ساخت پروتئین نوترکیب آلکالین سرین پروتئاز مقاوم به شرایط قلیایی: همسانه سازی و بیان ژن باکتری باسیلوس‌ لیکنی ‌فورمیس در پلاسمید pMAL-c2X و بهینه سازی فعالیت آنزیمی آن

محورهای موضوعی : میکروبیولوژی

شاهین خوبانی ¹ , رضا نقی ها ² , احمد عریان ³ , الهام معضمیان ⁴

1 - دانشجوی دکترای تخصصی میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده کشاورزی و علوم نوین، دانشگاه آزاد واحد شیراز، شیراز، ایران
2 - دانشیار میکروب شناسی، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران
3 - استاد پاتولوژی، گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران
4 - استادیار میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، دانشکده کشاورزی و علوم نوین، دانشگاه آزاد واحد شیراز، شیراز، ایران

تاریخ دریافت : 1402/09/24 تاریخ پذیرش : 1404/08/22 تاریخ انتشار : 1403/12/29

کلید واژه: باسیلوس لیکنی ¬فورمیس, پلاسمید pMAL-c2X, سرین پروتئاز قلیایی, کلونینگ,

چکیده مقاله :

زمینه و هدف مطالعه: پروتئازهای قلیایی میکروبی در سال‌های اخیر به یک محصول مهم صنعتی و تجاری بیوتکنولوژی تبدیل‌شده است. پروتئاز قلیایی به دلیل توانایی زیاد در هیدرولیز و تحمل شرایط قلیایی، به‌طور گسترده در صنایع غذایی، شوینده و داروسازی استفاده می‌شود. باسیلوس‌ لیکنی ‌فورمیس به دلیل تولید آنزیم­های پروتئاز قلیایی مقاوم به حرارت نظر پژوهش­گران زیادی را به خود جلب کرده است. از این ‌رو، هدف از این پژوهش، کلونینگ و بیان ژن آلکالین سرین پروتئاز باکتری باسیلوس‌ لیکنی ‌فورمیس، ساخت پروتئین نوترکیب آلکالین سرین­ پروتئاز و بررسی اثر دما و pH بر فعالیت آنزیمی آن است. مواد و روش­ها: در این پژوهش، ژن آلکالین سرین پروتئاز باکتری باسیلوس‌ لیکنی ‌فورمیس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و واکنش زنجیره‌ای پلی مراز تکثیر و به کمک پلاسمید pMAL-c2X درون اشریشیا کلی سويه BL21) DH5) ترانسفورمه شد. انتقال ژن با استفاده از روش PCR بررسي و صحت رديف نوكلئوتيدي محصولات كلون شده با تعيين توالي نوكلئوتيدي تاييد گردید. سپس توان آنزیمی آلکالین سرین پروتئاز نوترکیب در pH و دماهای مختلف با روش تغییریافته Folin و Ciocalteu  بررسی گردید. نتایج: یافته­های این پژوهش نشان داد که کلونینگ ژن آلکالین سرین پروتئاز در باکتری اشریشیا کلی به شکل صحیح انجام و افزایش 343 درصدی در بیان پروتئین نوترکیب آلکالین سرین پروتئاز مشاهده گردید. از سوی دیگر، در واکنش زنجیره‌ای پلی مراز، کلونینگ ژن 1125جفت بازی آلکالین سرین پروتئاز تائید که پایداری و فعالیت بالایی در دمای بالا و pH قلیایی نشان داده شد. نتیجه گیری: لذا، تولید آنزیم پروتئاز با پایداری نسبتاً بالا در شرایط مختلف نشان‌ دهنده ارزش کاربردی مهم این تکنیک برای تولید آنزیم در صنعت و تولید در مقیاس بزرگ است.

چکیده انگلیسی:

Introduction: In recent years, microbial alkaline proteases have become an important industrial and commercial biotechnology product. Alkaline protease is widely used in food, detergent and pharmaceutical industries due to its relatively high hydrolysis ability and tolerance in alkaline conditions. Bacillus licheniformis has attracted the attention of researchers due to the production of heat-resistant alkaline protease enzymes. Therefore, the aim of this study was to clone the alkaline serine protease gene of Bacillus licheniformis into Escherichia coli in order to produce this enzyme and to investigate the effect of temperature and pH on the activity of the recombinant enzyme. Materials and methods: In this study, the alkaline serine protease gene of Bacillus licheniformis was amplified using specific primers and polymerase chain reaction (PCR). The alkaline serine protease gene was transformed into Escherichia coli BL21 (DH5) by plasmid pMAL-c2X. Gene transfer was investigated using PCR, and the cloned products' nucleotide sequence was confirmed by determining the nucleotide sequence. Then the enzymatic capacity of recombinant alkaline serine protease was investigated at different pH and temperatures with the modified method of Folin and Ciocalteu. Results: The present study showed that cloning the alkaline serine protease gene in Escherichia coli led to a 343% increase in the production of the alkaline protease enzyme. Polymerase chain reaction confirmed the cloning of the 1125 bp gene. Also, the produced enzyme showed high stability and activity at high temperatures and alkaline pH. Conclusion: Protease enzyme production with relatively high stability in different conditions shows the important application value of this technique for enzyme production in industry and large-scale production.

منابع و مأخذ:

1. Al-Dhuayan, I., Kotb, E., Alqosaibi, A. and Mahmoud, A., 2021. Histological studies on a newly isolated Bacillus subtilis D10 protease in the debridement of burn wound eschars using a mouse model. Pharmaceutics, 13(7), p.923.
2. Bhatt, H.B. and Singh, S.P., 2020. Cloning, expression, and structural elucidation of a biotechnologically potential alkaline serine protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus lehensis JO-26. Frontiers in Microbiology, 11, p.941.
3. Brahmachari, G., 2023. Biotechnology of microbial enzymes: production, biocatalysis, and industrial applications—an overview. In: Biotechnology of Microbial Enzymes, pp.1–10.
4. Chatterjee, S., 2015. Production and estimation of alkaline protease by immobilized Bacillus licheniformis isolated from poultry farm soil of 24 Parganas and its reusability. Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research, 6(1), p.2.
5. Cheng, Q., Xu, F., Hu, N., Liu, X. and Liu, Z., 2015. A novel Ca²⁺-dependent alkaline serine-protease (Bvsp) from Bacillus sp. with high fibrinolytic activity. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 117, pp.69–74.
6. England, N., 1991. pMAL™ Protein Fusion and Purification System. New England Biolabs.
7. Esakkiraj, P., Meleppat, B., Lakra, A.K., Ayyanna, R. and Arul, V., 2016. Cloning, expression, characterization and application of protease produced by Bacillus cereus PMW8. RSC Advances, 6(45), pp.38611–38616.
8. Fu, Z., Ab Hamid, S.B., Razak, C.N.A., Basri, M., Salleh, A.B. and Abd Rahman, R.N.Z., 2003. Secretory expression in Escherichia coli and single-step purification of a heat-stable alkaline protease. Protein Expression and Purification, 28(1), pp.63–68.
9. Garibyan, L. and Avashia, N., 2013. Research techniques made simple: polymerase chain reaction (PCR). The Journal of Investigative Dermatology, 133(3), p.e6.
10. Harish, B. and Uppuluri, K.B., 2018. Microbial serine protease inhibitors and their therapeutic applications. International Journal of Biological Macromolecules, 107, pp.1373–1387.
11. Jacobs, M., Eliasson, M., Uhlén, M. and Flock, J.I., 1985. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic Acids Research, 13(24), pp.8913–8926.
12. Jia, B. and Jeon, C.O., 2016. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. Open Biology, 6(8), p.160196.
13. Karray, A., Alonazi, M., Horchani, H. and Ben Bacha, A., 2021. A novel thermostable and alkaline protease produced from Bacillus stearothermophilus isolated from olive oil mill soils suitable for industrial biotechnology. Molecules, 26(4), p.1139.
14. Kieliszek, M., Pobiega, K., Piwowarek, K. and Kot, A.M., 2021. Characteristics of the proteolytic enzymes produced by lactic acid bacteria. Molecules, 26(7), p.1858.
15. Li, Y., Liu, X., Zhang, L., Ding, Z., Xu, S., Gu, Z. et al., 2019. Transcriptional changes in the xylose operon in Bacillus licheniformis and their use in fermentation optimization. International Journal of Molecular Sciences, 20(18), p.4615.
16. Mahmoud, A., Kotb, E., Alqosaibi, A.I., Al-Karmalawy, A.A., Al-Dhuayan, I.S. and Alabkari, H., 2021. In vitro and in silico characterization of alkaline serine protease from Bacillus subtilis D9 recovered from Saudi Arabia. Heliyon, 7(10), e08133.
17. Nannipieri, P., Trasar-Cepeda, C. and Dick, R.P., 2018. Soil enzyme activity: a brief history and biochemistry as a basis for appropriate interpretations and meta-analysis. Biology and Fertility of Soils, 54, pp.11–19.
18. Olajuyigbe, F.M. and Ehiosun, K.I., 2013. Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions. African Journal of Biotechnology, 12(21), pp.3249–3257.
19. Pant, G., Prakash, A., Pavani, J., Bera, S., Deviram, G., Kumar, A. et al., 2015. Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis. Journal of Taibah University for Science, 9(1), pp.50–55.
20. Peng, Y., Yang, X.J., Xiao, L. and Zhang, Y.Z., 2004. Cloning and expression of a fibrinolytic enzyme (subtilisin DFE) gene from Bacillus amyloliquefaciens DC-4 in Bacillus subtilis. Research in Microbiology, 155(3), pp.167–173.
21. Reddy, N., Deekonda, V., Seshagiri, S., Reddy, R. and Gangula, A.K., 2022. Production, characterization and applications of proteases produced by Bacillus licheniformis, Acinetobacter pittii and Aspergillus niger using neem seed oil cake as substrate. Industrial Crops and Products, 187, p.115403.
22. Sharma, K.M., Kumar, R., Panwar, S. and Kumar, A., 2017. Microbial alkaline proteases: optimization of production parameters and their properties. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 15(1), pp.115–126.
23. Sharma, M., Gat, Y., Arya, S., Kumar, V., Panghal, A. and Kumar, A., 2019. A review on microbial alkaline protease: an essential tool for various industrial approaches. Industrial Biotechnology, 15(2), pp.69–78.
24. Singh, R., Singh, T. and Pandey, A., 2019. Microbial enzymes: an overview. In: Advances in Enzyme Technology: Biomass, Biofuels and Biochemicals, pp.1–40.
25. Tang, X.M., Shen, W., Lakay, F., Shao, W.L., Wang, Z.X., Prior, B. et al., 2004. Cloning and over-expression of an alkaline protease from Bacillus licheniformis. Biotechnology Letters, 26, pp.975–979.
26. Tóth, E., Huszár, K., Bencsura, P., Kulcsár, P.I., Vodicska, B., Nyeste, A. et al., 2014. Restriction enzyme body doubles and PCR cloning: on the general use of type IIs restriction enzymes for cloning. PLoS ONE, 9(3), e90896.
27. Wong, T.Y., Preston, L.A. and Schiller, N.L., 2000. Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structure–function analysis, biological roles, and applications. Annual Review of Microbiology, 54(1), pp.289–340.
28. Yimer, D. and Tilahun, A., 2018. Microbial biotechnology review in microbial enzyme production methods, assay techniques and protein separation and purification. Journal of Nutrition, Health and Food Engineering, 8(1), pp.1–7.
29. Zhang, Y., Hu, J., Zhang, Q., Cai, D., Chen, S. and Wang, Y., 2023. Enhancement of alkaline protease production in recombinant Bacillus licheniformis by response surface methodology. Bioresources and Bioprocessing, 10(1), p.11.
30. Zhou, C., Zhang, H., Fang, H., Sun, Y., Zhou, H., Yang, G. et al., 2021. Transcriptome-based functional identification and application of regulator AbrB on alkaline protease synthesis in Bacillus licheniformis 2709. International Journal of Biological Macromolecules, 166, pp.1491–1508.
31. Zhou, C., Zhou, H., Li, D., Zhang, H., Wang, H. and Lu, F., 2020. Optimized expression and enhanced production of alkaline protease by genetically modified Bacillus licheniformis 2709. Microbial Cell Factories, 19, p.13.