و ایجاد پرگنه‌هاي مربوط به رشد نمونه‌ها بر روي محيط لوین‌اشتاين-جانسون

 

شکل 3- الکتروفورز محصول PCR-16S rRNA (1 تا 5: نمونه‌های موش؛ کنترل مثبت: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس؛ کنترل منفی: مایکوباکتریوم اویوم، لدر: 100 جفت بازی)

 

شکل 4- الکتروفورز محصول PCR-IS6110 (1 تا 5: نمونه‌های موش؛ کنترل مثبت: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس؛ کنترل منفی: مایکوباکتریوم اویوم، لدر: 100 جفت بازی)

با استفاده از آزمون‌RD9 ، مشخص گردید که 5 نمونه مثبت، متعلق به جنس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس  (با باندی در محدوده 235 جفت باز؛ شکل 5) بودند.

 

شکل 5- الکتروفورز محصول RD9 (1 تا 5: نمونه‌های موش؛ کنترل مثبت: مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بویس؛ کنترل منفی: مایکوباکتریوم اویوم، لدر: 100 جفت بازی)

بحث و نتیجه‌گیری

سل یک بیماری مشترک می‌باشد و انسان علاوه بر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌تواند در اثر آلودگی به مایکوباکتریوم بوویس نیز به سل زئونوز مبتلا گردد. با توجه به نقش حیوانات بخصوص گاو در انتقال این بیماری به انسان، وجود این نوع سل در جامعه و میزان فراوانی آن از شاخص‌های معرف سطح بهداشت جامعه محسوب می‌گردد و به همین دلیل باید نقش حیواناتی مانند گاو یا موش را در انتقال بیماری مهم دانست (2). علی‌رغم تلاش برای درمان و ریشه‌کنی سل، متاسفانه هنوز یک بیماری مهم عفونی در سطح جامعه انسانی می‌باشد.

میزان فراوانی سل در گله‌های گاو ایران در طول 50 سال گذشته در نتیجه اجرای برنامه کنترلی و به دلیل انجام تست و کشتار در گاوهای توبرکولین مثبت روند کاهشی داشته و از 5 درصد در سال 1351 به 2/0 درصد در سال 1390 رسیده است (8). میزان وضعیت بهداشتی در کشور‌های مختلف را می‌توان از میزان آلودگی افراد آن کشور به مایکوباکتریوم بوویس تشخیص داد (8)، در انگلستان و اروپا به ترتیب این میزان 5/0 و 4/1 درصد (5) و در آمریکای لاتین بین 43/0 و 1 درصد بوده است (4).

در سال‌های اخیر با استفاده از روش‌های  PCRبا تکثیر قطعه16S rRNA  و IS6110، انتقال مایکوباکتریوم توبركلوزیس بین یک شخص با بیماری ریوی و یك حیوان بررسی شده است. در واقع با استفاده از این روش مشخص شد كه به طور مثال سگ عامل انتقال توبركلوزیس به انسان بوده است و سگ‌های بیمار قابلیت انتقال توبركلوزیس به انسان را دارند و می‌توانند به عنوان منبع انتقال توبركلوزیس به انسان مطرح باشند كه باید به این مسئله اذعان نمود، كه کنترل سل در حیوانات می‌تواند تا حد بالایی از انتقال آن در بین افراد ممانعت کند و در كاهش این بیماری موثر باشد (10).

در مطالعه حاضر نیز با استفاده از روش PCR با تکثیر قطعه16S rRNA  و IS6110، مشخص گردید که 5 نمونه کشت مثبت در موش، به ترتیب متعلق به جنس مایکوباکتریوم و کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس هستند. در نهایت با استفاده از آزمون‌RD9 ، مشخص گردید که 5 نمونه مثبت، متعلق به کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بودند. در نتیجه با توجه به این نتایج می‌توان دامدارها و دامداری‌های آلوده را شناسایی کرد و از انتقال بیماری در بین افراد ممانعت نمود.

در مطالعه لونی و همکاران در سال 2017، نقش موش در حضور عامل سل در گاوداری‌های آلوده در استان خوزستان به اثبات رسید. آن‌ها با استفاده از تست توبرکولين، از تعداد 40 کانون آلوده به سل گاوي 16 نمونه موش از دامداري‌هاي آلوده به کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس انتخاب کردند و با استفاده PCR توسط16S rRNA  جنس مايکوباکتريايي جدايه‌ها را تائيد نمودند. سپس با استفاده از قطعه الحاقي IS6110، تعلق جدايه‌ها به اعضاء کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس را مشخص کردند. لونی و همکاران، فقط عضو کمپلکس مايکوباکتريوم توبرکلوزيس را تشخیص دادند و گونه مورد نظر را تعیین نکردند. اما در مطالعه حاضر علاوه بر هم‌خوانی نتایج با پژوهش آن‌ها، گونه مورد نظر (مايکوباکتريوم توبرکلوزيس) نیز با روش RD-تایپینگ تعیین شد (8).

در مطالعه‌ای در سال 1937، توبرکولوزیس برای اولین بار درجوندگان وحشی کشف شد و همچنین در این مطالعه میزان شیوع مایکوباکتریوم میکروتی به میزان 11 درصد در Bank vole، میزان شیوع 2 درصدی در Wood mice و 5/1 درصدی در حشره خوار‌ها به دست آمد (2).

پالمر و همکاران در سال 2006، توانستند مشخص کنند که اپوسوم در انتقال مایکوباکتریوم بوویس نقش دارد و توانستند مایکوباکتریوم بوویس را در صاریغ، گورکن اروپایی، بوفالوی آفریقایی، گراز وحشی و آهوی دم سفید شناسایی کنند (12).

ارگات و همکاران در سال 2013، توانستند مایکوباکتریوم بوویس را از طریق PCR- IS6110 و اسپولیگوتایپینگ (Spoligotyping) از نمونه بافتی و شیر گاو و بز جداسازی و تعیین هویت کردند (5).

در ایران، بر روی 15 عدد موش از دامداری آلوده به مایکوباکتریوم آزمایش انجام شد که مشخص شد سه عدد از جدایه‌ها آلوده به مایکوباکتریوم میکروتی و دو عدد از جدایه‌ها آلوده به مایکوباکتریوم کانزاسی می‌باشند (9).

در مطالعه دیگر که در ایران انجام گرفت، از 100 عدد موشی که از دامداری آلوده به مایکوباکتریوم جدا شد 6 عدد از آنها آلوده به مایکوباکتریوم بوویس بودند (2).

در مطالعه اکبرین و همکاران، مشخص شد که وجود موش در انتقال و آلودگی با مایکوباکتریوم بوویس در گله‌های گاو شیری نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کند (1).

نتیجه گیری نهایی

در این مطالعه برای اولین بار مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از گاوداری آلوده به مایکوباکتریوم بوویس از طریق کبد، ریه و طحال جدا سازی شد. در این رابطه نقش موش در حضور عامل سل در گاو داری آلوده به اثبات رسید و مشخص گردید که این جدایه ها به کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس تعلق دارد، لذا اهمیت نقش جوندگانی مانند موش در سل دامی و متعاقب آن در سل انسانی به اثبات رسید. در نهایت، می‌توان اظهار داشت که اثبات مخازن نگهداری باکتری‌های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در جوندگان از نظر بهداشت عمومی و خطر گردش بیماری سل بین جوندگان، حیوانات و انسان بسیار حائز اهمیت می باشد. 

تقدیر و تشکر

نویسندگان از تمامی كسانی كه در انجام این تحقیق آنها را یاری كردند، بخصوص اعضاء آزمایشگاه رفرانس سل گاوی تشکر و قدردانی می‌كنند.

تعارض منافع

بین نویسندگان تعارض در منافع گزارش نشده است.

منابع

1.        Akbarein, H., Bahonar, A., Bokaie, S., Mosavar, N., Rahimi-Foroushani, A., Sharifi, H., Makenali, A.S., Rokni, N.D., Marhamati-Khameneh, B. and Broumanfar, S. (2014). Determinants of bovine Tuberculosis in dairy farms covered by the tuberculin screening test: A herd level case control study. Iranian Journal of Epidemiology, 10: 15-24.

2.       Alizadeh, K., Mosavari, N. and Nazari, R. (2018). Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis complex from rodents of infected cattle husbandry. Veterinary Researches and Biological Products, 31: 74-86. https://doi.org/10.22092/vj.2017.110383.1302

3.       Barberis, I., Bragazzi, N.L., Galluzzo, L. and Martini, M. (2017). The history of tuberculosis: from the first historical records to the isolation of Koch's bacillus. Journal of Preventive Medicine and Hygiene, 58: 9-12. PMCID: PMC5432783

4.       Costello, E., O'Grady, D., Flynn, O., O'Brien, R., Rogers, M., Quigley, F., Egan, J. and Griffin, J. (1999). Study of restriction fragment length polymorphism analysis and spoligotyping for epidemiological investigation of Mycobacterium bovis infection. Journal of Clinical Microbiology, 37: 3217-3222. https://doi.org/10.1128/JCM.37.10.3217-3222.1999

5.       Ereqat, S., Nasereddin, A., Levine, H., Azmi, K., Al-Jawabreh, A., Greenblatt, C.L., Abdeen, Z. and Bar-Gal, G.K. (2013). First-time detection of Mycobacterium bovis in livestock tissues and milk in the West Bank, Palestinian Territories. PLoS neglected tropical diseases, 7: 1-7. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002417

6.       Kipar, A., Burthe, S.J., Hetzel, U., Rokia, M.A., Telfer, S., Lambin, X., Begon, M. and Bennettet, M. (2014). Mycobacterium microti tuberculosis in its maintenance host, the field vole (Microtus agrestis): characterization of the disease and possible routes of transmission. Veterinary Pathology, 51: 903-914. https://doi.org/10.1177/0300985813513040

7.       Lekko, Y. M., Ooi, P. T., Omar, S., Mazlan, M., Ramanoon, S.Z., Jasni, S., Jesse, F. and Che-Amat, A. (2020). Mycobacterium tuberculosis complex in wildlife: Review of current applications of antemortem and postmortem diagnosis. Veterinary world, 13, 1822-1836. https://doi.org/10.14202/vetworld.2020.1822-1836. PMID: 33132593

8.       Loni, R., Mosavari, N., Tadayon, K., Keshavarz, R., Ghaem-Maghami, S., Dashtipour, S. and Mohammad Taheri, M. (2017). Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria from rodents of infected cattle farms in Khuzestan province. Journal of Veterinary Microbiology, 13: 109-119.

9.       Moradi, E., Mosavari, N., Tebianian, M., Tadayon, K., Ghaderi, R., Soleymani-Babadi, K., Mohammad Taheri, M., Dashtipour, S., Loni, R., Moradi Garavand, M., Keshavarz, P., Azarvandi, A. and Aref Pajoohi, R. Pest rodents as the essential elements of Mycobacterium bovis controlling programs. International Journal of Mycobacteriology, 4: 137-144. https://doi.org/10.1016/j.ijmyco.2014.09.007

10.       Moravkova, M., Slany, M., Trcka, I., Havelkova, M., Svobodova, J., Skoric, M., Heinigeova, B. and Pavlik, I. (2011). Human-to-human and human-to-dog Mycobacterium tuberculosis transmission studied by IS6110 RFLP analysis: a case report. Veterinární Medicína, 56: 314-317.

11.       Mosavari, N., Karimi, A., Tadayon, K., Shahhosseini, G., Zavaran Hosseini, A. and Babaie, M. (2021). Evaluation of heating and irradiation methods for production of purified protein derivative (PPD) of Mycobacterium tuberculosis. Archives of Razi Institute, 75: 439-449. https://doi.org/10.22092/ari.2019.123082.1238

12.       Palmer, M.V. (2006). Mycobacterium bovis infection in animals and humans. Emerging Infectious Disease, 12: 1306-1310. https://doi.org/10.3201/eid1208.060526

13.       Quinn, P.J., Markey, B.K., Carter, M.E., Donnelly, W.J. and Leonard, F.C. (2002). Veterinary microbiology and microbial disease. 2st Edition. Iowa State University Press: 44-56.

14.       Tortoli, E., Gitti, Z., Klenk, H.P., Lauria, S., Mannino, R. and Mantegani, P. (2013). Survey of 150 strains belonging to the Mycobacterium terrae complex and description of Mycobacterium engbaekii sp. nov., Mycobacterium heraklionense sp. nov. and Mycobacterium longobardum sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 63: 401-411. https://doi.org/10.1099/ijs.0.038737-0

15.       van Soolingen, D., de Haas, P.E., Kremer, K. (2001). Restriction fragment length polymorphism typing of mycobacteria. Methods in Molecular Medicine, 54: 165-203. https://doi.org/10.1385/1-59259-147-7:165. PMID: 21341076.

16.       Warren, R.M., Gey van Pittius, N.C., Barnard, M., Hesseling, A., Engelke, E., de Kock, M., Gutierrez, M.C., Chege, G.K., Victor, T.C., Hoal, E.G. and van Helden, P.D. (2006). Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex by PCR amplification of genomic regions of difference. The International Journal of Tuberculosis And Lung Disease, 10: 818-822. PMID: 16850559

17.        

 

 

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis from mice in a farm with tuberculosis reactor in Tehran province

Khashaiar Mansouri1, Nader Mosavari2, Mahdi Babaie3, Shojaat Dashtipour4

1-       PhD of Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Garmsar Branch, Islamic Azad University, Garmsar, Semnan, Iran

2-       Associate Professor of Microbiology, Reference Laboratory of Bovine Tuberculosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

3-       Master of Biochemistry, Reference Laboratory of Bovine Tuberculosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

4-       Master of Biotechnology, Reference Laboratory of Bovine Tuberculosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

Received: 03 March 2021         Accepted: 07 August 2024

Abstract

Mycobacterium tuberculosis complex, the agent of tuberculosis, causes morbidity and mortality particularly in developing countries. It is important to investigate the possibility of mycobacterium transmission to animals such as mice, because as a result of the bacterial transmission to mice, the population of infected mice increases in animal husbandry and makes it possible to eliminate the entire livestock population.

DNA-fingerprinting tools have been developed to improve tuberculosis case detection and control. Molecular typing techniques allow to detect and follow M. tuberculosis complex. The aim of this study was to isolate and identify of Mycobacterium from mice with tuberculosis reactors. Five mice are selected from a Mycobacterium bovis-infected farm in 2019. To investigate the presence of Mycobacterium, the samples are cultured in Löwenstein-Jensen medium. PCR technique based on 16S rRNA and IS6110 fragment is used to identity of the isolates. Finally, Mycobacterium species are identified using RD-typing. After examining the resulting slide from the cultured samples, it is found that five mice are infected with Mycobacterium. Results of 16S rRNA and IS6110 PCR analysis shows the presence of 543 and 245 bp bands respectively, which supports that the isolates belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex. The RD-typing technique confirms the presence of Mycobacterium tuberculosis in isolates. Animals such as mice can transmit various species of Mycobacterium tuberculosis complex to other farm animals and living organisms.

Keywords: Tuberculosis, Mice, Mycobacterium, RFLP-PCR, RD Typing

* Corresponding Author: Nader Mosavari 

Address: Associate Professor of Microbiology, Reference Laboratory of Bovine Tuberculosis, Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran, E-mail: [e-mail]