زیست پالایی جیوه معدنی از طریق ساخت وکتور نوترکیب pET 21a(+)-merA
محورهای موضوعی : زیست فناوری میکروبیحمیده باغی سفیدان 1 , علیرضا تاری نژاد 2
1 - دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان
2 - دانشیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان
کلید واژه: جیوه, زیست پالایی, ژن merA, وکتور نوترکیب,
چکیده مقاله :
سابقه و هدف: ورود جیوه معدنی از طریق صنایع و کشاورزی به محیط زیست یکی از جدی ترین مشکلات زیست محیطی در کشور به شمار می آید. زیست پالایی توسط باکتری ها یکی از راهکارهای مناسب و عملی برای پاکسازی آلاینده ها از محیط محسوب می گردد. مطالعه حاضر با هدف ساخت وکتور نوترکیب حاوی ژن merA و نیز بررسی بیان آن به منظور پاکسازی جیوه انجام گردید. مواد و روش ها: ابتدا ژن merA از ژنوم باکتری مقاوم به جیوه جداسازی و در داخل وکتور بیانی pET21a(+) کلون گردید. صحت همسانه سازی ژن مورد نظر از طریق واکنش PCR و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت. وکتور نوترکیب pET21a(+)-merA به درون باکتری اشریشیا کلی سویه BL21 کلون شد. برای مشاهده افزایش مقاومت به جیوه معدنی در باکتری تراریخته و عملکردی بودن آنزیم تولیدی از وکتور نوترکیب، میزان رشد باکتری های اشریشیا کلی سویه BL21حاوی وکتور نوترکیب به همراه باکتری های اشریشیا کلی سویه BL21 فاقد ژن merA در محیط حاوی جیوه معدنی در مدت 48 ساعت اندازه گیری شدند. یافته ها: نتایج نشان داد که رشد باکتری اشریشیا کلی حاوی وکتور بدون ژن هدف تا 12 ساعت پس از ریختن جیوه به شدت تحت تاثیر محیط حاوی جیوه قرار گرفته و قادر به رشد در مقادیر 10 و ppm 20 جیوه نمی باشند. در حالی که باکتری حاوی وکتور نوترکیب pET21a(+)-merA دارای قابلیت رشد خوبی در محیط حاوی جیوه بودند. SDS-PAGE پروتئین های باکتری حاوی وکتور نوترکیب بر روی ژل آکریل آمید نشان داد که بیشترین بیان پروتئین MerA (با اندازه kDa 62)، پس از 16 ساعت القا با IPTG یک میلی مولار در دمای 37 درجه سلیسیوس به دست می آید. نتیجه گیری: در مجموع توانایی رشد باکتری های اشریشیا کلی حاوی وکتور نوترکیب، نشان دهنده عملکرد پروتئین MerA در باکتری های تراریزش شده می باشد. همچنین افزایش مقاومت باکتری نوترکیب به جیوه معدنی موجود در محیط بیانگر این موضوع است که می توان آلاینده های فلزات سنگین در محیط زیست را با مدیریت مناسب از طریق ساخت وکتور نوترکیب پاکسازی نمود.
Background & Objectives: Inorganic mercury entrance into the environment through industry and agriculture is one of the most serious environmental hazards in the country. Microbial bioremediation is considered as one of the practical solutions to clean up pollutant ions from the environment. The present study was conducted to construct a recombinant vector including merA gene, and also to investigate its expression in order to clean up mercury. Material & Methods: merA gene from mercury resistance bacterial genome was isolated, and subsequently cloned into the pET21a(+) expression vector. Confirmation of cloning target gene was achieved by PCR and restriction enzyme digestion. Then pET21a(+)-merA recombinant vector was cloned into E.coli strain BL21. In order to assess increased resistance to mercury in recombinant bacteria, and the functionality of the enzyme produced by the recombinant vector, the growth rate of recombinant BL21 E. coli strains to contain merA gene, and without it was measured in a medium containing mercury for 48 hours. Results: The results showed that the growth of E. coli strains without merA gene was strongly affected after introducing mercury into the media till 12 hours, and bacteria would not be able to grow at 10 ppm and 20 ppm mercury levels. However, transformed bacteria with pET21a(+)-merA vector showed suitable growth in mercury-containing media. SDS-PAGE analysis of recombinant bacterial proteins on acrylamide gel showed the highest MerA (62KDa) expression following 16 hours induction with 1mM IPTG at 37ºC. Conclusion: Overall, the growth ability of merA- containing recombinant bacteria reflects the action of MerA protein in transformed bacteria. Furthermore, increasing the resistance of recombinant bacteria to the mercury indicates that environmental heavy metal pollutants can be cleaned up properly through the construction of recombinant vectors.
_||_
