Cloning and Expression of Heat Shock Protein 60kDa Gene from Brucella melitensis as Subunit Vaccine
محورهای موضوعی : Camelط. عباسی-دالویی 1 , م. تهمورث‌پور 2 , م.ه. سخاوتی 3
1 - Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
2 - Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 - Department of Animal Science, Faculty of Agriculture, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
کلید واژه: expression, GroEL, Immunogenicity, recombinant vaccine,
چکیده مقاله :
Brucellosis is caused by the bacterium Brucella and affects various domestic and wild species. GroEL (Heat Shock Protein 60kDa) as one of the major antigens that stimulate the immune system, increases Brucella survival. The aim of the current study was to clone and express GroEL in Escherichia coli in order to design subunit vaccine. Amplifying was performed using specific primers. The full-length open reading frame of this gene was cloned into the expression vector pET-32a(+) and expressed in BL21 (DE3). The expressed antigen was purified and the molecular weight of the recombinant protein was about 70 kDa. Sequencing results along with SDS-PAGE and Western analysis confirmed the expression of recombinant GroEL in the heterologous Escherichia coli. The results of colony polymerase chain reaction (PCR), enzyme digestion and sequencing showed that the GroEL antigen has been successfully cloned and sub-cloned into pET-32a(+). The results showed that Escherichia coli was able to express GroEL protein appropriately. This protein was expressed by induction with isopropyl β -D-thiogalactoside (IPTG) at concentration of 1 mM and it was confirmed by Ni-NTA column, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western-blotting electrophoresis. The results of this study showed that Escherichia coli can be used as an appropriate host to produce the recombinant GroEL protein. This recombinant protein may be useful to simulate immune system, to produce recombinant vaccine and diagnostic kit in future studies after it passes biological activity tests in vivo in animal model and or other suitable procedure.
بیماری بروسلوز با واسطه باکتری بروسلا ایجاد شده و گونه‌های اهلی و وحشی زیادی را مبتلا می‌کند. گروئیل (پروتئین شوک حرارتی با وزن مولکولی ۶۰ کیلو دالتون) به عنوان یکی از آنتی‌ژن‌های اصلی محرک سیستم ایمنی، باعث افزایش زنده مانی بروسلا می‌شود. هدف از این مطالعه همسانه‌سازی و بیان ژن گروئیل در باکتری اشرشیا کلی به عنوان یک واکسن زیر واحد بوده است. تکثیر این ژن توسط آغازگرهای اختصاصی صورت گرفته و قطعه ژنی تکثیر شده در وکتور بیانی pET-32a(+) همسانه‌سازی و در میزبان BL21 (DE3) بیان گردید. آنتی‌ژن بیان شده پس از تخلیص دارای وزن مولکولی ۷۰ کیلو دالتون بود. صحت بیان پروتئین نوترکیب در باکتری اشرشیا کلی توسط توالی‌یابی، SDS-PAGE و وسترن بلات تأیید گردید. همچنین نتایج واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، هضم آنزیمی و توالی‌یابی نشان دادند که این ژن با موفقیت در pET-32a(+) همسانه‌سازی گردیده است. نتایج همچنین نشان دادند که سویه باکتریایی استفاده شده به طور مناسب گروئیل را بیان کرده است. القا بیان توسط IPTG با غلطت ۱ میلی‌مولار صورت گرفته و بیان آن با تخلیص توسط ستون نیکل و مشاهده بر روی SDS-PAGE و وسترن بلات تأیید شد. نتایج این مطالعه نشان داد که میزبان بیانی اشرشیا کلی برای تولید و پروتئین نوترکیب گروئیل مناسب است. این پروتئین نوترکیب ممکن است برای تحریک سیستم ایمنی مناسب بوده و بتوان از آن برای تولید واکسن نوترکیب و کیت تشخیصی پس از انجام مطالعات بیشتر روی فعالیت بیولوژیکی آن با مدل حیوانی یا سایر روش‌های مناسب، استفاده کرد.
Ahsani M.R., Bafti M.S., Esmailizadeh A.K. and Mohammadabadi M.R. (2011). Genotyping of isolates of Clostridium perfringens from vaccinated and unvaccinated sheep. Small Rumin. Res. 95, 65-69.
Ahsani M.R., Mohammad Abadi M.R., Shamsodini Bafti M., Ezatkhah M., Derakhshan Hasani M. and Esmailzadeh A.K. (2010a). Application of triplex PCR technique in identification of Clostridium perfringens b, c and d types. Iranian J. Anim. Sci. Res. 2, 185-190.
Ahsani M.R., Mohammadabadi M.R. and Shamsaddini M.B. (2010b). Clostridium perfringens isolate typing by multiplex PCR. J. Venom Anim. Toxins. Incl. Trop. Dis. 16, 573-578.
Al Dahouk S., Fleche P.L., Nockler K., Jacques I., Grayon M., Scholz H.C., Tomaso H., Vergnaud G. and Neubauer H. (2007). Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis. J. Microbiol. Method. 69, 137-145.
Amirmozafari N., Ghazi F., Mostafazadeh A., Mostafaie A. and Rajabnia R. (2008). Comparison of heat shock response in Brucella abortus and Brucella melitensis. Pakistan J. Biol. Sci. 11, 188-194.
Bae J.E. and Toth T.E. (2000). Cloning and kinetics of expression of Brucella abortus heat shock proteins by baculovirus recombinants. Vet. Microbiol. 75, 199-204.
Cassataro J., Estein S.M., Pasquevich K.A., Velikovsky C.A., de la Barrera S., Bowden R., Fossati C.A. and Giambartolomei G. H. (2005). Vaccination with the recombinant Brucella outer membrane protein 31 or a derived 27-amino-acid synthetic peptide elicits a CD4+ T helper 1 response that protects against Brucella melitensis infection. Infect. Immun. 73, 8079-8088.
Corbel M.J. (2006). Brucellosis in Humans and Animals. World Health Organization. Publisher by World Health Organization, Geneva, Switzerland.
Delpino M.V., Estein S.M., Fossati C.A., Baldi P.C. and Cassataro J. (2007). Vaccination with Brucella recombinant DnaK and SurA proteins induces protection against Brucella abortus infection in BALB/c mice. Vaccine. 25, 6721-6729.
Franco M.P., Mulder M., Gilman R.H. and Smits H.L. (2007). Human brucellosis. Lancet Infect. Dis. 7, 775-786.
Golshani M., Rafati S., Jahanian-Najafabadi A., Nejati-Moheimani M., Siadat S.D., Shahcheraghi F. and Bouzari S. (2015). In silico design, cloning and high level expression of L7/L12-TOmp31 fusion protein of Brucella antigens. Res. Pharm. Sci. 10, 436-445.
LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P. F. and McCoy J.M. (1993). A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11, 187-193.
Mohammadabadi M.R., Shaikhaev G.O., Sulimova G.E., Rahman O. and Mozafari M.R. (2004). Detection of bovine leukemia virus proviral DNA in Yaroslavsl, Mongolian and black pied cattle by PCR. Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 766-768.
Mohammadabadi M.R., Soflaei M., Mostafavi H. and Honarmand M. (2011). Using PCR for early diagnosis of bovine leukemia virus infection in some native cattle. Genet. Mol. Res. 10, 2658-2663.
Pappas G. (2010). The changing Brucella ecology: novel reservoirs, new threats. Int. J. Antimicrob. Agents. 36(1), 8-11.
Pappas G., Papadimitriou P., Christou L. and Akritidis N. (2006). Future trends in human brucellosis treatment. Expert Opin Invest. Drugs. 15, 1141-1149.
Ritchie J.A., Rupper A., Cardelli J.A. and Bellaire B.H. (2012). Host interferon-gamma inducible protein contributes to Brucella survival. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 55-61.
Sambrook J. and Russell D.W. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Seleem M.N., Boyle S.M. and Sriranganathan N. (2010). Brucellosis: a re-emerging zoonosis. Vet. Microbiol. 140, 392-398.
Shahdadnejad N., Mohammadabadi M.R. and Shamsadini M. (2016). Typing of Clostridium Perfringens Isolated from Broiler Chickens Using Multiplex PCR. Genet. 3rd Millennium. 14(4), 4368-4374.
Silva C.L. (1999). The potential use of heat-shock proteins to vaccinate against mycobacterial infections. Microb. Infect. 1, 429-435.
Yang X., Skyberg J.A., Cao L., Clapp B., Thornburg T. and Pascual D.W. (2013). Progress in Brucella vaccine development. Front. Biol. 8, 60-77.
Zandi E., Mohammadabadi M.R., Ezzatkhah M. and Esmailizadeh A.K. (2014). Typing of toxigenic isolates of Clostridium perfringens by multiplex PCR in ostrich. Iran J. Appl. Anim. Sci. 4, 509-514.
Zhan Y., Liu Z. and Cheers C. (1996). Tumor necrosis factor alpha and interleukin-12 contribute to resistance to the intracellular bacterium Brucella abortus by different mechanisms. Infect. Immun. 64, 2782-2786.
