واکنش رنگی تكثير همدما به واسطه حلقه با رونويسي معكوس(RT-LAMP) به منظور شناسایی ساده و سریع کرونا ویروس حاد و شدید تنفسی 2
محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولی
محسن واعظ
1
,
نازنین کاظمی نژاد
2
1 - گروه زیست فناوری صنعتی و محیط زیست، پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران.
2 - گروه زیست فناوری صنعتی و محیط زیست، پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران.
کلید واژه: کروناویروس حاد و شدید تنفسی 2, کووید-19, RNA ويروس ها, واکنش تکثیر هم دما به واسطه حلقه بارونویسی معکوس, رنگ سنجی.,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: تکامل و شیوع سویههای جدید و در حال ظهور کروناویروس حاد و شدید تنفسی 2 (SARS-CoV-2) عامل بیماری کووید-19 هنوز یک چالش بهداشتی محسوب میشود و روشهای مولکولی کمک کننده هستند. اين پژوهش با هدف راهاندازی یک روش ساده و سریع رنگسنجی واکنش تكثير همدما بواسطه حلقه با رونويسي معكوس (RT-LAMP) کروناویروس انجام شد.
مواد و روش ها: اين پژوهش به صورت تجربی بر روی دو RNA مصنوعی رونوشت برداری شده از دو سازه ژنی مورد مطالعه قبلی ما و یک RNA جدید سنتز شده از ژن نوکلئوکپسید SARS-CoV-2 تهیه شده از واریانت XFG انجام شد. در ابتدا اقدام به تهیه RNA سنتزی به عنوان ژن هدف برای راه اندازی واکنش RT-LAMP گردید. پس از بهینه سازی واکنش از معرف رنگی هیدروکسی نفتل بلو استفاده و روش رنگسنجی راهاندازی شد. همچنین واکنش رنگی RT-LAMP بر روی ژن سنتزی واریانت XFG با موفقیت انجام گردید. از واکنش Real-time PCR نیز بر روی نمونه هاي RNA سنتز شده به منظور تایید نتایج استفاده گردید.
یافته ها: روش رنگسنجی RT-LAMP با موفقیت برای تشخیص نمونههای سنتزی SARS-CoV-2 راهاندازی و بهینه گردید. زمان لازم برای انجام واکنش 40 دقیقه با حد تشخیص 75 نسخه ژن هدف در واکنش تعیین گردید.
نتیجه گیری: بکارگیری روش رنگ سنجی مرئی با حضور رنگ HNB در حین واکنش RT-LAMP روشی ساده و سریعتر از بکارگیری رنگهای فلورسانت معمول همچون سایبرگلد و سایبرگرین است و ضمن حذف زمان آشکارسازی نتایج از ایجاد آلودگی پس از پایان واکنش جلوگیری و از تولید نتیجه مثبت کاذب میکاهد.
Background & Objectives: Evolution and spread of novel and emerging strains of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), the causative agent of COVID-19, is still a public health challenge and molecular methods can be helpful. In this study, development of a simple and rapid colorimetric Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for coronavirus was investigated.
Materials & Methods: This research was conducted experimentally on two synthetic RNAs transcribed from two gene constructs from our previous study and a new RNA synthesized from the SARS-CoV-2 nucleocapsid gene prepared from the XFG variant. Initially, synthetic RNA was prepared for the target genes. Then, the RT-LAMP reaction was optimized and a simple and rapid colorimetric method was established using the hydroxynaphthyl blue color reagent. In addition, colorimetric reaction was developed on XFG variant. Real-time PCR reaction was also used on synthesized RNA samples to validate the results.
Results: The colorimetric RT-LAMP method was successfully set up and optimized for detection of SARS-CoV-2 on synthetic samples. The reaction time was determined to be 40 minutes with a detection limit of 75 copies of the target gene in the reaction. Colorimetric RT-LAMP was also successfully for XFG synthetic nucleocapsid gene.
Conclusion: Using the visible colorimetric method in the presence of HNB dye during the RT-LAMP reaction is a simple and faster method than common fluorescent dyes such as Syber Gold and Syber Green. It eliminates the time required to visualize results with cross-contamination prevention when the reaction is completed reducing false positive results.
1. Reperant LA, Osterhaus AD. AIDS, Avian flu, SARS, MERS, Ebola, Zika… what next?. Vaccine. 2017 Aug 16;35(35):4470-4.
2. Dawood FS, Iuliano AD, Reed C, Meltzer MI, Shay DK, Cheng P-Y, et al. Estimated global mortality
associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. Lancet Infect Dis. 2012;12(9): 687-95.
3. Peiris JS, Yuen KY, Osterhaus AD, Stöhr K. The Severe Acute Respiratory Syndrome. N Engl J Med. 2003;349(25):2431-41.
4. Abdelrahman Z, Li M, Wang X. Comparative review of SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, and influenza A respiratory viruses. Frontiers in immunology. 2020 Sep 11;11:552909.
5. Mahase E. Covid-19: first coronavirus was described in The BMJ in 1965. BMJ 2020;369:m1547.
6. Wu F, Zhao S, Yu B, Chen YM, Wang W, Song ZG. A novel coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020; 579:265-9.
7. Cui J, Li F, Shi ZL (2019) Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat Rev Microbiol 17(3):181–192. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9.
8. Ge XY, Yang WH, Zhou JH, Li B, Zhang W, Shi ZL, Zhang YZ (2017) Detection of alpha- and betacoronaviruses in rodents from Yunnan, China. Virol J 14(1):98. https://doi.org/10.1186/s12985-017-0766-9.
9. Gorbalenya, A. E. et al. The species severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat. Microbiol. 2020;5(4):536.
10. Tao K, Tzou PL, Nouhin J, Gupta RK, de Oliveira T, Kosakovsky Pond SL, Fera D, Shafer RW. The biological and clinical significance of emerging SARS-CoV-2 variants. Nature Reviews Genetics. 2021 Dec;22(12):757-73.
11. WHO. Risk evaluation for SARS-CoV-2 variant under monitoring: XFG. Technical Advisory Group on Virus Evolution (TAG-VE), 2025 Jun 25. Available from: https://www.who.int/publications/m/item/risk-evaluation-for-sarscov-2-variant-under-monitoring-xfg.
12. Guo C, Yu Y, Liu J, Jian F, Yang S, Song W, Yu L, Shao F, Cao Y. Antigenic and virological characteristics of SARS-CoV-2 variants BA. 3.2, XFG, and NB. 1.8. 1. The Lancet Infectious Diseases. 2025 Jan 1.
13. Shah SA, Palomar DP, Barr I, Poon LL, Quadeer AA, McKay MR. Seasonal antigenic prediction of influenza A H3N2 using machine learning. Nature Communications. 2024 May 7;15(1):3833.
14. Mansoori, Amin. Influenza Co-Infection among COVID-19 Patients in Iran: A Systematic Review. Infection Epidemiology and Microbiology. 2024 Dec 12;10.
15. Alborzi E, Monavari H, Kiani J, Karbalaie Niya MH, Tavakoli A. Low Prevalence Of SARS-COV-2 And Influenza Virus Coinfection During COVID-19 Disease Pandemic, In Iran. Iranian Journal of Virology. 2022 Dec 10;16(2):35-40.
16. Caruana G, Croxatto A, Coste AT, Opota O, Lamoth F, Jaton K, Greub G. Diagnostic strategies for SARS-CoV-2 infection and interpretation of microbiological results. Clinical Microbiology and Infection. 2020 Jun 25.
17. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research. 2000 Jun 15;28(12):e63-.
18. Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loopmediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiol. 2015;53(1):1-5.
19. Askari A, Kargar M, Ghorbani-Dalini S Doosti A. Loop-mediated isothermal amplification: Rapid and cost-effective method for detection of pathogens. Journal of Microbial World. 2012 5; (12): 7-22 (In persian).
20. Shahhosseiny MH, Esmailii Z, Moslemi E, Yaghmaii P. Loop Mediated Isothermal Amplification of Hepatitis B Virus in Hemodialysis Patients. Journal of Microbial World. 2009 2(4): 183-192 (In persian).
21. Panno, S., Matić, S., Tiberini, A., Caruso, A. G., Bella, P., Torta, L., ... & Davino, S. (2020). Loop Mediated Isothermal Amplification: Principles and Applications in Plant Virology. Plants, 9(4), 461.
22. Yilmaz S, Adkins S, Batuman O. Field-portable, rapid, and low-cost RT-LAMP assay for the detection of tomato chlorotic spot virus. Phytopathology®. 2023 Mar 22;113(3):567-76.
23. Vaez M, Kazemimejad N, Fallah Mehrabadi J. Rapid SARS-CoV-2 RT-LAMP Assay Setup using Gene Construct Design Approach. Iranian Journal of Medical Microbiology. 2023 Jun 10;17(3):329-38.
24. Young L, Dong Q. Two‐step total gene synthesis method. Nucleic acids research. 2004 Jan 1;32(7):e59-.
25. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DG. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance. 2020 Jan 23;25(3):2000045.
26. Yan Y, Chang L, Wang L. Laboratory testing of SARS‐CoV, MERS‐CoV, and SARS‐CoV‐2 (2019‐nCoV): Current status, challenges, and countermeasures. Reviews in medical virology. 2020 May;30(3):e2106.
27. Kargar M, Askari A, Doosti A, Ghorbani-Dalini S. Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of hepatitis C virus. Indian Journal of Virology. 2012 Jun;23(1):18-23.
28. Gonzalez-Gonzalez E, Lara-Mayorga IM, Rodriguez-Sanchez IP, Zhang YS, Martinez-Chapa SO, Trujillo-de Santiago G, Alvarez MM. Colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for cost-effective and quantitative detection of SARS-CoV-2: the change in color in LAMP-based assays quantitatively correlates with viral copy number. Analytical Methods. 2021;13(2):169-78.
29. Lai MY, Bukhari FD, Zulkefli NZ, Ismail I, Mustapa NI, Soh TS, Hassan AH, Peariasamy KM, Lee YL, Suppiah J, Thayan R. Clinical testing on SARS-CoV-2 swab samples using reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). BMC Infectious Diseases. 2022 Aug 18;22(1):697.
30. Hongjaisee S, Kham-Kjing N, Musikul P, Daengkaokhew W, Kongson N, Guntala R, Jaiyapan N, Kline E, Panpradist N, Ngo-Giang-Huong N, Khamduang W. A single-tube colorimetric loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of SARS-CoV-2 RNA. Diagnostics. 2023 Sep 25;13(19):3040.
