immunohistochemical evaluation in testicular tissue of male rats following PM2.5 particle inhalation

Immunohistochemistry of testicular tissue following inhalation of PM2.5 particles

Subject Areas : Experimental physiology and pathology

elnaz noshadirad ¹ , kazem parivar ² , Saeed Motesaddi Zarandi ³ , Pejman Mortazavi ⁴ , batool Gorbani yekta ⁵

1 - Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
2 - Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
3 - Department of Environmental Health Engineering, School of Public Health and Safety, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4 - Department of Veterinary Pathobiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University
5 - گروه فیزیولوژی ، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ازاد اسلامی تهران

Received: 2023-10-29 Accepted : 2024-01-07 Published : 2024-02-20

Keywords: Particle matter, Oxidative stress, Testis, Aquaporin9,

Abstract :

Background & Aim: Exposure to suspended particles (PM2.5) and gaseous air pollution poses a serious threat to spermatogenesis in men. However, the specific molecular mechanism behind this remains largely unknown. This study aims to investigate the impact of PM2.5 and gas pollution on various aspects including the oxidant/antioxidant system, oxidative stress and also the changes in the expression level of aquaporin protein through immunohistochemistry and western blotting in testicular tissue were investigated. Materials & Methods: A total of 36 male Wistar rats were randomly divided into three groups: a control group exposed to standard air conditions, a group exposed to gas pollutants alone (Gas), and a group exposed to both gas pollutants and PM2.5 (Gas+PM2.5). All groups were subjected to pollutant exposure for three months, four days a week, and five hours a day. Results: The findings revealed that co-exposure to gaseous pollutants and PM2.5 led to increased concentration of Malondialdehyde (MDA), as well as decreased in aquaporin 9 protein in immunohistochemistry and western blot, compared to the control group. Conclusion: Therefore, exposure to PM2.5 and gaseous pollutants probably provokes oxidative stress in the testis, which leads to the reduction of aquaporin 9 protein through the activation of signaling pathways. Thus, PM2.5 pollution appears to play a crucial role in infertility by disrupting spermatogenesis.

References:

1. Wei Y, Cao X-N, Tang X-L, Shen L-J, Lin T, He D-W, et al. Urban fine particulate matter (PM2. 5) exposure destroys blood–testis barrier (BTB) integrity through excessive ROS-mediated autophagy. Toxicology mechanisms and methods. 2018;28(4):302-19.
2. Thangavel P, Park D, Lee Y-C. Recent insights into particulate matter (PM2. 5)-mediated toxicity in humans: an overview. International journal of environmental research and public health. 2022;19(12):7511.
3. Wang L, Luo D, Liu X, Zhu J, Wang F, Li B, Li L. Effects of PM2. 5 exposure on reproductive system and its mechanisms. Chemosphere. 2021;264:128436.
4. Kannan A, Mariajoseph-Antony LF, Panneerselvam A, Loganathan C, Kiduva Jothiraman D, Anbarasu K, Prahalathan C. Aquaporin 9 regulates Leydig cell steroidogenesis in diabetes. Systems Biology in Reproductive Medicine. 2022;68(3):213-26.
5. Motesaddi Zarandi S, Shahsavani A, Khodagholi F, Fakhri Y. Concentration, sources and human health risk of heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons bound PM 2.5 ambient air, Tehran, Iran. Environmental geochemistry and health. 2019;41:1473-87.
6. Zarandi SM, Shahsavani A, Khodagholi F, Fakhri Y. Co-exposure to ambient PM2. 5 plus gaseous pollutants increases amyloid β1–42 accumulation in the hippocampus of male and female rats. Toxin reviews. 2019.
7. Sowlat MH, Naddafi K, Yunesian M, Jackson PL, Shahsavani A. Source apportionment of total suspended particulates in an arid area in southwestern Iran using positive matrix factorization. Bulletin of environmental contamination and toxicology. 2012;88:735-40.
8. Rochester JR. Bisphenol A and human health: a review of the literature. Reproductive toxicology. 2013;42:132-55.
9. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical biochemistry. 1979;95(2):351-8.
10. Babaei H, Alibabrdel M, Asadian S, Siavashi V, Jabarpour M, Nassiri SM. Increased circulation mobilization of endothelial progenitor cells in preterm infants with retinopathy of prematurity. Journal of Cellular Biochemistry. 2018;119(8):6575-83.
11. Jabarpour M, Siavashi V, Asadian S, Babaei H, Jafari SM, Nassiri SM. Hyperbilirubinemia-induced pro-angiogenic activity of infantile endothelial progenitor cells. Microvascular research. 2018;118:49-56.
12. Siavashi V, Nassiri SM, Rahbarghazi R, Vafaei R, Sariri R. ECM‐Dependence of endothelial progenitor cell features. Journal of cellular biochemistry. 2016;117(8):1934-46.
13. Sarti E, Pasti L, Rossi M, Ascanelli M, Pagnoni A, Trombini M, Remelli M. The composition of PM1 and PM2. 5 samples, metals and their water soluble fractions in the Bologna area (Italy). Atmospheric Pollution Research. 2015;6(4):708-18.
14. Lei XG, Zhu J-H, Cheng W-H, Bao Y, Ho Y-S, Reddi AR, et al. Paradoxical roles of antioxidant enzymes: basic mechanisms and health implications. Physiological reviews. 2016;96(1):307-64.
15. Wang B, Chan Y-L, Li G, Ho KF, Anwer AG, Smith BJ, et al. Maternal particulate matter exposure impairs lung health and is associated with mitochondrial damage. Antioxidants. 2021;10(7):1029.
16. Leclercq B, Kluza J, Antherieu S, Sotty J, Alleman L, Perdrix E, et al. Air pollution-derived PM2. 5 impairs mitochondrial function in healthy and chronic obstructive pulmonary diseased human bronchial epithelial cells. Environmental pollution. 2018;243:1434-49.
17. Huang K, Shi C, Min J, Li L, Zhu T, Yu H, Deng H. Study on the mechanism of curcumin regulating lung injury induced by outdoor fine particulate matter (PM2. 5). Mediators of inflammation. 2019;2019.
18. Liu X, Meng Z. Effects of airborne fine particulate matter on antioxidant capacity and lipid peroxidation in multiple organs of rats. Inhalation toxicology. 2005;17(9):467-73.
19. Ostro B, Malig B, Broadwin R, Basu R, Gold EB, Bromberger JT, et al. Chronic PM2. 5 exposure and inflammation: determining sensitive subgroups in mid-life women. Environmental research. 2014;132:168-75.
20. Kannan A, Panneerselvam A, Mariajoseph-Antony LF, Loganathan C, Prahalathan C. Role of aquaporins in spermatogenesis and testicular steroidogenesis. The Journal of Membrane Biology. 2020;253:109-14.
21. Hemmingsen JG, Hougaard KS, Talsness C, Wellejus A, Loft S, Wallin H, Møller P. Prenatal exposure to diesel exhaust particles and effect on the male reproductive system in mice. Toxicology. 2009;264(1-2):61-8.
22. Liu J, Ren L, Wei J, Zhang J, Zhu Y, Li X, et al. Fine particle matter disrupts the blood–testis barrier by activating TGF‐β3/p38 MAPK pathway and decreasing testosterone secretion in rat. Environmental toxicology. 2018;33(7):711-9.
23. Wang H, Shen X, Tian G, Shi X, Huang W, Wu Y, et al. AMPKα2 deficiency exacerbates long-term PM2. 5 exposure-induced lung injury and cardiac dysfunction. Free Radical Biology and Medicine. 2018;121:202-14.
24. Zhang H, Yang B. Aquaporins in Reproductive System. Aquaporins. 2023:179-94.
25. Shou Y, Huang Y, Zhu X, Liu C, Hu Y, Wang H. A review of the possible associations between ambient PM2. 5 exposures and the development of Alzheimer's disease. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019;174:344-52.

Full-Text:



 

 

ارزیابی ایمونوهیستوشیمی در بافت بیضه موش صحرایی نر به دنبال استنشاق ذرات PM2.5

   الناز نوشادی راد1، کاظم پریور 2، سعید متصدی زرندی 3، پژمان مرتضوی 4، بتول قربانی یکتا 5

 

1ـ دانشجوی دکتری گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

۲ـ استاد گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. [e-mail]

۳ـ استاد گروه مهندسي بهداشت محيط، دانشکده بهداشت و ايمني، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران.

4- دانشیار گروه پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

5- استادیارگروه فیزیولوژی ، دانشکده پزشکی، علوم پزشکی تهران، دانشگاه علوم پزشکی آزاد اسلامی، خیابان شریعتی، تهران، ایران.

.

تاریخ دریافت:07/08/1402                                                                                       تاریخ پذیرش: 17/10/1402

چکیده

زمینه و هدف:  قرار گرفتن مردان در معرض ذرات معلق (PM2.5) و آلودگی هوا با گازهای مختلف می‌تواند به طور جدی اسپرم زایی را تهدید کند. با این حال، در مورد مکانیسم مولکولی خاص آن نادانسته‌های زیادی وجود دارد. در مطالعه حاضر به بررسی اثر مواجهه با PM2.5 و آلودگی‌های گازی بر سیستم اکسیدان، آنتی اکسیدانی، استرس اکسیداتیو و همچنین بررسی تغییرات سطح بیان پروتئین آکواپورین از طریق ایمونوهیستوشیمی و وسترن بلات در بافت بیضه پرداخته شد.

 مواد و روش ها: تعداد 36 موش صحرایی نر نژاد ویستار به طور تصادفی به سه گروه تقسیم شدند: یک گروه کنترل در معرض هوا در شرایط استاندارد، یک گروه گاز که به تنهایی در معرض آلاینده‌های گازی (Gas) قرار داشتند و یک گروه گاز به اضافه PM2.5 (Gas+PM2.5). آلاینده‌ها همه گروه‌ها به مدت سه ماه، چهار روز در هفته و پنج ساعت در روز در معرض قرار گرفتند.

نتایج: یافته ها نشان می‌دهد که قرار گرفتن همزمان در معرض آلاینده‌های گازی و PM2.5 باعث افزایش در غلظت مالون دی آلدئید (MDA)، همچنین کاهش پروتئین آکواپورین 9 در ایمونوهیستوشیمی و وسترن بلات در مقایسه با گروه کنترل نشان داد.

نتیجه گیری: بنابراین قرار گرفتن در معرض PM2.5 و آلاینده‌های گازی احتمالاً باعث تحریک استرس اکسیداتیو در بیضه شده که منجر به کاهش پروتئین آکواپورین 9 از طریق فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ می‌شود. به نظر می‌رسد آلودگی PM2.5 نقش مهمی در بروز ناباروری از طریق اختلال در اسپرماتوژنز دارد.

کلمات کلیدی: ذرات PM2.5، استرس اكسیداتیو، بیضه، آکواپورین9 

 

 

مقدمه

آلودگی هوا، به ویژه وجود ذرات ریز(PM2.5)( Particulate matter)، به دلیل اثرات مضر آن بر سلامت انسان، یک نگرانی رو به رشد جهانی است. امروزه تحقیقات گسترده بر روی اثرات تنفسی و قلبی عروقی PM2.5 متمرکز شده است، تأثیر بالقوه آن بر سلامت انسان بسیار مورد توجه قرار دارد (1).

در میان آلاینده‌های مختلف، PM2.5 به ذرات ریز با قطر کمتر از 5/2 میکرومتر اشاره دارد که می‌توانند در هنگام استنشاق به اعماق سیستم تنفسی نفوذ کنند. مطالعات متعدد قرار گرفتن در معرض PM2.5 را با پیامدهای نامطلوب سلامتی، از جمله بیماری‌های تنفسی، اختلالات قلبی عروقی و حتی اختلالات عصبی مرتبط دانسته اند. با این حال، تاثیر PM2.5 بر سلامت باروری، به‌ویژه از اثرات آن بر بافت بیضه، اطلاعات علمی محدوداست (2). بیضه‌ها نقش مهمی در عملکرد تولید مثل مردان دارند و مسئول تولید اسپرم و تنظیم هورمون هستند (3). هر گونه اختلال در بیضه می‌تواند منجر به اختلال در اسپرم زایی و به خطر افتادن باروری شود. با افزایش شیوع آلودگی هوا و پتانسیل آن برای تأثیرگذاری بر سیستم‌های ارگان‌های مختلف، بررسی پیامدهای خاص قرار گرفتن در معرض PM2.5 بر بافت بیضه ضروری می‌شود. چندین مکانیسم قابل قبول برای توضیح رابطه بین آلودگی هوا و سلامت باروری مردان پیشنهاد شده است. استنشاق ذرات PM2.5 می‌تواند طیف وسیعی از اجزای سمی از جمله فلزات سنگین، هیدروکربن‌های آروماتیک چند حلقه ای (PAHs) و مواد شیمیایی مختل کننده غدد درون ریز را وارد گردش خون سیستمیک کند. این مواد می‌توانند در بیضه‌ها تجمع کرده و فرآیندهای سلولی طبیعی را مختل کنند و منجر به اثرات نامطلوب بر کیفیت، کمیت و عملکرد کلی تولید مثل اسپرم شوند (3).

آکواپورین‌ها پروتئین‌های غشایی هستند که انتقال آب و املاح کوچک را در غشای سلولی تسهیل می‌کنند. در میان آنها،  (AQP9)( Aquaporin9) به عنوان یک عامل کلیدی در حفظ تعادل اسمزی در بافت‌های مختلف از جمله بیضه‌ها شناسایی شده است. تعداد فزاینده ای از شواهد نشان می‌دهد که تغییرات در بیان AQP9 ممکن است با شرایط پاتولوژیک موثر بر عملکرد بیضه مرتبط باشد (4). بررسی تأثیر بالقوه قرار گرفتن در معرض PM2.5 بر سطوح بیان AQP9 می‌تواند اطلاعاتی را در مورد مسیرهای مکانیکی زمینه‌ای آسیب بیضه ناشی از ذرات ریز گرد و غبار فراهم کند.

 مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی، در اختلال (ROS) (reactive oxygen species) علاوه بر این استرس اکسیداتیو، عدم تعادل بین تولید گونه های فعال اکسسیژن در عملکرد بیضه نقش دارد. تولید بیش از حد ROS می‌تواند عملکرد اسپرم را مختل کند، اسپرم زایی را مختل کند و منجر به آسیب DNA شود. ذرات PM2.5 حاوی اجزای سمی هستند که می‌توانند ROS را از طریق چرخه ردوکس و مکانیسم‌های دیگر تولید کنند (1). افزایش تولید ROS می‌تواند دفاع آنتی اکسیدانی درون زا را تحت تأثیر قرار دهد و منجر به آسیب اکسیداتیو به لیپیدها، پروتئین‌ها و DNA در بافت بیضه شود. این استرس اکسیداتیو ممکن است به اختلال عملکرد بیضه، اختلال در کیفیت اسپرم و مشکلات باروری کمک کند. در این مطالعه اثر مواجهه با PM2.5 بر تغییرات ایمونوهیستوشیمی مارکر آکواپورین 9 ، وسترن بلات و استرس اکسیداتیو در بافت بیضه مدل موش صحرایی پس از 3 ماه مواجهه با PM2.5 مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مکان و دوره‌ی زمانی انجام مطالعه

محل انجام آزمایش در دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی در شمال شهر تهران و در مختصات جغرافیایی (E °3947/51 و° N 7991/35) قرار داشت. اتاقک مواجهه 1 و اتاقک مواجهه 2 و اتاقک گروه کنترل در آزمایشگاه پایلوت حیوانات که در ارتفاع تقریباً m 20 از سطح زمین قرار داشت، طراحی و ساخته شد. مطالعه در مدت زمانی 3 ماه انجام شد. بر اساس مطالعات مشابه، مواجهه برای 4 روز در هفته و هر روز 5 ساعت (9 الی14) انجام شد (5).

طراحی آزمایش

طراحی اتاقک مواجهه

سه اتاقک برای انجام آزمایش طراحی شد که در شکل 1 آورده شده است. اتاقک گروه کنترل که شامل هوای با شرایط استاندارد می‌شود. اتاقک مواجهه 1 که شامل PM2.5 به همراه گازهای آلاینده می‌شود و اتاقک مواجهه 2 که شامل گازهای آلاینده به‌تنهایی می‌شود.

در اتاقک گروه کنترل از طریق یک پمپ خلاء فیلتر شده HEPA مدل H13 (SungJin Co., Ltd., Korea) و یک فیلتر هوای کربن فعال برای حذف PM و گاز به محفظه پمپ شد.  

در اتاقک مواجهه 1 (PM2.5 به همراه گازهای آلاینده) هوای آزاد با دبی l/min 12 توسط دستگاه نمونه‌بردار ذرات حجم کم  ( Low volume sampler (LVS) Echo PM (Tecora Echo PM – TCR Tecora Italy)

) و بدون فیلتر نمونه‌برداری به داخل اتاقک دمیده می‌شد و هوای وارد شده از طریق روزنه‌ای با قطر cm 3 که در بالای اتاقک قرار داشت خارج می‌شد.

در اتاقک مواجهه 2 آلاینده‌ها گروه گاز به تنهایی در معرض آلاینده‌های گازی بود. در این حالت شیر ورودی پمپ وکیوم دارای فیلتر هپا مدل H13 جهت حذف PM می‌باشد. فیلتر هپا کلاس H13 می‌تواند 99/97 درصد گرد و غبار ریز را حذف کند. بنابراین، تنها آلاینده‌های گازی را می‌توان در هوای خروجی یافت (5). جهت تنظیم خواب موش‌های صحرایی، نور درآزمایشگاه پایلوت حیوانات توسط یک لامپ خودکار به صورت 12 ساعت خاموش و 12 ساعت روشن، تنظیم شد (5).

 

 

 

شکل1- اتاقک‌های گروه‌های مورد مطالعه تحت معرض. به ترتیب از سمت راست به چپ شامل: گروه دریافت‌كنندهء آلاینده‌های گازی، گروه (کنترل)دریافت‌كنندهء هوای تمیز با شرایط استاندارد، گروه دریافت‌كنندهء  PM2/5 و آلاینده‌های گازی.

 

گروه بندی موش‌های صحرایی برای آزمایش مواجهه

تعداد 36 موش صحرایی یک ماهه نر از گونه ویستار از مرکز تحقیقات علوم اعصاب دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی خریداری شد. حیوانات با مکمل‌های آب و غذای معمولی در شرایط مشخص شده بدون پاتوژن (سیکل نور تاریکی ۱۲/۱۲ ساعته با رطوبت ۵±۵۵ درصد در دمای ۱±۲۴ درجه سانتی‌گراد) قرار گرفتند.همچنین میانگین وزن موش ها قبل از شروع مواجهه 85 گرم بود و بعد از مدت زمان 3 ماه وزن موش ها به وزن متوسط 170 تا 200 گرم رسید. موش‌ها به مدت 1 هفته قبل از انجام آزمایش‌ها سازگار شدند. اتاق‌های نوردهی بر اساس روش توصیف شده توسط زرندی و همکاران 2019 طراحی شدند و زمان قرار گرفتن در مدت 3 ماه شامل تقریباً دو چرخه اسپرم‌زایی بود. موش‌ها به‌طور تصادفی به سه گروه (12سر در هر گروه) شامل گروه کنترل (Control)، گروه آلاینده‌های گازی (Gas) و PM2.5 به اضافه گروه آلاینده گازی (Gas+PM2.5) تقسیم شدند (شکل1). آزمایش در طول دوره گرمایش زمستانی انجام شد.

نمونه‌برداری ذرات PM2.5  

برای سنجش غلظت کاتیون‌ها، فلزات و PAHs در ذرات PM2.5، نمونه‌برداری انجام شد. در مجاورت سایت مواجهه، نمونه ‌برداری ذرات PM2.5 در هوای آزاد توسط نمونه‌بردار حجم پایین (Echo PM) ساخت كشور ايتاليا هر 6 روز یکبار دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی انجام شد(6) . نمونه‌برداری ذرات PM2.5 در دوره 24 ساعته و از 9 صبح الی 9 صبح روز بعد با دبی l/min 20 (معادل m3 8/28) انجام شد. از فیلتر فایبرگلاس (Whatman International Ltd. , Maidstone England) با قطر mm47 جهت نمونه‌برداری ذرات PM2.5 استفاده شد. در ادامه جهت تعیین غلظت فلزات (آهن، کادمیوم، سرب، کروم، مس، نیکل، منگنز وآلومینیم) از دستگاه  ICP-     MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS); Model 7900 Agilent Technologies, Santa Clara, CA) به آزمایشگاه شرکت آریا شیمی شریف منتقل و سنجش‌ها انجام شد. مراحل جمع‌آوری و نگهداری  PM2.5 براساس مطالعات قبلی انجام گرفت (7). تجزیه و تحلیل مواد توسط مرجع استاندارد (SRM 1648) براساس مطالعات قبلی گروه ما ارزیابی شد (6).

ارزیابی PM2.5 و آلاینده‌های گازی

غلظت PM2.5 همراه با دی‌اکسید گوگرد SO2 (Sulfur dioxide)، ازون  O3(Ozone) و دی‌اکسید نیتروژنNO2  (Nitrogen dioxide) درهوای اتاق حیوانات، به طور مداوم در دوره سه ماهه مورد بررسی قرارگرفت. غلظت PM2.5 براساس روش نظارت بر میرایی بتا و غلظت آلاینده‌های گازی با دستگاه فلورسانس ماورابنفش (UV) (سریHoriba AP-370) براساس مطالعات قبلی گروه ما بررسی شد (8).

نمونه برداری و آماده سازی نمونه‌ها

پروتکل‌های این تحقیق بر اساس اصول حیوانات آزمایشی قانون رفاه حیوانات بود. کلیه مراحل آزمایشی انجام شده در این تحقیق مورد تایید کمیته سازمانی اخلاق دامی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران قرار گرفت و تعداد موش‌های مورد استفاده تا حد امکان به حداقل رسید. یک روز پس از قرار گرفتن در مواجهه با آلاینده‌ها در اتاقک‌ها، از پنتوباربیتال سدیم (150 میلی گرم بر گرم وزن بدن) برای بیهوشی موش‌ها استفاده شد. بیضه‌ها برداشته شدند. بیضه‌ها در سالین فیزیولوژیک شسته شدند. سپس بیضه سمت راست هر موش برای آنالیز بیوشیمیایی در دمای 80- درجه سانتیگراد منجمد شد و بیضه چپ هر موش برای آنالیز بافت شناسی در‏ فیکساتیو بوئن تثبیت شد.

جنبه‌های اخلاقی 

 

تمام مراحل مراقبت حیوانی و آزمایشات صورت گرفته کاملاً مطابق با معیارهای کمیته اخلاق مراقبت از حیوانات دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران با کد اخلاق (IR.IAU.SRB.REC.1398.055) انجام شد.

سنجش استرس اکسيداتيو

سطح MDA در بافت بیضه

سطح مالون دی آلدئید (MDA) به عنوان یک نشانگر پراکسیداسیون لیپیدی در بیضه، با روش Ohkawa و همکاران و به کمک کیت سنجش MDA ساخت پادگین طب آنالیز شد (9). به طور خلاصه ۱۰ میلی گرم از بافت بیضه با ۳۰۰ میکرولیتر Lysis Buffer و ۳ میکرولیتر BHT100x مخلوط شد و سپس هموژن گردید. برای حذف مواد نامحلول، به مدت ۳ دقیقه در دور ۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ گردید. مایع رویی به عنوان نمونه در نظر گرفته شد. از مایع رویی برای تجزیه و تحلیل MDA استفاده شد.

ایمونوهیستوشیمی  

روش ایمونوهیستوشیمی برای بیان Aquaporin9 طبق دستورالعمل شرکت سازننده کیت (Bioss سفارش طب آسیا) انجام گرفت. در پایان دوره درمان سه ماهه، بافت بیضه موش‌های هر گروه جدا شد. بخشی از بافت تشریح شد و در فیکساتیو بوئن به مدت 24 ساعت ثابت شد. بافت های ثابت به طور معمول پردازش شدند و سپس در پارافین جاسازی شدند و برای تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی به ضخامت 5 میلی متر برش داده شدند. برای انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی Aquaporin9، ابتدا نمونه ها با آنتی بادی پلی کلونال AQP9 (Bioss bs-2060R; 1:200, USA) انکوبه شدند و سپس با یک آنتی بادی ثانویه (Abcam, USA, 1:500) در ظرف با استفاده از کیت تشخیص ایمونوهیستوشیمی انکوبه شدند.

جهت بررسی بیان اسلاید‌های ایمنوهیستوشیمی اکواپورین9 از نرم افزار Image-J استفاده گردید. اسلایدهای رنگ آمیزی شده به وسیله‌ی میکروسکوپ نوری مطالعه گردید، در هر لام به طور تصافی در زیر میکروسکوپ، 10 فیلد انتخاب و با عدسی40، در هر فیلد 100 سلول اسپرماتوسیت شمارش شد و نسبت هسته ای ایمیونوراکتیو به دست آمد و در انتها درصد هسته‌های رنگ گرفته در بین 1000 سلول مشخص شد. ایمینو راکتیویته زیر 5‌% منفی و بالای 5‌% مثبت قلمداد گردید. کنترل منفی، رنگ آمیزی اسلایدها بدون آنتی بادی ثانویه بود.

درصد واکنش ایمنی بدون در نظر گرفتن شدت رنگپذیری بوده و فقط میزان رنگپذیری در نظر گرفته شد.

میزان بیان به صورت زیر ارزیابی گردید:

1-       0‌% (بدون واکنش ایمنی ) = 0 یا منفی

2-       1-10‌% = +1 یا مثبت ضعیف 

3-       10-50‌% = +2 یا مثبت متوسط

4-       > 50‌% = +3 یا مثبت شدید

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

آنالیز وسترن بلات مانند قبل با چند تغییر انجام شد (10, 11). ابتدا بافت ها با استفاده از بافر ریپا لیز شدند. برای از بین بردن لیزات، سانتریفیوژ در 14000 دور در دقیقه به مدت بیست دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از تعیین غلظت پروتئین با استفاده از کیت The Bradford protein Quantification (طبق دستورالعمل سازنده)، لیزهای بافت و حجم مساوی از بافر نمونه 2X Laemmli با هم مخلوط شدند. سپس لیزات یا 20μg Lysates پس از 5 دقیقه جوشاندن در معرض SDS-PAGE قرار گرفتند، سپس به غشای  immune-Blot 0.2 μm  (PVDF) (پلی وینیلیدین دی فلوراید) منتقل شد (Cat No: 162-017777; Bio-Rad Laboratories, CA, USA). در مرحله بعد غشاها با 5% BSA (Cat No: A-7888; Sigma Aldrich, MO, USA) در 0.1% Tween 20 به مدت یک ساعت مسدود شدند و سپس غشاها در دمای اتاق با آنتی بادی ثانویه آکواپورین 9 (Anti- Aquaporin 9 (Cat No: ab191056, abcam))، وآنتی بادی کنترل (anti-beta actin-loading control Cat No: ab8227, abcam) انکوبه شدند دوباره به مدت یک ساعت پس از سه بار شستشوی غشاها با TBST، آن را با آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش (HRP) IgG H&L  (Cat No: ab6721; Abcam) انکوبه کردند و سپس با نورتابی شیمیایی افزایش یافته (ECL) دوباره به مدت 1-2 دقیقه انکوبه شدند. بیان پروتئین به β-اکتین نرمال شد. برای تراکم سنجی باندهای پروتئینی از نرم افزار آنالایزر ژل نسخه ( 2010a ()NIH, USA) استفاده شد، به این صورت که سطح درصد زیر منحنی هر باند بر درصد سطح زیر منحنی باند اکتین مربوطه تقسیم شد و سپس مقادیر محاسبه شده بین گروه ها مقایسه شد (12).

 

 

 

جدول 1- غلظت آلاینده‌های ازون، دی‌اکسید نیتروژن، دی‌اکسید گوگرد و PM2.5  در مدت 3 ماه

 

 

 

 

تحلیل آماری

با استفاده از نرم افزار آماری SPSS ویرایش 21 داده‌های کمی با استفاده از آزمون آماری one-way ANOVA و توسط آنالیز واریانس یک طرفه  با آزمون Tukey‘s انجام شد.

نتايج

  تعیین غلظتPM2/5 ، ازون، دی‌اکسید نیتروژن و دی‌اکسید گوگرد در جدول 1 گزارش شده است. تعیین غلظت فلزات وهیدروکربن‌های چندحلقه‌ای در جدول 2 گزارش گردید. سنجش سطح مالون دی آلدهید (MDA) در جدول 3 گزارش گردیده است. در گروه‌های گاز (Gas) و گاز به اضافه PM2.5 (Gas+ PM2.5)، افزایش قابل‌توجهی در سطوح MDA نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (P>0.05)(شکل 2).   

آنالیز ایمونوهیستوشیمی بیان آکواپورین 9

 در گروه کنترل در مقطع یک لوله اسپرم ساز، بیان آکواپورین 9 در اسپرماتوسیت‌ها دیده شد (شکل 3). در گروه (گاز‌های آلاینده) در مقطع بیضه، اکواپورین 9 خیلی کم در لوله‌های اسپرم ساز دیده شد (شکل 3). در گروه (PM2.5 و آلودگی گازی) در مقطع لوله‌ی اسپرم ساز ، اکواپورین 9 در اسپرماتوسیت دیده نشد (شکل 3). Aquaporin 9 در بافتهای بیضه طبیعی موش در سلولهای اسپرماتوسیت و جرم سلها به میزان وسیع و منتشر به صورت غشایی بیان می‌گردد که در رنگ آمیزی ایمنوهیستوشیمی به رنگ قهوه ای خود را نشان می‌دهد. در بیضه‌های موشهای تحت تاثیر با آلاینده‌ها در هیچ کدام از لوله‌های اسپرم ساز بیضه آکواپورین 9 بیان نگردید. با توجه به شاخص ارزیابی در گروه کنترل: +1، در گروه (گاز‌های آلاینده): 0 و در گروه (PM2.5 و آلودگی گازی): 0 گزارش شد.

 

 

جدول 2- غلظت فلزات سنگین در مدت 3 ماه برحسب  µg/m3

 

 

جدول3- غلظت هیدروکربن‌های چندحلقه‌ای در مدت 3 ماه  مواجهه  برحسب ng/m3

 

 

 

 

شکل2- فعالیت سطح مالون دی آلدئید در بیضه موش‌ها پس از 3 ماه مواجهه ،  میانگین و انحراف معیار (Mean±SD) سطح MDA در گروه­های مختلف مورد مطالعه . تعداد موش­های صحرایی در هر گروه 12 سر می‌باشد. 001/0> P*** و  05/0>P*  نشان­دهنده اختلاف معنی­داردر مقایسه با گروه کنترل سالم می­باشد.

 

 

 

شکل 3- بیان پروتئین آکواپورین (فلش‌های سیاه رنگ) در بیضه موش صحرایی کنترل (A)، مواجه شده با آلودگی گازی (B) و مواجهه شده با PM2.5 و آلودگی گازی (C). 

 

 

آنالیز وسترن بلات بیان  ژن آکواپورین 9

سطح بیان آکواپورین 9 در (TJ) گروه‌های گاز (Gas) و (TM) گاز به اضافه PM2.5 (Gas+ PM2.5)، کاهش معنی داری نسبت به (TC) گروه کنترل مشاهده شد (P>0.05)(شکل 4).

 

 

شکل 4-آنالیز وسترن بلات برای تجزیه و تحلیل سطوح بیان آکواپورین9 پس از قرار گرفتن در معرض سه ماهه انجام شد. داده های به دست آمده به عنوان میانگین ± SEM نشان داده شده است. 001/0> P*** ، 01/0>P**  ، 05/0>P*

 

 

بحث

حضور ذرات ریز یا PM2.5 باعث نوعی از آلودگی هوا می شود که موجب طیف وسیعی از مشکلات سلامتی از جمله بیماری‌های تنفسی و قلبی عروقی و همچنین پیامدهای نامطلوب تولید مثلی می گردد. به‌طورکلی بیشترین غلظت کاتیون‌ها و فلزات درذرات PM2.5 ، آلومینیوم و بیشترین غلظت PAHs در دوره 3 ماه مواجهه مربوط به فنانتران بود.

در مطالعه Sarti  و همکاران (2015) به بررسی غلظت عناصر فلزی Al، Sb، As، Cd، Fe، Mn، Ni، Pb، V و Zn  در ذرات PM2.5  در منطقه Bologna در ایتالیا پرداخته شد. نتایج پژوهش مذکور نشان داد که آهن، آلومینیوم و روی بیشترین فراوانی را در بین عناصر فلزی داشتند. همچنین گزارش شد که آلاینده­های تولیدی از جاده­های پرترافیک می­تواند منبع عمده­ای برای عناصر آهن، منگنز و مس باشد. برای عناصر با غلظت ناچیز مانند وانادیوم و نیکل احتراق سوخت فسیلی در دمای بالا و برای فلزاتی مانند آرسنیک، کادمیوم و سرب فرایندهای صنعتی با دمای بالا می‌تواند منبع انتشار باشد. در پژوهش حاضر، بیشترین میزان مربوط به حضور بالای رآلومینیوم بود (13).

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که پس از قرار گرفتن در معرض آلودگی گازی و PM2.5، سطح مالون دی آلدئید MDA به طور معنی داری در بدن افزایش یافت. استرس اکسیداتیو زمانی اتفاق می‌افتد که بین تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و توانایی بدن در سم‌زدایی آن‌ها عدم تعادل وجود داشته باشد (14). MDA نشانگر پراکسیداسیون لیپیدی است، که نوعی آسیب اکسیداتیو است که هنگام حمله ROS به لیپیدهای غشای سلولی رخ می‌دهد (14) چندین مطالعه نشان داده اند که قرار گرفتن در معرض PM2.5 می‌تواند سطح MDA را در بافت‌های مختلف از جمله ریه‌ها، کبد و مغز افزایش دهد. این نشان می‌دهد که قرار گرفتن در معرض PM2.5 می‌تواند باعث آسیب اکسیداتیو به غشای سلولی شود و عملکرد آنها را مختل کند (15-17). مشابه نتایج مطالعه حاضر، و همکاران گزارش داد که قرار گرفتن در معرض دوزهای مختلف PM2.5 در موش‌های صحرایی نر باعث کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانی و افزایش سطح MDA در بیضه شد (18). مکانیسم‌هایی که توسط آن PM2.5 بر فعالیت آنزیم تأثیر می‌گذارد و سطح MDA را افزایش می‌دهد کاملاً شناخته نشده است. با این حال، چندین مکانیسم ممکن پیشنهاد شده است. یک مکانیسم این است که PM2.5 می‌تواند مستقیماً ROS را از طریق ترکیب شیمیایی خود تولید کند (18). مکانیسم دیگر این است که PM2.5 می‌تواند مسیرهای التهابی را در بدن فعال کند و منجر به تولید ROS شود. التهاب پاسخ طبیعی بدن به آسیب یا عفونت است، اما التهاب مزمن می‌تواند منجر به استرس اکسیداتیو و آسیب به اجزای سلولی شود (19). در نتیجه، قرار گرفتن در معرض PM2.5 می‌تواند اثرات مضری بر بدن از طریق اختلال در فعالیت آنزیم‌های تنشی مهم مانند SOD، CAT و GPX و افزایش سطح MDA داشته باشد. در مطالعه حاضر، بررسی ایمونوهیستوشیمیایی آکواپورین 9 نشان داد که بیان این پروتئین در بافت بیضه پس از مواجهه با PM2.5 بسیار کم شد به طوری که به ندرت در گروه مواجهه با PM2.5 و گاز مشاهده شد. در بیضه، AQP9 عمدتاً در سلول‌های سرتولی یافت می‌شود که مسئول حمایت و تغذیه سلول‌های اسپرم در حال رشد هستند(20). آکواپورین 9 نقش مهمی در حفظ تعادل مناسب آب و یون‌ها در بیضه دارد که برای رشد و عملکرد طبیعی اسپرم بسیار مهم است(4).

در مطالعه حاضر، بررسی وسترن بلات آکواپورین 9 نشان داد که بیان این پروتئین در بافت بیضه پس از مواجهه با PM2.5 به همراه آلاینده گازی و در گروه مواجهه با گاز به طور معنی داری کاهش یافت. 

در بررسی های دیگران که موش ها در معرض PM2.5  قرار گرفتن، نتایج آنها نشان داد که بیان AQP9 در بیضه موش‌های نر کاهش یافته است که شباهت به مطالعه حاضر داشت (21). به نظر می‌رسد قرار گرفتن در معرض PM2.5 منجر به کاهش ایمونوهیستوشیمی AQP9 در بیضه موش‌های صحرایی نر شده باشد. اگرچه مکانیسم‌هایی که توسط آن قرار گرفتن در معرض PM2.5 ممکن است بر بیان AQP9 و ایمونوهیستوشیمی در بیضه تأثیر بگذارد هنوز به طور کامل شناخته نشده است، با این حال، چندین مسیر بالقوه در این خصوص پیشنهاد می‌شود.

یکی از مکانیسم‌های ممکن استرس اکسیداتیو است که زمانی اتفاق می‌افتد که عدم تعادل بین تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و توانایی بدن در سم‌زدایی از آنها وجود داشته باشد. نشان داده شده است که قرار گرفتن در معرض PM2.5 باعث افزایش تولید ROS در بیضه می‌شود که می‌تواند منجر به استرس اکسیداتیو و آسیب به سلول‌های بیان کننده AQP9 شود (22). مکانیسم بالقوه دیگر التهاب است نشان داده شده است که قرار گرفتن در معرض PM2.5 باعث التهاب در بافت‌های مختلف از جمله ریه‌ها و سیستم قلبی عروقی می‌شود (23).

در بیضه، التهاب می‌تواند منجر به آسیب به سلول‌های بیان کننده AQP9 و کاهش بیان AQP9 و ایمونوهیستوشیمی شود. در نهایت، این امکان وجود دارد که قرار گرفتن در معرض PM2.5 بتواند بیان AQP9 و ایمونوهیستوشیمی در بیضه را از طریق مکانیسم‌های اپی ژنتیک تحت تاثیر قرار دهد (24). تغییرات اپی ژنتیک به تغییراتی در DNA یا هیستون‌ها اشاره دارد که می‌توانند بیان ژن را بدون تغییر توالی DNA اصلی تغییر دهند. نشان داده شده است که قرار گرفتن در معرض PM2.5 باعث ایجاد تغییرات اپی ژنتیکی در بافت‌های مختلف از جمله ریه‌ها و مغز می‌شود (25). ممکن است تغییرات مشابهی در بیضه رخ دهد که منجر به تغییرات در بیان AQP9 شود.

 برای نتیجه گیری بهتر و دقیق تر نیاز به آزمایشات بیشتری برای شناخت مکانیسم‌های زیربنایی این رویداد است. قرار گرفتن در محیط PM2.5 ممکن است باعث اختلال در عملکرد سیستم تناسلی نرشود و در نتیجه ناباروری را به همراه داشته باشد داشته باشد. 

نتیجه گیری 

به طور کلی نتایج مطالعه حاضر نشان داد که قرار گرفتن موش‌های صحرایی نر در معرض آلاینده‌های گازی و PM2.5 باعث اختلال در بیضه می‌شود که تأثیر مخربی بر اسپرم‌زایی دارد. همچنین سبب کاهش بیان پروتئین آکواپورین در بافت بیضه می‌شود. با توجه به افزایش شاخص استرس اکسیداتیو مالون دی آلدهید می‌توان اظهار داشت که تولید بیش از حد ROS باعث فعال شدن مسیر سیگنال دهی در بیضه‌ها و کاهش اسپرماتوژنز خواهد شد و کاهش باروری را به دنبال خواهد داشت. به نظر می‌رسد با توجه به وضعیت آلودگی در کشور در حال توسعه ایی نظیر ایران، بررسی دقیق تر اثر آلودگی هوا بر فرآیند باروری مردان ضروری است.

تعارض منافع

همه نویسندگان اعلام می کنند که تضاد منافع وجود ندارد.

 

 

 

 

 

فهرست منابع

1. Wei Y, Cao X-N, Tang X-L, Shen L-J, Lin T, He D-W, et al. Urban fine particulate matter (PM2. 5) exposure destroys blood–testis barrier (BTB) integrity through excessive ROS-mediated autophagy. Toxicology mechanisms and methods. 2018;28(4):302-19.

2. Thangavel P, Park D, Lee Y-C. Recent insights into particulate matter (PM2. 5)-mediated toxicity in humans: an overview. International journal of environmental research and public health. 2022;19(12):7511.

3. Wang L, Luo D, Liu X, Zhu J, Wang F, Li B, Li L. Effects of PM2. 5 exposure on reproductive system and its mechanisms. Chemosphere. 2021;264:128436.

4. Kannan A, Mariajoseph-Antony LF, Panneerselvam A, Loganathan C, Kiduva Jothiraman D, Anbarasu K, Prahalathan C. Aquaporin 9 regulates Leydig cell steroidogenesis in diabetes. Systems Biology in Reproductive Medicine. 2022;68(3):213-26.

5. Motesaddi Zarandi S, Shahsavani A, Khodagholi F, Fakhri Y. Concentration, sources and human health risk of heavy metals and polycyclic aromatic hydrocarbons bound PM 2.5 ambient air, Tehran, Iran. Environmental geochemistry and health. 2019;41:1473-87.##

6. Zarandi SM, Shahsavani A, Khodagholi F, Fakhri Y. Co-exposure to ambient PM2. 5 plus gaseous pollutants increases amyloid β1–42 accumulation in the hippocampus of male and female rats. Toxin reviews. 2019.##

7. Sowlat MH, Naddafi K, Yunesian M, Jackson PL, Shahsavani A. Source apportionment of total suspended particulates in an arid area in southwestern Iran using positive matrix factorization. Bulletin of environmental contamination and toxicology. 2012;88:735-40.

8. Rochester JR. Bisphenol A and human health: a review of the literature. Reproductive toxicology. 2013;42:132-55.

9. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical biochemistry. 1979;95(2):351-8.

10. Babaei H, Alibabrdel M, Asadian S, Siavashi V, Jabarpour M, Nassiri SM. Increased circulation mobilization of endothelial progenitor cells in preterm infants with retinopathy of prematurity. Journal of Cellular Biochemistry. 2018;119(8):6575-83.

11. Jabarpour M, Siavashi V, Asadian S, Babaei H, Jafari SM, Nassiri SM. Hyperbilirubinemia-induced pro-angiogenic activity of infantile endothelial progenitor cells. Microvascular research. 2018;118:49-56.

12. Siavashi V, Nassiri SM, Rahbarghazi R, Vafaei R, Sariri R. ECM‐Dependence of endothelial progenitor cell features. Journal of cellular biochemistry. 2016;117(8):1934-46.

13. Sarti E, Pasti L, Rossi M, Ascanelli M, Pagnoni A, Trombini M, Remelli M. The composition of PM1 and PM2. 5 samples, metals and their water soluble fractions in the Bologna area (Italy). Atmospheric Pollution Research. 2015;6(4):708-18.

14. Lei XG, Zhu J-H, Cheng W-H, Bao Y, Ho Y-S, Reddi AR, et al. Paradoxical roles of antioxidant enzymes: basic mechanisms and health implications. Physiological reviews. 2016;96(1):307-64.

15. Wang B, Chan Y-L, Li G, Ho KF, Anwer AG, Smith BJ, et al. Maternal particulate matter exposure impairs lung health and is associated with mitochondrial damage. Antioxidants. 2021;10(7):1029.

16. Leclercq B, Kluza J, Antherieu S, Sotty J, Alleman L, Perdrix E, et al. Air pollution-derived PM2. 5 impairs mitochondrial function in healthy and chronic obstructive pulmonary diseased human bronchial epithelial cells. Environmental pollution. 2018;243:1434-49.

17. Huang K, Shi C, Min J, Li L, Zhu T, Yu H, Deng H. Study on the mechanism of curcumin regulating lung injury induced by outdoor fine particulate matter (PM2. 5). Mediators of inflammation. 2019;2019.

18. Liu X, Meng Z. Effects of airborne fine particulate matter on antioxidant capacity and lipid peroxidation in multiple organs of rats. Inhalation toxicology. 2005;17(9):467-73.

19. Ostro B, Malig B, Broadwin R, Basu R, Gold EB, Bromberger JT, et al. Chronic PM2. 5 exposure and inflammation: determining sensitive subgroups in mid-life women. Environmental research. 2014;132:168-75.

20. Kannan A, Panneerselvam A, Mariajoseph-Antony LF, Loganathan C, Prahalathan C. Role of aquaporins in spermatogenesis and testicular steroidogenesis. The Journal of Membrane Biology. 2020;253:109-14.

21. Hemmingsen JG, Hougaard KS, Talsness C, Wellejus A, Loft S, Wallin H, Møller P. Prenatal exposure to diesel exhaust particles and effect on the male reproductive system in mice. Toxicology. 2009;264(1-2):61-8.

22. Liu J, Ren L, Wei J, Zhang J, Zhu Y, Li X, et al. Fine particle matter disrupts the blood–testis barrier by activating TGF‐β3/p38 MAPK pathway and decreasing testosterone secretion in rat. Environmental toxicology. 2018;33(7):711-9.

23.        Wang H, Shen X, Tian G, Shi X, Huang W, Wu Y, et al. AMPKα2 deficiency exacerbates long-term PM2. 5 exposure-induced lung injury and cardiac dysfunction. Free Radical Biology and Medicine. 2018;121:202-14.

24. Zhang H, Yang B. Aquaporins in Reproductive System. Aquaporins. 2023:179-94.

25. Shou Y, Huang Y, Zhu X, Liu C, Hu Y, Wang H. A review of the possible associations between ambient PM2. 5 exposures and the development of Alzheimer's disease. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2019;174:344-52. 

 

.

 

 

immunohistochemical evaluation in testicular tissue of male rats following PM2.5 particle inhalation

Elnaz Noshadirad1, Kazem, Parivar2, Saeed Motesaddi Zarandi3, Pejman Mortazavi 4, Betol Gorbani yekta5.

 

1- PhD. Student, Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

2- Professor, Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. Corresponding Author: [e-mail]

3-Professor, Department of Environmental Health Engineering, School of public Health and safety, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran.

4- Associate Professor, Department of Pathobiology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

5- Assistant Professor , Department of Physiology, Faculty of Medicine, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University of Medical Sciences, Shariati St, Tehran, Iran.

 

Received:2023.10. 29                                                                                         Accepted: 2024.01.07

 

Abstract

Background & Aim: Exposure to suspended particles (PM2.5) and gaseous air pollution poses a serious threat to spermatogenesis in men. However, the specific molecular mechanism behind this remains largely unknown. The present study investigated the effect of exposure to PM2.5 and gas pollutants on MDA, as well as the changes in the expression levels of aquaporin proteins through immunohistochemistry and Western blot analysis in the testicular tissue of male rats.

Materials & Methods: A total of 36 male Wistar rats were randomly divided into three groups: the control group exposed to standard air conditions, the gas group, which was exposed solely to gas pollutants, and the gas plus PM2.5 group(Gas+PM2.5). All groups were subjected to pollutant exposure for three months, four days a week, and five hours a day.

Results: Immunohistochemistry and Western blot results indicate that simultaneous exposure to gas pollutants and PM2.5 leads to an increase in the concentration of malondialdehyde (MDA) and a decrease in aquaporin 9 protein compared to the control group.

Conclusion: Therefore, exposure to PM2.5 and gaseous pollutants probably provokes oxidative stress in the testis, which leads to the reduction of aquaporin 9 protein through the activation of signaling pathways. Thus, PM2.5 pollution appears to play a crucial role in infertility by disrupting spermatogenesis.

Key words: Particle matter, Oxidative stress, Testis, Aquaporin9

 

---