تشخیص کریپتوکوکوس نئوفورمانس در بیماران ایدزی با روش تکثیر هم دمایی به واسطه حلقه (LAMP)

محورهای موضوعی : میکروب شناسی مولکولی

محمدحسن شاه حسینی ¹ , علیرضا رضائی امیرآبادی ² , جلیل وند یوسفی ³ , محمد قهری ⁴ , کیهان آزادمنش ⁵ , الهام مسلمی ⁶

1 - دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد شهر قدس ، گروه میکروبیولوژی
2 - دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد کرج ، گروه میکروبیولوژی
3 - دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد کرج ، گروه میکروبیولوژی
4 - دانشگاه امام حسین (ع) ، گروه زیست شناسی
5 - انستیتو پاستور ایران- آزمایشگاه ویروس شناسی
6 - دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شرق/قیامدشت، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت : 1388/05/25 تاریخ پذیرش : 1388/10/25 تاریخ انتشار : 1388/10/11

کلید واژه: HIV, LAMP, کریپتوکوکوس نئوفورمنس, ایدز, ura5,

چکیده مقاله :

زمینه و هدف: کریپتوکوکوس نئوفورمنس بیشتر افراد دچار نقص سیستم ایمنی را درگیر می‌کند و مننژیت حالت شایع بیماری می‌باشد. روش‌های متعددی برای تشخیص این عامل کشنده رایج است اما هیچ‌کدام از این روش‌ها، حساسیت، اختصاصیت و سرعت قابل قبولی را ندارند. LAMP یک روش مقرون به‌صرفه در عین حال بسیار سریع و حساس و سودمند به‌ویژه در کشورهای در حال توسعه می‌باشد. در این مطالعه سعی بر راه اندازی و بهینه نمودن LAMP برای تشخیص وارزیابی میزان شیوع کریپتوکوکوس نئوفورمنس در نمونه‌های سرمی بیماران مبتلا به ایدز شده است. مواد و روش‌ها: تعداد 34 نمونه سرم خون از بیماران فوق جمع آوری گردید. آزمون‌های حساسیت و اختصاصیت بر روی روش انجام و آزمون بر روی نمونه‌ها بهینه گردید. پس از انجام مراحل غیرفعال‌سازی عوامل عفونی موجود درنمونه‌ها و استخراج DNA، از تعداد 6 پرایمر طراحی شده ویژه ژن ura5 ، برای به‌کارگیری آزمون LAMP در تشخیص کریپتوکوکوس نئوفورمنس استفاده شد. یافته‌ها: تعداد 3 مورد از 34 نمونه جمع آوری شده با استفاده از LAMP مثبت گزارش گردید. حساسیت و اختصاصیت این روش 100% ارزیابی شد. نتیجه‌گیری: LAMP روشی کاربردی، حساس، سریع و مقرون به‌صرفه در تشخیص کریپتوکوکوس نئوفورمنس، می‌باشد. استفاده از این روش که برای اولین بار در ایران انجام شده است، در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی با داشتن کم‌ترین تجهیزات قابل انجام است.

چکیده انگلیسی:

Background and Objective: Cryptococcus neoformans is opportunistic capsulated yeast that infects immunocompromised individuals. Infection occurs due to inhalation of the agent and common infection form is meningitis. Several methods are common to detect this life threthening agent but none of them have well accepted in sensitivity, specificity and rapidness. In this research the effort has been on installation and optimizing the LAMP assay in order to detect the agent itself and its distribution importance of Cryptococcus neoformans in serum specimens of AIDS patients. Material and methods: Atotal number of 34 serum specimens were collected from 34 AIDS patients. After applying sensitivity and specificity tests for the installed technique, optimization of the assay was performed on the specimens. The specimens got inactivated and after steps of DNA extraction, 6 designated primers for the target gene (ura5) were applyed for detection of Cryptococcus neoformans by using the LAMP method. Results: In this study 3 specimens of the total number of 34 AIDS patients were reported positive by using LAMP technique. This it reveals the importance of Cryptococcal infection in AIDS patients. Conclution: Loop-mediated isothermal amplification is an applicable, sensitive, quick and lucrative method for detection of Cryptococcus neoformans. Diagnostic laboratory can use this method without requiring any special instruments.

منابع و مأخذ:

1. Mitchell AP. Updated view of Cryptococcus neoformans mating type and virulence. Infect Immun. 2003 Sep;71(9):4829-30.

2. Kwon-Chung K.J VA. Do major species concepts support one,two or more species within Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Res. 2006;6:574-84.

3. A. Guerrero  NJ, D. L. Goldman ,B. C. Fries. Phenotypic switching in Cryptococcus neoformans. Microbiology. 2006 152(Pt 1):3-9.

4. Nielsen K DOA, Heitman J. Cryptococcus neoformans mates on pigeon guano: implications for the realized ecological niche and globalization. Eukaryot Cell. 2007 6(6):949-59.

5. Findley K R-CM, Metin B, Kroiss J, Fonseca A, Vilgalys R, Heitman J. Phylogeny and phenotypic characterization of pathogenic Cryptococcus species and closely related saprobic taxa in the Tremellales. Eukaryot Cell. 2009 8(3):353-61.

6. BARRETO DE OLIVEIRA MTB, T.; THEELEN, B. Cryptococcus neoformans shows a remarkable genotypic diversity in Brazil. J clin Microbiol. 2004.;42:1356-9.

7. BIALEK RW, M.; BEKURE-NEMARIAM, K. Detection of Cryptococcus neoformans DNA in Tissue Samples by Nested and Real-Time PCR Assays. Clin Diag Lab Immunol. 2002;9:461-9.

8. PAPPALARDO MCSNM, M.S.C. Cryptococcosis: a review of the Brazilian experience for the disease. Rev Inst Med trop S Paulo. 2003;45:299-305.

9. D’SOUZA CAH, F., BOEKHOUT, T.; COX, G.M. & HEITMAN, J. Investigation of the basis of virulence in serotype A strains of Cryptococcus neoformans from apparently immunocompetent individuals. Curr Genet. 2004;46:92-102.

10. Regina Célia PASCHOAL  MHH, Rosário Crespo HIRATA ,Márcia de Souza Carvalho MELHEM ,Amanda Latercia Tranches DIAS ,Claudete Rodrigues PAULA. NEUROCRYPTOCOCCOSIS: DIAGNOSIS BY PCR METHOD. Rev Inst Med trop S Paulo. 2004 July-August;46(4):203-7.

11. Asmaa Bahrami DMHS, Dr Kayhan Azadmanesh, Dr Zahra Noormohamadi, Dr Elham Moslemi and Dr Farzaneh Jadali. Optimization of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method for detection of herpes simplex virus type 1 and 2. SJKU. 2011;16(1):56-63.

12. Mohmmad hasan Shahhosseiny ZE, Elham Moslemi, Parichehre Yaghmaii. Loop mediated isothermal amplification of hepatitis B virus in hemodialysis patients. Journal of Microbial World. 2009;2(3):183-92[In Persian].

13. Mori Y NT. Loop-mediated isothermal amplifi cation (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. . J Infect Chemother. 2009;15:62–9.

14. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.

15. Parida MM. SS, Dash PK., Tripathi NK., Lakshmi V., Mamidi N., Shrivastva  A., Gupta N., Saxena P., and Pradeep J. Rapid and realtime detection of chikungunya virus by reverse transcription loop mediated isothermal amplifi cation assay. J clin Microbiol. 2007;45:351-7.

16. Nagamine K HTaNT. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplifcation using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 2002;16:223-9.

17. Mori Y NK, Tomita N, Notomi T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. J Biochem Biophys Res Commun. 2001;289:150-4.

18. Parida M SS, Kumar Dash P, Rao PVL, Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) : a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18:407- 21.

19. Mori Y, Hirano T, Notomi T. Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers. BMC Biotechnol. 2006;6:3.

20. Blevins LB, J. Fenn, H. Segal, P. Newcomb-Gayman, K. C. Carroll. False-positive cryptococcal antigen latex agglutination caused by disinfectants

and soaps. J Clin Microbiol. 1995;33:1674–167.

21. Kauffman L BS, editor. Cryptococcosis: A wakening giant. In: The black and white yeasts Proceedings of the 4 th International Conference on mycosis; 1978; Washington DC: Pan American Health Organisation and Science publication.p. 176-187.

22. Ellis D MD, Hajjeh RA, Warnock D, Meyer W, Barton R. Epidemiology: surveillance of fungal infections. Med Mycol 2000;38:173-82.

23. Meyer W KS, Castañeda A, Jackson S, Huynh M, Latouche GN, editor. Global molecular epidemiology offers hints towards ongoing speciation within Cryptococcus neoformans. In: Abstracts of the 5th International Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis; 2002 March 3-7, 2002; South Australian Postgraduate Medical Education Association,Adelaide, Australia.

24. Banerjee U KJ, Sethi S, Gupta K. Sudden spurt of Cryptococcosis at a tertiary care hospital at New Delhi between. Indian J Med Res December to February 1995;102:272-4.

25. Kaur R RD, Kakkar M, Monga R, Sharma VK. Cryptococcal meningitis in pediatric AIDS. J Trop Ped 2003;49(124-125).

26. BanerjeeU JN, Sethi S. Lets be aware: Cryptocococcosis is no more away from children. Indian Association of Medical Microbiologist. Aug 2003;Delhi Chapter Annual meeting:Safdarjung Hospital, New Delhi.

27. Khanna N CA, Desai A, Ravi V, Santosh V, Shankar SK, Satishchandra P. Cryptococcosis in the immunocompromised host with special reference to AIDS. Indian J Chest Dis Allied Sci. 2000 Oct-Dec;42(4):311-5.

28. Powderly WG. CryptococcalmeningitisandAIDS. ClinInfectDis. 1993;17:837-42.

29. Cohen J. Comparison of the sensitivity of three methods for the rapid identification of Cryptococcus neoformans. J Clin Pathol. 1984;37(3):332-4.

30. Velegraki A KVG, Kansouzidou A ,Smilakou S ,Mitroussia-Ziouva A ,Legakis N.J. prospective use of RFLP analysis on amplified Cryptococcus neoformans URA5 gene sequences for rapid identification of varieties and serotypes in clinical samples. Medical Mycology. October  2001 39(5):409-17.

31. Klein KR HL, Deml SM, Rysavy JM, Wohlfiel SL, Wengenack NL. Identification of Cryptococcus gattii by use of L-canavanine glycine bromothymol blue medium and DNA sequencing. J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3669-72.

32. Ushikubo H. The principle of LAMP method. Uirusu. 2004;54:107-12.

33. Hong TC MQ, Cuong DV, Parida M, Minekawa H, Notomi T, Hasebe F, Morita K. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 2004;42:1956–61.