مهار تشکیل بیوفیلم بواسطه تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین و کاهش بیان ژن‌های pslA، algDو pelA در جدایه‎های بالینی سودوموناس آئروژینوزا

محورهای موضوعی : ژنتیک

مهسا احمدزاده کلنگستانی ¹ , ساجده معظمی میرک محله ² , محمد نیک پسند ³ , مهدی شهریاری نور ⁴ , نجمه رنجی ⁵

1 - گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
2 - گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
3 - گروه شیمی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
4 - گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران
5 - گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

تاریخ دریافت : 1404/05/28 تاریخ پذیرش : 1404/06/16 تاریخ انتشار : 1404/06/18

کلید واژه: سودوموناس آئروژینوزا, بیوفیلم, نانوکامپوزیت مگنتیک, اناریجه, سیپروفلوکساسین,

چکیده مقاله :

مقدمه:  سودوموناس آئروژینوزا یک پاتوژن بیمارستانی فرصت‌طلب با مقاومت چند دارویی است که به دلیل توانایی در تشکیل بیوفیلم، یک چالش مهم درمانی محسوب می‌شود. هدف این مطالعه، ارزیابی اثرات نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه در ترکیب با سیپروفلوکساسین بر مهار تشکیل بیوفیلم و تغییر بیان ژن‌های مرتبط با بیوفیلم در جدایه‌های بالینی مقاوم بود.

مواد و روش‌ها : در این مطالعه، 26 جدایه بالینی P. aeruginosa  از بیمارستان‌های تهران جمع‌آوری و پروفایل حساسیت آنتی‌بیوتیکی آنها با روش کربی بائر تعیین شد. حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) به روش براث میکرودایلوشن ارزیابی شد. نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه سنتز شده و عملکرد ضد بیوفیلمی آنها در ترکیب با سیپروفلوکساسین بررسی شد. اثرات هم‌افزایی با آزمون چکر بورد، میزان تشکیل بیوفیلم  با روش رنگ‌آمیزی کریستال ویوله، و بیان ژن‌های pslA، algD  و pelA  با Q-RT-PCR بررسی شدند.

یافته‌ها:  آنالیز فیزیکوشیمیایی سنتز موفق نانوکامپوزیت های  مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه را با اندازه ذرات 28 تا 82 نانومتر تأیید کرد. همه جدایه‌ها به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند و MIC در محدوده 128 تا 1024 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. آزمون چکر بورد، اثر هم‌افزایی بین نانوکامپوزیت های عامل‌دار شده با اناریجه و سیپروفلوکساسین در سویه ATCC 9027 و چندین جدایه بالینی نشان داد. علاوه بر این، تیمار ترکیبی باعث کاهش معنی‌دار تشکیل بیوفیلم و کاهش بیان ژن‌های pslA، algD  و pelA  در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین به‌تنهایی شد (P<0.05).

نتیجه‌گیری : این یافته‌ها نشان می‌دهد که نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه می‌تواند اثر ضدباکتریایی سیپروفلوکساسین علیه جدایه‌های مقاوم P. aeruginosa  را از طریق کاهش بیان ژن‌های مرتبط با تشکیل بیوفیلم، افزایش دهد.

چکیده انگلیسی:

introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic hospital-acquired pathogen with multidrug resistance, in which biofilm formation plays a critical role in therapeutic failure. This study aimed to evaluate the effects of Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanocomposites in combination with ciprofloxacin on the inhibition of biofilm formation and deregulation of biofilm-related gene in resistant clinical isolates.

Material and Methods: In this study, 26 clinical isolates of P. aeruginosa were collected from hospitals in Tehran, Iran, and their antibiotic susceptibility profiles were determined using the Kirby–Bauer method. Minimum inhibitory concentration (MIC) was evaluated by broth microdilution. The Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanocomposites were synthesized and their anti-biofilm function were assessed in combination with ciprofloxacin. Synergistic activity was assessed by the checkerboard assay, biofilm formation was quantified using crystal violet staining, and the expression of pslA, algD, and pelA genes was analyzed by Q-RT-PCR.

Results: Physicochemical analysis confirmed the successful synthesis of Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanoparticles with particle sizes ranging from 28 to 82 nm. All of isolates were resistant to ciprofloxacin, with MIC values ranging from 128 to 1024 µg/mL. Checker board analysis demonstrated a synergistic effect between the Froriepia subpinnata- functionalized nanocomposites and ciprofloxacin in the strain ATCC 9027 and several clinical isolates. Moreover, the combination treatment significantly led to decrease of biofilm formation and downregulation of pslA, algD, and pelA genes compared to treatment with ciprofloxacin alone (P<0.05).

Conclusion: The findings indicate that Froriepia subpinnata-functionalized magnetic nanocomposites can enhance the antibacterial efficacy of ciprofloxacin against resistant P. aeruginosa isolates by downregulating biofilm formation-related genes.

منابع و مأخذ:

1. Westbrock-Wadman S, Sherman DR, Hickey MJ, Coulter SN, Zhu YQ, Warrener P, et al. Characterization of a Pseudomonas aeruginosa efflux pump contributing to aminoglycoside impermeability. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Dec;43(12):2975-83. DOI: 10.1128/AAC.43.12.2975
2. Ghafoor A, Hay ID, Rehm BH. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl Environ Microbiol. 2011 Aug;77(15):5238-46. DOI: 10.1128/AEM.00637-11
3. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 2010 Sep;8(9):623-33. DOI: 10.1038/nrmicro2415
4. Alva PP, Sundar S, D'Souza C, Premanath R. Increased expression of genes involved in biofilm formation in a multidrug-resistant environmental Pseudomonas aeruginosa isolate. J Datta Meghe Inst Med Sci Univ. 2021;16(2):357-62.
5. Kaboli Chalmardi M, Gholami M, Hajilou N, Kakavan M, Haghshenas M, Goli HR. Investigating the Frequency of AlgD Gene in Clinical Isolates of Pseudomonas Aeruginosa Collected from Teaching-Therapeutic Hospitals of Mazandaran-2022. J Mazandaran Univ Med Sci. 2024;34(232):218-27.
6. Pakizehkar S, Ranji N, Sohi AN, Sadeghizadeh M. Polymersome-assisted delivery of curcumin: A suitable approach to decrease cancer stemness markers and regulate miRNAs expression in HT29 colorectal cancer cells. Polym Adv Technol. 2020 Jan;31(1):160-77. DOI: 10.1002/pat.4754
7. Pakizehkar S, Ranji N, Naderi Sohi A, Sadeghizadeh M. Curcumin loaded PEG400-OA nanoparticles: A suitable system to increase apoptosis, decrease migration, and deregulate miR-125b/miR182 in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Polym Adv Technol. 2020 Aug;31(8):1793-804. DOI: 10.1002/pat.4917
8. Aladejana EB, Adelabu OA, Aladejana AE, Ndlovu SI. Antimicrobial properties of alternative medicines used in the management of infections in diabetic patients: A comprehensive review. Pharmacol Res Mod Chin Med. 2024 Sep;11:100432. DOI: 10.1016/j.prmcm.2024.100432
9. Asafo-Agyei T, Appau Y, Barimah KB, Asase A. Medicinal plants used for management of diabetes and hypertension in Ghana. Heliyon. 2023 Dec;9(12):e22977. DOI: 10.1016/j.heliyon.2023.e22977
10. Mirzania F, Sarrafi Y, Moridi Farimani M. Comparative Evaluation of Chemical Compositions and Biological Activities of Wild and Cultivated Froriepia subpinnata L. Essential Oils. J Agric Sci Technol. 2019;21(2):331-40.
11. Bandian L, Moghaddam M, bahraini m. Investigate the antimicrobial activity and synergistic effects of Zataria multiflora, Salvia verticillata and Froriepia subpinnata ethanolic extracts on bacterial vegetables decay. J Food Microbiol. 2021;1(8):45-57.
12. Adel M, Safari R, Nematollahi A, Ghiasi M, Nafian Dehkordi I. Evaluation of antifungal activity of essential oils of Eryngium campestre, Cuminum cyminum, Pimpinella affinis and Allium sativum on Fusarium solani isolated from ornamental aquarium fish. J Appl Ichthyol Res. 2015;2(4):23-32.
13. Esmailpour K, Shourian M. Green Synthesis of Gold Nanoparticles Using Pimpinella affinis Leaf and Stem Extracts and Evaluation of Their Cytotoxic Effects Against Human Breast Cancer Cells Under In-vitro Condition. Cell Tissue J. 2023;14(3):217-40.
14. Roudbaraki ZA, Ranji N, Mohammadipour A, Ghasemnegad Z. The effect of silybin-encapsulated micelle nanoparticles on mexY expression in ciprofloxacin-resistant isolates of Pseudomonas aeruginosa. J Microb World. 2018;36(11):269-77.
15. Borji S, Shahriarinour M, Shariati S, Ranji N, Nikpassand M. Enhanced therapeutic efficacy of silibinin loaded silica coated magnetic nanocomposites against Pseudomonas aeruginosa in Combination with Ciprofloxacin and HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2025;15(1):21498. DOI: 10.1038/s41598-025-87012-4
16. Pourasgar S, Ranji N, Asadpour L, Shahriarinour M, Nikpassand M. Antibacterial and Anti-cancer Properties of Curcumin-Functionalized Silica-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles. Arab J Sci Eng. 2024.
17. Kordmahaleh NP, Mipour M, Ranji N, Shahriarinour M, Nikpassand M. Anti-bacterial activity of silibinin-functionalized silica-coated Fe3O4 magnetic nanocomposites on Pseudomonas aeruginosa. 3 Biotech. 2025;15(8):253.
18. Bahrami A, Jamzad M, Sedaghat S. Phytochemicals and Biological Activities of Froriepia subpinnata (Ledeb.) Baill. Extracts. J Med plants By-products. 2021;10(1):109-15.
19. Rostamabadi H, Samandari Bahraseman MR, Esmaeilzadeh-Salestani K. Froriepia subpinnata Leaf Extract-Induced Apoptosis in the MCF-7 Breast Cancer Cell Line by Increasing Intracellular Oxidative Stress. Iran J Pharm Res. 2023;22(1):e136643. DOI: 10.5812/ijpr-136643
20. Pourasgar S, Ranji N, Asadpour L, Shahriarinour M, Nikpassand M. Antibacterial and Anti-cancer Properties of Curcumin-Functionalized Silica-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles. Arab J Sci Eng. 2025;50(9):6231-49.
21. Salimi N, Mohammadi-Manesh E, Ahmadvand N, Danafar H, Ghiasvand S. Curcumin-Loaded by Fe3O4/GO and Fe3O4/ZnO/GO Nanocomposites for Drug Delivery Applications: Synthesis, Characterization and Anticancer Assessment. J Inorg Organomet Polym Mater. 2024;34(3):1256-71. DOI: 10.1007/s10904-023-02879-3
22. Xia Q, Huang J, Feng Q, Chen X, Liu X, Li X, et al. Size- and cell type-dependent cellular uptake, cytotoxicity and in vivo distribution of gold nanoparticles. Int J Nanomedicine. 2019;14:6957-70. DOI: 10.2147/IJN.S215005
23. Imani Pirsaraei B, Ranji N, Asadpour L. Investigation the Effect of Micelle Nanoparticles Containing Curcumin on Ciprofloxacin Resistant Isolates of Pseudomonas Aeruginosa and on mexC and mexD Genes Expression. J Arak Univ Med Sci. 2018;21(2):10-20.
24. Farahi RM, Ali AA, Gharavi S. Characterization of gyrA and parC mutations in ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from Tehran hospitals in Iran. Iran J Microbiol. 2018 Aug;10(4):242-9. PMID: 30675330; PMCID: PMC6339890.
25. Rajabpour M, Alikhani MY. MIC determination of Pseudomonas aeruginosa strains were isolated from clinical specimens of patients admitted to educational hospitals in Hamedan (90-91). Iran J Med Microbiol. 2013;7(3):18-25.
26. Esmaili S, Hosseini Doust R. Synergistic effect of silver nanoparticles (AgNPs) and gentamicin against clinical isolates of Pseudomona aeruginosa. Med Sci J Islam Azad Univ. 2019;29(1):64-70.
27. Fatemi N, Sharifmoghadam MR, Bahreini M, Khameneh B, Shadifar H. Antibacterial and Synergistic Effects of Herbal Extracts in Combination with Amikacin and Imipenem Against Multidrug-Resistant Isolates of Acinetobacter. Curr Microbiol. 2020 Sep;77(9):1959-67. DOI: 10.1007/s00284-020-02075-3
28. Dariushy R, Ashrafi F. Effect of Curcumin Nanoparticles on Biofilm Gene Expression in Pseudomonas Aeruginosa. Res Med. 2022;46(3):95-104.
29. Stenvang M, Dueholm MS, Vad BS, Seviour T, Zeng G, Geifman-Shochat S, et al. Epigallocatechin gallate remodels overexpressed functional amyloids in Pseudomonas aeruginosa and increases biofilm susceptibility to antibiotic treatment. J Biol Chem. 2016 Dec 23;291(51):26540-53. DOI: 10.1074/jbc.M116.739375
30. Kim HS, Lee SH, Byun Y, Park HD. 6-Gingerol reduces Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and virulence via quorum sensing inhibition. Sci Rep. 2015 Feb 25;5:8656. DOI: 10.1038/srep08656

متن کامل:



مهار تشکیل بیوفیلم بواسطه تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین و کاهش بیان ژن‌های  pslA، algDو pelA در جدایه‎های بالینی سودوموناس آئروژینوزا

 

عنوان کوتاه شده: مهار تشکیل بیوفیلم با اناریجه

 

مهسا احمدزاده کلنگستانی1، ساجده معظمی میرک محله1، محمد نیک پسند2، مهدی شهریاری نور1، نجمه رنجی1*

 

1-       گروه زیست شناسی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

2-       گروه شیمی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

 

ارسال: 28/5/1404 

بازنگری 14/6/1404  

 پذیرش : 16/6/1404

 

 

پست الکترونیک:  [e-mail]

 

چکیده

مقدمه:  سودوموناس آئروژینوزا یک پاتوژن بیمارستانی فرصت‌طلب با مقاومت چند دارویی است که به دلیل توانایی در تشکیل بیوفیلم، یک چالش مهم درمانی محسوب می‌شود. هدف این مطالعه، ارزیابی اثرات نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه در ترکیب با سیپروفلوکساسین بر مهار تشکیل بیوفیلم و تغییر بیان ژن‌های مرتبط با بیوفیلم در جدایه‌های بالینی مقاوم بود.

مواد و روش‌ها : در این مطالعه، 26 جدایه بالینی P. aeruginosa  از بیمارستان‌های تهران جمع‌آوری و پروفایل حساسیت آنتی‌بیوتیکی آنها با روش کربی بائر تعیین شد. حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) به روش براث میکرودایلوشن ارزیابی شد. نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه سنتز شده و عملکرد ضد بیوفیلمی آنها در ترکیب با سیپروفلوکساسین بررسی شد. اثرات هم‌افزایی با آزمون چکر بورد، میزان تشکیل بیوفیلم  با روش رنگ‌آمیزی کریستال ویوله، و بیان ژن‌های pslA، algD  و pelA  با Q-RT-PCR بررسی شدند.

یافته‌ها:  آنالیز فیزیکوشیمیایی سنتز موفق نانوکامپوزیت های  مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه را با اندازه ذرات 28 تا 82 نانومتر تأیید کرد. همه جدایه‌ها به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند و MIC در محدوده 128 تا 1024 میکروگرم/میلی‌لیتر بود. آزمون چکر بورد، اثر هم‌افزایی بین نانوکامپوزیت های عامل‌دار شده با اناریجه و سیپروفلوکساسین در سویه ATCC 9027 و چندین جدایه بالینی نشان داد. علاوه بر این، تیمار ترکیبی باعث کاهش معنی‌دار تشکیل بیوفیلم و کاهش بیان ژن‌های pslA، algD  و pelA  در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین به‌تنهایی شد (P<0.05).

نتیجه‌گیری : این یافته‌ها نشان می‌دهد که نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل‌دار شده با عصاره برگ اناریجه می‌تواند اثر ضدباکتریایی سیپروفلوکساسین علیه جدایه‌های مقاوم P. aeruginosa  را از طریق کاهش بیان ژن‌های مرتبط با تشکیل بیوفیلم، افزایش دهد.

کلمات کلیدی:  سودوموناس آئروژینوزا، بیوفیلم، نانوکامپوزیت مگنتیک، اناریجه، سیپروفلوکساسین

 

شـــیوه آدرس دهـــی این مقاله : م احمدزاده کلنگستانی، س معظمی میرک محله، م نیک پسند، م شهریاری نور، ن رنجی.  مهار تشکیل بیوفیلم بواسطه تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین و کاهش بیان ژن‌های  pslA،  algDو pelA در جدایه‎های بالینی سودوموناس آئروژینوزا. مجله دانش زیســـتی ایـــران. 1404؛20 (1): ۱-..

 

 

Inhibition of Biofilm Formation by Froriepia subpinnata Leaf Extract-Functionalized Magnetic Nanocomposites and Ciprofloxacin and Downregulation of pslA, algD, and pelA Genes in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa

 

 

Mahsa Ahmadzadeh Kelangestani1, Sajedeh Moazzami Mirak Mahaleh1, Mohammad Nikpassand2, Mahdi Shahriarinour1, Najmeh Ranji1*

 

 

 1Department of Biology, Ra.C., Islamic Azad University, Rasht, Iran.

2Department of Chemistry, Ra.C., Islamic Azad University, Rasht, Iran.

 

Submitted: 19  ⁄  8  ⁄  2025

Revised: 5  ⁄  9  ⁄  2025

Accepted:   7  ⁄  9  ⁄  2025

 

 

*Corresponding author:

Email: [e-mail]

Abstract

introduction: Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic hospital-acquired pathogen with multidrug resistance, in which biofilm formation plays a critical role in therapeutic failure. This study aimed to evaluate the effects of Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanocomposites in combination with ciprofloxacin on the inhibition of biofilm formation and deregulation of biofilm-related gene in resistant clinical isolates.

Material and Methods: In this study, 26 clinical isolates of P. aeruginosa were collected from hospitals in Tehran, Iran, and their antibiotic susceptibility profiles were determined using the Kirby–Bauer method. Minimum inhibitory concentration (MIC) was evaluated by broth microdilution. The Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanocomposites were synthesized and their anti-biofilm function were assessed in combination with ciprofloxacin. Synergistic activity was assessed by the checkerboard assay, biofilm formation was quantified using crystal violet staining, and the expression of pslA, algD, and pelA genes was analyzed by Q-RT-PCR.

Results: Physicochemical analysis confirmed the successful synthesis of Froriepia subpinnata leaf extract-functionalized magnetic nanoparticles with particle sizes ranging from 28 to 82 nm. All of isolates were resistant to ciprofloxacin, with MIC values ranging from 128 to 1024 µg/mL. Checker board analysis demonstrated a synergistic effect between the Froriepia subpinnata- functionalized nanocomposites and ciprofloxacin in the strain ATCC 9027 and several clinical isolates. Moreover, the combination treatment significantly led to decrease of biofilm formation and downregulation of pslA, algD, and pelA genes compared to treatment with ciprofloxacin alone (P<0.05).

Conclusion: The findings indicate that Froriepia subpinnata-functionalized magnetic nanocomposites can enhance the antibacterial efficacy of ciprofloxacin against resistant P. aeruginosa isolates by downregulating biofilm formation-related genes.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Biofilm, Magnetic nanocomposite, Froriepia subpinnata, Ciprofloxacin

Cite this article: M Ahmadzadeh Kelangestani, S Moazzami Mirak Mahaleh, M Nikpassand, M Shahriarinour, N Ranji. Inhibition of Biofilm Formation by Froriepia subpinnata Leaf Extract-Functionalized Magnetic Nanocomposites and Ciprofloxacin and Downregulation of pslA, algD, and pelA Genes in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iranian Journal of Biological Sciences. 2025; 20 (1): 1-…

 

 

 مقدمه

سودوموناس آئروژینوزا به عنوان یک پاتوژن‌ فرصت طلب بیمارستانی با مقاومت های چند دارویی گزارش می شود. مقاومت در سودوموناس آئروژینوزا یک چالش درمانی جدی است که به طور قابل توجهی باعث افزایش مرگ و میر بیمارستانی و افزایش هزینه های درمانی می شود (1). یکی از علل تشدید کننده مقاومتهای دارویی در سودوموناس آئروژینوزا، توانایی این پاتوژن در تشکیل بیوفیلم و اتصال به سطوح است. بیوفیلم ساختاری منسجم از تجمع باکتریایی است، که توسط سلول‌های پاتوژن تولید شده و به عنوان یک عامل محافظتی باکتریایی در برابر سیستم ایمنی بیمار، آنتی بیوتیک ها و دیگر عوامل محیطی محسوب می شود. بطوریکه به عنوان نمونه، در افراد مبتلا به سیستیک فیبروزیز مشاهده شده که تشکیل بیوفیلم‌ علت اصلی زنده مانی سودوموناس آئروژینوزا و همچنین یک یاز علل افزایش دهنده مقاومت به آنتی بیوتیکها و مقابله در برابر پاسخ دفاعی میزبان است (2). ساختار بیوفیلم ها از پلی ساکاریدها، پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدهایی تشکیل می شود که باعث ثبات ساختار آن ها و افزایش چسبندگی به سطوح می‌شوند. این شبکه منسجم، باعث اتصال سلول‌های باکتری به هم و بی‌حرکت شدن آنها در محل اتصال می شود (3). قابل ذکر است مقاومت سودوموناس آئروژینوزا در برابر آنتی بیوتیک‌ها هنگام رشد به صورت بیوفیلم نسبت به زمانی که در حالت پلانکتونی و معلق هستند، افزایش می یابد. پایداری ساختار بیوفیلم در سودوموناس آئروژینوزا با تولید سه پلی ساکارید اصلی به نام‌های  Pel،Psl و آلژینات (algD) تعیین می‌شود. حضور Pel و Psl در مراحل اولیه تشکیل بیوفیلم ضروری است. Psl  یک پنتاساکارید است که از D-گلوکز، D-مانوز و L-رامنوز تشکیل شده است. پلی ساکارید Pel عمدتاً از گلوکز تشکیل شده است و آلژینات یک پلیمر خطی متشکل از دی-مانورونیک اسید و ال-گلورونیک اسید است که مسئول پایداری ساختار، حفظ آب و مواد مغذی و همچنین محافظت از پاتوژن است (4). تولید کپسول از جنس آلژینات یکی از مهمترین عوامل بیماریزایی سودوموناس آئروژینوزا محسوب می‌شود. عملکردهای بیماریزای مرتبط با آلژینات شامل مهار و تداخل مستقیم با فاگوسیتوز، حفاظت باکتری در برابر آنتی بیوتیک‌ها، ساخت بیوفیلم، ممانعت از کموتاکسی لکوسیت‌ها، جذب رادیکال‌های آزاد سمی و شکل‌گیری میکروکلونی های باکتریایی است (5).

از آنجایی که ترکیبات طبیعی گیاهی به دلیل مصرف روزانه یا در طب سنتی ، با بدن انسان سازگارترند و عوارض جانبی کمتری دارند (6, 7)، محققین به استفاده از عصاره‌های گیاهی به عنوان منبعی از فیتوکمیکال ها جهت درمانهای کمکی عفونتهای بیمارستانی (8)، دیابت(9)، سرطانها (7) و ... توجه بسیاری دارند. اناریجه یک گیاه ارزشمند از خانواده چتریان (Apiaceae) دارای پراکندگی جغرافیایی محدود در آناتولی، ایران، ترکمنستان، افغانستان، قفقاز و عراق می باشد (8). این گیاه در ایران در مناطق شمالی، شمال غرب، مرکزی، شرق و شمال شرق پراکنده است. اناریجه دارای ترکیبات شیمیایی همچون میرسنون، لیمونن و ترپینولن است (10) که دارای خواص دارویی متنوعی از جمله خواص ضد باکتریایی (11)، ضد قارچی (12) و ضد سرطانی (13) می باشد (9). هدف از این مطالعه بررسی تأثیر نانوکامپوزیت‌های مگنتیک (Fe3O4) عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین بر مهار تشکیل بیوفیلم در جدایه‎های بالینی سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به سیپروفلوکساسین بود.

 

مواد و روش‌ها

جمع آوری نمونه و شناسایی باکتری

 پنجاه وهشت جدایه مشکوک سودوموناس آئروژینوزا در سال 1403  با کد اخلاق IR.IAU.RASHT.REC.1403.030 از کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد رشت، از بیمارستان‌های تهران جمع‌آوری گردید. تعیین هویت جدایه ‌ها به کمک رنگ‌آمیزی گرم، تست های کاتالاز، اکسیداز، سیمون سیترات، TSI ، کشت در محیط سیتریماید آگار و رشد در دمای C° 42 صورت گرفت (14).

 

 سنتز نانوکامپوزیت Fe3O4 عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه 

در ابتدا برگ اناریجه از بازارهای محلی در رودسر (شرق گیلان) خریداری شد. پس از شستن و خشک کردن برگها، حدود 6 گرم برگ اناریجه (Froriepia subpinnata) آسیاب شد. سپس پودر خشک گیاه، در 100 میلی لیتر آب مقطر حل شده و همراه با سود 2 نرمال در استیرر مغناطیسی هم زده شد (مخلوط واکنش الف). سپس یک گرم اکسید آهن (Fe3O4) با زایلن مخلوط و تحت امواج اولتراسونیک قرار گرفت. سپس، ترکیب 3-کلروپروپیل تری اتوکسی به مخلوط واکنش اضافه شد و سانتریفیوژ شد (مخلوط واکنش ب). در ادامه عصاره گیاهی اناریجه (مخلوط واکنش الف)، طی 2-3 ساعت به تدریج به مخلوط واکنش ب اضافه و به مدت 48 ساعت در دمای اتاق در استیرر مغناطیسی هم زده شد. محصول نهایی (نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با برگ گیاه اناریجه) در دمای C 60° خشک گردید.

 

آزمون FTIR

طیف سنجی مادون قرمز (Fourier-transform infrared spectroscopy) مربوط به Fe3O4، عصاره برگ اناریجه و نانو کامپوزیت های عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه با دستگاه طیف سنج Shimadzu FTIR-8400S (Shimadzu Europe) مورد بررسی قرار گرفت (15).

میکروسکوپ الکترونی رویشی (SEM)

ساختار نانو کامپوزیت های عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی نشر میدانی MIRA3 TESCAN (FE-SEM) مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، FE-SEM برای بررسی اندازه ذرات مورد استفاده قرار گرفت. به این منظور نمونه بصورت یک قطره 1mg/ml از نانو کامپوزیت های عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه در سطح اسلاید کربنی با یک لایه طلا به ضخامت 100 Å پوشانده شد و تصاویر با ولتاژ فزاینده 26 کیلو وات بدست آمد (16).

 

 بررسی  پروفایل حساسیت آنتی بیوتیکی به روش انتشار از دیسک

به منظور تعیین پروفایل حساسیت آنتی بیوتیکی در 20 جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا از بین 58 جدایه بیمارستانی، از آزمون کربی بائر (انتشار از دیسک) استفاده شد. میزان حساسیت یا مقاومت به آنتی بیوتیکهای سیپروفلوکساسین (µg5)، پایپراسیلین(µg100)، جنتامایسین (µg10)، ایمی پنم (µg10) و آمیکاسین(µg30) به کمک دیسک‌های آنتی بیوگرام از شرکت پادتن طب (تهران، ایران) بررسی شد. بعد از 18 تا 24 ساعت انکوباسیون در °C ۳۷ ، قطر هاله عدم رشد اطراف هر دیسک مطابق با استاندارد CLSI 2023 ارزیابی شد.

 

 تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC)

جهت تعیین MIC در جدایه‌هاي سودوموناس آئروژینوزا مقاوم به سیپروفلوکساین، از روش براث میکرودایلوشن استفاده شد. به این منظور کدورت نیم مک فارلند هر جدایه به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر (OD630=0.08-0.1nm) تعیین شد. در ادامه، رقت‌های متوالی سیپروفلوکساسین تزریقی (روناک دارو، ایران) در محدوده غلظتی 1 تا 1024 میکروگرم در میلی لیتر در پلیت 96 خانه ای ته صاف، اضافه شد. سپس، به رقتهای مختلف سیپروفلوکساسین در هر چاهک، 100 میکرولیتر از کدورت نیم مک فارلند از هر جدایه ، اضافه شد و در دمای °C ۳۷ به مدت 18-24 ساعت نگهداری شد. نتایج MIC، طبق استاندارد CLSI 2023  تفسیر گردید. از سوی دیگر، تعیین MIC نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ گیاه اناریجه، نیز صورت گرفت. به این منظور رقت‌های متوالی از نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با برگ گیاه اناریجه در محدوده غلظتی 1 تا 1024 میکروگرم در میلی لیتردر چاهک های پلیت 96 خانه‌ای ته صاف، اضافه شد. به هر چاهک 100 میکرولیتر از کدورت نیم مک فارلند جدایه مورد بررسی، اضافه شد و در دمای °C ۳۷ به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شد.

 

بررسی اثر هم افزایی 

به منظور ارزیابی اثرات هم افزایی (سینرژستیک) بین دو ترکیب دارویی سیپروفلوکساسین و عصاره برگ اناریجه، از روش چکر بورد بهره برده شد. بدین منظور، در ستون‌های عمودی میکروپلیت 96 خانه‌ای غلظت‌های مختلف سیپروفلوکساسین MNCs  (دارو A) ریخته شد، و در ردیف‌های افقی میکروپلیت، غلظت‌های مختلف نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (داروB) اضافه شد. به هر چاهک، سوسپانسیون باکتریایی در غلظت نهایی CFU/mL 105 × 5/7-5 افزوده شد. به این ترتیب هر دو داروی A وB با شیب غلظتی در میکروپلیت اضافه و هر چاهک ترکیبی از دو دارو را در اختیار سلولهای باکتریایی جهت برر سی اثربخشی داروها قرار داد. شاخص غلظت‌ مهارکنندگی کسری (FICI) ¹با استفاده از فرمول ذیل محاسبه شد (16): 

 

 

بررسی مهار تشکیل بیوفیلم تحت تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین

جهت بررسی مهار تشکیل بیوفیلم از رنگ آمیزی کریستال ویوله بهره برده شد. بیست جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا از نظر تشکیل بیوفیلم 24 ساعت بعد از کشت در محیط مولرهینتون آگار و انکوبه در دمای°C ۳۷، بررسی شدند. در ادامه، سویه استاندارد (ATCC 9027) و سه جدایه‌‎ی بالینی سودوموناس آئروژینوزا تحت تیمار با دو دارو (MIC هر دو دارو در حالت ترکیبی) در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین (MIC در حالت ترکیبی) به تنهایی و بدون تیمار با داروها به مدت 24 ساعت قرار گرفتند. هدف از این آزمون، بررسی اثربخشی عصاره برگ اناریجه بر سیپروفلوکساسین در حالت ترکیبی در مقایسه با سیپروفلوکساسین به تنهایی مشابه با مطالعات قبلی (15, 17) بود. بدین منظور، کدورت نیم مک فارلند (CFU/mL 108 × 5/0) از هر باکتری تهیه شد. سپس  100 میکرولیتر از هر باکتری با غلظت نهایی CFU/mL 105 × 5/7-5 ، تحت تیمار با 1) نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (1/2 MIC ترکیبی) و سیپروفلوکساسین (1/2 MIC ترکیبی) و 2) سیپروفلوکساسین (1/2 MIC ترکیبی) و 3) بدون تیمار با دو دارو به مدت 24 ساعت در دمای°C ۳۷ قرار گرفتند. بعد از 24 ساعت، سلولهای معلق و پلانکتونی با PBS (بافر نمکی فسفاته) شسته و از چاهک ها خارج شد. در ادامه، با متانول 95% به مدت پنج دقیقه، تثبیت سلولهای چسبیده به سطح چاهک ها صورت گرفت. سپس، چاهک‌ها با کریستال ویوله 1% به مدت 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از سه بار شستشو، اسید استیک گلاسیال 33% به هر چاهک اضافه و تشکیل بیوفیلم در طول موج 575 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر (Biotek Biotek ELx800, USA) به صورت OD خوانده شد (16).

 

 بررسی بیان ژن‌های مؤثر در تشکیل بیوفیلم تحت تیمار با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین

جهت بررسی بیان ژن‎های algD, pslA, pelA سویه استاندارد ATCC 9027  و دو جدایه بالینی بصورت تصادفی انتخاب شد. جدایه ها با کدورت CFU/mL 105 × 5/7-5 تحت تیمار با 1) نانوکامپوزیت های  مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (1/2 MIC ترکیبی) و سیپروفلوکساسین (1/2 MIC ترکیبی) (گروه تست) و 2) سیپروفلوکساسین (1/2 MIC ترکیبی) (گروه کنترل) در دمای°C ۳۷ به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شدند. سپس مطابق با دستور کار کیت RNXPLUS  (سیناکلون، تهران)، استخراج RNA  تام سلولی از دو گروه تست و کنترل صورت گرفت. از کیت سنتزcDNA  شرکت یکتا تجهیز آزما (تهران) جهت سنتز cDNA استفاده شد. به این منظور RNA ، ابتدا اولیگو dT (M50µ) و آب DEPC به حجم نهایی µL 5/13 رسیده و در دمای °C 70  در دستگاه ترموسایکلر (BioRad، آلمان) به مدت 5 دقیقه قرار گرفت. سپس بافر 5x first strand، (M10µ)  dNTPs، RNasin و آنزیم MMLV به اجزای واکنش اضافه و به مدت 60 دقیقه در دمای °C42  و به مدت 10 دقیقه در دمای °C 70  در دستگاه ترموسایکلرBioRad  (آلمان) قرار داده شد. بررسی سطح بیان ژن‌ها در دو گروه تست و کنترل به روش qRT-PCR با استفاده از کیت SYBR Premix SYBR green ( یکتا تجهیزآزما، تهران) در دستگاه ABI StepOne (Applied Biosystems، امریکا) صورت گرفت. برنامه دمایی واکنش qRT-PCR  به قرار ذیل بود: مرحله واسرشت شدن ابتدایی (°C 95 به مدت 3 دقیقه) و 40 سیکل شامل°C 95 به مدت 5 ثانیه،°C 60 به مدت 10 ثانیه و °C72 به مدت 10 ثانیه. ژن rpsL به عنوان ژن رفرنس مورد استفاده قرار گرفت. پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 ذکر شده است. واکنش ها حداقل دو بار تکرار شد و نتایج به بصورت میانگین±انحراف معیار ارائه شد. آنالیز بیان ژن‌ها در نمونه‌های تست و کنترل به کمک معادله  صورت گرفت.

 

جدول 1.  پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه
نام پرایمر	توالی پرایمر	طول محصول (bp)	رفرنس
algD-F	5'-ATCTCATCACCAGCCACGAC-3'	187	GenBank: CP034908.2
algD-R	5'-TATTCCTTGTTGGCCCCGTG-3'
pslA-F	5'-ACCGGGCCTGGATGAAACGC-3'	127	(15)
pslA-R	5'-AAGCCGATGATGCCGGAGCG-3'
pelA-F	5'-CAGCAAGAAAGGAATCGCCG-3'	200	GenBank: CP034908.2
pelA-R	5'-AGTCGAACTGGGAAAGCTCG-3'
rpsL-F	5'-CTCGGCACTGCGTAAGGTAT -3'	216	(15)
rpsL-R	5'-CCGTACTTCGAACGACCCTG -3'

 

 

 آنالیز آماری

نتایج بیان ژن با توزیع نرمال، به صورت میانگین± انحراف معیار ارائه شد. اختلاف آماری بین دو گروه تست و کنترل ، به کمک از نرم افزار GraphPad Prism8 و آزمون t-test ارزیابی شد. مقدار P<0.05، ‎جهت بررسی معنی دار بودن نتایج استفاده شد.

 

 نتایج

 آنالیز فیزیکوشیمی نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه

طیف FT-IR ی اکسید آهن (Fe3O4)، عصاره برگ اناریجه و نانوکامپوزیت های اکسید آهن عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه با استفاده از طیف‌سنج Shimadzu FTIR-8400S (Shimadzu Europe) برای شناسایی گروه های عاملی متصل به نانوکامپوزیت های سنتز شده انجام شد. طیف گیری FTIR  در محدوده 400 و  cm-14000 به دست آمد. عدد موج در محدوده cm-1 3300-3600 مربوط به ارتعاشات کششی پیوند O-H گروه های فنلی موجود در عصاره برگ اناریجه و گروه های هیدروکسیل نانوکامپوزیت های اکسید آهن عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه است. یک نوار در cm-11615 قابل مشاهده است که به ارتعاشات کششی C=C گروه آروماتیک و وینیل اختصاص دارد. همچنین، یک نوار با در حدود cm-1550 که با ارتعاشات Fe-O در هسته نانو- Fe3O4 منطبق است، که وجود Fe3O4 در نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه را تایید کرد (شکل 1).

 

 

 

شکل 1. نتایج FTIR مربوط به الف) اکسید آهن (Fe3O4)، ب) عصاره برگ اناریجه و ج) نانوکامپوزیت های اکسید آهن عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه

 

ابعاد نانوکامپوزیت ها در محدوده 28 تا 82 نانومتر مطابق با تصویر FE-SEM در شکل 2 تعیین شد. نمایش فوق، یکنواختی اجزای ذره و آرایش متقارن نانوکامپوزیت ها را نشان می دهد.

 

شکل 2. تصویر FE-SEM مربوط به نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه

 

 پروفایل حساسیت آنتی بیوتیکی 

در این مطالعه توصیفی تحلیلی، 26 جدایه سودوموناس آئروژینوزا از بیمارستان‌های تهران از عفونت ادراری (3/42 %)، سوختگی (50%) و عفونت خون (7/7%) با توزیع 53/61% در زنان و 46/38 % در مردان، در محدوده سنی 20 تا 60 سال جداسازی شد. نتایج انتشار از دیسک با پنج دیسک آنتی بیوگرام برای 26 جدایه بالینی، نشان داد که 6/84% جدایه‌ها به روش انتشار از دیسک مقاوم به ایمی پنم و 4/65% جدایه ها مقاوم به سیپروفلوکساسین گزارش شد.

 

جدول 2. الگوي حساسيت جدايه هاي بالینی سودوموناس آئروژینوزا بر طبق CLSI 2023 به روش کربی بائر (انتشار از دیسک)
آمیکاسین	ایمی پنم	جنتامایسین	پایپراسیلین	سیپروفلوکساسین	آنتی بیوتیک
8 (8/30%)	2 (7/7%)	9 (6/34%)	7 (9/26%)	9 (6/34%)	حساس(Susceptible)
1 (8/3%)	2 (7/7%)	1 (8/3%)	2 (7/7%)	0 (0%)	نیمه حساس (Intermediate)
17 (4/65%)	22 (6/84%)	16 (5/61%)	17(4/65%)	17 (4/65%)	مقاوم( Resistant)

 

تعیین MIC  سیپروفلوکساسین و نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه

در همه جدایه‌ها به روش براث میکرودایلوشن، حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) سیپروفلوکساسین در محدوده 128 تا 1024 میکروگرم در میلی لیتر گزارش شد (نمودار 1). MIC  نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه در همه جدایه ها، بیشتر از 1024 میکروگرم در میلی لیتر گزارش شد.

 

 

نمودار1. توزيع ميزان MIC  سیپروفلوکساسین بصورت درصد در 26 جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا

 

ارزیابی اثر هم افزایی بین عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین

جهت بررسی اثر هم افزایی (سینرژستیک) بین نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین در سویه استاندارد ATCC 9027  و پنج جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا از آزمون چکر بورد بهره برده شد. مطابق فرمول محاسبه شاخص FIC (16)، اثر هم افزایی در سویه استاندارد و پنج جدایه بالینی، مشاهده شد (جدول 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 3. اثر هم افزایی (سینرژستیک) بین نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین

شماره باکتری		(µg/mL) MIC  به تنهایی		(µg/mL) MIC ترکیبی		FICI
		سیپروفلوکساسین	نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه	سیپروفلوکساسین	نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه
ATCC 9027		32	1024<	8	16	265/0<
P.14		1024	1024<	128	32	156/0<
P.15		512	1024<	64	32	156/0<
P.21		512	1024<	32	32	093/0<
P.35		512	1024<	128	64	312/0<
P.44		1024	1024<	128	128	25/0<
اثر هم افزایی  5/0 *FICI< ، اثر هم افزایی جزئی  75/0 **FICI< ، اثر افزایشی  76/0 ≤FICI< 1 ***

 

 مهار تشکیل بیوفیلم 

جهت بررسی میزان تشکیل بیوفیلم در 26 جدایه بالینی مورد مطالعه، همه جدایه ها بعد از کشت 24 ساعته با کریستال ویوله رنگ آمیزی و میزان تشکیل بیوفیلم بر اساس میزان جذب خوانده شده توسط دستگاه الایزا ریدر به چهار گروه قوی، متوسط، ضعیف و منفی (بدون تشکیل بیوفیلم) دسته بندی شد. میزان تشکیل بیوفیلم در 26 جدایه سودوموناس آئروژینوزا  نشان داد که 54/11%، 92/26 % و 62/34 % از جدایه ها به ترتیب توان تشکیل بیوفیلم قوی، متوسط، ضعیف و و92/26 % از جدایه ها عدم توان تشکیل بیوفیلم را داشتند (نمودار2). 

 

 

نمودار 2. توزیع درصد تشکیل بیوفیلم در 26 جدایه بالینی سودوموموناس آئروژینوزا.

 

میزان مهار تشکیل بیوفیلم در سویه استاندارد ATCC 9027  و پنج جدایه جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا تحت تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (1/2MIC در حالت ترکیبی) و سیپروفلوکساسین(1/2MIC در حالت ترکیبی) بیشتر از تحت تیمار به تنهایی با سیپروفلوکساسین(1/2MIC در حالت ترکیبی) و در مقایسه با بدون تیمار با هر دو دارو بود (نمودار3).

 

نمودار 3. میزان مهار تشکیل بیوفیلم (بصورت درصد) در سویه استاندارد (ATCC 9027) و پنج جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا تحت تیمار با سه گروه 1) تحت تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (Froriepia subpinnata) و سیپروفلوکساسین، 2) تحت تیمار با سیپروفلوکساسین به تنهایی  و 3) کنترل. هر آزمون حداقل دو بار تکرار شد. نتایج بصورت میانگین± انحراف معیار ارائه شده است. اختلاف معنی دار بین گروههای مورد مقایسه، بصورت *P<0.05، **P<0.01  و ***P<0.001 نشان داده شده است.

 

 

 مهار بیان ژنهای مؤثر در تشکیل بیوفیلم 

جهت بررسی بیان ژنهای مؤثر در مهار تشکیل بیوفیلم از روش Real time PCR کمی (Q-RT-PCR)، بهره برده شد. آنالیز نتایج  Q-RT-PCR نشان داد که بیان ژنهای pslA ، algDو pelA در سویه استاندارد و جدایه شماره 14 در گروه تجت تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه (1/2MIC در حالت ترکیبی) و سیپروفلوکساسین (1/2MIC در حالت ترکیبی) در مقایسه با گروه تحت تیمار با سیپروفلوکساسین به تنهایی (1/2MIC در حالت ترکیبی)، کاهش معنی دار (P<0.05) نشان داد (نمودار4).

 

نمودار 4. میزان تغییر بیان کمی ژن های مؤثر در تشکیل بیوفیلم (pslA ، algDو pelA) در سویه استاندارد و جدایه شماره 14 در گروه تجت تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده حاوی اناریجه و سیپروفلوکساسین (گروه تست) در مقایسه با گروه تحت تیمار با سیپروفلوکساسین به تنهایی (گروه کنترل). هر آزمون حداقل دو بار تکرار شد. نتایج بصورت میانگین± انحراف معیار نشان داده شده است. اختلاف معنی دار بین گروههای تست و کنترل، بصورت *P<0.05 نشان داده شده است.

 

 بحث

در مطالعات مشخص شده که برگ گیاه اناریجه ( Froriepia subpinnata)، یک گیاه بومی ایران، ترکمنستان، افغانستان، قفقاز و عراق (8)، دارای خواص آنتی اکسیدانی، ضد باکتریایی (18)، و ضد سرطانی (19) است. نانوذرات مگنتیک می توانند به کمک میدان مغناطیسی سمت بافت هدف، هدایت شده و باعث اثربخشی بیشتر و سریعتر درمان شوند. همچنین به دلیل کوچک بودن اندازه، سطح فعال وسیع جهت اتصال با ترکیبات دارویی، زیست تخریب پذیری، سمیت کم، و پایداری بالا در مایعات بدن این نانوذرات، گزینه مناسبی برای استفاده در دارورسانی ها هستند (15). از سوی دیگر، Fe3O4 دارای ارجحیت به دیگر مواد مغناطیسی، به خاطر داشتن Fe2+ (یک دهنده الکترون) است. در نتیجه این نانوذرات (Fe3O4)، سایت های اتصال شیمیایی به داروها، لیگاندهای هدف، ژنها، و دیگر ترکیبات دارویی را جهت دارورسانی هدفمند، اعطا می کند (20). به این خاطر، به دلیل وجود ترکیبات شیمیایی همچون میرسنون، لیمونن، ترپینولن و ... (10) در عصاره این گیاه، و حلالیت کم این ترکیبات دارویی در آب و به تبع در مایعات بدن، در این مطالعه سعی شد از نانوکامپوزیت های مگنتیک جهت افزایش رهایش عصاره برگ اناریجه استفاده شود تا ترکیبات موجود در این گیاه، در ابعاد نانوذرات به درون سلولهای پاتوژن وارد و اثربخشی عصاره گیاهی را افزایش دهند. نتایج این مطالعه نشان داد که نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه در ترکیب با سیپروفلوکساسین قادر به مهار رشد و مهار تشکیل بیوفیلم در جدایه های سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به سیپروفلوکساسین، شدند.

در مطالعه سلیمی و همکاران نانوکامپوزیت های Fe3O4/ZnO/GO  و Fe3O4/ZnO/GO  با اندازه تقریبی 42  تا 53 نانومتر، خواص ضد سرطانی نشان دادند(21). در مطالعه پورعسگر و همکاران نانوذرات مغناطیسی عامل دار شده با ترکیب فعال زردچوبه (کورکومین) با میانگبن اندازه 40 تا 80 نانومتر سنتز و دارای خواص مغناطیسی و ضد باکتریایی و ضد سرطانی تشخیص داده شد (20). در مطالعه Xia و همکاران سنتز نانوذرات با میانگبن اندازه 40 تا 80 نانومتر توان جذب درون سلولی و زیست تخریب پذیری مناسبی داشت (22). در مطالعه حاضر نیز نانوکامپوزیت های مغناطیسی عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه اندازه 28 تا 82 نانومتر با خواص مغناطیسی داشتند که برای جذب توسط سلولها مناسب بوده و به این خاطر توانست در ترکیب با سیپروفلوکساسین خواص ضد باکتریایی در غلظت های کم دارو را نشان دهد. 

ایمانی و همکاران در سال 1396 با مطالعه برروی 69 جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا بدست آمده از چندین آزمایشگاه و بیمارستان در رشت و لاهیجان از نمونه‌هاي سوختگی، ادراري، ترشحات تنفسی، نکروز بافتی، خون، گوش نشان دادند که 33/33% این جدایه‌ها به روش انتشار از دیسک و 68/37% جدایه‌ها به روش براث دایلوشن (تعیین MIC) به سیپروفلوکساسین مقاوم بودند. ميزان مقاومت به سيپروفلوکساسين در جدایه ها به روش براث دایلوشن  بین 32 تا 1024 میکروگرم در میلی لیتر گزارش شد (23). در مطالعه مشیریان فرهی و همکاران در سال 2018 از میان 57 جدایه سودوموناس آئروژینوزا جدا شده از بیمارستان‌های تهران، 37/41 % جدایه‌ها به‌روش انتشار از دیسک، مقاوم به سیپروفلوکساسین بودند. همچنین از 30 جدایه مورد ارزیابی با MIC، 22 جدایه دارای MIC بیشتر از μg/ml 4 بودند (24). در مطالعه رجب پور و همکاران، در سال 2013 از 100 جدایه بیمارستانی سودوموناس آئروژینوزا، حدود 90 درصد موارد، مقاوم به سیپروفلوکساسین به روش MIC گزارش شد (25). در مطالعه حاضر از بین 26 جدایه بدست آمده از بیمارستان‌های تهران، 17 جدایه (4/65%) به‌روش انتشار از دیسک مقاوم به سیپروفلوکساسین گزارش شد. درحالی که همه جدایه‌ها به روش براث میکرودایلوشن، دارای MIC در محدوده 128 تا 1024 میکروگرم در میلی لیتر و مقاوم به سیپروفلوکساسین گزارش شدند. نرخ مقاومت به روش انتشار از دیسک و MIC در این مطالعه مشابه با مطالعات پیشین بود. مشابه با مطالعه ایمانی و همکاران، تفاوت میزان مقاومت در دو روش تعیین حساسیت به دارو، به دلیل دقت بالاتر روش MIC نسبت به روش انتشار از دیسک می باشد. لذا انتظار می رود در مراکز درمانی کشور با وجود چنین گزارشاتی، تعیین MIC جایگزین روش کربی بائر (انتشار از دیسک) جهت تجویز مناسبترین آنتی بیوتیک ها شود.

در مطالعه برجی و همکاران در سال 2025 اثر هم افزایی بین  نانوذرات مگنتیک عامل دار شده با سیلیبینین و سیپروفلوکساسین  در جدایه های بالینی سودوموناس آئروژینوزا مشاهده شد (15).  اسماعیلی و همکاران در سال 2019 اثر هم افزایی بین نانوکامپوزیت های اکسید نقره و جنتامایسین را علیه جدایه های بالینی سودوموناس آئروژینوزا نشان دادند (26). فاطمی و همکاران در سال2020 اثر هم افزایی بین عصاره متانولی گیاه گندواش با ایمی پنم و آمیکاسین در جدایه های بالینی اسینتو باکتر با مقاومت چنددارویی را گزارش دادند (27). در این مطالعه نیز اثر هم افزایی بین نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده حاوی اناریجه و سیپروفلوکساسین در سویه استاندارد و جدایه های بالینی سودوموناس آئروژینوزا مقاوم به سیپروفلوکساسین تأیید شد. بنابراین انتظار می رود بتوان از این گروه از ترکیبات گیاهی در عفونتهای مقاوم به دارو همراه با آنتی بیوتیکها در آینده، به عنوان مکمل های دارویی استفاده کرد.

در مطالعه پسندیده کرد محله و همکاران مشخص شد که نانوکامپوزیت های مگنتیک با پوشش سیلیکا عامل دار شده با سیلیبینین و سیپروفلوکساسین، خاصیت مهار تشکیل بیوفیلم در سویه استاندارد ATCC 9027  و جدایه های بالینی سودوموناس آئروژینوزا در مقایسه با سیپروفلوکساسین به تنهایی داشتند (17). در مطالعه پور عسگر و همکاران مشخص شد که تیمار با نانوذرات مگنتیک عامل دار شده با کورکومین و سیپروفلوکساسین، خاصیت مهار تشکیل بیوفیلم در سویه استاندارد و جدایه های بالینی اسینتو باکتر بومانی از طریق کاهش بیان ژن Bap در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین داشتند (16). در مطالعه داریوشی و همکاران در سال 2020 مشخص شد که نانوذرات کورکومین باعث کاهش ژن های دخیل در تشکیل بیوفیلم (pilA, algX و lasI)  در جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا شدند (28). در مطالعه Stenvang و همکاران در سال 2016 مشخص شد که Epigallocatechin-3-gallate اثر مهاری تشکیل بیوفیلم در عفونت‌های ناشی از سودوموناس آئروژینوزا دارد (29). کیم و همکاران نشان دادند که ترکیب فعال زنجبیل (جینجرول) باعث کاهش تشکیل بیوفیلم و کاهش بیان ژنهای مؤثر در کوروم سنسینگ در جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا می شود (30). در مطالعه حاضر نتایج آزمون تشکیل بیوفیلم در سویه استاندارد ATCC 9027 و پنج جدایه بالینی سودوموناس آئروژینوزا، کاهش تشکیل بیوفیلم را در گروه تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین نشان داد. بنابراین به نظر می رسد نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه، مهار تشکیل بیوفیلم را در ترکیب با سیپروفلوکساسین افزایش می دهد. همچنین در مطالعه حاضر بیان هر سه ژن مؤثر در تشکیل بیوفیلم (pslA ، algDو pelA) تجت تیمار با نانوکامپوزیت های  مگنتیک عامل دار شده حاوی اناریجه و سیپروفلوکساسین کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل نشان داد. بر طبق این نتایج انتظار می رود نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده حاوی اناریجه از طریق مهار بیان ژنهای مؤثر در تشکیل بیوفیلم در سلولهای مقاوم به دارو باعث افزایش مهار رشد باکتریها و افزایش اثربخشی سیپروفلوکساسین باشد.

 

نتیجه‌گیری

در مطالعه حاضر اثر هم افزایی نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با عصاره برگ اناریجه و سیپروفلوکساسین در جدایه های مقاوم به دارو تأیید شد. همچنین تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با اناریجه و سیپروفلوکساسین باعث مهار تشکیل بیوفیلم در جدایه‌های بالینی و سویه استاندارد شد. بیان ژن‌های مؤثر در تشکیل بیوفیلم  pslA ، algDو pelA بعد از تیمار با نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با اناریجه و سیپروفلوکساسین در مقایسه با تیمار با سیپروفلوکساسین به تنهایی، کاهش معنی دار نشان داد. بنابراین به نظر می رسد نانوکامپوزیت های مگنتیک عامل دار شده با اناریجه و سیپروفلوکساسین از طریق کاهش بیان ژن های مؤثر در تشکیل بیوفیلم باعث کاهش رشد سلولهای باکتریایی شدند.

 

 References

 

1.       Westbrock-Wadman S, Sherman DR, Hickey MJ, Coulter SN, Zhu YQ, Warrener P, et al. Characterization of a Pseudomonas aeruginosa efflux pump contributing to aminoglycoside impermeability. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Dec;43(12):2975-83. DOI: 10.1128/AAC.43.12.2975

2.       Ghafoor A, Hay ID, Rehm BH. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl Environ Microbiol. 2011 Aug;77(15):5238-46. DOI: 10.1128/AEM.00637-11

3.       Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 2010 Sep;8(9):623-33. DOI: 10.1038/nrmicro2415

4.       Alva PP, Sundar S, D'Souza C, Premanath R. Increased expression of genes involved in biofilm formation in a multidrug-resistant environmental Pseudomonas aeruginosa isolate. J Datta Meghe Inst Med Sci Univ. 2021;16(2):357-62.

5.       Kaboli Chalmardi M, Gholami M, Hajilou N, Kakavan M, Haghshenas M, Goli HR. Investigating the Frequency of AlgD Gene in Clinical Isolates of Pseudomonas Aeruginosa Collected from Teaching-Therapeutic Hospitals of Mazandaran-2022. J Mazandaran Univ Med Sci. 2024;34(232):218-27.

6.       Pakizehkar S, Ranji N, Sohi AN, Sadeghizadeh M. Polymersome-assisted delivery of curcumin: A suitable approach to decrease cancer stemness markers and regulate miRNAs expression in HT29 colorectal cancer cells. Polym Adv Technol. 2020 Jan;31(1):160-77. DOI: 10.1002/pat.4754

7.       Pakizehkar S, Ranji N, Naderi Sohi A, Sadeghizadeh M. Curcumin loaded PEG400-OA nanoparticles: A suitable system to increase apoptosis, decrease migration, and deregulate miR-125b/miR182 in MDA-MB-231 human breast cancer cells. Polym Adv Technol. 2020 Aug;31(8):1793-804. DOI: 10.1002/pat.4917

8.       Aladejana EB, Adelabu OA, Aladejana AE, Ndlovu SI. Antimicrobial properties of alternative medicines used in the management of infections in diabetic patients: A comprehensive review. Pharmacol Res Mod Chin Med. 2024 Sep;11:100432. DOI: 10.1016/j.prmcm.2024.100432

9.       Asafo-Agyei T, Appau Y, Barimah KB, Asase A. Medicinal plants used for management of diabetes and hypertension in Ghana. Heliyon. 2023 Dec;9(12):e22977. DOI: 10.1016/j.heliyon.2023.e22977

10.       Mirzania F, Sarrafi Y, Moridi Farimani M. Comparative Evaluation of Chemical Compositions and Biological Activities of Wild and Cultivated Froriepia subpinnata L. Essential Oils. J Agric Sci Technol. 2019;21(2):331-40.

11.       Bandian L, Moghaddam M, bahraini m. Investigate the antimicrobial activity and synergistic effects of Zataria multiflora, Salvia verticillata and Froriepia subpinnata ethanolic extracts on bacterial vegetables decay. J Food Microbiol. 2021;1(8):45-57.

12.       Adel M, Safari R, Nematollahi A, Ghiasi M, Nafian Dehkordi I. Evaluation of antifungal activity of essential oils of Eryngium campestre, Cuminum cyminum, Pimpinella affinis and Allium sativum on Fusarium solani isolated from ornamental aquarium fish. J Appl Ichthyol Res. 2015;2(4):23-32.

13.       Esmailpour K, Shourian M. Green Synthesis of Gold Nanoparticles Using Pimpinella affinis Leaf and Stem Extracts and Evaluation of Their Cytotoxic Effects Against Human Breast Cancer Cells Under In-vitro Condition. Cell Tissue J. 2023;14(3):217-40.

14.       Roudbaraki ZA, Ranji N, Mohammadipour A, Ghasemnegad Z. The effect of silybin-encapsulated micelle nanoparticles on mexY expression in ciprofloxacin-resistant isolates of Pseudomonas aeruginosa. J Microb World. 2018;36(11):269-77.

15.       Borji S, Shahriarinour M, Shariati S, Ranji N, Nikpassand M. Enhanced therapeutic efficacy of silibinin loaded silica coated magnetic nanocomposites against Pseudomonas aeruginosa in Combination with Ciprofloxacin and HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2025;15(1):21498. DOI: 10.1038/s41598-025-87012-4

16.       Pourasgar S, Ranji N, Asadpour L, Shahriarinour M, Nikpassand M. Antibacterial and Anti-cancer Properties of Curcumin-Functionalized Silica-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles. Arab J Sci Eng. 2024.

17.       Kordmahaleh NP, Mipour M, Ranji N, Shahriarinour M, Nikpassand M. Anti-bacterial activity of silibinin-functionalized silica-coated Fe3O4 magnetic nanocomposites on Pseudomonas aeruginosa. 3 Biotech. 2025;15(8):253.

18.       Bahrami A, Jamzad M, Sedaghat S. Phytochemicals and Biological Activities of Froriepia subpinnata (Ledeb.) Baill. Extracts. J Med plants By-products. 2021;10(1):109-15.

19.       Rostamabadi H, Samandari Bahraseman MR, Esmaeilzadeh-Salestani K. Froriepia subpinnata Leaf Extract-Induced Apoptosis in the MCF-7 Breast Cancer Cell Line by Increasing Intracellular Oxidative Stress. Iran J Pharm Res. 2023;22(1):e136643. DOI: 10.5812/ijpr-136643

20.       Pourasgar S, Ranji N, Asadpour L, Shahriarinour M, Nikpassand M. Antibacterial and Anti-cancer Properties of Curcumin-Functionalized Silica-Coated Fe3O4 Magnetic Nanoparticles. Arab J Sci Eng. 2025;50(9):6231-49.

21.       Salimi N, Mohammadi-Manesh E, Ahmadvand N, Danafar H, Ghiasvand S. Curcumin-Loaded by Fe3O4/GO and Fe3O4/ZnO/GO Nanocomposites for Drug Delivery Applications: Synthesis, Characterization and Anticancer Assessment. J Inorg Organomet Polym Mater. 2024;34(3):1256-71. DOI: 10.1007/s10904-023-02879-3

22.       Xia Q, Huang J, Feng Q, Chen X, Liu X, Li X, et al. Size- and cell type-dependent cellular uptake, cytotoxicity and in vivo distribution of gold nanoparticles. Int J Nanomedicine. 2019;14:6957-70. DOI: 10.2147/IJN.S215005

23.       Imani Pirsaraei B, Ranji N, Asadpour L. Investigation the Effect of Micelle Nanoparticles Containing Curcumin on Ciprofloxacin Resistant Isolates of Pseudomonas Aeruginosa and on mexC and mexD Genes Expression. J Arak Univ Med Sci. 2018;21(2):10-20.

24.       Farahi RM, Ali AA, Gharavi S. Characterization of gyrA and parC mutations in ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from Tehran hospitals in Iran. Iran J Microbiol. 2018 Aug;10(4):242-9. PMID: 30675330; PMCID: PMC6339890.

25.       Rajabpour M, Alikhani MY. MIC determination of Pseudomonas aeruginosa strains were isolated from clinical specimens of patients admitted to educational hospitals in Hamedan (90-91). Iran J Med Microbiol. 2013;7(3):18-25.

26.       Esmaili S, Hosseini Doust R. Synergistic effect of silver nanoparticles (AgNPs) and gentamicin against clinical isolates of Pseudomona aeruginosa. Med Sci J Islam Azad Univ. 2019;29(1):64-70.

27.       Fatemi N, Sharifmoghadam MR, Bahreini M, Khameneh B, Shadifar H. Antibacterial and Synergistic Effects of Herbal Extracts in Combination with Amikacin and Imipenem Against Multidrug-Resistant Isolates of Acinetobacter. Curr Microbiol. 2020 Sep;77(9):1959-67. DOI: 10.1007/s00284-020-02075-3

28.       Dariushy R, Ashrafi F. Effect of Curcumin Nanoparticles on Biofilm Gene Expression in Pseudomonas Aeruginosa. Res Med. 2022;46(3):95-104.

29.       Stenvang M, Dueholm MS, Vad BS, Seviour T, Zeng G, Geifman-Shochat S, et al. Epigallocatechin gallate remodels overexpressed functional amyloids in Pseudomonas aeruginosa and increases biofilm susceptibility to antibiotic treatment. J Biol Chem. 2016 Dec 23;291(51):26540-53. DOI: 10.1074/jbc.M116.739375

30.       Kim HS, Lee SH, Byun Y, Park HD. 6-Gingerol reduces Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and virulence via quorum sensing inhibition. Sci Rep. 2015 Feb 25;5:8656. DOI: 10.1038/srep08656

 

17

 

---

[1]  Fractional Inhibitory Concentration Index

---