بررسی آلودگی اسپیروکتوزیس در پرندگان زینتی شهرستان رشت در سال 1402
سید عارفه دودمانی
1
(
دانش آموخته دانشکده دامپزشکی، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ايران
)
مهدی رضائی
2
(
استادیار گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکي، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامي، ارومیه، ايران.
)
محمدرضا اصغرزاده
3
(
استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد ارومیه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران
)
کلید واژه: اسپیروکتوز, براکیسپیرا, پرندگان زینتی, رشت, PCR.,
چکیده مقاله :
زمینه و هدف: اسپیروکتوزیس رودهای، یک بیماری باکتریایی پیچیده حاد است که عامل ایجادکننده آن باکتری اسپیروکت، به خانوادهء براکیسپیراسه، جنس براکیسپیرا تعلق دارد. گونههای براکیسپیرا باکتریهای مارپیچ، بیهوازی، گرم منفی هستند که بدلیل وجود تاژکهای پریپلاسمیک متعدد، دارای تحرک مارپیچی میباشند. این عامل عفونت با میکروسکوپ فاز کنتراست به خوبی قابل مشاهده است. گونههای مختلف این باکتری، از خوکها، سگها، خوکچه هندی، پرندگان و جوندگان وحشی جدا شدهاند. آلودگی اسپیروکتوزیس میتواند از طریق گوشت آلوده به انسان نیز منتقل شود. سه گونه مهم از این باکتری، براکیسپیرا اینترمدیا، براکیسپیرا پیلوسیکولی، براکیسپیرا الوینیپولی میباشند که در سکوم تکثیر یافته و مستقر میشوند. کلونیزاسیون باکتری در رودههای کور، از مهمترین خصوصیات فرم گوارشی بیماری است. مرغهای تخمگذار و مادر عفونت را بهصورت تاخیر رشد، کاهش تخمگذاری و اسهال مزمن نشان میدهند. علاوه بر ایجاد تظاهرات بالینی، جنس براکیسپیرا با افزایش ضریب تبدیل غذایی بر عملکرد گله تاثیر سوء میگذارد. بیماری حاصل از اسپیروکت در پرندگان بهصورت علائم گوارشی، تنفسی و سیستمیک دیده میشود. پرندگان زینتی، از جمله میزبانهای این باکتری هستند. با توجه به بیماریزایی عامل عفونت، باکتری را میتوان از هر دو مسیر گوارشی و تنفسی جداسازی و شناسایی کرد. رعایت امنیتزیستی مناسب از مهمترین عوامل جلوگیری از شیوع این عفونت است. هدف از انجام مطالعه حاضر شناسایی باکتری اسپیروکت با استفاده از رنگآمیزی گیمسا و آزمون مولکولی PCR (polymerase chain reaction) در پرندگان زینتی شهرستان رشت بود.
مواد و روش کار: برای انجام این مطالعه توصیفی-مقطعی در نیمهی دوم سال 1402، تعداد 60 سواب نایی و 60 سواب گوارشی از ۶۰ پرنده زینتی با حداقل سن 6 ماه اخذ گردید. نمونهها در بافر PBS به آزمایشگاه منتقل شد. بر روی نمونهها رنگآمیزی گیمسا انجام گرفت. به منظور استخراج DNAاز روش لیز حرارتی در دمای 100 درجه سلسیوس (15 دقیقه)، شوک دمایی 20- درجه سلسیوس (ده دقیقه) و سانتریفیوژ سوپرناتانت بهدست آمده با شتاب 12000 دور در دقیقه استفاده گردید. آزمون مولکولی PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جنس اسپیروکت (F: 5'- ATAACCCATGGAAACATGGAC-3', R: 5'- TCCATTGTGGAAGATTCTCAG-3') از نظر تکثیر قطعه 230 جفت بازی بر مبنای ژن 16SrDNA انجام گرفت. برنامه دمایی PCR جهت تکثیر قطعه هدف 16S rDNA واسرشت اولیه در 95 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه، 40 چرخه شامل دناتوراسیون 95 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمر 55 درجه سلسیوس به مدت 25 ثانیه، تکثیر در 72 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه و در نهایت تکثیر نهایی با دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه انجام گردید.
یافتهها: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد تعداد 10 نمونه در رنگآمیری گیمسا مثبت ارزیابی شدند. از این تعداد 7 نمونه مربوط به نمونههای تنفسی (67/11 درصد) و 3 نمونه مربوط به نمونه های گوارشی (5 درصد) بودند. همچنین مشاهده باند 230 جفت بازی، پس از الکتروفورز ژل آگارز 2 درصد، تعداد 24 نمونه در آزمون PCR را مثبت نشان داد که از این تعداد 13 مورد مربوط به نمونههای گوارشی (67/21 درصد) و 11 مورد مربوط به نمونههای نایی (33/18 درصد) بود. از میان گونههای نمونهبرداری شده، بیشترین عفونت در گونه عروس هلندی (Cockatiel) مشاهده شد. طوطی گرینچیک و مرغ عشق به ترتیب بعد از گونهی عروس هلندی در ردههای بعدی آلودگی قرار گرفتند.
نتیجهگیری: مطالعات انجامشده پیرامون براکیسپیرا، وجود اسپیروکت را در مرغهای تخمگذار، بوقلمونها و شترمرغ نشان دادهاند. ولی مطالعهای که وجود این باکتری را در پرندگان زینتی بررسی کردهباشد، در دست نیست. مطالعه حاضر، اولین گزارش آلودگی اسپیروکت در پرندگان زینتی در جهان است. این مطالعه علاوه بر اینکه وجود عفونت اسپیروکتی در پرندگان زینتی شهرستان رشت را برای اولین بار در ایران به اثبات میرساند، دقت و حساسیت بالای آزمون مولکولیPCR در تشخیص بیماری را نشان داد. بهطور کلی نتایج این تحقیق میتواند بهعنوان یک رهیافت و کار اپیدمیولوژیک در منطقه، برای عفونتهای تنفسی و گوارشی در پرندگان زینتی مد نظر قرار بگیرد.
چکیده انگلیسی :
Background and Aim: Intestinal spirochetosis is an acute and complex bacterial disease caused by spirochete bacteria belonging to the family Brachyspiraceae and the genus Brachyspira. These bacteria are spiral-shaped, anaerobic, and Gram-negative microorganisms. Due to the presence of multiple periplasmic flagella, they show characteristic corkscrew-like motility. This infectious agent can be clearly observed using phase-contrast microscopy. Different species of Brachyspira have been isolated from pigs, dogs, guinea pigs, birds, and wild rodents. Transmission of spirochetosis to humans may also occur through the consumption of contaminated meat, which highlights its zoonotic importance. Three major species, including Brachyspira intermedia, Brachyspira pilosicoli, and Brachyspira alvinipulli, are considered the most important pathogenic species in birds. These bacteria multiply and become established mainly in the cecum. Colonization of the cecal intestines is one of the most important features of the digestive form of the disease. Infected laying and breeder chickens commonly show delayed growth, reduced egg production, and chronic diarrhea. In addition to causing clinical symptoms, Brachyspira species negatively affect flock performance by increasing the feed conversion ratio, which results in economic losses. In birds, spirochetal infection may present with digestive, respiratory, and systemic signs. Ornamental birds are also considered potential hosts for this bacterium. Because of the pathogenic nature of the infectious agent, Brachyspira can be isolated and identified from both digestive and respiratory tracts. Proper biosecurity measures are among the most important factors in preventing the spread of this infection. The aim of the present study was to identify spirochete bacteria in ornamental birds in Rasht, Iran, using Giemsa staining and polymerase chain reaction (PCR) molecular techniques.
Materials and Methods: This descriptive cross-sectional study was conducted during the second half of the year 1402 (2023–2024). A total of 60 ornamental birds with a minimum age of six months were sampled. From each bird, one tracheal swab and one digestive swab were collected, resulting in 60 respiratory and 60 digestive samples. All samples were transferred to the laboratory in phosphate-buffered saline (PBS). Giemsa staining was performed on the collected samples for microscopic examination. For DNA extraction, a thermal lysis method was used. Samples were heated at 100°C for 15 minutes, followed by a cold shock at −20°C for 10 minutes. The obtained supernatant was then centrifuged at 12,000 × g to extract bacterial DNA. PCR was carried out using genus-specific spirochete primers (F: 5'-ATAACCCATGGAAACATGGAC-3' and R: 5'-TCCATTGTGGAAGATTCTCAG-3') to amplify a 230-base pair fragment of the 16S rDNA gene. The PCR thermal program included an initial denaturation step at 95°C for 10 minutes, followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, primer annealing at 55°C for 25 seconds, and extension at 72°C for 30 seconds. final extension step was performed at 72°C for 10 minutes. PCR products were analyzed using 2% agarose gel electrophoresis.
Results :The results of Giemsa staining showed that 10 samples were positive for spirochetes. Among these positive samples, 7 were respiratory samples (11.67%) and 3 were digestive samples (5%). PCR analysis demonstrated higher detection sensitivity. Observation of the 230-bp band after agarose gel electrophoresis confirmed that 24 samples were positive by PCR. Of these, 13 samples were digestive samples (21.67%) and 11 were tracheal samples (18.33%). Among the sampled bird species, the highest rate of infection was observed in Cockatiels (Nymphicus hollandicus). Green-cheeked conures ranked second, followed by budgerigars, which showed lower infection rates compared to Cockatiels.
Conclusion: Previous studies on Brachyspira species have confirmed the presence of spirochete infections in laying hens, turkeys, and ostriches. However, no previous research has investigated the presence of these bacteria in ornamental birds. Therefore, the present study represents the first report worldwide documenting spirochete infection in ornamental birds. In addition, this study provides the first evidence of spirochetal infection in ornamental birds in Rasht, Iran. The findings clearly demonstrate the high sensitivity and accuracy of PCR compared to Giemsa staining for the diagnosis of spirochetosis. Overall, the results of this research can be considered a valuable epidemiological approach for the investigation of digestive and respiratory infections in ornamental birds in the region and emphasize the importance of biosecurity measures to control and prevent disease spread.
• Bano, L., Merialdi, G., Bonilauri, P., Dall'Anese, G., Capello, K., Comin, D., et al. (2008). Prevalence, disease associations and risk factors for colonization with intestinal spirochaetes (Brachyspira spp.) in flocks of laying hens in north-eastern Italy. Avian Pathology, 37(3): 281-286.
• Bassami, M.R., Jamshidi, A., Kasaei, A.K. and Mohamadi, A.M. (2012). Isolation and identification of Brachyspira pilosicoli from laying hens flocks, using conventional culture and molecular methods in Mashhad, Iran. Iranian Journal of Veterinary Science and Technology, 4(1): 29-36. [In Persian]
• Burch, D.G.S., Harding, C., Alvarez, R. and Valks, M. (2006). Treatment of a field case of avian intestinal spirochaetosis caused by Brachyspira pilosicoli with tiamulin. Avian Pathology, 35(3): 211-216.
• Cleveland, C.A., Swanepoel, L., Brown, J.D., Casalena, M.J., Williams, L. and Yabsley, M. J. (2020). Surveillance for Borrelia spp. in upland game birds in Pennsylvania, USA. Veterinary Sciences, 7(3): 82.
• Feberwee, A., Hampson, D.J., Phillips, N.D., La, T., Van der Heijden, H.M., Wellenberg, G.J., et al. (2008). Identification of Brachyspira hyodysenteriae and other pathogenic Brachyspira species in chickens from laying flocks with diarrhea or reduced production or both. Journal of Clinical Microbiology, 46(2): 593-600.
• Hampson, D., Phillips, N. and Pluske, J. (2002). Dietary enzyme and zinc bacitracin reduce colonisation of layer hens by the intestinal spirochaete Brachyspira intermedia. Veterinary Microbiology, 86(4): 351-360.
• Hampson, D.J., Oxberry, S.L. and La, T. (2006). Potential for zoonotic transmission of Brachyspira pilosicoli. Emerging Infectious Diseases, 12(5): 869.
• Herbst, W., Willems, H., Heuser, J. and Ewers, C. (2018). Isolation and antimicrobial susceptibility of Brachyspira species from feces of layer chickens in Germany. Tierärztliche Praxis Ausgabe G: Großtiere/Nutztiere, 46(1): 29-34.
• Jansson, D., Fellström, C., Råsback, T., Vågholm, I., Gunnarsson, A., Ingermaa, F. et al. (2008). Phenotypic and molecular characterization of Brachyspira spp. isolated from laying hens in different housing systems. Veterinary Microbiology, 130: 348-362.
• Jordan, F.T. and Hampson, D.J. (2008). Some other bacterial diseases. In Diseases of Poultry 5th ed: Boxmeer: MSD Animal Health: 213-218.
• Logue, C.M. (2020). Diseases of Poultry 14th ed. New York: Wiley Blackwell: 1018-1033.
• Mappley, L.J., La Ragione, R.M. and Woodward, M.J. (2014). Brachyspira and its role in avian intestinal spirochaetosis. Veterinary Microbiology, 168(2-4): 245-260.
• Myers, S.E., Dunn, P.A., Phillips, N.D., La,T. and Hampson, D.J. (2009). Brachyspira intermedia and Brachyspira pilosicoli are commonly found in older laying flocks in Pennsylvania. Avian Diseases, 53(4): 533-537.
• Nemes, C., Glávits, R., Dobos-Kováks, M., Ivanics, É., Kaszanyitzky, É., Beregszászi, A., et al. (2006). Typhlocolitis associated with spirochaetes in goose flocks. Avian Pathology, 35(1): 4-11.
• Nietfeld, J.C. (2013). Spiral-curved organisms II: Brachyspira (Serpulina) and Lawsonia. Veterinary Microbiology. 4th ed., New York: Wiley Blackwell, pp: 167.
• Passey, J.L. and La Ragione, R.M. (2022). JMM profile: Brachyspira species: the causative agent of avian intestinal spirochaetosis. Journal of Medical Microbiology, 71(9): 001495.
• Razmyar, J., Peighambari, S.M. and Barin, A. (2011). Isolation and characterization of Brachyspira species based on biochemical scheme and 16S rDNA partial sequencing: International Journal of Veterinary Research: 5(4): 204-210. [In Persian]
• Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001). Detection of DNA in agarose gels. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp: 5-14.
• Shivaprasad, H. and Duhamel, G. (2005). Cecal spirochetosis caused by Brachyspira pilosicoli in commercial turkeys. Avian Diseases, 49(4): 609-613.
• Smibert, R., Devolt, H. and Faber Jr, J. (1958). A study of the bacterial flora of the respiratory system of normal chickens. Poultry Science, 37(1): 159-166.
• Smith, J.L. (2005). Colonic spirochetosis in animals and humans. Journal of Food Protection, 68(7): 1525-1534.
• Stephens, C. and Hampson, D. (1999). Prevalence and disease association of intestinal spirochaetes in chickens in eastern Australia. Avian Pathology, 28(5): 447-454.
• Welchman, D., Steventon, A., Mawhinney, I. and Abuoun, M. (2016). Intestinal spirochaetes (Brachyspira species) in pheasants in Great Britain. The Veterinary Record, 178(8): 193.
