بهينه سازی ريزازديادی گياه دارويی پامچال (Perimula veris )

ريز ازديادی گياه پامچال

محورهای موضوعی : زیست شناسی گیاهی

فرح فراهانی ¹ , زهرا صبوری ² , محسن زرگر ³

1 - استاد گروه زیست شناسی، دانشکده علوم کوانتوم و زیست اجتماعی، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران
2 - دانش آموخته گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه پیام نور (مرکز شرق)، تهران، ایران
3 - دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم کوانتوم و زیست اجتماعی، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران.

تاریخ دریافت : 1404/04/11 تاریخ پذیرش : 1404/05/16 تاریخ انتشار : 1404/06/09

کلید واژه: بنزیل‌آمینوپورین (BAP), کشت در‌شیشه‌, شاخه‌زایی, بذرهای محلات و آمل, ریزازدیادی,

چکیده مقاله :

مقدمه: پامچال (Primula veris L.) یکی از گیاهان دارویی ارزشمند است که در پزشکی و صنعت داروسازی اهمیت دارد. بدلیل محدودیت‌های تکثیر طبیعی و لزوم حفظ منابع ژنتیکی، ریزازدیادی روشی کارآمد برای تولید انبوه و یکنواخت گیاهان سالم بشمار می‌رود. هدف پژوهش تأثیر مقادیر مختلف بنزیل‌آمینوپورین (BAP) و ایندول استیک اسید (IAA) بر باززایی و رشد In vitro  شاخساره‌های بذور محلات و آمل بود.

مواد و روش ها: جهت تکثیر از تیمارها با مقادیر 1، 5/1، 2 و 5/2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/1 میلی گرم بر لیتر IAA  استفاده شد.

یافته ها: تجزیه واریانس نشان دادند، اثر متقابل مقدار هورمون و منبع بذر بر صفات طول و تعداد ساقه، طول و تعداد برگ در سطح احتمال 5% معنادار بود. بیشترین طول ساقه در تیمارهای 1و 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP بذر محلات و کمترین طول ساقه در تیمار 5/2 میلی گرم بر لیتر BAP بذر آمل مشاهده شد. بیشترین میانگین تعداد ساقه، تعداد و طول برگ در تیمار 2 میلی گرم بر لیتر BAP بذر محلات و بیشترین تعداد ساقه در بذر آمل در تیمار 1 میلی گرم بر لیتر BAP به‌دست آمد. نتایج آزمون‌های مقایسه میانگین (LSD و دانکن) نیز تفاوت معنی‌دار بین تیمارها را در صفات تأیید کرد. به‌طور کلی، مقادیر 5/1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP بیشترین تأثیر را در بهبود شاخص‌های رشدی در هر دو نوع بذر محلات و آمل داشتند.

نتیجه گیری: این یافته‌ها می‌توانند مبنایی برای بهینه‌سازی ریزازدیادی و توسعه پروتکل‌های تکثیر In vitro جهت برنامه‌های اصلاحی آینده فراهم سازند.

چکیده انگلیسی:

Introduction: Primula veris L., a valuable medicinal plant in medicine and the pharmaceutical industry. Due to limitations in natural propagation and the necessity to conserve genetic resources, micropropagation offers an efficient approach for the mass production of uniform and healthy plants. This study aimed to evaluate the effects of different concentrations of benzylaminopurine (BAP) on in vitro regeneration and growth of shoot explants derived from seeds of two Iranian: Mahallat and Amol.

Materials and Methods: The experimental treatments included BAP concentrations of 1, 1.5, 2 and 2.5 mgl^-1 and IAA 1.5 mgl^-1.

Results: Analysis of variance (ANOVA) revealed that the interaction between hormone concentration and seed origin had a significant effect (p < 0.05) on shoot length, number of shoots, leaf length, and number of leaves. The highest shoot length was observed in treatments 1, 1.5 mg^-1 of Mahallat seeds, while the lowest was recorded in treatment 2.5 mg^-l of Amol seeds. The greatest mean values for shoot number, leaf number, and leaf length were obtained in treatment 1.5 mg^-1 of Mahallat seeds, while the highest shoot number for Amol was observed in treatment 1 mg^-1. Mean comparison tests (LSD and Duncan’s multiple range test) confirmed significant differences among most treatments across the evaluated traits. Overall, BAP concentrations of 1.5 mgl^-1 and 2 mgl^-1 were most effective in enhancing growth parameters in both Mahallat and Amol seeds.

Conclusion: These findings provide a practical basis for optimizing micropropagation and developing efficient in vitro multiplication protocols for future breeding programs.

منابع و مأخذ:

1. Okrslar V, Plaper I, Kovac M, Erjavec A, Obermajer T, Rebec A, et al. Saponins in tissue culture of Primula veris L. In Vitro Cell Dev Biol-Plant. 2007;43(6):644–51. doi:10.1007/s11627-007-9072-3.
2. Coumans M, Coumans-Gilles MF, Delhez J, Gaspar T. Mass propagation of Primula obconica. Acta Hortic. 1979;(91):287–94. doi:10.17660/ActaHortic.1979.91.33.
3. Morozowska M, Cieszkowski A, Polskiego W. In vitro clonal propagation of Primula veris L. and preliminary phytochemical analysis. Acta Biol Cracov Ser Bot. 2004;46(2):169–75.
4. Ebrahimpour F, Eidizadeh K. Medicinal Plants. Tehran: Payamnoor Publisher; 2003.
5. Tütüncü M. In vitro culture of Primula: A review. Int J Agric Nat Sci. 2020;13(2):118–25.
6. Hayta S, Smedley MA, Li J, Harwood WA, Gilmartin PM. Plant Regeneration from Leaf-derived Callus Cultures of Primrose (Primula vulgaris). HortScience. 2016;51(5):558–62. doi:10.21273/HORTSCI.51.5.558.
7. Jedrzejczyk I, Morozowska M, Nowinska R, Jagodzinski AM. Primula veris plants derived from in vitro cultures and from seeds: genetic stability, morphology, and seed characteristics. Turk J Bot. 2016;42(4):412–22. doi:10.3906/bot-1802-7.
8. Wang MR, Bettoni JC, Zhang AL, Lu X, Zhang D, Wang QC. In Vitro Micrografting of Horticultural Plants: Method Development and the Use for Micropropagation. Horticulturae. 2022;8(7):576. doi:10.3390/horticulturae8070576.
9. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol Plant. 1962;15(3):473–97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.
10. Chandravanshi M, Yashwant S, Agrawal A, Raja W. In vitro Micropropagation of Important Commercial Medicinal Plant: Plumbago zeylanica. Adv Biol Res. 2014;8(3):139–42. doi:10.5829/idosi.abr.2014.8.3.81121.
11. Sivakumar P, Chitra M, Sasikala K, Selvamurugan M, Karunakaran V. An Overview of Pharmaceutical Applications and In Vitro Micropropagation Techniques for Rare and Endangered Plant Specie. J Adv Biol Biotechnol. 2024;27(9):573–85. doi:10.9734/jabb/2024/v27i91330.
12. Noroozisharaf A, Hamidoghli Y, Zakizadeh H. In vitro seed germination and micropropagation of primrose (Primula heterochroma Stapf.) an endemic endangered Iranian species via shoot tip explants. Hortic Environ Biotechnol. 2011;52(3):298–302. doi:10.1007/s13580-011-0129-1.
13. Benson EE, Danaher JE, Pimbley IM, Anderson CT, Wake JE, Daley S, et al. In vitro micropropagation of Primula scotica: A rare Scottish plant. Biodivers Conserv. 2000;9(6):711–26. doi:10.1023/A:1008941726419.
14. Noroozisharaf A, Hatamzadeh A, Samizadeh Lahiji H, Bakhshi D. Genetic diversity of endangered primrose (Primula heterochroma Stapf.) accessions from Iran revealed by ISSR and IRAP markers. Sci Hortic. 2015;190:173–8.

متن کامل:



بهينه سازی ريزازديادی گياه دارويی پامچال (Perimula veris  )

 

فرح فراهانی1 *، زهرا صبوری 2، محسن زرگر3

 

1.  استاد گروه زیست شناسی، دانشکده علوم کوانتوم و زیست اجتماعی، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران.

2.  دانش آموخته گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه پیام نور (مرکز شرق)، تهران، ایران.

۳- دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم کوانتوم و زیست اجتماعی، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران.

 

عنوان کوتاه شده:  ريز ازديادی گياه پامچال

ارسال: 11/4/1404 

بازنگری 2/5/1404  

 پذیرش : 16/5/1404

 

* نویسنده مسؤل:  [e-mail]

 

چکیده

مقدمه: پامچال (Primula veris L.) یکی از گیاهان دارویی ارزشمند است که در پزشکی و صنعت داروسازی اهمیت دارد. بدلیل محدودیت‌های تکثیر طبیعی و لزوم حفظ منابع ژنتیکی، ریزازدیادی روشی کارآمد برای تولید انبوه و یکنواخت گیاهان سالم بشمار می‌رود. هدف پژوهش تأثیر مقادیر مختلف بنزیل‌آمینوپورین (BAP) و ایندول استیک اسید (IAA) بر باززایی و رشد In vitro  شاخساره‌های بذور محلات و آمل بود.

مواد و روش ها: جهت تکثیر از تیمارها با مقادیر 1، 5/1، 2 و 5/2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/1 میلی گرم بر لیتر IAA  استفاده شد.

یافته ها: تجزیه واریانس نشان دادند، اثر متقابل مقدار هورمون و منبع بذر بر صفات طول و تعداد ساقه، طول و تعداد برگ در سطح احتمال 5% معنادار بود. بیشترین طول ساقه در تیمارهای 1و 5/1 میلی گرم بر لیتر BAP بذر محلات و کمترین طول ساقه در تیمار 5/2 میلی گرم بر لیتر BAP بذر آمل مشاهده شد. بیشترین میانگین تعداد ساقه، تعداد و طول برگ در تیمار 2 میلی گرم بر لیتر BAP بذر محلات و بیشترین تعداد ساقه در بذر آمل در تیمار 1 میلی گرم بر لیتر BAP به‌دست آمد. نتایج آزمون‌های مقایسه میانگین (LSD و دانکن) نیز تفاوت معنی‌دار بین تیمارها را در صفات تأیید کرد. به‌طور کلی، مقادیر 5/1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP بیشترین تأثیر را در بهبود شاخص‌های رشدی در هر دو نوع بذر محلات و آمل داشتند.

نتیجه گیری: این یافته‌ها می‌توانند مبنایی برای بهینه‌سازی ریزازدیادی و توسعه پروتکل‌های تکثیر In vitro جهت برنامه‌های اصلاحی آینده فراهم سازند.

کلمات کلیدی: بنزیل‌آمینوپورین (BAP)، کشت در‌شیشه‌، شاخه‌زایی، بذرهای محلات و آمل، ریزازدیادی

 

شـــیوه آدرس دهـــی این مقاله: ف فراهانی، ز صبوری ، م زرگر.  بهينه سازی ريزازديادی گياه دارويی پامچال (Perimula veris  ). مجله دانش زیســـتی ایـــران. 1403؛19 (4): ۱-..

Optimization of In Vitro Micropropagation of the Medicinal Plant Primula veris L.

 

Farah Farahani *1, Zahra Sabouri 2, Mohsen Zargar 3

 

1. Full professor, Department of Biology, Institute of Quantum Science and Social Biology, Qo. C., Islamic Azad University, Qom, Iran.

2 MSc, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Payame Noor University (East Tehran Branch), Tehran, Iran.

3. Associate professor, Department of Biology, Institute of Quantum Science and Social Biology, Qo. C., Islamic Azad University, Qom, Iran.

 

*Corresponding author : [e-mail]

 

Submitted: 2  ⁄  7  ⁄  2025

Revised: 24  ⁄  7  ⁄  2025

Accepted: 7  ⁄  8  ⁄  2025

 

 

Abstract

Introduction: Primula veris L., a valuable medicinal plant in medicine and the pharmaceutical industry. Due to limitations in natural propagation and the necessity to conserve genetic resources, micropropagation offers an efficient approach for the mass production of uniform and healthy plants. This study aimed to evaluate the effects of different concentrations of benzylaminopurine (BAP) on in vitro regeneration and growth of shoot explants derived from seeds of two Iranian: Mahallat and Amol.

Materials and Methods: The experimental treatments included BAP concentrations of 1, 1.5, 2 and 2.5 mgl-1 and IAA 1.5 mgl-1.

Results: Analysis of variance (ANOVA) revealed that the interaction between hormone concentration and seed origin had a significant effect (p < 0.05) on shoot length, number of shoots, leaf length, and number of leaves. The highest shoot length was observed in treatments 1, 1.5 mg-1 of Mahallat seeds, while the lowest was recorded in treatment 2.5 mg-l of Amol seeds. The greatest mean values for shoot number, leaf number, and leaf length were obtained in treatment 1.5 mg-1 of Mahallat seeds, while the highest shoot number for Amol was observed in treatment 1 mg-1. Mean comparison tests (LSD and Duncan’s multiple range test) confirmed significant differences among most treatments across the evaluated traits. Overall, BAP concentrations of 1.5 mgl-1 and 2 mgl-1 were most effective in enhancing growth parameters in both Mahallat and Amol seeds.

Conclusion: These findings provide a practical basis for optimizing micropropagation and developing efficient in vitro multiplication protocols for future breeding programs.

Keywords: Benzylaminopurine (BAP), In vitro culture, Shoot proliferation, Mahallat and Amol seeds, Micropropagation

 

 

مقدمه

گياه پامچال از جنس Primula به خانواده Primulaceae تعلق دارد. با نام علمي primula veris L.  شناخته می شود. پامچال گياهي علفي و چند ساله است. منشأ آن اروپاي مرکزي و آسيا گزارش شده است و در مناطق سرد و مرطوب شمال ايران رشد مي کند و به طور وحشي در جنگلها و بيشه زارها مي رويد (1). برگ ها خاصيت دارويي دارند و مي توان آنها را به لحاظ داشتن ويتامين ها و ساپونين ها مورد استفاده قرار داد. اين گياه در درمان هاي خانگي براي معالجه سرفه، برونشيت، زکام و همچنين به عنوان مسکن و يک ادرارآور و ضدانعقاد استفاده مي شود، همچنين در درمان بيماريهاي عصبي، تنفسي، کليوي و خوني کاربرد دارد. البته پامچال علاوه بر خواص مذکور، دارویي تب بر، ضدانگل و حالت تهوع را درمان مي نمايد. اثرات دارويي بالا به خاطر وجود متابوليت هاي ثانويه از جمله آلکالوئيدها مي باشد. متابوليت هاي ثانويه اين گياه، از جمله ساپونين هايي که داراي خواص موثر اسپکتورانتي هستند به دليل توانايي در از بين بردن موکوس يا خلط مي توانند به شربت هاي سرفه اي که در درمان بيماري هاي برونشيتي يا ريوي به کار مي روند اضافه شود (1).

کاشت و تکثير اين گياه به وسيله بذر و به طريق رويشي انجام مي شود. اگر چه تکثير پامچال از طريق بذر امکان پذير است، ولي روش مناسبي نيست زيرا بذرهاي پامچال به سرعت قوه ناميه خود را از دست مي دهند، رشد و نمو گياهان به کندي صورت مي گيرد، بدليل تفرق صفات يکنواختي لازم وجود ندارد، دوره نونهالی طولانی تر است و کيفيت اوليه بذر از بين مي رود، همچنين بي نظمي و تاخير در جوانه زني بذر در اکثر گونه هاي پامچال مانع جدي براي تولید انبوه اين گياهان است (2،3). براي آن دسته از گياهان كه نياز به يكنواختي دارند روش بذر كاري براي تكثير آن ها مشكل آفرين است. همچنين در بعضي گياهاني كه زمان لازم براي بلوغ و به گل رفتن گياه طولاني است، هزينه زيادي دارد(4).

پامچال دارای گل‌هایی جذاب بوده و به‌طور گسترده به‌عنوان گیاهان زینتی باغچه‌ای و گلدانی کشت می‌شوند. برخی گونه‌های پامچال از اهمیت اقتصادی قابل‌توجهی در صنعت گیاهان زینتی برخوردار هستند. در سیستم‌های تولید تجاری، هیبریدهای پامچال عمدتاً از طریق بذر تکثیر می‌شوند؛ هرچند که امکان تقسیم بوته نیز برای برخی گونه‌ها وجود دارد. با این حال، مشکلاتی مانند جوانه‌زنی نامنظم یا دیرهنگام و نرخ جوانه‌زنی پایین بذرها در بسیاری از گونه‌های پامچال، مانع از تکثیر انبوه آن‌ها می‌شود. از اینرو، تکنیک‌های کشت بافت گیاهی به‌عنوان ابزارهای ارزشمندی در برنامه‌های اصلاح نژادی، گسترش تنوع ژنتیکی، انتقال ژن و همچنین حفاظت از منابع ژنتیکی گیاهی در پامچال مطرح هستند (5).

ریزازدیادی گونه‌های Primula از اهمیت بالایی برای مطالعات علمی بنیادی و نیز کاربردهای تجاری برخوردار است. Primula vulgaris، دارای ناهم‌ریختی گل (floral heteromorphy) بوده و دو نوع متمایز از گل‌های هرمافرودیت تولید می‌کند. مطالعاتی که به شناسایی ژن‌های مؤثر در توسعه این ناهم‌ریختی گلی می‌پردازند، نیازمند تکثیر گیاهان جهش‌یافته گلی هستند و باززایی مؤثر، شرط کلیدی برای ایجاد سیستم‌های تراریختی در این گیاه است. چندین رقم از گونه، P. vulgaris و هیبریدهای P. × polyantha، به‌عنوان محصولات زینتی مهم شناخته می‌شوند. ارقام نیمه‌پر یا پرگل (semidouble/double) پامچال نیز از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند. با این حال، تکثیر رویشی این ارقام عقیم و همچنین افزایش تعداد والدین هم‌نژاد برای تولید بذر هیبرید F1، روندی کند دارد. در این میان، ریزازدیادی سریع‌ترین و کارآمدترین روش برای افزایش تعداد این ارقام است. یک پروتکل مؤثر و کارآمد برای باززایی In vitro ، P. vulgaris از طریق اندام‌زایی غیرمستقیم از ریزنمونه‌های برگ بالغ توسعه داده شده است. پروتکل ریزازدیادی امکان تکثیر P. vulgaris را بدون محدودیت‌های فصلی و بدون تخریب گیاه والد ارزشمند فراهم می‌سازد. این روش، با توسعه بیشتر، بعنوان پایه‌ برای طراحی سیستم‌های تراریختی در پامچال و مقاومت به بیماری‌ها در شرایط آزمایشگاهی حائز اهمیت است (6).

کاربرد روش هاي زیست فناوري کشت بافت به منظور تكثير و افزايش توان ژنتيكي گياهان دارويي و همچنين شناسايي سريع تر و دقيق تر ژنوتيپ هايي كه مواد موثره بيشتري توليد مي كنند، مي تواند بسيار مفيد و از لحاظ تجاري بسيار سودآور باشد. یکی از روش هاي مختلف براي تكثير با تکنيک کشت بافت ريزازديادي است، با ريزازديادي مي توان نرخ تكثير را بالا برد و مواد گياهي عاري از پاتوژن توليد كرد (4).

اندازه‌گیری مقدار DNA با استفاده از روش فلو سایتومتری، پایداری ژنتیکی گیاهان Primula veris L.. حاصل از فرآیند ریزازدیادی را تأیید می کند. پامچال در گروه گیاهان با ژنوم بسیار کوچک طبقه‌بندی می‌شود. منشأ گیاهان به‌طور معناداری ویژگی‌های مورفولوژیکی را تحت تأثیر قرار داده است. گیاهان مشتق از ریزازدیادی، بذرهای بزرگ‌تری تولید کردند. یافته‌های این پژوهش نویدبخش استفاده گسترده از گیاهان باززایی‌شده پامچال در باغبانی زینتی و صنعت داروسازی هستند (7).

کشت ریزپیوندی درشیشه (In vitro micrografting) یکی از تکنیک‌های مهم و پشتیبان در ریزازدیادی بسیاری از گونه‌های گیاهی، به‌ویژه گیاهان چوبی، محسوب می‌شود. این روش به‌عنوان یک راهبرد مؤثر برای بازیابی شاخه‌ها و سازگاری گیاهان رشد یافته در شرایط In vitro با محیط خارج توسعه یافته است. از کاربردهای این تکنیک در ریزازدیادی می‌باشد که نقش‌های کلیدی در بازگرداندن بنیه رشد و توانایی ریشه‌زایی گیاهان، افزایش باززایی شاخه‌ها پس از جنین‌زایی سوماتیکی یا اندام‌زایی، کمک به رشد مجدد شاخه‌ها پس از فرآیند نگهداری در دمای بسیار پایین (کریوپریزرویشن) دارد.

این تکنیک بویژه بعنوان ابزاری بالقوه در مهندسی ژنتیک گیاهان باغبانی و حفاظت ایمن از ذخایر ژنتیکی گیاهی مورد تأکید قرار گرفته است (8).

در اين پژوهش بهينه سازی ريزازديادی گياه پامچال انجام شده است، زیرا پامچال يک گونه در معرض انقراض است و در بعضي نواحي به صورت محافظت شده مي باشد. در نتيجه يک راه موثر براي به دست آوردن متابوليت هاي با ارزش از پامچال، تکنولوژي کشت بافت مي باشد. اما اطلاعات بسيار کمي از روش هاي کشت بافت گياهان جنس Primula موجود است. کشت بافت گياهان يک راه اميد بخش ديگر براي توليد گروهی از متابوليت هایی است که به دست آوردن آنها از راه هاي سنتتيک شيميايي يا عصاره گيري گياهي مشکل است و بنابراين چاره اي جز استفاده از روش هاي زيست فناوري باقي نمي ماند. معمولا کشت بافت به کيفيت توليد و محصول باارزش اهمیت مي دهد (1).

به علاوه کشت بافت با استفاده از تکنيک هاي پيشرفته زيست فناوري فرصت هاي جديدي در افزايش توليد ترکيبات جديد ارائه مي دهد. ریزازدیادی گونه‌های پامچال در شرایط آزمایشگاهی یک تکنیک حیاتی هم برای حفاظت و هم برای باغبانی تجاری است. این روش امکان تکثیر سریع و کارآمد گونه های مختلف پامچال، از جمله آنهایی که نادر یا در معرض خطر هستند را فراهم می کند. 

 

مواد و روشها

مواد گياهی، تهیه گیاهچه استریل

  بذور پامچال پس از جمع آوري از مناطق محلات و آمل ابتدا به مدت 20 دقیقه در جریان آب شهر قرارگرفتند. در مرحله بعد با الکل 70 درصد به مدت 1 دقیقه و سپس در آب ژاول 30 درصد به مدت20 دقیقه ضدعفونی شدند. سپس بذرها 5 بار با آب مقطر استریل در زیر هود لامينار شستشو داده شدند. بذور استریل شده در محیط کشت پایه استریل (Murashige, Skoog 1962) MS  حاوي ساکارز (3%)  و آگار (1%) با 7/5 :pH کشت می شوند (9). شرايط اتاق کشت با دمای 2±25 درجه سانتی گراد و فتوپريود 16 ساعت نور و 8 ساعت تاريکی برای جوانه زنی و رشد در نظر گرفته شده است.

شرايط کشت

 آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام شد. تاثیر تيمار هورمون های بنزیل آمینوپورین( BAP ) و اندول استیک اسید (IAA) و سطوح مختلف هورمونی (1، 5/1 ، 2، 5/2 ميلی گرم بر ليتر برای هورمون BAP و 5/1 ميلی گرم بر ليتر برای هورمون IAA ) (طبق جدول 1) و يک نوع قطعه جداکشت (نوک یا جوانه شاخساره) مورد بررسی قرار گرفتند. 

 

 

جدول1. تیمارهای مقادیر متفاوت هورمون در بهينه سازي ريزازديادی گياه پامچال (Primula veris L.)

     

نوک شاخساره )به طول حدود 5 ميلي­متر) از دانه رست هاي سه هفته اي که در شرايط آزمايشگاهي رشد کردند به عنوان جداکشت مورد استفاده قرار گرفت. جداکشت ها به محيط هاي کشت MB1(MS+ BAP 2.5 mgl-1, IAA 1.5 mgl-)،   MB2(MS+ BAP 2 mgl-1, IAA 1.5 mgl-1)،  MB3(MS+ BAP 1/5 mgl-1, IAA 1.5 mgl-1) و MB4 (MS+ BAP 1 mgl-1, IAA 1 mgl-1) منتقل شدند و در دمای 2± 25 درجه سانتی گراد و فتوپريود 16 ساعت روشنايي در اتاق رشد نگهداري شدند. صفات مورفولوژيک طول ساقه، تعداد شاخساره و تعداد برگ در تيمارهاي مختلف پس از طي دوره 30 روزه مورد بررسي قرار گرفتند.

 

آناليز آماری داده ها

داده هاي حاصل از طرح بلوک های تصادفی با آزمون های آماري و نرم افزاز SPSS (Version 21) مورد تجزيه و تحليل قرار

گرفتند. میانگین داده ها و انحراف معیار، آنالیز ANOVA ، گروه بندی دانکن و مقایسه حداقل میانگین داده ها (LSD) بررسی و

سپس نمودارها با نرم افزار اکسل رسم شدند.

 

نتايج

 

تاثیر تيمارهای مختلف در صفات مورفولوژيکی گياهچه هاي پامچال حاصل از بذرهای مناطق محلات و آمل

بيشترين ميانگين طول ساقه 16 ميلی متر در تیمارهای MB3 و MB4، بذر محلات و بيشترين ميانگين طول ساقه 2 ميلی متر در تیمار MB1، بذر آمل مشاهده شدند. در گروه بندی دانکن غلظت های هورمونی 1، 5/1 و 2 میلی گرم بر لیتر (تیمارهای MB1، MB2 و MB3) نسبت به 2 میلی گرم بر لیتر (تیمار MB4) BAP، در طول ساقه بذر محلات و غلظت های هورمونی 1 و 5/1 میلی گرم بر لیتر (تیمارهای MB3 و MB4) نسبت به 5/2 میلی گرم بر لیتر (تیمار MB4) و غلظت هورمونی 2 میلی گرم بر لیتر (تیمار MB4) نسبت به غظت هورمونی 1  میلی گرم بر لیتر (تیمار MB1) BAP، در طول ساقه بذر آمل در گروههای متفاوت قرار داشتند و در سطح احتمال %5 معنا دار بودند (جدول 2).

تجزیه واریانس اثرات متقابل غلظت هورمونی و جداکشت نوک شاخساره بذرهای محلات و آمل نشان دادند،  ميانگين طول ساقه در غلظت های هورمون BAP مورد نظر  تفاوت معنی داري را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (جدول 3).

بيشترين ميانگين تعداد ساقه 10 عدد در هر جداکشت تيمار MB2، بذر محلات و بيشترين ميانگين تعداد ساقه 10 عدد در هر جداکشت تيمار MB4، بذر آمل مشاهده شدند. در گروه بندی دانکن غلظت های هورمونی 1، 2 و 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر BAP، در تعداد ساقه بذر محلات و غلظت های هورمونی 1 ، 5/1 و 2 میلی گرم بر میلی لیتر (در یک گروه) نسبت به 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر BAP، در تعداد ساقه بذر آمل در گروههای متفاوت قرار داشتند و در سطح احتمال 5% معنا دار بودند (جدول 2).

تجزیه واریانس اثرات متقابل غلظت هورمونی و جداکشت نوک شاخساره بذر محلات بر ميانگين تعداد ساقه نشان دادند ميانگين تعداد ساقه در غلظت های هورمونی 1، 5/1 و 5/2 ميلی گرم بر ليتر هورمونی BAP (تیمارهای MB4، MB3 و MB2) و بذر آمل غلظت هورمونی 5/2 ميلی گرم بر ليتر هورمونی BAP (تیمار MB4) نسبت به سایر تیمارها تفاوت معنی داري را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (جدول 3). 

بيشترين ميانگين طول برگ 11 ميلی متر در تيمار MB2 ، بذر محلات و بيشترين ميانگين طول برگ 9 ميلی متر در تيمار MB3، بذر آمل مشاهده شدند. در گروه بندی دانکن غلظت های هورمونی 5/1، 2 و 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر BAP (تیمارهای MB4، MB3 و MB2)، در طول برگ بذر محلات در سه گروه متفاوت قرار داشتند و در سطح احتمال 5% معنا دار بودند. در غلظت های هورمونی متفاوت BAP، در طول برگ بذر آمل در یک گروه قرار داشتند و در سطح احتمال 5% معنا دار نبودند (جدول 2).

تجزیه واریانس اثرات متقابل غلظت هورمونی و جداکشت نوک شاخساره بذرهای محلات و آمل بر ميانگين تعداد ساقه  نشان دادند ميانگين تعداد ساقه در غلظت های هورمونی 1، 5/1، 2 و 5/2 ميلی گرم بر ليتر هورمون BAP  تفاوت معنی داري را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (جدول 3).

بيشترين ميانگين تعداد برگ 39 عدد در هر گياهچه تيمار MB2، بذر محلات و بيشترين ميانگين تعداد برگ 6 عدد در هر گياهچه تيمار MB4، بذر آمل مشاهده شدند. در گروه بندی دانکن غلظت های هورمونی 1، 2 و 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر BAP (تیمارهای MB4، MB2 و MB1)، در تعداد برگ بذر محلات و غلظت های هورمونی 1 و 5/2 میلی گرم بر میلی لیتر BAP (تیمارهای MB4 و MB3)، در تعداد برگ بذر آمل در گروههای متفاوت قرار داشتند و در سطح احتمال 5% معنا دار بودند (جدول 2).

تجزیه واریانس اثرات متقابل غلظت هورمونی و جداکشت نوک شاخساره بذرهای محلات و آمل بر ميانگين تعداد ساقه  نشان دادند ميانگين تعداد ساقه در غلظت های هورمونی 1، 5/1، 2 و 5/2 ميلی گرم بر ليتر هورمون BAP  تفاوت معنی داري را در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (جدول 3). 

نتايج تجزيه واريانس نشان مي‌دهد، اثر تيمارهاي مختلف بر تعداد برگ، طول برگ، طول ساقه و تعداد ساقه در گیاهچه های بذر محلات و تعداد برگ، طول ساقه و تعداد ساقه در گیاهچه های بذر آمل در سطح P<0.05  معنادار است (جدول 3). 

نتايج آزمون مقايسه ميانگين ها (LSD) در سطح احتمال پنج درصد نشان مي دهد که در مورد صفت تعداد برگ گیاهچه بذر محلات بين همه تيمارها اختلاف معني دار است، در مورد اندازه برگ گیاهچه بذر محلات نيز اختلاف بين همه تيمارها با هم معني دار بود. نتيجه اين آزمون در مورد طول ساقه گیاهچه بذر محلات نشان مي دهد که تيمار  MB2با تيمارهاي MB3 و MB4  اختلاف معني داري ندارند. همچنين در مورد تعداد ساقه گیاهچه بذر محلات اختلاف بين تيمارهاي MB2 و MB3 معني دار نيست. 

نتايج آزمون مقايسه ميانگين ها (LSD) در سطح احتمال پنج درصد نشان مي دهد که در  مورد صفت تعداد برگ گیاهچه بذر آمل، بين همه تيمارها اختلاف معني دار است، در مورد اندازه برگ گیاهچه بذر آمل اختلاف بين تيمارهاي MB3 و MB4 با هم معني دار نبود. نتيجه اين آزمون در مورد طول ساقه گیاهچه بذر آمل نشان مي دهد که تيمارهاي MB4 و MB2 اختلاف معني داري ندارند.  همچنين در مورد تعداد ساقه گیاهچه بذر آمل اختلاف بين همه تيمارها باهم معني دار بود.

 

MB1

MB2

MB3

MB4

      

     شکل ۱. صفات مورفولوژیکی گیاهچه های پامچال حاصل از بذر محلات

 

MB3

MB1

MB2

MB4

      

    شکل 2. صفات مورفولوژیکی گیاهچه های پامچال حاصل از بذر آمل

 

جدول 2. ميانگين صفات مورفولوژيکي گياهچه هاي پامچال بذرهای محلات و آمل در تيمارهای متفاوت

 

مقدار هورمون BAP(mgl-1)

مقدار هورمون IAA(mgl-1)

تیمار

تعداد برگ

طول برگ (mm)

طول ساقه (mm)

تعداد ساقه

بذر محلات

بذر آمل

بذر محلات

بذر آمل

بذر محلات

بذر آمل

بذر محلات

بذر آمل

1

5/1

MB4

b 3± 19

a 0± 6

b 0± 7

a 0± 9

a 1± 16

b 0± 00/1

b 1± 5

a 1± 10

5/1

5/1

MB3

ab 3± 26

ab 0± 5

b 2± 6

a 0± 9

a 2± 16

b 0± 00/1

b 1± 5

a 1± 9

2

5/1

MB2

a 3± 39

a 0± 5

a 2± 11

a 0± 8

a 2± 11

a 0± 1

a 3± 10

a 1± 9

5/2

5/1

MB1

c 1± 08/14

b 0± 3

c 0± 00/1

a 0± 7

b 0± 1

a 0± 2

c 0± 00/1

b 0± 03/6

 

 

جدول 3.  نتايج آزمون تجزيه واريانس صفات مورفولوژيکی گياهچه­هاي بذرهای محلات و آمل در تيمارهاي متفاوت

 

 

مقايسه ميانگين صفات مورفولوژیکی گياهچه هاي بذور محلات و آمل در تيمارهاي مختلف

در مورد صفت تعداد برگ، بيشترين تعداد برگ در گياهچه هاي بذر محلات با تيمار MB2 رویت گردید. همان طور که در نمودار 1 مشاهده مي شود تعداد برگ گیاهچه بذر محلات به طور قابل توجهی بيشتر از گیاهچه بذر آمل مي باشد. در گیاهچه بذر محلات، با افزايش غلظت هورمون بنزيل آمينو پورين، تعداد برگ افزايش مي يابد. اما در مورد گیاهچه بذر آمل با افرايش غلظت هورمون، تعداد برگ ها کاهش يافته و در کل تغيير چنداني را نشان نمي دهد.

از نظر صفت طول برگ گیاهچه ها، تيمار MB2 در بذر محلات بيشترين طول برگ را دارا بود، اما در تيمارهاي ديگر، در بذر آمل طول برگ گیاهچه در مقايسه با بذر محلات بيش تر بود. همچنين ميانگين طول برگ در گیاهچه بذر محلات با تيمار MB1، 1 میلی متر بود. در کل صفت طول برگ گیاهچه، با افزايش غلظت هورمون بنزيل آمينو پورين، در بذر محلات روند افزايشي و در بذر آمل روند کاهشي را نشان مي دهد.

در مورد صفت طول ساقه گیاهچه ها، طول ساقه در بذر محلات به طور قابل ملاحظه اي بيشتر از بذر آمل بود و بيشترين طول ساقه در تيمارهاي MB4 و MB3 بذر محلات مشاهده گرديد در حالي که طول ساقه در اين دو تيمار براي بذر آمل 1 میلی متر بود. همان طور که نمودار 2 نشان مي دهد در کل صفت طول ساقه گیاهچه، با افزايش غلظت هورمون بنزيل آمينو پورين، در بذر محلات روند کاهشي و در بذر آمل روند افزايشي را نشان مي دهد. در مورد صفت تعداد ساقه گیاهچه، بيشترين مقدار در تيمارهاي MB2 بذر محلات و MB4 بذر آمل مشاهده شد. در کل طول ساقه گیاهچه در بذر بومي بيشتر از بذر محلات بود و مقدار آن در تيمار MB1 بذر محلات برابر 1 میلی متر بود. در کل صفت طول ساقه گیاهچه، با افزايش غلظت هورمون بنزيل آمينو پورين، در بذر محلات روند افزايشي و در بذر آمل روند کاهشي را نشان مي دهد.

 

 

 

 

بحث

در تحقیق حاضر قطعات گره و نوک شاخساره گیاهچه های پامچال برای بهینه سازی ریزازدیادی مورد استفاده قرار گرفتند در آزمایش‌هایی که چاندراوانشی و همکاران (2014) به‌منظور استانداردسازی تکنیک کشت (in vitro) برای گیاه Primula zeylanica، بعنوان یکی از منابع گیاهی مهم دارویی، به‌منظور بررسی توان بالقوه آن برای ریزازدیادی انجام دادند، از قطعات گره‌ این گیاه بعنوان ریزنمونه برای ریزازدیادی بر روی محیط‌کشت MS حاوی بنزیل‌آمین‌پورین (BAP) و جیبرلیک اسید (GA₃) جهت آغاز رشد ساقه کشت داده شدند (10).

سیواکومار و همکاران (2024) از ریزنمونه های تک گره و در محیط کشت MS حاوی بنزیل‌آمینو‌پورین (BAP) در تحریک تولید شاخه‌های متعدد استفاده کردند. همچنین از تی دی آزرون (TDZ) ، کینتین (KIN) و 2,4-دی‌کلروفنوکسی‌استیک اسید نیز در محیط کشت MS برای تحریک رشد شاخه و ریشه در فرآیندهای اندام‌زایی مستقیم و غیرمستقیم استفاده می‌شود (11).

در بهینه سازی ریزازدیادی پامچال هورمون های سیتوکینین و اکسین را با مقادیر متفاوت مورد استفاده قرار دادیم، که محققان متعددی مانند هایتا و همکاران (2016)، نوروزی شریف و همکاران (2011) و بنسون و همکاران (2000) از هورمون های ستوکینین و اکسین برای ریزازدیادی استفاده کردند (6،12،13) .

نوروزی شریف (2015) پروتکل ریزازدیادی برای Primula heterochroma با استفاده از ریزنمونه های نوک شاخساره بهینه شده و باززایی زیاد شاخساره در محیط کشت حاوی هورمون های BAP و NAA پیشنهاد کردند و تلاش های حفاظتی برای این گونه ایرانی در معرض خطر را از طریق تکنیک های آزمایشگاهی تسهیل نمودند (14).

در مقایسه نرخ رشد و تکثیر گیاهچه های پامچال حاصل از بذر محلات در مقادیر بالاتر از 2 میلی گرم بر لیتر هورمون سیتوکینین و در بذر آمل در مقادیر 1 تا 5/1 میلی گرم بر لیتر سیتوکینین بیشترین باززایی را داشتند. در پژوهشی که Hayta و همکاران (2016) انجام دادند، نرخ بالای باززایی گیاهچه ها از کالوس را در مقادیر 2 تا 3 میلی گرم بر لیتر هورمون سیتوکینین TDZ گزارش کردند که نتایج تحقیق حاضر در بذر محلات همخوانی دارد (6).

هایتا و همکاران (2016) پروتکل ریزازدیادی گونهPrimula vulgaris  با استفاده از ریزنمونه های حاصل از برگ در محیط کشت MS حاوی هورمون های TDZ و اکسین (NAA) و یا 2,4-D بدون آسیب رساندن به گیاهان مادری انجام دادند (6). گونه نادر Primula scotica با استفاده از محیط های بدون هورمون یا محیط مکمل شده با بنزیل آمینو پورین و اسید ایندول استیک تکثیر شد و به نرخ ضریب 4-6 رسید (13).

از مقایسه تاثیر تیمارهای مختلف برروی ریزازدیادی پامچال دریافتیم در تیمارهای MB4، MB3 و MB2 بیشترین تغییرات افزاینده در صفات مورفولوژیکی تعداد برگ و طول ساقه باززایی شده از بذر محلات و بیشترین تغییرات افزاینده در صفات مورفولوژیکی طول برگ و تعداد ساقه باززایی شده از بذر آمل مشاهده شده است. گونه گیاهی و ارقام می توانند در باززایی گیاهچه ها تاثیر داشته باشند. شریف و همکاران (2011) در باززایی گونه پامچال هتروکروم با ریزنمونه راس ساقه در محیط کشت MS با هورمون های BA و NAA رشد و ریشه زایی انجام دادند (12). 

 

نتیجه گیری

بسیاری از گونه‌های گیاهی نادر و در معرض خطر، دارای متابولیت‌های ثانویه ارزشمند با کاربردهای دارویی هستند. این ترکیبات زیست‌فعال (Bioactive compounds) اغلب نقش مهمی در سیستم‌های پزشکی سنتی دارند و از این رو، نشان‌دهنده اهمیت کشت بافت این گیاهان نیز می‌باشند. برخی از آن‌ها به دلیل تخریب زیستگاه، برداشت بی‌رویه، یا تغییرات اقلیمی در آستانه انقراض قرار دارند. این شرایط بر ضرورت فوری تدوین راهبردهای مؤثر حفاظتی و توسعه روش‌های کشت پایدار این گونه‌ها تأکید دارد. ریزازدیادی به‌عنوان یک تکنیک مؤثر برای تولید تعداد زیادی گیاه از یک ریزنمونه، ابزاری ارزشمند در حفاظت و کشت تجاری گونه‌های نادر محسوب می‌شود. از میان انواع مختلف ریزنمونه‌ها، رأس ساقه و قطعات گره مؤثرترین گزینه‌ها برای ریزازدیادی معرفی شده‌اند.

 

 

References

 

1.       Okrslar V, Plaper I, Kovac M, Erjavec A, Obermajer T, Rebec A, et al. Saponins in tissue culture of Primula veris L. In Vitro Cell Dev Biol-Plant. 2007;43(6):644–51. doi:10.1007/s11627-007-9072-3.

2.       Coumans M, Coumans-Gilles MF, Delhez J, Gaspar T. Mass propagation of Primula obconica. Acta Hortic. 1979;(91):287–94. doi:10.17660/ActaHortic.1979.91.33.

3.       Morozowska M, Cieszkowski A, Polskiego W. In vitro clonal propagation of Primula veris L. and preliminary phytochemical analysis. Acta Biol Cracov Ser Bot. 2004;46(2):169–75.

4.       Ebrahimpour F, Eidizadeh K. Medicinal Plants. Tehran: Payamnoor Publisher; 2003.

5.       Tütüncü M. In vitro culture of Primula: A review. Int J Agric Nat Sci. 2020;13(2):118–25.

6.       Hayta S, Smedley MA, Li J, Harwood WA, Gilmartin PM. Plant Regeneration from Leaf-derived Callus Cultures of Primrose (Primula vulgaris). HortScience. 2016;51(5):558–62. doi:10.21273/HORTSCI.51.5.558.

7.       Jedrzejczyk I, Morozowska M, Nowinska R, Jagodzinski AM. Primula veris plants derived from in vitro cultures and from seeds: genetic stability, morphology, and seed characteristics. Turk J Bot. 2016;42(4):412–22. doi:10.3906/bot-1802-7.

8.       Wang MR, Bettoni JC, Zhang AL, Lu X, Zhang D, Wang QC. In Vitro Micrografting of Horticultural Plants: Method Development and the Use for Micropropagation. Horticulturae. 2022;8(7):576. doi:10.3390/horticulturae8070576.

9.       Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol Plant. 1962;15(3):473–97. doi:10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x.

10.       Chandravanshi M, Yashwant S, Agrawal A, Raja W. In vitro Micropropagation of Important Commercial Medicinal Plant: Plumbago zeylanica. Adv Biol Res. 2014;8(3):139–42. doi:10.5829/idosi.abr.2014.8.3.81121.

11.       Sivakumar P, Chitra M, Sasikala K, Selvamurugan M, Karunakaran V. An Overview of Pharmaceutical Applications and In Vitro Micropropagation Techniques for Rare and Endangered Plant Specie. J Adv Biol Biotechnol. 2024;27(9):573–85. doi:10.9734/jabb/2024/v27i91330.

12.       Noroozisharaf A, Hamidoghli Y, Zakizadeh H. In vitro seed germination and micropropagation of primrose (Primula heterochroma Stapf.) an endemic endangered Iranian species via shoot tip explants. Hortic Environ Biotechnol. 2011;52(3):298–302. doi:10.1007/s13580-011-0129-1.

13.       Benson EE, Danaher JE, Pimbley IM, Anderson CT, Wake JE, Daley S, et al. In vitro micropropagation of Primula scotica: A rare Scottish plant. Biodivers Conserv. 2000;9(6):711–26. doi:10.1023/A:1008941726419.

14.       Noroozisharaf A, Hatamzadeh A, Samizadeh Lahiji H, Bakhshi D. Genetic diversity of endangered primrose (Primula heterochroma Stapf.) accessions from Iran revealed by ISSR and IRAP markers. Sci Hortic. 2015;190:173–8.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

 

---