خالص سازی هورمون رشد انسانی تولید شده به شکل محلول از سویه نوترکیب اشریشیاکلی در مقیاس آزمایشگاهی

محورهای موضوعی : میکروب شناسی صنعتی

سید مرتضی رباط جزی ¹ (استادیار، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، مجتمع شیمی و مهندسی شیمی، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی،تهران، گروه مهندسی بیوشیمی)
سید محمد حسن‌‌پور متی‌‌کلایی ² (دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، مجتمع شیمی و مهندسی شیمی، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی،تهران، گروه مهندسی بیوشیمی)
ولی اله بابایی پور، ³ (دانشیار، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، مجتمع شیمی و مهندسی شیمی، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی،تهران، گروه مهندسی بیوشیمی)
حمیده روحانی نژاد ⁴ (استادیار، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، مجتمع شیمی و مهندسی شیمی، پژوهشکده علوم و فناوری زیستی،تهران، گروه علوم زیستی)

تاریخ دریافت : 1398/06/05 تاریخ پذیرش : 1398/07/30 تاریخ انتشار : 1398/12/01

کلید واژه: کروماتوگرافی تمایلی, هورمون رشد نوترکیب انسانی (, )rhGHبیان سیتوپلاسمی,

چکیده مقاله :

سابقه و هدف: هورمون رشد انسانی یا سوماتوتروپین یک پلی پپتید تک زنجیره ای با وزن مولکولی kDa22 دارای 191 واحد آمینو اسیدی است. هدف از این پژوهش، ارزیابی تولید و خالص سازی فرم محلول هورمون رشد انسانی نوترکیب در مقیاس آزمایشگاهی می باشد.مواد و روش ها: در این تحقیق از باکتریاشریشیاکلی حاوی پلاسمید pET32a(+)-Trx-His6-hGH استفاده شد. به منظور دست یابی به میزان بالای تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در محیط سیتوپلاسم به شکل محلول از برچسب Trx و برای خالص سازی از برچسب هیستیدینی استفاده شد. باکتری در محیط LB و TB در دمای ⁰C 25 رشد داده شد. فرایند خالص سازی بر اساس روش کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از ژل Ni-NTA انجام گردید.نتایج: نتیجه آنالیز ژل الکتروفورز بیان 55 % هورمون رشد نوترکیب را نشان داد که تقریبا 7/33 % تولید آن به شکل محلول و 8/18% آن به شکل نامحلول بود. میزان فیوژن پروتین هورمون رشد انسانی حاصل از تخلیص g1 رسوب سلولی mg 4/22 تعیین گردید.نتیجه گیری: بااستفاده از برچسب Trx فیوژن پروتین هورمون رشد انسانی نوترکیب محلول به خوبی بیان شد. همچنین با استفاده از روش خالص سازی بر اساس دنباله هیستیدینی، خلوص 91% و بازده کل 38 % هورمون رشد انسانی به دست آمد.

چکیده انگلیسی:

Background & Objectives: Human growth hormone (hGH) or somatotropin is a single chain polypeptide that consisting of 191 amino acid residues and a molecular weight of 22kDa. The purpose of this study was to evaluate the production and purification of the soluble form of recombinant human growth hormone in the lab-scale.Material & Methods: In this study, the recombinant E. coli containing the plasmid pET32a(+)-hGH was used. To obtain high-level production of soluble hGH in the cytoplasm was used from Trx tag and for the purification process of hGH was used from His tag. The bacteria were grown in LB and TB culture media at 25 ⁰C. The purification process carried out based on affinity chromatography using Ni-NTA resin.Results: The SDS-PAGE analysis showed 55% hGH expression that 33.7% expressed as soluble and 18.8% expressed as IBs. The amount of hGH fusion protein purified through a Ni-NTA column was 22. 4 mg per gram of wet cells.Conclusion: The results of this study indicate that hGH-Trx fusion protein was properly expressed. The purity of hGH fusion protein purified by the histidine-tagged protein purification method was determined by 91% with a total yield of 38%.

منابع و مأخذ:

1. Møller N, Jørgensen JO. Effects of growth hormone on glucose, lipid, and protein metabolism
   in human subjects. Endocr Re. 2009; 30(2): 152–177.
   2. Mulinacci F, Capelle MA, Gurny R, Drake AF, Arvinte T. Stability of human growth hormone:
   influence of methionine oxidation on thermal folding. J Pharm Sci. 2011; 100(2): 451-463.
   
   3. Lu M, Flanagan JU, Langley RJ, Hay MP, Perry JK. Targeting growth hormone function: strategies and therapeutic applications. Signal Transduct Target Ther. 2019; 4: 3.
   4. Laron Z. Growth hormone and insulin-like growth factor-I: effects on the brain, hormones,
   brain and behavior. Exp Gerontol. 2015; 68: 76–81.
   5. Ribela MT, Gout PW. Bartolini P. Synthesis and chromatographic purification of recombinant
   human pituitary hormones. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003; 790 (1–2):
   285-316.
   6. Andersen DC, Krummen L. Recombinant protein expression for therapeutic applications. Curr
   Opin Biotech. 2002; 13(2): 117-123.
   7. Jia B, Jeon CO. High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current
   status and future perspectives. Open Biol. 2016; 6(8): 160-196.
   8. Novagen, Competent cells. User Protocol TB009 Rev. 0104, EMD Biosciences, Inc., 2004;
   1-23.
   9. Kinna A, Tolner B, Rota EM, Titchener-Hooker N, Nesbeth D, Chester K. IMAC capture of
   recombinant protein from unclarified mammalian cell feed streams. Biotechnol Bioeng. 2016;
   113(1): 130-140.
   10. Magnusdottir A, Johansson I, Dahlgren LG, Nordlund P, Berglund H. Enabling IMAC
   purification of low abundance recombinant proteins from E.coli lysates. Nat Methods. 2009; 6
   (7): 477-478.
   11. Susanne Graslund PN et al. Protein production and purification. Nat Methods. 2008; 5(2):
   135-146.
   12. Rouhani Nejad H, Yari S, Deldar AA. Hamidi AA. Cloning and expression of human
   growth hormone gene by thioredoxin tag. J Cell Tissue, 2017; 7(4): 339-406. [In Persian]
   13. Kim MJ, Park HS, Seo KH, Yang HJ, Kim SK, Choi JH. Complete solubilization and
   purification of recombinant human growth hormone produced in Escherichia coli. PLoS One.
   2013; 8(2): e56168-10.1371/journal.pone.0056168.
   14. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current
   protocols in molecular biology, New York. John Wiley & Sons, Inc; 2004 .
   15. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage
   T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-685.
   16. Ku HK, Lim HM, Oh KH, Yang HJ, Jeong JS, Kim SK. Interpretation of protein quantitation
   using the Bradford assay: comparison with two calculation models. Anal Biochem. 2013; 434
   (1): 178-180.
   17. Palmer I, Wingfield P T. Preparation and extraction of insoluble (inclusion-body) proteins
   from Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci. 2004; 6: Unit 6(3).
   18. Overton TW. Recombinant protein production in bacterial hosts. Drug Discov Today. 2014;
   19(5): 590-601.
   19. Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and
   challenge. Front Microbiol. 2014; 17(5): 172.
   20. Zamani M, Berenjian A, Hemmati S, Nezafat N, Ghoshoon MB, Dabbagh F, Mohkam M,
   Ghasemi Y. Cloning, expression, and purification of a synthetic human growth hormone in
   Escherichia coli using response surface methodology. Mol Biotechnol. 2015; 57(3): 241-250.
   21. Bolanos-Garcia VM, Davies OR. Structural analysis and classification of native proteins from
   E.coli commonly co-purified by immobilised metal affinity chromatography. Biochim Biophys
   Acta. 2006; 1760(9): 1304-1313.
   22. Ghasemi R, Hashemzadeh H, Razavi H, Yakhchali B. Production of recombinant human
   growth hormone and future challenges. Modares J Biotechnol. 2018; 9(1): 79-92. [In Persian]
   23. Ghavim M, Abnous K, Arasteh F, Taghavi S, Nabavinia M S, Alibolandi M, Ramezani M.
   High level expression of recombinant human growth hormone in Escherichia coli: crucial role
   of translation initiation region. Res Pharm Sci. 2017; 12(2): 168–175.
   24. Ghasemi F, Zomorodipour A, Shojai S, Ataei F, Khodabandeh M, Sanati MH. Using
   L-arabinose for production of human growth hormone in Escherichia coli, studying the
   processing of gIII: hGH precursor. Iran J Biotechnol, 2004; 2(4): 250-260.
   25. Azadi S, Sadjady S K, Mortazavi S A, Naghdi N, Mahboubi A, Solaimanian R. Bioprocess
   and downstream optimization of recombinant human growth hormone in Pichia pastoris. Res
   Pharm Sci. 2018; 13(3): 222-238.