بررسی فراوانی ژن¬های اینتگرون کلاس 1 ، 2 و 3 در ایزوله¬های اشریشیا¬کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران دیابتی در شهرستان شهرکرد
محورهای موضوعی : میکروبیولوژینگین دلی سرراکی 1 , فاطمه خداوردی پور 2 , نازیلا ارباب سلیمانی 3
1 - دانش آموخته کارشناسی ارشد میکروبیولوژي، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران
2 - مرکز تحقیقات تغذیه و محصولات ارگانیک، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
3 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران
کلید واژه: دیابت, اینتگرون, عفونت ادراری, اشریشیا کلی یوروپاتوژن,
چکیده مقاله :
سویه های اشریشیا کلی یوروپاتوژن شایعترین سویههای بیماریزا در انسان میباشند. مهمترین خصوصیت سویههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن، توانایی کلونیزه شدن آنها در سطح سلولهای یورواپیتلیوم میزبان می‌باشد. مطالعه حاضر بر روی 300 نمونه ادرار بیماران مبتلا به دیابت ملیتوس نوع 2 مشکوک به عفونت ادراری، مراجعه کننده به آزمایشگاه های تشخیص طبی شهرستان شهرکرد در سال 1394 صورت گرفت. 5 تا 10 سی سی نمونه ادرار بیماران دیابتی در ظروف استريل جمع آوری و با استفاده از لوپ کالیبره، 01/0 میلی لیتر از نمونه ادرار سانتریفوژ نشده در شرايط استريل بر روي محيط مک کانکی آگار کشت داده شد. در این تحقیق پس از انجام آزمون PCR به منظور تشخیص قطعی باکتری اشریشیا کلی، حضور توالی ژن 16srRNA تمامی نمونه ها مورد بررسی قرار گرفتند و در حضور پرایمرهای اختصاصی به فراوانی ژن های اینتگرون کلاس 1، 2 و 3 پرداخته شد. از 300 بیمار دیابتی مورد بررسی در 100 نمونه عفونت ادراری تشخیص داده شد که در 51 نمونه (51 درصد) آلودگی به اشریشیا کلی گزارش شد. از 51 ایزوله اشریشیاکلی مورد بررسی اینتگرون کلاس 1 در 30 ایزوله (82/58 درصد)، اینتگرون کلاس 2 در 20 ایزوله (21/39 درصد) و اینتگرون کلاس 3 در 5 ایزوله (80/9 درصد) گزارش گردید. بیشترین مقاومت به آمپی سیلین (66/66 درصد) و کمترین مقاومت به نیتروفورانتوئین (96/1 درصد) گزارش شده است. در تجزیه و تحلیل آماری بین مقاومت به جنتامایسین، ایمیپنم و نیتروفورانتوئین با اینتگرون کلاس 1 ارتباط آماری معنی داری مشاهده گردید(05/0 p-value<).
The most common uropathogenic strains of Escherichia coli strains are pathogenic in humans. The most important feature of uropathogenic Escherichia coli strains, the ability of colonization on the surface of host is the euro epithelium cells.
The present study took place on 300 urine samples of patients with diabetes mellitus type 2 suspected urinary tract infections, referred to clinical laboratories of Shahrekord city, Iran in 1394. 5 to 10 cc of urine samples from diabetic patients were collected and by calibrated loop, 0.01 ml of urine cultured in Mac kanky agar media. After performing PCR test were examined to 16srRNA Escherichia coli gene, all samples tested for the presence of class 1, 2 and 3 integron genes at the present of specific primers.
Of 300 diabetic patients UTI diagnosed in 100 samples. In 51 patients (51%) E.coli was diagnosed. Results indicate that class 1 integron was seen in 30 isolations (58.82%), class 2 in 20 (39.2%) and the third class in 5 ones (9.8%). Most resistance reported to ampicillin (66.66%) and the lowest resistance reported to Nitrofurantoin (1.96%).
Based on statistical analysis had a significant relationship was observed between resistance to gentamicin, imipenem and Nitrofurantoin with class 1 integron (p-value< 0/05).
1. Melanitou E, Fain P, Eisenbarth G. Genetics of Type 1A (immune mediated) diabetes. Journal of Autoimmunity 2003; 21 (2): 93–98.
2. Islami G, Goodarzi S, Fallah F, Goodarzi M. [Prevalence of Escherichia coli and Klebsiella in the integron in children with urinary tract infection, multi-drug resistant]. Shahid Beheshti University of Medical Sciences and Health Services 2011; 34(1) : 61-65.
3. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract 2010; 87 (1): 4-14.
4. Balasoiu D, van Kessel KC, Van kats-Renaud HJ, Collet J, Hoepolman AI. Granulocytes function in women with diabetes and asymptomatic bacteriuria. Diabetes Care 1997; 20: 393–395.
5. Bertoni AG, Saydah S. Diabetes and the risk of infection related mortality in the US. Diabetes Care 2001; 24: 1004–1009.
6. Pozzilli P, Lesli RDG. Infections and diabetes: Mechanisms and prospects for prevention. Diabet Med 1994; 11: 935-941.
7. Carton JA, Maradona JA, Nuno FJ, Fernandez-Alvarez R, Perez-Gonzalez F, et al. Diabetes mellitus and bacteremia: A comparative study between diabetic and non diabetic patients. Eur J Med 1992; 1: 281-287.
8. Boyko EJ, Fihn SD, Scholes D, Abraham L, Monsey B. Risk of urinary tract infection and asymptomatic bacteruria among diabetes and nondiabetic postmenopausal women. J Am Epidemiol 2005; 161: 557-564.
9. Stapleton A. Urinary tract infection in patients with diabetes. Am J Med 2002;113(1A): 80- 84.
10. Hosking DJ, Bennet T, Hampton JR. Diabetic autonomic neuropathy. J Diabetes Care 1978; 27: 1043-54.
11. Ronald A, Ludwig E. Urinary tract infection in adults with diabete. J Antimicrobial Agent 2001; 17: 287-289.
12. Brown JS, Wessells H, Chancellor MB, Howards SS, Stamm WE, et al. Urologic complication of diabetes. Diabetes Care 2005; 8(1): 177–185.
13. Thomas GN, Jiang CQ, Taheri S, Xiao ZH, Tomlinson B, et al. A systematic review of life style modification and glucose intolerance in the prevention of type 2 diabetes. Cur Diabetes Rev 2010; 6: 378-87.
14. Kargar M, Daneshvar M, Homayoun M. [Surveillance of virulence markers and antibiotic resistance of shiga toxin purchase in Shiraz]. ISMJ 2011; 14: 76-83.
15. Wilson BA, Salyers AA, Whitt DD. Bacterial Pathogenesis a Molecular Approach. 3rd ed Washington DC ASM Press 2010; 91-11.
16. Rowe-Magnus DA, Guerout AM, Ploncard P, Dychinco B, Davies J, Mazel D. The evolutionary history of chromosomal super integrons provides an ancestry for multiresistant integrons. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98(2):652-657.
17. Stokes HT, Hall RM. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Molecular microbiology 1989; 3(12):1669-83.
18. Stalder T, Barraud O, Casellas M, Dagot C, Ploy MC. Integron involvement in environmental spread of antibiotic resistance. Fron Microbiol 2012; 3(119):1-14.
19. Barlow RS, Gobius KS. Diverse class 2 integrons in bacteria from beef cattle sources. J Antimicrob Chemother 2006; 58(6): 1133-1138.
20. Partridge SR, Tsafnat G, Coiera E, Iredell JR. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS microbiology reviews 2009; 33(4):757-84.
21. Clinical Laboratory Stards Institute(CLSI). Performance Stards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, Approved stard-Ninth Edition (M2-A9). Clinical Laboratory Stards Institute, Wayne, PA. 2006.
22. National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS). Methods for disk antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5. Wayne, Pa. 2003.
23. Turton JF, Perry C, Elgohari S, CV. H. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific, variable number tandem repeat and virulence gene targets. J Med Microbiol. 2010; 59(4):541-7.
24. Kerrn MB, Klemmensen T, Frimodt-Møller N, Espersen F. Susceptibility of Danish Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections and bacteraemia, and distribution of sul genes conferring sulphonamide resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2002; 50, 513–516.
25. Schwartz T, Kohnen W, Jansen B, Obst U. Detection of antibiotic resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMSMicrobiol Eco 2003; 43(2): 325–335.
26. Kümmerer K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother 2004; 54(3): 311-320.
27. Hussein AI, Ahmed AM, Sato M, Shimamoto T. Characterization of integrons and antimicrobial resistance genes in clinical isolates of Gram-negative bacteria from Palestinian hospitals. Microbiol Immunol 2009; 53(11): 595-602.
28. Machado E, Canton R, Baquero F. Integron content of extended-spectrum-b-lactamase-producing Escherichia colistrains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49 (5): 1823-1829.
29. Dillon B, Thomas L, Mohmand G, Zelynski A, Iredell J. Multiplex PCR for screening of integrons in bacterial lysates. J Microbiol Methods 2005; 62(2): 221-232.
30. Farshad Sh, Japoni A, Hosseini M. [Low Distribution of Integrons among Multidrug resistant E.coli Strains Isolate from Children with community-Acquired urinary tract infections in Shiraz, Iran]. Polish J Microbiol 2008; 57 (3): 193-198.
31. Falakian Z, Nikokar I, Nafisi MR, Karimi A M V. [Frequency of class 1 Integrons among Escherichia coli isolates of patients with urinary tract infection Iran]. J Clin Infect Dis 2011; 6 (4): 24.
32. Ranjbaran M, Zolfaghari M, Japoni-Nejad A, Amouzandeh Nobaveh AR, Abtahi H, Nejad M, et al. Molecular investigation of integrons in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from urinary tract infections. J Mazandaran Univ Med Sci 2013; 23(105):20-7.
33. Islami G, Seyed Javadi S, Fallah H F G. Prevalence of integrons in multi drug resistance E. coli and Kelebsiella isolated from urinary tract infections in children. Pajohandeh 2010; 34(1):61-5.
رهیاف های نوین در علوم سلولی و مولکولی JNACMS دوره 2 شماره 2 تابستان 1403 Journal homepage: https://sanad.iau.ir/journal/nacms |
|
بررسی فراوانی ژنهای اینتگرون کلاس 1 ، 2 و 3 در ایزولههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده از بیماران دیابتی در شهرستان شهرکرد
نگین دلی سرراکی1 ، فاطمه خداوردی پور2، نازیلا ارباب سلیمانی3* محمد رضا افشارزاده4
1. دانش آموخته کارشناسی ارشد میکروبیولوژي، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
2. مرکز تحقیقات تغذیه و محصولات ارگانیک، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
3. گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران.
4. گروه دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
اطلاعات مقاله |
| چکیده |
تاریخچه مقاله: دریافت: 16/06/1403 پذیرش:22/08/1403 چاپ: تابستان 1403 DOI: |
| سویههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن شایعترین سویههای بیماریزا در انسان میباشند. مهمترین خصوصیت سویههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن، توانایی کلونیزه شدن آنها در سطح سلولهای یورواپیتلیوم میزبان می‌باشد. مطالعه حاضر بر روی 300 نمونه ادرار بیماران مبتلا به دیابت ملیتوس نوع 2 مشکوک به عفونت ادراری، مراجعه کننده به آزمایشگاههای تشخیص طبی شهرستان شهرکرد در سال 1394 صورت گرفت. 5 تا 10 سی سی نمونه ادرار بیماران دیابتی در ظروف استريل جمع آوری و با استفاده از لوپ کالیبره، 01/0 میلی لیتر از نمونه ادرار سانتریفوژ نشده در شرايط استريل بر روي محيط مک کانکی آگار کشت داده شد. در این تحقیق پس از انجام آزمون PCR به منظور تشخیص قطعی باکتری اشریشیا کلی، حضور توالی ژن 16srRNA تمامی نمونهها مورد بررسی قرار گرفتند و در حضور پرایمرهای اختصاصی به فراوانی ژنهای اینتگرون کلاس 1، 2 و 3 پرداخته شد. از 300 بیمار دیابتی مورد بررسی در 100 نمونه عفونت ادراری تشخیص داده شد که در 51 نمونه (51 درصد) آلودگی به اشریشیا کلی گزارش شد. از 51 ایزوله اشریشیا کلی مورد بررسی اینتگرون کلاس 1 در 30 ایزوله (82/58 درصد)، اینتگرون کلاس 2 در 20 ایزوله (21/39 درصد) و اینتگرون کلاس 3 در 5 ایزوله (80/9 درصد) گزارش گردید. بیشترین مقاومت به آمپی سیلین (66/66 درصد) و کمترین مقاومت به نیتروفورانتوئین (96/1 درصد) گزارش شده است. در تجزیه و تحلیل آماری بین مقاومت به جنتامایسین، ایمیپنم و نیتروفورانتوئین با اینتگرون کلاس 1 ارتباط آماری معنی داری مشاهده گردید(05/0 p-value<).
|
کلمات کلیدی: دیابت، اینتگرون، عفونت ادراری، اشریشیا کلی یوروپاتوژن. |
| |
*نویسنده مسئول: nazilaarbab@yahoo.co.uk
|
مقدمه
دیابت1 یا بیماری قند خون2 یک اختلال متابولیک در بدن است. در این بیماری توانایی تولید انسولین در بدن از بین می‌رود و یا بدن در برابر انسولین مقاوم شده و بنابراین انسولین تولیدی نمی‌تواند عملکرد طبیعی خود را انجام دهد(1،2). دیابت از جمله شايعترين و مهمترين بيماريهاي موجود در جهان ميباشد و مبتلايان خود را در معرض خطر بالايي از نظر ابتلا به عفونت قرار می‌دهد (8-3). در اين ميان دستگاه ادراري شايعترين محل بروز عفونت در بين مبتلايان به ديابت ميباشد. دیابت به دلیل ایجاد چندین ناهنجاری در سیستم دفاعی، سبب مستعد شدن فرد به عفونت دستگاه ادراری میگردد(11-9). صدمات وارد شده در اعمال مختلف گلبولهای سفید از جمله مهاجرت، فاگوسیتوز و کموتاکسی از جمله این ناهنجاریها میباشند. علاوه بر این، نوروپاتی دیابتی نیز به علت نقص در تخلیه کامل مثانه، سبب ایجاد عفونت دستگاه ادراری میشود. غلظتهای بالاتر قند در ادرار ممکن است نقش مهمی در افزایش بروز عفونت دستگاه ادراری در بیماران دیابتی بازی کند(11، 12). خطر مرگ و مير زودرس، بيماريهاي قلبي، كليوي، عصبي و نابينايي در افراد ديابتي دو برابر افراد غيرديابتي است (13). بنابراین نیاز به شناخت موثر و سریع عفونت ادراری و درمان آن با آنتیبیوتیکهایی که میکروارگانیسمهای ایجاد کننده عفونت دستگاه ادراری کمترین درجه مقاومت را به آن نشان میدهند، به شدت احساس میشود. سویههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن شایعترین سویههای بیماریزا در انسان میباشند. مهمترین خصوصیت سویههای اشریشیا کلی یوروپاتوژن توانایی کلونیزه شدن آنها در سطح سلولهای یورواپیتلیوم میزبان می‌باشد(14، 15). اینتگرونهای کلاس 1 اولین بار توسط استوکس3 و هال4 در سال 1989 کشف شدند و بیش از 40 ژن مقاومتی در ارتباط با مقاومت به آمینوگلیکوزیدها بتالاکتامها، کلرامفنیکل، ماکرولیدها، سولفانامیدها، ضدعفونی کنندهها و دزانفکتانها را حمل مینمایند (16،17). متعاقب اینتگرونهای کلاس 1، اینتگرونهای کلاس 2 شیوع بالایی را در ایزولههای بالینی در باکتریهای گرم منفی نشان میدهند (18). کاستهای ژنی موجود در این دسته از کلاسها عمدتا در ارتباط با مقاومتهای مختلف مثل: استرپتومایسین، اسپکتینومایسین و تریمتوپریوم میباشند. ژن اینتگراز در اینتگرونهای کلاس 2 در حدود 46درصد مشابه ژن اینتگراز در اینتگرونهای کلاس 1 می‌باشد(19). اینتگرونهای کلاس 3 برای اولین بار توسط آرکاوا5 و همکارانش در سال 1996 در ژاپن شناسایی گردید. این دسته از اینتگرونها به ندرت در نمونه‌های بالینی وجود دارند ولی اخیراً در نمونه‌های کلینیکی نظیر: سودوموناس آئروژینوزا، سراشیا مارسنس، سودوموناس پوتیدا و کلبسیلا پنومونیه در ژاپن، پرتغال و کانادا یافت شده است (20). مطالعات نشان می‌دهد صرف نظر از الگوی مصرف آنتیبیوتیکها، ژنهای مقاوم آنتیبیوتیکی می‌توانند در بین جمعیتهای باکتریایی منتقل شوند. ژنهای مقاومت آنتیبیوتیکی معمولاً در عناصر ژنتیکی به نام اینتگرونها وجود دارند(4). انتقال افقی اینتگرونها موفقترین راه انتشار ژنهای مقاومت و پیدایش گونههای با مقاومت چندگانه MDR6 است. غالب گونههای جدا شده از بیماران و محیط بیمارستان با ویژگی MDR متعلق به کلاس 1 هستند که بر روی پلاسمید یا ترانسپوزون قرار دارند(2).
مواد و روش کار
تحقيق حاضر بر روی 300 نمونه ادرار بیماران دیابتی مشکوک به عفونت ادراری مراجعه کننده به آزمایشگاههای تشخیص طبی شهرستان شهرکرد صورت گرفت. نمونه ادرار توسط بیمار در ظروف استريل جمعآوری و بلافاصله پس از نمونه گیری، جهت انجام کشت و آزمون‌های بیوشیمیایی و تشخیص نوع باکتری مورد بررسی قرار گرفتند. جهت کشت با استفاده از لوپ کالیبره، 01/0 میلی لیتر از نمونه ادرار سانتریفوژ نشده در شرايط استريل بر روي محيط مک کانکی آگار کشت داده شدند. پس از مشخص شدن نمونه‌های UTI مثبت، تعيين هويت باكتري توسط آزمون‌های بیوشیمیایی و PCR صورت پذیرفت 21،22). برای تعیین حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی بیوتیک‌ها از روش کربی- بایر7 بر طبق دستورالعمل CLSI (مندرج در راهنمای ارایه شده توسط شرکت پادتن طب) استفاده شد. در این تحقیق از سویه استاندارد اشریشیا کلی ATCC 25922 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. دیسک‌های آنتیبیوتیک در این آزمایش شامل: کوتریموکسازول (تری‌متو‌پریم+سولفامتوکسازول) (SXT)، آمیکاسین (AM30)، سفتریاکسون (CRO30)، نیتروفورانتوئین (FM300)، سفالوتین(CF30)، نالیدیکسیک اسید (NA30)، نورفلوکساسین (NOR)، تتراسایکلین (TE30)، ایمیپنم (IPM10)، جنتامایسین (GM10) از شرکت پادتن طب-ایران مورد استفاده قرار گرفتند. جهت ارزیابی کیفیت DNA استخراج شده از نمونه‌های مورد مطالعه از روش الکتروفورز روی ژل آگارز استفاده شد. بدین منظور 5 میکرولیتر از DNA استخراج شده بر روی ژل 5/1 درصد آگارز الکتروفورز گردید. به منظور کمیت سنجی DNA تخلیص شده از دستگاه بایوفوتومتر استفاده شد و با اندازه گیری میزان DNA در نمونه در طول موج نوری280 نانومتر میزان DNA موجود در نمونه تعیین گردید. DNA های دارای کیفیت مناسب و کمیتی معادل 50 نانوگرم، جهت مراحل بعدی و انجام آزمایش PCR انتخاب گردیدند.
بعد از استخراج DNA از زوج پرايمرهای مربوط به ردیابی ژن 16srRNA به تایید ایزولهها پرداخته شد و در نهایت در حضور پرایمرهای اختصاصی به بررسی فراوانی ژنهای اینتگرون کلاس 1، 2 و 3 پرداخته شد. توالی پرایمرها در جدول(1) نشان داده شده است (23).
[1] - Diabetes
[2] - Diabetes Mellitus
[3] - Stokes
[4] - Hall
[5] - Arakawa
[6] - multi-drug resistant
[7] - Kirby Bauer
جدول 3- نتایج مربوط به ردیابی ژنهای اینتگرون در ایزولههای اشریشیا کلی
ژن | توالي پرايمر(3َ-5َ) | اندازه محصول(bp) | ||
16srRNA | F: ATT TGA AGA GGT TGC AAA CGA T R: TTC ACT CTG AAG TTT TCT TGT TT C | 130 | ||
| ||||
Int 1 | F: GGT CAA GGA TCT GGA TTT CG R:ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC | 436 | ||
Int 2 | F:AGT GGG TGG CGA ATG AGT G R:GTA GCA AAC GAG TGA CGA AAT G | 788 | ||
Int 3 | F:TGT TCT TGT ATCGGC AGG TG R: GGC ATC CAA GCA GCA AG | 600 | ||
واکنش PCRبرای ردیابی ژن 16srRNA در حجم نهایی 25 میکرولیتر واجد 5/2 میکرولیتر بافر با غلظت 10 برابر PCR buffer 10X))، 100 میکرومول Mix dNTP (10 میلی مولار)، 5/1 میلی مول کلرید منیزیم (MgCl2)، 1 میکرومول از زوج پرایمرهای F و R، 1 واحد آنزیم تگ پلی مراز و 2 میکرولیترDNA (50 نانوگرم)، صورت گرفت. برنامه حرارتی برای تکثیر ژن 16srRNA اشریشیا کلی به صورت یک سیکل 94 درجه سانتیگراد 5 دقیقه، 30 سیکل تکراری 94 درجه سانتیگراد 30 ثانیه، 55 درجه سانتیگراد 60 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد 60 ثانیه و 1 سیکل انتهایی 72 درجه سانتیگراد 1 دقیقه انجام شد.
جهت ردیابی ژنهای اینتگرون کلاس۱ و اینتگرون کلاس ۲ واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر متشکل از 5 میکرولیتر بافر با غلظت 10 برابر، 150 میکرومول Mix dNTP، 5/1 میلی مول کلرید منیزیم، 1 میکرومول از زوج پرایمرهای F و R، 1 واحد آنزیم تگ پلی مراز و 2 میکرولیتر DNA (50 نانوگرم)، صورت گرفت. برنامه حرارتی برای تکثیر ژنهای ژنهای اینتگرون کلاس 1 و 2 در ایزوله های اشریشیا کلی به صورت: یک سیکل 94 درجه سانتیگراد 5 دقیقه، 32 سیکل تکراری 94 درجه سانتیگراد 5 دقیقه، 60 درجه سانتیگراد 60 ثانیه، 72 درجه درجه سانتیگراد 2 دقیقه و 1 سیکل انتهایی 72 درجه سانتیگراد 1 دقیقه انجام شد.
جهت ردیابی ژنهای اینتگرون کلاس3 واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر واجد 5/2 میکرولیتر بافر با غلظت 10 برابر PCR buffer 10X))، 100 میکرومول Mix dNTP (10 میلی مولار)، 5/1 میلی مول کلرید منیزیم (MgCl2)، 1 میکرومول از زوج پرایمرهای F و R، 1 واحد آنزیم تگ پلی مراز و 2 میکرولیتر DNA (50 نانوگرم)، صورت گرفت (17). برنامه حرارتی برای تکثیر ژن های ژن اینتگرون کلاس 3 در ایزوله های اشریشیا کلی به صورت: یک سیکل 94 درجه سانتیگراد 5 دقیقه، 35 سیکل تکراری 94 درجه سانتیگراد 60 ثانیه، 58 درجه سانتی گراد 60 ثانیه، 72 درجه درجه سانتی گراد 2 دقیقه و 1 سیکل انتهایی 72 درجه سانتی گراد 1 دقیقه انجام شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده جدول (1) نشان داده شده است.
برای تکثیر قطعات ژنی مورد مطالعه از دستگاه Eppendorf Master cycler Gradient, Germany استفاده شد. به منظور ردیابی قطعه ژنی تکثیر یافته در PCR، 15 میکرولیتر از محصول PCR بر روی ژل 5/1 درصد آگارز واجد اتیدیوم بروماید در ولتاژ ثابت 90 ولت به مدت 45 دقیقه در حضور مارکر 100 جفت بازی DNA صورت گرفت و پس از مشاهده ژل به دست آمده با دستگاه تراس لومیناتور ( England، Uviteck) تصویر به دست آمده بر روی کاغذ حرارتی ثبت شد.
نتایج حاصل از ارزیابی ژنهای اینتگرون کلاس 1، 2 و3 با استفاده از آزمون دقیق فیشر (Fisher Exact test) و با نرم افزار SPSS شماره 18 مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
مطالعه حاضر بر روی 300 نمونه ادرار بیماران مبتلا به دیابت ملیتوس نوع 2 مشکوک به عفونت ادراری، مراجعه کننده به آزمایشگاههای تشخیص طبی شهرستان شهرکرد در سال 1394 صورت گرفت. پس از کشت نمونه‌های ادرار، جداسازی باکتریهای عامل عفونت ادراری توسط آزمون‌های بیوشیمیایی صورت گرفته و به منظور تشخیص قطعی آزمون PCR تایید شد. از 300 نمونه مورد بررسی در 100 نمونه عفونت ادراری تشخیص داده شد. که آلودگی به اشریشیا کلی در 51 مورد (51 درصد) گزارش گردید. پس از استخراج DNA کیفیت DNA های مورد بررسی روی ژل آگارز 1درصد بررسی گردید. نتایج در شکل (1) نشان داده شده است.
شکل 1- ژل حاصل از الکتروفورز DNA استخراج شده از ایزولههای اشریشیا کلی
پس از انجام آزمون PCR به منظور تشخیص قطعی باکتری اشریشیا کلی و حضور توالی16srRNA تمامی نمونهها با داشتن باند 200 جفت بازی مثبت تشخیص داده شدند. نتایج در شکل 2 نشان داده شده است.
پس از تایید باکتری با استفاده از آزمون‌های میکروبیولوژی و مولکولی مقاومت نسبت به آمپی سیلین 66/66 درصد، تتراسایکلین 86/56 درصد، کوتریموکسازول90/54 درصد، نالیدیکسیک اسید 94/52 درصد، سيپروفلوكساسين21/39 درصد، سفالوتین 18/41 درصد، نورفلوکساسین 29/35 درصد، آمیکاسین 49/25 درصد، سفتریکسون 41/29 درصد، جنتامایسین 65/17درصد، ایمیپنم 53/23 درصد و مقاومت نسبت به نیتروفورانتوئین 96/1 درصد گزارش گردید. مقاومت نسبت به یک آنتیبیوتیک در 11 ایزوله (56/21 درصد)، نسبت به 2 آنتیبیوتیک در 9 ایزوله (64/17 درصد)، نسبت به 3 آنتیبیوتیک در 6 ایزوله (76/11 درصد)، نسبت به 4 آنتیبیوتیک در 4 ایزوله(84/7 درصد)، نسبت به 5 آنتیبیوتیک در 4 ایزوله(80/9 درصد)، نسبت به 6 آنتیبیوتیک در6 ایزوله(76/11 درصد)، نسبت به 7 آنتیبیوتیک در 3 ایزوله (88/5 درصد)، نسبت به 8 آنتیبیوتیک در 2 ایزوله(92/3 درصد)، نسبت به 9 آنتیبیوتیک در 3 ایزوله(88/5 درصد)، نسبت به 10 آنتیبیوتیک در 2 ایزوله(92/3 درصد)، نسبت به 11 آنتیبیوتیک در 1 ایزوله (96/1 درصد) و نسبت به 12 آنتیبیوتیک در 1 ایزوله(96/1درصد) گزارش گردید. از 51 ایزوله اشریشیا کلی مورد بررسی در این تحقیق اینتگرون کلاس 1 در 30 ایزوله (82/58درصد)، اینتگرون کلاس 2 در 20 ایزوله (21/39 درصد) و اینتگرون کلاس 3 در 5 ایزوله (80/9درصد) گزارش گردید. نتایج در جدول (3) نشان داده شده است. حضور همزمان ژنهای اینتگرون کلاس 1 و 2 در 14 ایزوله (45/27 درصد)، ژنهای اینتگرون کلاس 1 و 3 در 3 ایزوله (88/5 درصد) گزارش گردید، ژنهای اینتگرونهای کلاس 2 و 3 همزمان در 2 ایزوله (92/3 درصد) و حضور همزمان ژنهای اینتگرون کلاس 1 ، 2 و 3 در 3 ایزوله (88/5 درصد) گزارش گردیدند. نتایج در شکلهای 3 و 4 نشان داده شده است.
جدول 3- نتایج مربوط به ردیابی ژنهای اینتگرون در ایزولههای اشریشیا کلی
نوع اینتگرون | کلاس 1 | کلاس 2 | کلاس 3 | کلاس 1 و 2 | کلاس 1 و 3 | کلاس 2 و 3 | کلاس 1 ، 2 و 3 |
تعداد ایزوله | 30 (82/58%) | 20 (21/39%) | 5 (80/9%) | 14 (45/27%) | 3 (88/5%) | 2 (92/3%) | 3 (88/5%) |
شکل3- الکتروفورز محصول PCR ژنهای اینتگرون کلاس 1و 2ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی. ستون 2: باند 436 جفت بازی اینتگرون کلاس 1 و باند 788 جفت بازی اینتگرون کلاس 2، ستون 3: باند 788 جفت بازی اینتگرون کلاس 2، ستون 4: باند 436 جفت بازی اینتگرون کلاس 1.
شکل 4- الکتروفورز محصول PCR ژن اینتگرون کلاس 3. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 1: کنترل منفی. ستونهای 3،2، 4 و 5: باند 600 جفت بازی ژن اینتگرون 3.
در تجزیه و تحلیل آماری براساس آزمون دقیق فیشر بین مقاومت به آنتیبیوتیک جنتامایسین، ایمی پنم و نیتروفورانتوئین و اینتگرون کلاس 1 ارتباط معنیداری مشاهده گردید(05/0 p-value<) و بین سایر آنتیبیوتیکها و اینتگرونهای کلاس 1، 2 و 3 ارتباط آماری معنیدار مشاهده نگردید (05/0 p-value>).
بحث
افزایش مقاومت دارویی معضل بزرگی است و علت اصلی پیدایش مقاومت، مصرف نامناسب و بیرویه آنتیبیوتیکها می‌باشد. مطالعات نشان می‌دهد صرف نظر از الگوی مصرف آنتیبیوتیکها، ژنهای مقاومت آنتیبیوتیکی می‌توانند در ایجاد مقاومت باکتری‌ها به آنتیبیوتیکها نقش داشته باشند (26،25). نقش اينتگرونها در گسترش مقاومت آنتيبيوتيكي به ويژه از طريق انتقال افقي تا اندازهاي است كه مقالات مختلف، نقش اينتگرونها را در مقاومت چندگانه باكتريهای گرم منفی قابل توجه میدانند (28،27). همچنين اينتگرونها، به عنوان ابزاري جهت كنترل عفونتها و همچنين جهت مطالعه مقاومت آنتيبيوتيكي در باكتريها شناخته ميشوند (29). با توجه به مطالب گفته شده بالا، در اين مطالعه الگوي مقاومت آنتيبيوتيكي در ايزولههاي اشریشیا کلی شيوع اينتگرونهاي كلاس 1، 2 و 3 در آنها و ارتباط اينتگرونها با ايجاد مقاومت آنتيبيوتيكي در ايزولهها مورد بررسي قرارگرفت. به طوریکه اینتگرون کلاس 1 در 20 ایزوله (21/39درصد)، اینتگرون کلاس 2 در 10 ایزوله (60/19درصد) و اینتگرون کلاس 3 در 5 ایزوله (18/9 درصد) گزارش گردید.
بررسي نتايج آنتيبيوگرام به دست آمده در اين مطالعه نشان دهنده افزايش ميزان مقاومت آنتيبيوتيكي در ايزولههاي مورد بررسي نسبت به مطالعات صورت گرفته قبلي در ايران ميباشد، به طوري كه در مطالعه حاضر ميزان مقاومت در ايزولههاي اشریشيا كلي نسبت به اكثر آنتيبيوتيكهاي مورد بررسي از جمله جنتامايسين، سيپروفلوكساسين، نيتروفورانتوئين و آميكاسين بسيار بالاتر از مطالعه صورت پذيرفته توسط فرشاد و همكارانش ميباشد. همچنين ميزان فراواني اينتگرون كلاس 1 در مطالعه حاضر 21/39درصد می‌باشد که از ميزان فراواني آن در مطالعه فرشاد بالاتر است (32). همچنین به نظر میرسد كه با افزايش ميزان فراواني اينتگرون كلاس 1 در ايزولههاي مورد بررسي در مطالعه ما نسبت به ايزولههاي مورد بررسي در مطالعه فرشاد و همكارانش، ميزان مقاومت آنتيبيوتيكي نيز در آنها افزايش يافته است. کلاس 1 اینتگرونها غالبا در سویههای انتروباکتریاسه گزارش شده است که یک عامل جدی برای گسترش مقاومت آنتیبیوتیکی می‌باشد. مطالعات انجام شده در مورد ایزوله های اشریشیا کلی جدا شده از مبتلایان به عفونت ادراری در اروپا و آسیا نشان می‌دهد که شیوع اینتگرون از 22 تا 59 درصد متغیر می‌باشد (30). در مطالعه انجام شده توسط فلکیان و همکاران فراوانی اینتگرون کلاس 1 در ایزولههای اشریشیا کلی جدا شده از موارد عفونت ادراری 9/41 درصد برآورد گردید که نسبت به نتایج حاصل از تحقیق ما بیشتر می‌باشد. در این مطالعه از نظر آماری ارتباط معنیداری بین وجود اینتگرون و مقاومت نسبت به آنتیبیوتیکهای جنتامایسین، آمیکاسین، سفوتاکسیم، سفتازیدیم، سفتریاکسون، سیپروفلوکساسین و ازترونام مشاهده گردید که حاکی از انتقال ژن مقاومت توسط این عناصر می‌باشد(31). در تحقیق انجام شده توسط رنجبران و همکاران که به منظور بررسي مولكولي اينتگرونها در ایزولههای اشریشيا كلي و كلبسيلا پنومونيه جدا شده از عفونتهاي دستگاه ادراري بيماران بستري شده در بخش مراقبتهاي ويژه يك بيمارستان در اراک صورت گرفت، بيشترين ميزان مقاومت آنتيبيوتيكي در ايزولههاي اشریشياكلي مربوط به آنتيبيوتيكهاي كوتريموكسازول 88، سفترياكسون76، آموكسيكلاو 74، سفتازيديم72 و سفوتاكسيم 72 درصد بود. در حالیکه در تحقیق ما مقاومت نسبت به آنتیبیوتیکهای کوتریموکسازول و سفتریاکسون کمتر از مطالعه رنجبران و همکاران می‌باشد. در تحقیق ما مقاومت نسبت به ایمی پنم 53/23 درصد گزارش گردید، در صورتی که در تحقیق رنجبران تمامي ايزولههاي اشریشياكلي نسبت به ايمي پنم حساسيت نشان دادند (32). در مطالعه انجام شده توسط اسلامی و همکاران که بر روی 200 ایزوله اشریشیا کلی صورت گرفت، 171 نمونه به عنوان مقاوم به چند دارو گزارش گردیدند که در 35 ایزوله ژن اینتگراز گزارش گردید که در 25 ایزوله (5/14درصد) ژن اینتگرون کلاس 1 و در 10 ایزوله (8/5درصد) ژن اینتگرون کلاس ۲ گزارش گردید که با نتایج حاصل از تحقیق ما مغایرت دارد. در اين مطالعه ارتباط معنيداري بين وجود ژن اينتگرون و مقاومت به آنتیبیوتیکهای جنتامايسين، نورفلوكساسين، سفالوتين و ناليديكسيك اسيد گزارش گردید (33).
نتیجه گیری
شیوع بالای اینتگرون کلاس 1 در ایزولههای اشریشیاکلی مقاوم به ایمی پنم، جنتامایسین و نیتروفورانتوئین در تحقیق ما میتواند حاکی از وجود ارتباط بین حضور اینتگرون و مقاومت آنتیبیوتیکی باشد. در تحقیق رنجبران ارتباط معنيداري بين حضور اينتگرون و مقاومت آنتيبيوتيكي كوتريموكسازول، جنتامايسين، سفوتاكسيم، سفتازيديم و آموكسي كلاو گزارش گردید.
در تحقیق حاضر از 51 ایزوله مورد بررسی در 25 ایزوله (49درصد) به بیش از 3 آنتیبیوتیک مقاومت داشتند و درصد بالایی از ایزولهها فاقد مقاومت چندگانه بودند که این امر میتواند دلیلی برای کمتر بودن شیوع اینتگرونها نسبت به تحقیقات سایر محققین باشد.
در این مطالعه بین وجود مقاومت با آنتیبیوتیکهای جنتامایسین، ایمی پنم و نیتروفورانتوئین و اینتگرون کلاس 1 ارتباط آماری معنیداری مشاهده گردید که نشان دهنده انتقال مقاومت آنتیبیوتیکی در بین ایزولهها از طریق اینتگرون کلاس 1 می‌باشد و علت این مقاومت میتواند حضور کاستهای ژنی مقاومت آنتیبیوتیکی در ژن اینتگرون کلاس 1 باشد. اما بین اینتگرونهای کلاس 2 و 3 و آنتیبیوتیکهای مورد نظر ارتباط آماری معنیداری مشاهده نگردید که نشان دهنده این است که علاوه بر اینتگرونها عوامل دیگری نظیر ترانسپوزونها نیز می‌توانند در انتقال مقاومت نقش داشته باشند.
منابع
1. Melanitou E, Fain P, Eisenbarth G. Genetics of Type 1A (immune mediated) diabetes. J Auto. 2003; 21 (2): 93–98.
2. Seyedjavadi S, Eslami G, Goudarzi M, Goudarzi H, Fallah F. Integrons and multidrug resistance among E. coli and Klebsiella pneumoniae isolated from children with urinary tract infections. Health Med. 2013; 7(1): 243-249.
3. Shaw JE, Sicree RA, Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2013. Diabetes Res Clin Pract. 2013; 87 (1): 4-14.
4. Balasoiu D, van Kessel KC, Van kats-Renaud HJ, Collet J, Hoepolman AI. Granulocytes function in women with diabetes and asymptomatic bacteriuria. Diabetes Care. 1997; 20: 393–395.
5. Bertoni AG., and Saydah S. 2001. Diabetes and the risk of infection related mortality in the US. Diabetes Care; 24: 1004–1009.
6. Pozzilli P and Lesli RDG. Infections and diabetes: Mechanisms and prospects for prevention. Diabet Med. 1994; 11: 935-941.
7. Carton JA, Maradona JA, Nuno FJ, Fernandez-Alvarez R, Perez-Gonzalez F, and et al. Diabetes mellitus and bacteremia: A comparative study between diabetic and nondiabetic patients. Eur J Med. 1992; 1: 281-287.
8. Boyko EJ, Fihn SD, Scholes D, Abraham L, and Monsey B. Risk of urinary tract infection and asymptomatic bacteruria among diabetes and nondiabetic postmenopausal women. J Am Epidemiol. 2005; 161: 557-564.
9. Stapleton A. Urinary tract infection in patients with diabetes. Am J Med. 2002; 113(1A): 80- 84.
10. Hosking DJ, Bennet T., and HamptonJR.1978. Diabetic autonomic neuropathy. J Diabetes Care. 27: 1043-54.
11. Ronald A, and Ludwig E. Urinary tract infection in adults with diabete. J Antimicrobial Agent. 2001; 17: 287-289.
12. Brown JS., Wessells H., Chancellor MB., Howards SS, Stamm WE. Urologic complication of diabetes. Diabetes Care. 2005; 8(1): 177–185.
13. Thomas GN, Jiang CQ, Taheri S, Xiao ZH, Tomlinson B. A systematic review of life style modification and glucose intolerance in the prevention of type 2 diabetes. Cur Diabetes Rev. 2010; 6: 378-387.
14. Kargar M, Daneshvar M, Homayoun M. Surveillance of virulence markers and antibiotic resistance of shiga toxin purchase in Shiraz. 2011; 14: 76-83.
15. Wilson BA, Salyers AA, Whitt DD. Bacterial Pathogenesis a Molecular Approach. 3rd ed Washington DC ASM Press. 2010; 91-111.
16. Rowe-Magnus DA, Guerout AM, Ploncard P, Dychinco B, Davies J, Mazel D. The evolutionary history of chromosomal super integrons provides an ancestry for multiresistant integrons. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98 (2): 652-657.
17. Stokes HT, Hall RM. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol Microbiol. 2011; 3(12):1669-83.
18. Stalder T, Barraud O, Casellas M, Dagot C, Ploy MC. Integron involvement in environmental spread of antibiotic resistance. Fron Microbiol. 2012; 3 (119):1-14.
19. Barlow RS, Gobius KS, Diverse class 2 integrons in bacteria from beef cattle sources. J Antimicrob Chemother. 2006; 58(6): 1133-1138.
20. Partridge SR, Tsafnat G, Coiera E, Iredell JR. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS microbiology reviews. 2009; 33(4):757-784.
21. Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI). Performance Stards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, Approved stared-Ninth Edition (M2-A9). Clinical Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. 2006.
22. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Methods for disk antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5. Wayne Pa. 2003.
23. Turton JF, Perry C, Elgohari S, CV Hampton. PCR characterization and typing of Klebsiella pneumoniae using capsular type-specific., variable number tandem repeat and virulence gene targets. J Med Microbiol. 2010; 59(4):541-547.
24. Kerrn MB, Klemmensen T, Frimodt-Møller N, Espersen F. Susceptibility of Danish Escherichia coli strains isolated from urinary tract infections and bacteraemia, and distribution of sul genes conferring sulphonamide resistance. J Antimicrob Chemother. 2002; 50 (2): 513–516.
25. Schwartz T, Kohnen W, Jansen B, Obst U. Detection of antibiotic resistant bacteria and their resistance genes in wastewater, surface water, and drinking water biofilms. FEMS Microbiol Eco. 2003; 43(2): 325–335.
26. Kümmerer K. Resistance in the environment. J Antimicrob Chemother. 2004; 54(3): 311-320.
27. Hussein AI, Ahmed AM, Sato M, Shimamoto T. Characterization of integrons and antimicrobial resistance genes in clinical isolates of Gram-negative bacteria from Palestinian hospitals. Microbiol Immunol. 2009; 53 (11): 595-602.
28. Machado E, Canton R, Baquero F. Integron content of extended spectrum b-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49 (5): 1823-1829.
29. Dillon B, Thomas L, Mohmand G, Zelynski A, Iredell J. Multiplex PCR for screening of integrons in bacterial lysates. J Microbiol Methods. 2005; 62(2): 221-232.
30. Farshad Sh, Japoni A, Hosseini M. Low Distribution of Integrons among Multidrug resistant E. coli Strains Isolate from Children with community-Acquired urinary tract infections in Shiraz, Iran. Polish J Microbiol. 2008; 57 (3): 193-198.
31. Falakian Z, Nikokar I, Nafisi MR, Karimi AM V. Frequency of class 1 Integrons among Escherichia coli isolates of patients with urinary tract infection Iran. J Clin Infect Dis. 2011; 6 (4): 24-32.
32. Ranjbaran M, Zolfaghari M, Japoni-Nejad A., Amouzandeh Nobaveh AR, Abtahi H, Nejad M Molecular investigation of integrons in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from urinary tract infections. J Mazandaran Univ Med Sci. 2013; 23 (105): 20-27.
33. Islami G, Seyed Javadi S, Fallah H. Prevalence of integrons in multidrug resistance E. coli and Kelebsiella isolated from urinary tract infections in children. Pajohandeh. 2011; 34(1):61-65.
The frequency of genes in integron class 1, 2 and 3 in uropathogenic Escherichia coli strains isolated from diabetic patients in Shahrekord city
Negin Deli Sarraki1, Fatemeh Khodaverdipour2, Nazila Arbab soleimani3*, Mohammad Reza Afsharzadeh4
1- Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Shahrekord Branch, Shahrekord, Iran.
2- Research Center of Nutrition and Organic Products (R.C.N.O.P), Islamic Azad University, Shahrekord Branch,Shahrekord ,Iran.
3- Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Islamic Azad University, Damghan Branch, Damghan, Iran.
4- Department of Veterinary Medicine, Islamic Azad University, Shahrekord Branch, Shahrekord,
Iran
*Corresponding author: Nazilaarbab@yahoo.co.uk
Abstract
The most common uropathogenic strains of Escherichia coli strains are pathogenic in humans. The most important feature of uropathogenic Escherichia coli strains, the ability of colonization on the surface of host is the euro epithelium cells.
The present study took place on 300 urine samples of patients with diabetes mellitus type 2 suspected urinary tract infections, referred to clinical laboratories of Shahrekord city, Iran in 1394. 5 to 10 cc of urine samples from diabetic patients were collected and by calibrated loop, 0.01 ml of urine cultured in Mac kanky agar media. After performing PCR test were examined to 16srRNA Escherichia coli gene, all samples tested for the presence of class 1, 2 and 3 integron genes at the present of specific primers.
Of 300 diabetic patients UTI diagnosed in 100 samples. In 51 patients (51%) E.coli was diagnosed. Results indicate that class 1 integron was seen in 30 isolations (58.82%), class 2 in 20 (39.2%) and the third class in 5 ones (9.8%). Most resistance reported to ampicillin (66.66%) and the lowest resistance reported to Nitrofurantoin (1.96%).
Based on statistical analysis had a significant relationship was observed between resistance to gentamicin, imipenem and Nitrofurantoin with class 1 integron (p-value< 0/05).
Keywords: Diabetic pateients, Escherichia coli, Integron, Urinary Tract nfection.
