Investigation of Genetic Diversity in Some Aloe Sp. Accessions Using Morphological Markers in the in vitro conditions
mansoor saljooghianpour
1
(
Department of Agriculture, Iranshahr Branch, Islamic Azad University, Iranshahr, Iran
)
s. mahdi javadzadeh
2
(
Department of Agriculture, Iranshahr Branch, Islamic Azad University, Iranshahr, Iran
)
Ahmad Ebrahimi
3
(
Agronomy - Agriculture - IAU - Iranshahr - Iran
)
Keywords: Cluster analysis, genetic diversity, tissue culture, Morphological Characteristics, aloe vera,
Abstract :
For study the genetic diversity of Aloe germplasm and identify the classification and relationship of germplasm collections and exploiting them in breeding programs, Thirty three Aloe accessions were collected. These accessions were including 31 wild genotypes and 2 commercial genotypes. Shoot tip explants were washed and sterile. Then, were inoculated on solid MS medium supplemented with 0.5 mgl-1 benzyl adenine + 0.5 mgl-1 α-naphthalene acetic acid and sub-cultured on the same medium for plantlet production and propagation once every four weeks. Plantlets were grown in Completely Randomized Design (CRD) with four replications in greenhouse. After six months, 18 morphological traits were measured and analyzed. Morphological analysis indicated that all the studied various characters have a significant difference at P < 0.01 among Aloe accessions. Also comparison of the means (Duncan’s test) for the genotypes was performed. Maximum amounts for most traits was related to genotype 29 which suggests the potential of this genotype for further studies. The results of orthogonal comparisons between genotypes of wild or native genotypes in a group and the control group showed that the genotypes for most morphological traits studied, there was no significant difference. Cluster analysis indicated that all accessions were divided into three major groups. There were commercial accessions in the third group, and the best wild accession (number of 29) was in this group that is representing high potential of this genotype.
بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی در بعضی از ژنوتیپ های گیاه دارویی صبر زرد در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی
چکیده
به منظور بررسي و مطالعه دقيق ژرم پلاسم این گياه و به منظور تمايز و تعيين روابط بين ژنوتیپ ها، در این تحقیق تعداد 33 جمعیت مختلف گیاه آلوئه که 31 جمعیت بومی و 2 جمعیت تجاری بودند جمع آوری شده و پس از شستشو و استریل، ریزنمونه های انتهایی بالای ساقه را جدا نموده و درون محيط كشت MS جامد به اضافه 5/0 ميلي گرم در ليتر NAA و 5/0 ميلي گرم در ليتر BA کشت شدند. پس از سه تا پنج واکشت به همان محيط کشت گياهچه هاي حاصل را تکثير و سپس در گلخانه کشت شدند طرح آزمایشی مورد استفاده طرح پايه كاملاً تصادفي با چهار تكرار بود. بعد از گذشت شش ماه 18 صفت مختلف مورفولوژیکی اندازه گیری و تجزیه شدند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اختلاف معنی داری در سطح احتمال 1٪ بین ژنوتیپ ها وجود داشت. آزمون مقایسات میانگین ها بر اساس آزمون چند دامنه ای دانکن بر روی ژنوتیپ ها برای صفات مختلف مورفولوژیکی انجام شد که بیشترین مقدار برای اکثر صفات مورد مطالعه مربوط به ژنوتیپ 29 بود که این امر حاکی از پتانسیل بالای این ژنوتیپ برای انجام مطالعات بیشتر و تکمیلی است. همچنین نتایج مقایسات اورتوگونال بین ژنوتیپ های وحشی یا بومی در یک گروه و ژنوتیپ های شاهد در گروهی دیگر نشان داد که بین این ژنوتیپ ها برای اکثر صفات مورفولوژیکی مورد مطالعه، اختلاف معنی داری وجود نداشت. همچنین بر اساس نتایج تجزیه خوشه ای ژنوتیپ های مورد ارزیابی به سه گروه دسته بندی شدند. مهمترین مشخصه این گروهبندی قرار گرفتن ژنوتیپ های شاهد به همراه چند ژنوتیپ بومی مانند ژنوتیپ شماره 29 در یک گروه بود بنابراین قرار گرفتن این ژنوتیپ به همراه چند ژنوتیپ بومی دیگر در کنار ژنوتیپ های شاهد در یک گروه نشان دهنده پتانسیل بالای این ژنوتیپ ها می باشد.
واژه های کلیدی: صبر زرد ، تنوع ژنتیکی، صفات مورفولوژیکی، کشت بافت، تجزیه خوشه ای
مقدمه
گياه آلوئه یا صبر زرد گیاهی پایدار و چند ساله است و به عنوان گیاه دارویی و زینتی و هم گیاهی که در لوازم آرایشی بهداشتی کاربرد بسیاری دارد کشت می‌شود. براساس مطالبي كه توسط دانشگاه فلوريدا منتشر شده، منشاء اين گياه آفريقا بوده و بومي مناطق گرم و خشك است و با اقليم جنوبي ایران سازگار است. بنابراین در استان‌هاي جنوبي ایران به خصوص استان بوشهر و استان هرمزگان و استان سیستان و بلوچستان رشد مي‌كند. آلوئه داراي ژنوتیپ های متفاوت از دو گونه مختلف در ایران است كه تعدادي از ژنوتیپ ها مختص ايران مي باشند. نظر به اينكه تركيبات دارویی اين گياه به دليل عدم توليد سنتتيك آنها مستقيماً از گياه استخراج شده و پتانسيل ژنتيكي گياه در كميت و كيفيت اين تركيبات بسيار موثر مي باشد بنابراين بررسي و مطالعه دقيق ژرم پلاسم گياه به منظور تمايز و تعيين روابط بين ژنوتیپ های مختلف آن مي تواند گامي موثر در جهت اصلاح ژرم پلاسم موجود به منظور دستيابي به حداكثر توان توليد تركيبات شيميائي مطلوب و مورد نظر باشد. تنوع ژنتیکی پایه و اساس برنامه های اصلاحی بوده و مبنای تمام گزینش ها در هر جمعیتی تنوع می باشد. انتخاب ژنوتیپی به وجود تنوع در موجود مورد بررسی نیاز دارد و با بالا رفتن تنوع ژنتیکی در یک جامعه حدود انتخاب چه در حالت طبیعی و چه مصنوعی وسیع تر می شود (عبدمیشانی و همکاران، 1376). مطالعه تنوع ژنتیکی فرایندی است که تفاوت یا تشابه گونه ها، جمعیت ها و یا افراد را با استفاده از روش ها و مدل های آماری خاص بر اساس صفات مورفولوژیک، اطلاعات شجره ای یا خصوصیات مولکولی افراد بیان می کند (بومیننی و همکاران 1997). اصلاح گران با استفاده از اطلاعات حاصل از تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیتی می توانند لاین های والدی مختلف را تعیین نمایند، ژرم پلاسم را رده بندی کنند و جابجایی های ژنتیکی را در جمعیت ها بررسی نمایند که حاصل این تنوع نیز در اثر تجمع ژن های جهش یافته می باشد (روفماین و همکاران 2005). تنوع ژنتیکی درون گونه ای به طور یکنواخت در زیستگاه های محدود توزیع نشده است. هر چند که در مورد گونه های وحشی توزیع جغرافیایی سهم بیشتری در تنوع ژنتیکی دارد. یکی از دغدغه های مهم جوامع گیاهی حفظ تنوع زیستی موجود است، چرا که بین کمیت تنوع ژنتیکی و مقدار وقوع تغییرات تکاملی در آن رابطه مثبتی وجود دارد (هوجکین و روماناتا 2002). جهت تعیین و برآورد تنوع ژنتیکی گیاهان می توان از روش های مختلفی مانند انواع نشانگرهای مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی یا DNA استفاده نمود. نشانگرهای مورفولوژیکی از دیرباز به منظور شناسایی و بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان بکار می روند (لابرا و همکاران 2004 و ماسی و همکاران 2006). این نشانگرها همان گونه که از نام آنها مشخص است از روی فنوتیپ ارزیابی می شوند و لذا ارزیابی آنها خیلی ساده است. این نشانگرها اکثراً نتیجه جهش های قابل رؤیت می باشند که به آسانی قابل ارزیابی هستند. کامپوس و همکاران در سال 2005 با مطالعه 65 رقم از مرکبات با استفاده از نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی به ارزیابی 20 خصوصیت کمی و 10 خصوصیت کیفی برگ، گل و میوه ها پرداختند. تجزیه های مولکولی و مورفولوژیکی هر دو تنوع بالایی را بین نمونه های مورد ارزیابی نشان دادند و مشخص شد که منبع مهمی از تنوع ژنتیکی در بین این نمونه ها وجود دارد که برای کارهای اصلاحی آینده بسیار مفید می باشد. همچنین گولام و همکاران در سال 2007 میزان تنوع ژنتیکی مربوط به نواحی جغرافیایی و خصوصیات مورفولوژیکی 96 توده کنجد، را بررسی کردند. در بررسی تنوع مورفولوژیکی و مولکولی و همچنین نقشه یابی کاساوا از 58 توده استفاده شد. درصد تنوع سهم هر صفت به کل تغییرات ژنتیکی در بررسی مورفولوژیکی توسط PCA مورد ارزیابی قرار گرفت. سه مؤلفه اول 68٪ از تغییرات را دربرداشتند که سهم مؤلفه اول 1/48٪ بود (راگو و همکاران 2007). حضرتی و همکاران (2012) اثرات مختلف کود ازته را روی صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی در گیاه آلوئه ورا مورد مطالعه و ارزیابی قرار دادند. در مطالعات بر روی گشنیز که یکی از گیاهان خانواده چتریان می باشد نشان داده شد که بین ماتریس های بیوشیمیایی و مورفولوژیکی و همچنین بین بیوشیمیایی و مولکولی همبستگی ضعیفی وجود دارد و بین ماتریس های مورفولوژیکی و مولکولی هیچگونه همبستگی وجود ندارد (لوپز و همکاران 2008). آرون کومار و همکاران (2009)، تجزیه اجزای فیتوشیمیایی و فعالیتهای ضد میکروبی در برابر پاتوژن های بالینی را در گیاه آلوئه ورا بررسی نمودند. آنها ترکیبات فیتوشیمیایی را تجزیه کمی و کیفی نمودند. نتیجه تجزیه کمی برای ترکیبات تانن، ساپونین، فلاونوئید و ترپنوئیدها مثبت و برای سایر ترکیبات منفی گزارش شد. لاکشمی و همکاران (2011)، شناسایی ترکیبات فیتوشیمیایی و فعالیتهای بیولوژیکی آنها را در گیاه دارویی آلوئه مورد بررسی و ارزیابی قرار دادند . نتیجه این تجزیه، شناسایی 26 ترکیب فعال موثر در این گیاه بود. همچنین هامان (2009)، کاربردها و ترکیبات را در ژل برگ گیاه آلوئه ورا مورد مطالعه قرار داد. وی ترکیبات زیادی را در ژل گیاه آلوئه ورا از جمله سرشار بودن ژل از پلی ساکاریدهای مهم گیاهی را گزارش کرد. ساتی اپرابها و همکاران (2010)، یک مطالعه مقایسه ای را روی آنتی اکسیدان ها و فعالیت ضد میکروبی و ترکیبات فیتوشیمیایی گیاه آلوئه ورا انجام دادند. آنها ضمن شناسایی 26 ترکیب فعال بر اساس تجزیه فیتوشیمیایی، نتایج مهمی را درباره فعالیتهای ضد باکتریایی و ضد قارچی و ضد ویروسی گزارش کردند. کوپوسامی و همکاران (2006)، فعالیت ضد میکروبی امودین و آلوئین A ایزوله شده از گیاه Aloe excelsa را مورد بررسی قرار دادند. آنها دو ترکیب را از گونه های vera و excelsa ایزوله نمودند و مشاهده نمودند که این دو ماده فعالیت ضد باکتریایی داشته بطوری که رشد آنها را محدود می کند. در مطالعه دیگری توسط همین محقق در سال 2010 با استفاده از GC-MS ترکیبات فعال در گیاه دارویی آلوئه را شناسایی نمود وی 3 ترکیب مهم را از گیاه Aloe excelsa شامل فنیل استونیتریل، کاروون و لیمونن را شناسایی و ایزوله کرد. گریس (2009) ارزیابی شیمی سیتماتیک را روی گیاه آلوئه ورا مورد مطالعه قرار داد. وی در این مطالعه میزان جذب اشعه uv را در برگ بررسی نمود و مشاهده کرد که میزان جذب این اشعه توسط برگ گیاه آلوئه زیاد می باشد. همچنین مطالعه جامعی را در مورد مشکلات بازتولید و کارایی ترکیبات عصاره خام در گیاه آلوئه ورا توسط کوک (2011) مورد بررسی و توجه قرار گرفت. لاورنس وهمکاران (2009)، جداسازی و خالص سازی و ارزیابی ترکیبات ضد باکتریایی عصاره گیاه آلوئه ورا را مورد بررسی قرار دادند. و نتیجه پژوهش آنها حاکی از فعالیت ضد باکتریایی بالای عصاره این گیاه در مقابل باکتریهای مورد هدف آنها داشت. همچنین در مطالعه ای دیگر رخسانا وهمکاران (2007)، فعالیتهای ضد قارچی عصاره گیاه آلوئه ورا را مورد مطالعه و ارزیابی قرار دادند و نتایج مثبتی از این فعالیتها را گزارش نمودند. رضایی و همکاران (1382) روش پايداري ژل گياه صبر زرد را مطالعه نمودند. در اين تحقيق نمونه برگ گياه صبر زرد راپس از جمع آوری و جداسازي ژل، خرد كردن مكانيكي، حرارت دادن (70-30 درجه سانتی گراد) و اضافه نمودن آنتي اكسيدان مناسب به آن مورد مطالعه قرار دادند. آنها در نهايت با سرد كردن محلول تهيه شده و گذشت مدت زمان مناسب (سه ماه)، مشاهده کردند که امولسيون ژلي علايم پايداري را نشان داد.
لی و همکاران 2013، مولساقی و همکاران 2014 و ریزوان و همکاران (2014) پروتکل بهینه کشت بافت و تولید انبوه گیاه آلوئه ورا به روش ریزازدیادی درون شیشه معرفی کردند. همچنین عادل برگ و همکاران (2012)، عبدی و همکاران (2013) و گوپتا و همکاران (2014)، ریزازدیادی در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی را در گیاه آلوئه ورا مورد بررسی قرار دادند. مطالعات مشابه دیگر نیزتوسط محققین مختلف دیگر روی این گیاه انجام شده است (بورگوگنون و همکاران 2013، کاردارل و همکاران 2014، کوماری و همکاران 2015). اثر سن فیزیولوژیکی و تنظیم کننده های رشد را روی ریزازدیادی در گیاه آلوئه ورا برای ارزیابی پایداری ژنتیکی توسط کانوار و همکاران (2015) مورد مطالعه و ارزیابی قرار گرفت. سلجوقیان پور (2013) و لوسینی و همکاران (2015) ترکیبات فیتوشیمیایی در گیاه آلوئه ورا را در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار دادند. همچنین کاویانی و همکاران (2015) بعضی از اطلاعات مفید در مورد ریزازدیادی را بیان کردند. الاگوکانان و همکاران (2016) تنوع ژنتیکی در آلوئه و استراتژی های اصلاح کردن آن را مورد مطالعه قرار دادند. مطالعات صفات مورفولوژیکی و ژنتیکی گیاهان رشد یافته در مزرعه حاصل از ریزازدیادی گیاه آلوئه ورا توسط داس و همکاران (2016) انجام گرفت. همچنین موریلو و همکاران (2015) اثرات تنش شوری ملایم روی صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی در گیاه آلوئه ورا را مورد مطالعه و ارزیابی قرار دادند.
از آنجایی که این گیاه یکی از مهمترین گیاهان دارویی می باشد و در سطح وسیع در دنیا کشت می شود و همچنین از محیط های کشت بافت برای تکثیر این گیاه استفاده می شود لذا در این تحقیق سعی شد که بررسی تنوع ژنتیکی بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی بین ژنوتیپ های جمع آوری شده در شرایط کنترل شده آزمایشگاهی باشد.
مواد و روش ها
مواد ژنتیکی آزمایش شامل 33 جمعیت مختلف گیاه آلوئه ورا که 31 جمعیت آن از نقاط مختلف استان سیستان و بلوچستان به عنوان جمعیت وحشی و طبیعی و 2 جمعیت دیگر که در حقیقت تجاری بودند به عنوان جمعیت های شاهد جمع آوری شدند. اسامی نمونه ها (جمعیت ها) و برچسپ داده شده به هر کدام در جدول-1 آورده شده است.
جدول 1- ژنوتیپ های جمع آوری شده و برچسپ داده شده به ژنوتیپ ها
نام ژنوتیپ ها | برچسپ داده شده | نام ژنوتیپ ها | برچسپ داده شده | نام ژنوتیپ ها | برچسپ داده شده |
chanf-1 | 1 | zaboli-2 | 12 | sarbaz-5 | 23 |
gotij-1 | 2 | lashar | 13 | chabahar-1 | 24 |
phanouch-1 | 3 | saravan | 14 | chabahar-2 | 25 |
sarbaz-1 | 4 | nikshahr | 15 | iranshahr-2 | 26 |
sarbaz-2 | 5 | phanouch-2 | 16 | gotij-3 | 27 |
sarbaz-3 | 6 | gotij-2 | 17 | spakeh-3 | 28 |
sarbaz-4 | 7 | segar | 18 | sarbaz-6 | 29 |
spakeh-1 | 8 | zaboli-3 | 19 | khash | 30 |
iranshahr-1 | 9 | zaboli-4 | 20 | zehkalot | 31 |
bent | 10 | chanf-2 | 21 | control-1 | 32 |
zaboli-1 | 11 | spakeh-2 | 22 | control-2 | 33 |
نمونه های جمع آوری شده را در آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد ایرانشهر پس از شستشو با آب معمولی، در محلول ضدعفوني كننده حاوي5/2% هيپوكلريد سديم فعال به مدت 20 دقيقه قرار داده شدند سپس سه تا چهار بار شستشو با آب مقطر استريل انجام شده و پس از ضدعفوني سطحي، قسمت بالایی ساقه را جدا نموده و درون ارلن حاوي محيط كشت جامد قرار داده شد. محيط كشت مورد استفاده براي كشت اوليه شامل محيط پايه MS (موراشيگ و اسکوگ، 1962)جامد به اضافه 5/0 ميلي گرم در ليتر NAA (نفتالین استیک اسید)، 5/0 ميلي گرم در ليتر BA (بنزيل آدنین) بود. پس از کشت، ظروف کشت به اتاقک رشد منتقل و در دماي 1 ±25 درجه سانتي‌گراد و طول روز 16 ساعت روشنايي با شدت نور 5000 تا 6000 لوکس و 8 ساعت تاريکي قرار گرفتند. واکشت ریزنمونه ها هر چهار هفته يکبار انجام شد که در نهايت تعداد سه تا پنج واکشت به همان محيط کشت و تحت همان شرايط انجام گرفت. بعد از رشد گياهچه ها، گياهچه هاي حاصل را مي بايستي تکثير نمود. در اين حالت با استفاده از پاجوش‌های اطراف گیاهچه‌ها که در محیط کشت تولید شده اند اقدام به تکثير گياهچه ها گرديد. بعد از 3 تا 5 دوره تکثير که هر دوره تکثير حدود چهار هفته طول کشيد گياهچه هاي زيادي از گياهچه هاي اوليه توليد شدند. گیاهچه های تولید شده در گلخانه کشت شدند طرح آزمایشی مورد استفاده طرح پايه كاملاً تصادفي با چهار تكرار که هر تکرار شامل يک گلدان دارای یک گیاهچه بود (شکل شماره 1 و 2). بعد از گذشت يک ماه صفاتي شامل تعداد پاجوش، طول گیاه (سانتی‌متر) ، طول ساقه (سانتی‌متر)، قطر ساقه (میلی‌متر)، میانگین طول میانگره (میلی‌متر)، تعدادبرگ در بوته، طول برگ (سانتی‌متر)، عرض برگ (سانتی‌متر)، ضخامت برگ (میلی متر)، وزن تر برگ (گرم)، وزن خشک برگ (میلی‌گرم)، تعداد خار حاشیه برگ، میانگین فاصله بین دو خار متوالی در برگ (میلی‌متر)، میانگین طول خار برگ (میلی‌متر)، وزن ژل در برگ (گرم)، نسبت وزن ژل به کل وزن برگ، ضخامت کوتیکول برگ (میلی‌متر) و ضخامت مزوفیل برگ (میلی‌متر) در ژنوتیپ های مورد مطالعه، اندازه گیری و یادداشت برداری گردید و سپس با نرم افزارها SPSS Ver 22 و MSTATC تجزیه شدند.
شکل 1 و 2- کشت بافت و کشت در گلخانه ژنوتیپ های بومی جمع آوری شده
نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس ژنوتیپ های مورد مطالعه براساس صفات مورفولوژیکی نشان داد که اختلاف معنی داری در سطح احتمال 1٪ بین ژنوتیپ ها وجود دارد (جدول2). همچنین آزمون مقایسات میانگین ها بر اساس آزمون چند دامنه ای دانکن بر روی ژنوتیپ ها برای صفات مختلف مورفولوژیکی انجام شد که بر این اساس برای صفت تعداد پاجوش کمترین مقدار مربوط به ژنوتیپ 29 و بیشترین مقدار برای ژنوتیپ های 1، 20، 2 و 7 بود. بیشترین و کمترین مقدار برای صفت میانگین فاصله دو خار متوالی در برگ به ترتیب مربوط به ژنوتیپ های 12 و 24 و برای صفت قطر ساقه 6 و 5 بود. برای صفات تعداد خار حاشیه برگ و ضخامت کوتیکول برگ بیشترین مقدار مربوط به ژنوتیپ 9 و کمترین مقدار این صفات به ترتیب برای ژنوتیپ های 16 و 18 بود. بیشترین مقدار برای صفات میانگین طول خار برگ و نسبت وزن ژل به کل وزن برگ به ترتیب برای ژنوتیپ های 5 و 1 و کمترین مقدار برای ژنوتیپ های 18 و 3 بود. ژنوتیپ 29 برای صفات مختلف طول گیاه، طول ساقه، میانگین طول میانگره، وزن ژل در برگ، ضخامت مزوفیل برگ، طول برگ، عرض برگ، ضخامت برگ، وزن تر برگ، وزن خشک برگ و تعداد برگ در بوته دارای بیشترین مقدار بود و فقط برای صفت تعداد پاجوش کمترین مقدار را به خود اختصاص داد که این امر حاکی از پتانسیل بالای این ژنوتیپ برای انجام مطالعات بیشتر و تکمیلی حکایت می کند. ژنوتیپ های شاهد (تجاری) در آزمون مقایسات میانگین جایگاه حدواسطی در بین ژنوتیپ ها داشتند. نتایج بدست آمده توسط محققین دیگر مانند داس و همکاران (2016)، حضرتی و همکاران (2012)، موریلو و همکاران (2015)، راگو و همکاران (2007) و لوپز و همکاران (2008). نیز نشان دهنده وجود تنوع در گیاهان مورد مطالعه شان بر اساس صفات مورفولوژیکی بود.
جدول 2- تجزیه واریانس ژنوتیپ های مورد مطالعه بر اساس صفات مختلف مورفولوژیکی
منابع تغییر | درجه آزادی | ضخامت برگ | عرض برگ | طول برگ | میانگین طول میانگره |
ژنوتیپ | 32 | **808/197 | **35/0 | **477/582 | **892/83 |
خطا | 99 | 86/9 | 1/0 | 246/6 | 063/3 |
ضریب تغییرات(%) |
| 31/6 | 62/7 | 45/7 | 97/5 |
منابع تغییر | درجه آزادی | تعداد خار حاشیه برگ | قطر ساقه | طول ساقه | تعداد برگ در بوته | تعداد پاجوش |
ژنوتیپ | 32 | **506/43 | **247/0 | **921/0 | **036/0 | **786/0 |
خطا | 99 | 247/2 | 053/0 | 04/0 | 003/0 | 052/0 |
ضریب تغییرات(%) |
| 23/5 | 56/6 | 35/5 | 21/6 | 17/8 |
منابع تغییر | درجه آزادی | میانگین فاصله دو خار متوالی | وزن خشک برگ | وزن تر برگ |
ژنوتیپ | 32 | **632/94 | **664/945 | **670/6029 |
خطا | 99 | 416/2 | 51/63 | 65/158 |
ضریب تغییرات(%) |
| 23/6 | 65/7 | 26/8 |
منابع تغییر | درجه آزادی | نسبت وزن ژل به کل وزن برگ | طول گیاه | میانگین طول خار برگ |
ژنوتیپ | 32 | **673/0 | **973/1308 | **123/0 |
خطا | 99 | 127/0 | 993/9 | 01/0 |
ضریب تغییرات(%) |
| 84/5 | 78/6 | 81/5 |
منابع تغییر | درجه آزادی | ضخامت مزوفیل برگ | ضخامت کوتیکول برگ | وزن ژل در برگ |
ژنوتیپ | 32 | **602/0 | **806/0 | **227/204 |
خطا | 99 | 02/0 | 04/0 | 553/6 |
ضریب تغییرات(%) |
| 48/5 | 12/5 | 23/6 |
* و ** = ميانگين مربعات به ترتيب در سطح احتمال 5% و 1% معني دار هستند.
از آنجایی که ژنوتیپ های جمع آوری شده مورد مطالعه همگی بصورت بومی و خودرو در مناطق مختلف بودند و آزمون اختلاف داشتن آنها با ژنوتیپ های تجاری مد نظر بود لذا برای مقایسه گروهی این ژنوتیپ ها با ژنوتیپ های شاهد از مقایسات اورتوگونال (مستقل) استفاده شد. در این مقایسات کلیه ژنوتیپ های وحشی یا بومی در یک گروه و ژنوتیپهای کنترل یا شاهد در گروهی دیگر قرار گرفتند و با همدیگر مقایسه و آزمون شدند. نتایج نشان داد که از میان صفات مختلف مورفولوژیکی مورد مطالعه، صفات میانگین فاصله بین دو خار متوالی ، طول برگ، عرض برگ، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، تعداد خار حاشیه برگ، قطر ساقه، وزن ژل در برگ، نسبت وزن ژل به کل وزن برگ و ضخامت کوتیکول برگ میان ژنوتیپ های بومی مورد مطالعه با ژنوتیپ های شاهد (تجاری) اختلاف معنی داری وجود نداشت. در حالی که برای صفت تعداد پاجوش در سطح 5٪ و برای صفات طول گیاه، طول ساقه، میانگین طول میانگره، تعداد برگ در بوته، ضخامت برگ، میانگین طول خار برگ و ضخامت مزوفیل برگ میان ژنوتیپ های بومی یا وحشی مورد مطالعه و ژنوتیپ های شاهد اختلاف معنی داری در سطح 1٪ وجود داشت (جدول 3).
جدول 3- مقایسات اورتوگونال (گروهی مستقل) بین ژنوتیپ های شاهد و ژنوتیپ های بومی مورد مطالعه بر اساس صفات مختلف مورفولوژیکی
صفات | مقدار Fc | صفات | مقدار Fc |
تعداد پاجوش | *406/5 | وزن تر برگ | ns138/0 |
تعداد برگ در بوته | **167/7 | وزن خشک برگ | ns138/0 |
طول ساقه | **480/7 | میانگین فاصله دو خار متوالی | ns648/0 |
قطر ساقه | ns048/94 | میانگین طول خار برگ | **689/25 |
تعداد خار حاشیه برگ | ns017/3 | طول گیاه | **421/11 |
میانگین طول میانگره | **224/7 | نسبت وزن ژل به کل وزن برگ | ns100/3 |
طول برگ | ns008/0 | وزن ژل در برگ | ns002/0 |
عرض برگ | ns671/2 | ضخامت کوتیکول برگ | ns947/0 |
ضخامت برگ | **558/7 | ضخامت مزوفیل برگ | **256/7 |
* و ** = ميانگين مربعات به ترتيب در سطح احتمال 5% و 1% معني دار هستند.
به منظور کاهش متغیرها به چند مؤلفه اصلی که ابعاد متفاوتی از تنوع مورد ارزیابی در داده ها را اندازه گیری می کنند، از تجزیه به مؤلفه های اصلی (PCA) استفاده شد. در واقع مؤلفه های حاصل از این تجزیه دریافت ساده ای از داده ها را نشان می دهند. در این تجزیه می توان تغییرات داده ها را بصورت فشرده و مختصر بیان نمود. بین مؤلفه های حاصل هیچ گونه همبستگی وجود ندارد و کاملاً مستقل از همدیگر هستند. به عبارتی PCA به منظور شناخت درصد سهم هر یک از صفات به کل تغییرات، بکار برده می شود (Raghu et al., 2007).
جدول 4- مقادیر ویژه، درصد واریانس و درصد تجمعی واریانس برای 4 مؤلفه اصلی بدست آمده از بررسی صفات مورفولوژیکی
درصد واریانس توجیهی تجمعی | درصد واریانس توجیهی | مقدار ویژه | مؤلفه |
207/56 | 207/56 | 117/10 | 1 |
203/67 | 996/10 | 979/1 | 2 |
589/75 | 386/8 | 510/1 | 3 |
868/81 | 278/6 | 122/1 | 4 |
جدول 4 مقادیر ویژه بالاتر از یک بدست آمده از ماتریس کواریانس را نشان می دهد. اولین مقدار ویژه مربوط به مؤلفه اول 117/10=1λ، 207/56٪ از کل تغییرات داده ها را توجیه کرد. پس از آن مؤلفه دوم با واریانس 979/1=2λ، 996/10٪ از کل تغییرات داده ها را شامل شد.
مؤلفه های سوم و چهارم به ترتیب دارای واریانس هایی برابر با 510/1=3λ و 122/1=4λ، داشتند که 386/8 و 278/6 درصد از کل تغییرات داده ها را توجیه کردند. چهار مؤلفه حاصل در مجموع 868/81٪ از کل تغییرات داده ها را توجیه نمودند.
بردارهای ویژه (ضرایب مؤلفه های اصلی) مربوط به مقادیر ویژه بالاتر از یک در جدول 5 مشاهده می شود. بزرگترین ضرایب (بار) مؤلفه ای در میان ضرایب هر مؤلفه ، در حقیقت نشان دهنده صفت یا صفاتی هستند که بیشترین نقش را در آن مؤلفه دارند. بنابراین بر طبق متغیر مربوط به آن ضرایب مؤلفه ای، می توان مؤلفه ها را نام گذاری کرد. در نهایت در تجزیه به مؤلفه های اصلی ساختاری متشکل از مؤلفه های مستقل بدست می آید که علاوه بر دسته بندی صفات، ترتیب و اهمیت هر یک از آنها را در توجیه تنوع کلی داده ها مشخص می سازد. با توجه به این که میزان واریانس هر مؤلفه ، اهمیت آن مؤلفه را در نشان دادن تغییرات داده ها روشن می نماید، می توان گفت که هر چه میزان واریانس یک مؤلفه مستقل بیشتر باشد، آن مؤلفه در تفسیر تغییرات کلی داده ها اهمیت بیشتری پیدا می کند. به علاوه میزان اشتراک یک صفت نشان دهنده بخشی از واریانس آن صفت است که با مؤلفه های مشترک ارتباط دارد.
مؤلفه اول که در آن صفات وزن ژل در برگ، وزن تر و خشک برگ، عرض برگ، طول برگ و تعدادبرگ در بوته به ترتیب با ضرایب 914/0، 911/0، 901/0، 898/0 و 869/0 بیشترین تأثیر مثبت را دارند، مؤلفه عملکرد برگ نام گذاری شد.
مؤلفه دوم که در آن صفات ضخامت مزوفیل برگ و ضخامت برگ به ترتیب با ضرایب 566/0 و 525/0 بیشترین تأثیر مثبت را دارند، مؤلفه ضخامت برگ نام گذاری شد.
صفات با ضرایب مثبت شامل تعداد خار حاشیه برگ و میانگین طول خار برگ به ترتیب با ضرایب 610/0 و 583/0 بیشترین مقادیر را در مؤلفه سوم به خود اختصاص دادند به نام مؤلفه خصوصیات خار در برگ نام گذاری شد.
مؤلفه چهارم شامل صفات تعداد خار حاشیه برگ و قطر ساقه به ترتیب با ضرایب 651/0 و 504/0 دارای بیشترین مقادیر مثبت بودند و به نام مؤلفه متفرقه نام گذاری شد.
جدول 5- ضرایب مؤلفه های اصلی (بردارهای ویژه) صفات مختلف مورفولوژیکی برای 4 مؤلفه اصلی
صفت | مؤلفه اول | مؤلفه دوم | مؤلفه سوم | مؤلفه چهارم |
میانگین فاصله دو خار متوالی در برگ آماده برداشت | 825/0 | 062/0 | 122/0- | 058/0- |
تعداد پاجوش | 489/0- | 378/0 | 382/0 | 252/0- |
طول برگ آماده برداشت | 898/0 | 224/0- | 171/0 | 136/0 |
عرض برگ آماده برداشت | 901/0 | 051/0 | 061/0 | 065/0- |
ضخامت برگ آماده برداشت | 756/0 | 535/0 | 184/0- | 161/0 |
وزن تر برگ آماده برداشت | 911/0 | 314/0- | 090/0 | 092/0- |
وزن خشک برگ آماده برداشت | 911/0 | 314/0- | 090/0 | 092/0- |
تعداد خار حاشیه برگ آماده برداشت | 200/0 | 099/0- | 610/0 | 651/0 |
تعدادبرگ در بوته | 869/0 | 203/0 | 006/0- | 035/0 |
میانگین طول خار برگ آماده برداشت | 497/0 | 042/0- | 583/0 | 345/0- |
طول گیاه | 839/0 | 397/0- | 034/0 | 116/0 |
طول ساقه | 777/0 | 205/0- | 391/0- | 192/0 |
قطر ساقه | 594/0- | 347/0- | 138/0- | 504/0 |
میانگین طول میانگره | 682/0 | 264/0 | 406/0- | 038/0- |
نسبت وزن ژل به وزن برگ آماده برداشت | 311/0- | 446/0- | 383/0- | 287/0- |
وزن ژل در برگ آماده برداشت | 914/0 | 316/0- | 032/0 | 104/0- |
ضخامت کوتیکول برگ آماده برداشت | 861/0 | 130/0 | 143/0 | 148/0- |
ضخامت مزوفیل برگ آماده برداشت | 711/0 | 566/0 | 218/0- | 182/0 |
برای گروه بندی ژنوتیپ ها از تجزیه خوشه ای استفاده شد. با استفاده از 18 صفت مورفولوژیکی اندازه گیری شده برای 33 ژنوتیپ، گروه بندی این ژنوتیپ ها بر اساس پیوستگی میانگین بین گروه ها انجام شد. قرار گیری ژنوتیپ ها در یک گروه در تجزیه خوشه ای بیانگر شباهت این ژنوتیپ ها به همدیگر است و در واقع ژنوتیپ های هر گروه به عنوان ژنوتیپ های مشابه مطرح هستند. بر اساس تجزیه خوشه ای (شکل-3) داده های مورفولوژیکی، ژنوتیپ های مورد ارزیابی به سه گروه دسته بندی شدند. گروه اول شامل ژنوتیپ های 11، 17، 16، 1، 14، 20، 13، 23، 4، 10، 2، 26، 8، 9، 12، 28، 31، 7، 22، 3، 6 و 18 بود که ژنوتیپ های 6 و 18 کمترین پیوستگی میانگین را با میانگین دیگر ژنوتیپ های این گروه داشتند. گروه دوم شامل ژنوتیپ های 5، 24، 19 و 15 بود. این گروه حدواسط دو گروه اول و سوم است. و سرانجام گروه سوم که شامل ژنوتیپ های 32، 33، 27، 30، 21، 25 و 29 بود. مهمترین مشخصه این گروه قرار گرفتن ژنوتیپ های شاهد (ژنوتیپ 32 و 33) به همراه ژنوتیپ شماره 29 در این گروه است. ژنوتیپ 29 ژنوتیپی است که بیشترین مقادیر صفات طول گیاه، طول ساقه، میانگین طول میانگره، تعدادبرگ در بوته، طول برگ، عرض برگ، ضخامت برگ، وزن تر برگ، وزن خشک برگ، وزن ژل در برگ، ضخامت مزوفیل برگ را به خود اختصاص داده است. بنابراین قرار گرفتن این ژنوتیپ به همراه چند ژنوتیپ بومی دیگر در کنار ژنوتیپ های شاهد در یک گروه نشان دهنده پتانسیل بالای این ژنوتیپ ها می باشد. البته بایستی به این نکته توجه کرد که در همین گروه، ژنوتیپ های شاهد کمترین پیوستگی میانگین را با میانگین دیگر ژنوتیپ های (ژنوتیپ های بومی) این گروه دارند. تجزیه خوشه ای داده های مورفولوژیکی همچنین نشان دهنده تنوع بالای بین ژنوتیپ ها ی بومی و تجاری (شاهد) است. زیرا همان طور که دندروگرام این تجزیه نشان می دهد عمده ژنوتیپ های بومی یا همان ژنوتیپ های وحشی یا خودرو در گروه های مجزا و جدای از ژنوتیپ های شاهد قرار گرفته اند. با این حال بین خود ژنوتیپ های وحشی مورد مطالعه تنوع زیادی قابل مشاهده نیست چون تقریباً اکثر ژنوتیپ های وحشی در یک گروه (گروه یک) قرار گرفته اند و همانطوری که ذکر شد ژنوتیپ های قرار گرفته در یک گروه دارای کمترین اختلاف یا عدم تشابه را نسبت به دیگر ژنوتیپ های مورد مطالعه در گروه های دیگر دارند. نتایج بدست آمده بر اساس تجزیه خوشه ای توسط محققین دیگر مانند الاگوکانان و همکاران (2016)، داس و همکاران (2016) و موریلو و همکاران (2015)، نیز نشان دهنده وجود تنوع در گیاهان مورد مطالعه شان بر اساس صفات مورفولوژیکی بود.
شکل 3- دندروگرام حاصل از تجزیه خوشه ای داده های مورفولوژیکی 33 ژنوتیپ مورد مطالعه بر مبنای پیوستگی میانگین بین گروهها
منابع مورد استفاده
1. رضایی، م.، ج. کامکار و ح. دیان. (1382). روش پایداری ژل گیاه صبر (Aloe vera L.). تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران. 19(2): 204-195.
2. عبد ميشاني، س. و ع. شاه نجات بوشهري. (1376). اصلاح نباتات تكميلي. انتشارات دانشگاه تهران. 320صفحه.
3. Abdi G., Hedayat M. and M. Modarresi. (2013). In vitro micropropagation of Aloe vera – Impacts of plant growth regulators, media and type of explants. J. Biol. Environ. Sci. 7:19–24.
4. Adelberg J. and J. Naylor-Adelberg. (2012). Effects of cytokinin on multiplication and rooting of Aloe barbadensis during micropropagation on agar and liquid medium. J. Med. Active Plants. 1: 1–5.
5. Alagukannan, G. and S. Ganesh. (2016). Genetic diversity in Aloe and its breeding strategies. Int. J. FarmSci. 6:312–326.
6. Arunkumar, S. and M. Muthuselvam. (2009). Analysis of Phytochemical Constituents and Antimicrobial Activities of Aloe vera L. against Clinical Pathogens World Journal of Agricultural Sciences. 5: 572-576.
7. Bommineni, R., Jauhar, P. P., Peterson, T. S. and R. N. Chibbar. (1997). Analysis of hybrids of Durum Wheat with Thinopyrum junceiforme using RAPD markers. Theor Genet. 95: 757-637.
8. Borgognone D., Marcucci, A., Colla, G., Renzaglia, M., Rea, E. and M. Cardarelli. (2013). In vitro growth of Aloe barbadensis Mill:The effect of activated Charcoal on medium pH, nitrogen uptake and elements content of shoots. Propag. Ornam. Plants 13:138–145.
9. Campos, E. T., Espinosa, M. A. G. and M. L. Warburton. (2005). Characterization of mandarin (Citrus spp.) using morphological and AFLP markers. Interciencia. 30(11):687-693.
10. Cardarelli, M., CardonaSuárezCarolina, M. and G. Colla. (2014). Influence Of ozone treatments on in vitro propagation of Aloe barbadensis in Continuous immersion bioreactor. Ind. CropProd. 55:194–201.
11. Cock, I.E. (2011). Problems of Reproducibility and Efficacy of Bioassays Using Crude Extracts, with reference to Aloe vera. Pharmacognosy Communications. 1(1):52-62.
12. Coopoosamy, M. and M.L. Magwa. (2006). Antibacterial activity of Aloe emodin and Aloin A isolated from Aloe excelsa. African Journal of Biotechnology. 5 (16): 1508-1510.
13. Das, A., Haque, S. M., Ghosh, B., Nandagopal, K. and T. B. Jha. (2016). Morphological and genetic characterization of micropropagated field grown Plants of Aloe vera L. Plant Tiss. Cult. Biotechnol. 25:231–246.
14. De Masi, L., Siviero, P. and C. Esposito. (2006). Assessment of agronomic, chemical and genetic variability in common basil (Ocimum sp.). Eur. Food Res.Technol. 223:273-281.
15. Ghulam, M. A., Sirato, Y. and S. K. Masumi. (2007). Assessment of genetic diversity in sesame (Sesamum indicum L.) Detected by Amplified Fraghment Length Polymorphism markers. Electronic journal of Biotechnology. 10:1.
16. Grace, O.M., Simmonds, M.J.S., Smith, G.F. and A.E. Van. (2009). Chemosystematic evaluation of Aloe section Pictae (Asphodelaceae). Biochemical Systematics and Ecology.1:1-6.
17. Gupta, S., Sahu, P. K., Sen, D. L. and P. Pandey. (2014). In-vitro Propagation of Aloe vera (L.) Burm. f. Br. Biotechnol.J. 4:806–816.
18. Hamman Josias H. (2009). Composition and application of Aloe vera leaf gel. Molecules 13: 1599‐1616.
19. Hazrati S., Sarvestani Z. T. and A. Salehi. (2012). the effect of differential Nitrogen fertilization on morphological and physiological traits of Aloe vera plants. Int. Res. J. Appl. Bas. Sci. 3:682–687.
20. Hodgkin, T., and V. Romanata Roa. (2002). People, Plants, and DNA: Perspectives on the Scientific and Technical Aspects of Conserving a Using Plant Genetic Resources. Managing Plant Genetic Diversity. 23(2):234-238.
21. Kanwar, K., Devi, V., Sharma, S., Soni, M. and D. Sharma. (2015). Effect of Physiological age and growth regulators on micropropagation of Aloe vera followed by genetic stability assessment. Natl. Acad. Sci. Lett. 38:29–35.
22. Kaviani, B. (2015). Some useful information about micropropagation. J. Ornamental Plants 5:29–40.
23. Kumari, A. and M. Naseem. (2015). an efficient protocol for micropropagation of a medicinal plant Aloe Vera L. through organ culture. J. Indian bot. Soc. 94:118–125.
24. Labra, M., Miele M. and B. Ladda. (2004). Morphological Characterization, essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum sp. Cultivars. Plant Sci. 167: 725-731.
25. Lakshmi, P.T.V. and P. Rajalakshmi. (2011). Identification of Phyto-Components and Biological Activities of Aloe vera Through the Gas Chromatography-Mass Spectrometry. International Research Journal of Pharmacy. 2(5):247-249.
26. Lawrence, R.., Tripathi P. and E. Jeyakumar. (2009). Isolation, Purification and Evaluation of Antibacterial Agents from Aloe Vera. Brazilian Journal of Microbiology. 40: 906-915.
27. Lee, Y. S., Park, H. M., Park, S. U., Baek, J. H. and T. J. Yang. (2013). Optimal Protocol for mass propagation of Aloe vera. J. CropSci. Biotechnol. 16:285–290.
28. Lopez, p. A. and M. P. Widrlechner. (2008). Assessing phenotypic, biochemical, and molecular diversity in Coriander (Coriandrum sativum L.) germplasm. Genet Resour Crop. 55: 247-275.
29. Lucini, L., Pellizzoni, M., Pellegrino, R., Molinari, G. P. and G. Colla. (2015). Phytochemical constituents and in vitro radical scavenging activity of Different Aloe species. Food Chem. 170:501–507.
30. Molsaghi, M., Moieni, A. and D. Kahrizi. (2014). Efficient protocol for rapid Aloe vera micropropagation. Pharm. Biol. 52:735–739.
31. Murillo-Amador, B., Nieto-Garibay, A., Troyo-Diéguez, E., García-Hernández, J. L., Hernández-Montiel, L. and R. D. Valdez-Cepeda. (2015). Moderate salt stress on the physiological and morphological traits of Aloe vera L. Bot. Sci. 93:639–648.
32. Raghu, D., Senthil, N., Saraawathi, T., Raveendran, M., Gnanam, R., Venkatachalam, R., Shanmugasundaram, P. and C. Mohan. (2007). Morphological and simple sequence repeats (SSR) based finger printing of South Indian Cassava germplasm. Integrative biology. 1(2): 141-148.
33. Rizwan, M., Soni, P., Kumar, R., Gupta, N. K., Shahzad, M. and G. Singh. (2014). High frequency regeneration protocol of Aloe vera L. Vegetos-anint. J. Plant Res. 27:127–130.
34. RoufMian, M. A., Zwonitzer, J. C., saha, Y. M. C. and A. A. Hopkins. (2005). AFLP diversity within and among Hardinggrass populations. Crop. Sci., 45: 251-259.
35. Rukhsana, B., Shafique, S. and S. Shafique. (2007). Appraisal of antifungal activity of Aloe vera. Mycopath. 5(1): 5-9.
36. SaljooghianPour M. (2013). Identification of phytochemical components of aloe plantlets by gas chromatography-mass spectrometry. African Journal of Biotechnology. 12(49): 6876-6880.
37. Sathyaprabha, G., Kumaravel, S., Ruffina, D. and P. Praveenkumar. (2010). A Comparative study on Antioxidant, Proximate analysis, Antimicrobial activity and phytochemical analysis of Aloe vera and Cissus quadrangularis by GC-MS. Journal of Pharmacy Research. 3(12):2970-2973.
Investigation of Genetic Diversity in Some Aloe Sp. Accessions Using Morphological Markers in the in vitro conditions
ABSTRACT
For study the genetic diversity of Aloe germplasm and identify the classification and relationship of germplasm collections and exploiting them in breeding programs, Thirty three Aloe accessions were collected. These accessions were including 31 wild genotypes and 2 commercial genotypes. Shoot tip explants were washed and sterile. Then, were inoculated on solid MS medium supplemented with 0.5 mgl-1 benzyl adenine + 0.5 mgl-1 α-naphthalene acetic acid and sub-cultured on the same medium for plantlet production and propagation once every four weeks. Plantlets were grown in Completely Randomized Design (CRD) with four replications in greenhouse. After six months, 18 morphological traits were measured and analyzed. Morphological analysis indicated that all the studied various characters have a significant difference at P < 0.01 among Aloe accessions. Also comparison of the means (Duncan’s test) for the genotypes was performed. Maximum amounts for most traits was related to genotype 29 which suggests the potential of this genotype for further studies. The results of orthogonal comparisons between genotypes of wild or native genotypes in a group and the control group showed that the genotypes for most morphological traits studied, there was no significant difference. Cluster analysis indicated that all accessions were divided into three major groups. There were commercial accessions in the third group, and the best wild accession (number of 29) was in this group that is representing high potential of this genotype.
Key words: Aloe vera, genetic diversity, morphological characteristics, tissue culture, cluster analysis