The effect of 17-beta-Estradiol on Malondialdehyde levels and Total Antioxidant Capacity in Serum and Breast Tissue of Rats, with and without Pretreatment with Tamoxifen

Subject Areas : Veterinary Clinical Pathology

Ali Mohammad Rezaeii ¹ , Mohammad Reza valilou ^{2 *} , Zafar Gholinejad ³

1 - D.V.M. Student, Faculty of Veterinary Medicine, Urmia Branch, Islamic Azad University, Urmia, Iran.
2 - Department of Pathobiology, TaMS.C., Islamic Azad University, Tabriz, Iran.
3 - Assistant Professor, Department of Laboratory Medical Sciences, Urmia Branch, Islamic Azad University, Urmia, Iran.

Received: 2025-01-05 Accepted : 2025-05-12 Published : 2025-08-20

Keywords: Estradiol, Malondialdehyde, Rat, Tamoxifen, Total Antioxidant Capacity,

Abstract :

Although the hormone estradiol clearly affects the process of carcinogenesis through binding to its receptors (alpha and beta), it is possible that part of its effects may be mediated through the induction of oxidative stress. In the present study, the effect of 17-beta estradiol on oxidative stress markers in rats (as an animal model) was investigated. For this purpose, sixteen rats were randomly divided into four equal groups. After acclimatization to the environment, in the pre-treatment phase, the rats in groups 1 and 2 received tamoxifen at a dose of 5 mg/kg daily for one week, while the rats in groups 3 and 4 received the same volume of distilled water. Subsequently, during the treatment phase, the rats in groups 2 and 3 received a single dose of estradiol at 0.2 mg/kg. Three days after the treatment phase, serum and mammary tissue samples were collected from all rats, and the levels of total antioxidant capacity (TAC) and serum malondialdehyde (MDA) were measured. The tissue samples were also subjected to histopathological evaluation. The results showed that neither estradiol nor tamoxifen induced pathological changes in the mammary tissue. Moreover, estradiol did not cause significant changes in the serum levels of malondialdehyde and total antioxidant capacity. However, tamoxifen caused a noticeable increase in both parameters, although the changes were not statistically significant. On the other hand, a significant correlation was observed between the levels of malondialdehyde and total antioxidant capacity (p<0.023). The findings of the present study do not support a short-term effect of estradiol in inducing oxidative stress, but at the same time, they do not rule out the potential role of tamoxifen in inducing oxidative stress.

Full-Text:



آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی                                                                                                          دوره 19، شماره 2، پیاپی 74، تابستان 1404، صفحات: 162-147

 

 

 DOI: 10.71499/jvcp.2025.1195564"مقاله پژوهشی"                                                                                                               

تاثیر هورمون 17- بتا استرادیول بر مقادیر مالون­دی­آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم و بافت پستان موش­های صحرایی، با و بدون پیش­تیمار با تاموکسیفن

 

علی‌محمد رضائی1، محمدرضا ولیلو2*، زعفر قلی‌نژاد3 

 

1 – دانشجوی دکتری حرفه­ای دامپزشکی، دانشکده دامپزشکی، واحد اروميه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران

2 – استادیار گروه پاتوبیولوژی، واحد علوم پزشکی تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران

3 – استادیار گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده پزشکی، واحد اروميه، دانشگاه آزاد اسلامی، ارومیه، ایران

*نویسنده مسئول مکاتبات: [e-mail]

 (دریافت مقاله: 29/10/1403  تاریخ پذیرش: 30/2/1404)

 

 

چکیده

هر چند هورمون استرادیول با اتصال به گیرنده­های خود (آلفا و بتا) بر روند سرطان‌‌زایی تاثیر‌ مشهودی دارد، ولی این احتمال وجود دارد که بخشی از اثرات این هورمون به واسطه ایجاد استرس اکسیداتیو حاصل شود. در مطالعه حاضر به بررسی تاثیر هورمون 17- بتا استرادیول بر فاکتور‌های استرس اکسیداتیو در موش صحرایی (مدل حیوانی) پرداخته­شد. بدین منظور تعداد 16 سر موش صحرایی به‌طور تصادفی به 4 گروه مساوی تقسیم شدند. پس از عادت کردن به محیط، در مرحله پیش­تیمار، موش­های گروه‌های اول و دوم، تاموکسیفن را به مدت یک هفته، هر روز به میزان ­mg/kg­­ 5 و موش­های گروه­های سوم و چهارم هم به همان مقدار، آب مقطر دریافت کردند. در ادامه و در مرحله تیمار، موش­های گروه­های دوم و سوم استرادیول (یک دوز به میزان ­mg/kg­ 2/0) دریافت کردند. 3 روز پس از مرحله تیمار، نمونه‌های سرم و بافت پستان همه موش­ها جداسازی شده و مقادیر ظرفیت آنتی‌اکسیدان تام و مالون­دی­آلدئید (malondialdehyde) سرم  اندازه‌گیری شد و نمونه‌های بافتی مورد ارزیابی هیستوپاتولوژی قرار گرفتند.­ نتایج نشان داد که استرادیول و تاموکسیفن، تغییرات آسیب­شناختی در بافت پستان ایجاد نکردند. همچنین، استرادیول نتوانست سبب تغییرات معنی‌دار در مقادیر مالون­دی­آلدئید و ظرفیت آنتی اکسیدانی تام سرم شود، اما تاموکسیفن سبب افزایش هر دو فاکتور فوق به شکل محسوس گردید، هرچند تغییرات مذکور از نظر آماری معنی‌دار نبودند. از طرف دیگر همبستگی معنی‌داری بین مقادیر مالون­دی­آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل مشاهده شد (023/0­p<). یافته­های مطالعه حاضر، تاثیر استرادیول بر ایجاد استرس اکسیداتیو در کوتاه‌مدت را تایید نمی‌کند، ولی در عین حال نمی‌تواند اثر تاموکسیفن بر القای استرس اکسیداتیو را رد نماید.

 

کلیدواژه‌‌ها: استرادیول، تاموکسیفن، مالون­دی­آلدئید، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل، موش صحرایی.

 

 

مقدمه

بر اساس آمار سازمان جهانی بهداشت، در سال 2020 حدود 3/2 میلیون مورد سرطان پستان شناسایی شده که از این تعداد، 685000 مورد منجر به مرگ شده­است (Ferlay et al., 2021). عوامل خطرساز برای بروز سرطان پستان متفاوت می‌باشند که از بین آن­ها می‌توان به سن بالا، چاقی، استفاده از الکل، سابقه خانوادگی و استعداد ژنتیکی، مواجهه با اشعه و استفاده از تنباکو اشاره نمود (Kamińska et al., 2015). همچنین از جمله فاکتورهائی که در بروز و پیشرفت سرطان پستان دخالت دارند می‌توان به مقدار هورمون‌های استروژنی اشاره کرد. به طور کلی 3 نوع هورمون استروژنی وجود دارد: استرون استرادیول­ و استریول که به ترتیب با عناوین E1، E2 و E3 ارائه می‌شوند ­(Samavat et al., 2015). استرادیول مهم­ترین هورمون زنانه می‌باشد که در تمام طول حیات جنس مونث به عنوان هورمون اصلی عمل می‌کند و هورمون‌های استرون و استریول هم به ترتیب در دوران یائسگی و دوران بارداری اهمیت دارند (Yu et al., 2022). سطح سرمی استروژن‌ها طی چرخه قاعدگی تغییر می‌کند و بر این اساس، مقادیر17بتا­استرادیول به عنوان مهم‌ترین استروژن از میزان pg/ml ­5 تا pg/ml 500 در نوسان است، بنابراین می‌توان مقادیر فوق را به عنوان محدوده نرمال برای زنان درنظرگرفت (O'Bryan et al., 2022). 

از طرف دیگر مطالعات نشان داده است که هورمون­های استروژنی در پیشرفت سرطان پستان دخالت دارند (Clemons et al., 2001) و تکثیر سلول‌های سرطان پستان در حضور استروژن امری اثبات شده است که بخشی از اثرات مذکور به واسطه اتصال گیرنده استروژن و عمل بیان ژن‌ها صورت می‌گیرد (Khan et al., 2022). بر این اساس، اتصال استروژن به گیرنده‌های مربوطه، سبب بیان ژن‌هایی می‌شود که به موجب آن سلول‌ها تکثیر یافته و با تغییر محیط تومور، باعث افزایش تکثیر و متاستاز سلولی می‌گردند. هرچند نقش استروژن در پیشرفت سرطان، بیشتر از طریق گیرنده استروژن اتفاق می‌افتد ولی دیدگاهی در خصوص تاثیر اثرات احتمالی این هورمون یا متابولیت‌های آن در پاتوژنز سرطان پستان از طریق ایجاد استرس اکسیداتیو وجود ندارد، در حالی که مطالعات پیشنهاد داده­اند که متابولیسم اکسیداتیو این هورمون به عنوان شروع­کننده سرطان عمل می­کند، به این معنی که استروژن تحت متابولیسم قرار گرفته و متابولیت‌هایی را ایجاد می­کند که این متابولیت‌ها خواص کارسینوژنیک دارند که از آن­ها می­توان به کاتکول استروژن اشاره کرد. کاتکول استروژن با اتصال به DNA و ایجاد فزون‌ورده دپورینه شده، سبب ایجاد آسیب در DNA  می­شود. همچنین در ساختار مولکول فوق، کوئینان و سمی‌کوئینان وجود دارد که تحت تاثیر واکنش‌های چرخه‌ای احیاء می‌توانند منشأ تولید رادیکال‌های آزاد باشند که این رادیکال‌های آزاد به صورت مشخص سبب ژنوتوکسیسیتی، آسیب DNA و آسیب پروتئین‌ها و نهایتاً استرس اکسیداتیو شده و شروع سرطان را موجب می‌شوند (Bhat et al., 2003). البته علی­رغم نقش تاییدشده استروژن در پیشرفت سرطان، نقش آن در ایجاد و شروع سرطان، به طور کامل تائید نشده­است (Russo et al. 2006). همچنین یک دلیل ضمنی برای استنتاج نقش متابولیت‌های استروژن در شروع سرطان پستان را می‌توان در ارتباط پلی‌مورفیسم‌های دو آنزیم دخیل در متابولیسم استروژن، در ایجاد سرطان پستان جست­وجو نمود. مطالعات نشان داده است پلی‌مورفیسم‌های آنزیم­های سیتوکروم P450، خانواده 1، زیرخانواده A، پلی‌پپتید 1 (CYP1A1) و کاتکول-O-متیل ترانسفراز (COMT) در بروز سرطان پستان دخالت دارند (Modugno et al., 2005). فرآیند متابولیسم استروژن دارای دو مرحله است. ابتدا استروژن توسط آنزیم‌های سیتوکروم p450 از نوع CYP 1A1 و CYP 1B1 به­ کاتکول‌آمین تبدیل می‌شود. کاتکول­آمین ایجاد شده -O متیله می‌گردد. آنزیم –Oمتیله­کننده، -Oمتیل ترانسفراز می‌باشد. مطالعات مختلف مکانیسم‌های مختلفی را پس از تولید رادیکال‌های آزاد توسط متابولیت‌های استروژن مطرح می‌نماید (Bulbul et al., 2022). برخی مطالعات معتقدند متابولیت کاتکول تولیدشده سبب آسیب DNA میتوکندریایی شده که متعاقب آن ترانسفورماسیون سلول‌های نرمال پستان به سلول‌های سرطانی اتفاق می‌افتد (Stepniak et al., 2016). برخی دیگر از مطالعات معتقدند که ترانسفورماسیون ناشی از استروژن از طریق فعال­سازی مسیرهای پیام‌رسانی از قبیل مسیر پیامرسانی پروتئین­کیناز B یا Akt و مسیر پیامرسانی فاکتور هسته ای کاپای بتا یا NFkb اتفاق می‌افتد (Bhat et al., 2003). در مورد نقش استروژن و متابولیت آن در شروع سرطان پستان چندین سوال وجود دارد. نخست آن که آیا آنزیم‌های متابولیت­کننده‌ استروژن در بافت‌های پستان و سلول‌های پیش سرطانی وجود دارند یا خیر؟ مطالعات نشان داده است که آنزیم CYP1A1 و آنزیم COMT در بافت پستان بیان می‌شوند، لذا می‌توان استنتاج نمود که ایجاد استرس اکسیداتیو به وسیله استروژن و متابولیت‌های آن می‌تواند به صورت محلی و نه به صورت سیستمیک اتفاق بیفتد (Salama et al., 1998). با این حال نقش استرس اکسیداتیو سیستمیک را هم نمی‌توان انکار نمود (Zhang et al., 2021).

با توجه به این­که در میان فاکتورهای استرس اکسیداتیو، ظرفیت آنتی‌کسیدان تام و مالون­دی­آلدئید بیشترین اطلاعات را در مورد وقوع این پدیده ارائه می‌دهد (Özkan et al. 2022). لذا، در مطالعه حاضر، ضمن تیمار موش­های صحرائی با داروهای استرادیول و تاموکسیفن (از تاموکسیفن جهت مهار گیرنده استروژن استفاده شد)، ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل و مالون­دی­آلدئید سرم موش­های صحرایی­، به عنوان دو متغیر استرس اکسیداتیو مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین بافت پستان حیوانات مذکور، از نظر بافت شناسی نیز مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‌ها

-‌ نگه­داری و تیمار حیوانات مورد مطالعه

این مطالعه تجربی آزمایشگاهی پس از اخذ مجوزهای لازم، طی 9 ماه اول سال 1403 انجام شد. تعداد 16 سر موش صحرایی ماده بالغ با میانگین وزنی 200 گرم از مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی ارومیه تهیه شد. حیوانات به صورت تصادفی در قفس‌های مخصوص به 4 گروه 4 تایی تقسیم شده و در دمای 25 درجه سلسیوس نگه­داری شدند. جهت کنترل استرس و عادت کردن حیوانات به محیط جدید، موش­های صحرایی مورد مطالعه، به مدت ده روز بدون هیچ­گونه مداخله نگه­داری شدند و صرفا آب و غذا در اختیارشان قرار گرفت. کلیه مراحل کار بر روی حیوانات آزمایشگاهی مورد تائید کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی ارومیه قرار گرفت. شکل 1 به صورت شماتیک نحوه پیش­تیمار و تیمار حیوانات را به تصویر کشیده است.

پس از دوره عدم مداخله، گروه اول موش‌های صحرایی به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شد و تا پایان دوره تیمار هیچگونه دارویی دریافت نکردند. به گروه های سوم و چهارم  داروی تاموکسیفن خوراکی (ابوریحان، تهران) به مدت 1 هفته با دوز 5 میلی­گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن گاواژ شد (Beyssen et al., 2000). پس از یک هفته به موش‌های یک گروه از دو گروه پیش تیمارشده با داروی تاموکسیفن، داروی استرادیول (ابوریحان، تهران) با غلظت 2/0 میلی­گرم بر وزن بدن به صورت زیرجلدی و به صورت تک دوز تزریق شد، ولی حیوانات گروه دیگر پیش­تیمار شده، استرادیول دریافت نکردند (Harburger et al., 2009). دوز‌های دارویی بر اساس مطالعه بیسن و همکارانش (Beyssen et al., 2000) و مطالعه هابورگر و همکارانش (Harburger et al., 2009) انتخاب شد. گروه دوم استرادیول را در شرایطی دریافت کرد که قبلا تاموکسیفن دریافت نکرده بودند. در ادامه همه موش­های مورد مطالعه، با استفاده از هیدروکلراید زایلازین 2 درصد و کتامین هیدروکلراید 10 درصد، به ترتیب  با دوزهای 40 و 60 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن با تزریق صفاقی، بی‌هوش شدند (Green et al., 1981). سپس خونگیری از قلب حیوانات مذکور انجام شده و سرم مربوطه بلافاصله جدا و در دمای 20- درجه سلسیوس نگه­داری شد. پروتکل ارائه­شده در شکل 1، نحوه تیمار و خون­گیری از حیوانات تحقیق را به­طور کامل نشان می‌دهد.

همچنین همزمان، نمونه‌های تهیه­شده از بافت پستان موش­ها هم­، در فرمالین تثبیت شدند.

 

 

شکل 1- نحوه تیمار موش‌های صحرایی در گروه‌های مورد مطالعه شامل گروه شاهد بدون مداخله، گروه دریافت‌کننده استرادیول، گروه دریافت‌کننده استرادیول با پیش­تیمار تاموکسیفن وگروه پیش­تیمار با تاموکسیفن بدون دریافت استرادیول.

 

 

-‌ تهیه مقطع از بافت پستان موش­های مورد مطالعه 

پس از تثبیت نمونه‌های بافت پستان موش­ها در فرمالین، پاساژ بافتی لازم انجام و سپس رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین و ائوزین (بهار افشان، ایران) انجام شد. بدین منظور ابتدا مرحله تثبیت بافت‌ها انجام شد. حذف آب یا آبگیری با غلظت‌های متوالی الکل از 70 تا 100 درصد (مرک، آلمان) طی سه مرحله دوساعته انجام شد. شفاف سازی، مرحله آغشته سازی با زایلازین (مرک، آلمان) و قالب گیری با پارافین (بهار افشان، ایران) انجام شد. در ادامه هم مرحله برش زنی یا تهیه سطح مقطع با میکروتوم (مدل cut4050، شرکت Micro TE، ساخت آلمان) انجام گردید. نهایتاً رنگ‌آمیزی با روش رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) انجام شد که شامل پارافین­زدایی، آبگیری و اتصال چسباندن لامل است. پس از آماده­شدن نمونه‌ها با استفاده از میکروسکوپ نوری نیکون (ECLIPSE E100، ساخت کشور ژاپن) لام‌ها مورد بررسی قرار گرفتند.

-‌ اندازه‌گیری مقادیر مالون­دی­آلدئید سرم موش­ها

به منظور بررسی تاثیر تیمارهای انجام­گرفته در تحقیق حاضر،  مقدار مالون­دی­آلدئید (MDA) به عنوان بیومارکر استرس اکسیداتیو در سرم، بر اساس روش مبتنی بر تيوباربيتوريك اسيد، اندازه­گیری شد. بدین منظور ابتدا محلول‌های کاری تري­كلرواستيك (مرک، آلمان)  اسيد 15درصد، تيوباربيتوريك اسيد (مرک، آلمان)  5/0 درصد و اسيد كلريدريك (مرک، آلمان)  025/0 نرمال آماده شدند. در ادامه مقدار 400 ميكروليتر از هر نمونه سرم مورد نظر با 800  میکرولیتر از معرف کاری فوق مخلوط شده و به مدت یک ساعت در دمای 96 درجه سلسیوس بن ماری (مدل8208، شرکت  پارس آزما)، گرمخانه­گذاری شد. بعد از سرد شدن مخلوط، به مدت 5 دقيقه هم در دمای 4 درجه سلسیوس و طی سرعت 13500 دور در دقیقه، سانتريفیوژ (مدل Far test 18000، فرزانه آرمان) شده و بلافاصله جذب نوری محلول فوقانی حاصله در طول موج 540 نانومتر در مقابل لوله بلانك با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Double Beam UV-Vis Spectrophotometry 2100: uv-2100) اندازه­گیری و در نهایت غلظت مالون­دي­آلدئيد نمونه با استفاده از ضريب خاموشی محاسبه شد (Senthilkumar et al., 2021). 

-‌ اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم موش­ها

جهت اندازه­گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی کل سرم از روش سنجش قدرت آنتی‌اکسیدانی با کاهش آهن (FRAP) استفاده شد (Benzie et al., 1996). اساس روش مذکور احیای یون‌های فریک (Fe3+) و تبدیل آن به یون‌های فرو (Fe2+) در pH اسیدی است که با 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine با TPTZ  (شرکت سیگمالدریچ، آمریکا)  کمپلکس رنگی تشکیل می­دهد. این کمپلکس دارای جذب در طول موج 593 نانومتر است.  محلول FRAP  شامل TPTZ 10 میلی­مولار در اسید کلریدریک 40 میلی­مولار در بافر استات (مرک، آلمان)  300 میلی­مولار است. مقدار یک میلی­لیتر محلول FRAP  با 50 میکرولیتر از نمونه سرم مخلوط شده و پس از گرمخانه­گذاری در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 30 دقیقه، جذب نوری آن در طول موج 593 نانومتر اندازه­گیری شد. در نهایت هم از ضريب خاموشی نوری کمپلکس، جهت محاسبه ظرفیت آنتی اکسیدانی کل سرم استفاده شد.          

-‌ تحلیل آماری داده­ها

جهت تحلیل داده‌ها از نرم افزار IBM SPSS Statistics 27 استفاده شد. میانگین‌ها متغیرها در گروه­های مختلف با استفاده از آزمون‌های تحلیل واریانس یک­طرفه (ANOVA) و کروسکال والیس (Kruskal Wallis test) مقایسه شد. همچنین برای بررسی همبستگی متغییرهای کمی از آزمون پیرسون استفاده شد. برای اعلام سطح معنی‌داری نتایج در آزمون­ها، مقدار p کمتر از 05/0 در نظر گرفته شد.

 

یافته­ها

-‌ نتایج بافت‌شناسی پستان موش­ها 

در مقاطع بافتی هیچ تغییری در بافت پستان موش­های گروه­های مورد مطالعه، اعم از تکثیر­ سلولی، مرگ سلولی و التهاب مشاهده نشد و صرفاً در برخی فولیکول‌های مو، آثاری از هیپرتروفی سلولی مشاهده­شد که به اثرات استرادیول نسبت داده می­شد. شکل 2 تصاویر مقاطع مذکور را نشان می­دهد.

 

 

 

 

 

 

شکل 2- تصویر مقاطع بافتی پستان موش‌های صحرایی مورد مطالعه: بالا-چپ: مربوط به گروه شاهد، پایین-چپ: مربوط به گروه استرادیول، بالا-راست: مربوط به گروه تاموکسیفن و بالا-چپ: مربوط به گروه تاموکسیفن+استرادیول (رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی 10×).

 

 

-‌ نتایج بررسی مقادیر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم

بررسی مقادیر میانگین ظرفیت اکسیدانی نشان داد که حداقل مقدار 48/7 و حداکثر مقدار 41/18 و میانگین ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام در این جامعه آماری 556/2±704/12 میکرومولار (میکرومول بر لیتر) می‌باشد. میانگین ظرفیت اکسیدانی کل سرم موش‌های گروه شاهد، معادل 738/2±128/11 بود. همچنین میانگین مذکور در مورد موش­های گروه دریافت­کننده استرادیول، معادل 255/1±201/12، در سرم موش­های گروه تاموکسیفن، 003/3± 845/14 و در سرم موش­های گروه چهارم که تاموکسیفن و استرادیول را دریافت کرده بودند، به میزان 195/2±643/12 میکرومولار بود (نمودار 1). همچنین مشخص شد که علی­رغم وجود تغییرات در مقادیر سرمی ظرفیت اکسیدانی تام در سرم موش­های گروه‌های مورد مداخله، تغییرات مذکور از نظر آماری معنی­­دار نبودند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1 - مقادیر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل سرم موش­های گروه‌های مختلف مورد مطالعه را نشان می‌دهد.  مقادیر p به­دست­آمده در مقایسه میانگین گروه شاهد با گروه­های تیمار با استرادیول، تاموکسیفن و تاموکسیفن-استرادیول به ترتیب 919/0، 180/0 و 807/0 می­باشد.

 

 

-‌ نتایج بررسی مقادیر مالون­دی­آلدئید سرم

حداقل مقدار مالون­دی­آلدئید در سرم موش‌های صحرایی 135/3 و حداکثر مقدار آن 981/17 میکرومولار می‌باشد. میانگین مالون‌دی­آلدئید سرم در جامعه آماری 16 سر موش صحرایی مورد آزمایش، برابر با  470/3±486/6 میکرومولار می‌باشد. همچنین بررسی توصیفی مقادیر مالون­دی­آلدئید سرم در گروه‌های مختلف نشان داد که میزان آن در مورد حیوانات گروه کنترل معادل 227/1±254/6­ میکرومولار، در خصوص موش­های گروه دریافت کننده استرادیول، 593/0±908/5­ میکرومولار، در مورد حیوانات گروه دریافت کننده تاموکسیفن، 174/6±524/9 میکرومولار و در خصوص موش­های گروهی که تاموکسیفن و استرادیول را دریافت کرده­بود، 896/0±259/4 میکرومولار به دست آمد. همچنین مشاهده شد که علی­رغم افزایش واضح در مقدار مالون دی­آلدئید سرم موش­های گروه تیمار شده با تاموکسیفن، تغییرات مذکور از نظر آماری معنی­دار نبود. 

 

 

 

نمودار 2- مقادیر مالون­دی­آلدئید سرم موش­های گروه‌های مختلف مورد مطالعه را نشان می­دهد. مقادیر p به­دست­آمده در مقایسه میانگین گروه شاهد با گروه­های تیمار با استرادیول، تاموکسیفن و تاموکسیفن-استرادیول به ترتیب 999/0، 496/0 و 813/0 می­باشد.

 

 

-‌ نتایج بررسی همبستگی متغیرهای مورد مطالعه

همان­طور که در نمودار 3 مشاهده می‌گردد، بررسی همبستگی بین مقادیر ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل و مالون­دی­آلدئید سرمی، نشان­دهنده همبستگی معنی‌دار مثبت می­باشد (319/0=R و 223/0=p). همچنین همبستگی دو متغیر مذکور در گروه سوم تیمار شده با تاموکسیفن قابل ملاحظه می­باشد. در حالی­که چنین همبستگی معنی­داری بین سه گروه دیگر برقرار نبود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3- نشان­دهنده همبستگی مقادیر MDA  و TAC در کل جامعه 16 سر موش صحرایی مورد مطالعه می­باشد.

 

جدول 1-  همبستگی آماری ظرفیت آنتی اکسیدان  کل و مالون­دی­آلدئید در سرم 16 سر موش 

	ضریب	df2	df1	F	سطح معنی‌داری		ثابت	b1
خطی	319/.	14	1	551/6	023/0		006/10	416/0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

. 

نمودار 4- همبستگی مثبت و معنی­دار بین دو متغیر TAC  و MDA در گروه پیش­تیمار با تاموکسیفن مشاهده شد ) 844/0=R و 081/0=p). 

 

 

بحث و نتیجه‌گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که هورمون استرادیول و داروی تاموکسیفن، در کوتاه­مدت نمی‌توانند تغییرات آسیب­شناختی معنی­داری در بافت پستان ایجاد کنند. بر اساس مقادیر مالون­دی­آلدئید و ظرفیت آنتی­اکسیدانی تام سرم  به­دست­آمده از مطالعه حاضر، نه تنها وجود هرگونه اثرات اکسیداتیو برای استرادیول رد شد، بلکه استرادیول در برابر اثرات اکسیداتیو تاموکسیفن خاصیت محافظتی نشان داد.

تحقیقات گسترده در شناخت علل ایجاد کننده سرطان پستان و نقش عوامل مختلف در پیشرفت آن صورت گرفته است، اما این بیماری کشنده همچنان سبب مرگ و میر تعداد زیادی از زنان در سراسر جهان می‌شود (Giaquinto et al., 2024). علی­رغم شناخت فاکتور‌های خطر بیماری، اتیولوژی اصلی این بیماری کاملاً مشخص نیست. در خصوص اتیولوژی سرطان پستان ابتدا باید این بیماری را در دو طبقه‌بندی تقسیم‌بندی نمود (Madeddu et al., 2014). بدین صورت که سرطان‌های پستان را می‌توان در دو دسته با شروع زودهنگام و شروع پس از یائسگی تقسیم نمود (Madeddu et al., 2014). زمینه‌ی ژنتیکی  از جمله تنوع ژنتیکی در ژن BRCA1، تنوع ژنتیکی در گیرنده هورمون‌ها، آنزیم‌های متابولیزه­کننده هورمون به عنوان مهم­ترین عوامل دخیل در بروز و پیشرفت سرطان پستان مطرح هستند (Rosen et al., 2003; Alamri et al., 2024). در این بازه زمانی یکی از مهم­ترین اتفاقات بروز فرآیند بلوغ می‌باشد که ناشی از افزایش و تغییرات سطوح هورمون‌ها از جمله استروژن­ها می‌باشد (Nordenström et al., 2022).

استروژن به عنوان یک هورمون در سه شکل استرادیول، استریول و استرون وجود دارد که در دوران بلوغ، دوران یائسگی و دوران بارداری در فرایند‌های مختلف دخالت دارند. لذا، چنانچه یکی از تغییرات دوران بلوغ را تغییرات هورمونی در نظر بگیریم، می‌توان فرض نمود که استرادیول سبب بروز سرطان پستان می‌شود (Steiner et al., 2003). استرادیول به عنوان یک هورمون استروئیدی تنها بافت‌هایی را تحت تاثیر قرار می‌دهد که دارای گیرنده برای این هورمون باشند و با اتصال به این گیرنده سبب بروز تغییرات در بافت پستان شامل تکثیر سلولی و تکامل بافتی می‌شود (Petersen, et al., 1987).

شاید بتوان عنوان نمود، اثرات استرادیول منحصراً از طریق گیرنده اتفاق نمی­افتد و مکانیسم­های دیگری قابل طرح است. به نظر می­رسد این هورمون می‌تواند خواص اکسیداتیو از خود نشان دهد و این خصوصیت می‌تواند مربوط به خود هورمون یا متابولیت‌های آن باشد. این درحالی­است که برخی مطالعات خواص آنتی­اکسیدانی برای استروژن تعریف نموده‌اند. در مطالعه حاضر، ما به بررسی این موضوع پرداختیم.  مالون­دی­آلدئید (MDA) به عنوان یک بیومارکر استرس اکسیداتیو حاصل از پراکسیداسیون لیپیدی است ( Singh, et al., 2014). نتایج این مطالعه نشان داد که مقادیر MDA تحت تاثیر هورمون استرادیول تغییری نکرده است. دیگر یافته‌ این تحقیق بروز تغییرات اکسیداتیو به شکل افزایش MDA در اثر تزریق تاموکسیفن بود. درحالی­که هدف از استفاده از تاموکسیفن بلوکه کردن مسیرهای گیرنده استروژن بود، ما شاهد افزایش مقادیر MDA بودیم هرچند به دلیل پایین­بودن تعداد نمونه‌ها این تغییرات به صورت غیرمعنی­دار مشاهده گردید. بررسی مقادیر MDA در گروه چهارم که استرادیول را پس از پیش­تیمار با تاموکسیفن دریافت کرده بود، نشان داد که مقادیر MDA القاء­شده با تاموکسیفن توسط استرادیول به صورت قابل توجهی کاهش پیدا کرده است. به عبارت دیگر تجویز استرادیول پس از پیش تیمار با تاموکسیفن، اثرات اکسیداتیو آن را کاهش می‌دهد. اثر مهاری استرادیول در جلوگیری از تولید MDA القاء­شده با تاموکسیفن را می‌توان در یک جمله خلاصه نمود: استرادیول در کوتاه مدت دارای خواص آنتی اکسیدانی است.

به طور رایج TAC به عنوان یک متغیر جهت ارزیابی قابلیت بدن برای مقابله با آسیب های اکسیداتیو تعریف می‌شود. TAC شامل دو بخش آنزیمی و غیرآنزیمی است. آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی شامل گلوتاتیون پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، پروکسیردوکسین، تیوردوکسین و سایر پروتئین‌های آنتی‌اکسیدانی می باشد. در بخش غیر آنزیمی، ویتامین C، ویتامین E و گلوتاتیون، اسید اوریک، بیلی­روبین و سایر مولکول­های طبیعی بدن دارای قابلیت آنتی­اکسیدانی هستند. افزایش TAC مربوط به افزایش این دو بخش و کاهش TAC نتیجه کاهش هر یک از این عوامل می‌باشد (Mehta et al., 2015).

در گروه پیش‌تیمار با تاموکسیفن بدون دریافت استرادیول، شاهد روند افزایش TAC بودیم. از طرفی تاموکسیفن سبب افزایش مقادیر MDA شده بود. در مطالعات قبلی خواص اکسیداتیو تاموکسیفن مطرح شده است( Ahmed, et al., 2021). یک تناقض ظاهری در نتایج، این یافته است که یک مولکول دارای خواص اکسیداتیو به نام تاموکسیفن چگونه سبب افزایش TAC شده است. تحلیل نگارندگان این است که تاموکسیفن سبب القاء بخش آنزیمی شده است. این استنتاج بر دو اصل استوار است. نخست این­که، مطالعات قبلی حاکی از آن است که خواص اکسیداتیو تاموکسیفن از طریق مسیر‌های سیگنالینگ اتفاق می‌افتد. به عنوان مثال، بکله و همکارانش نشان دادند تاموکسیفن با تاثیر بر Nrf2  بخشی از عناصر سیس تحت عنوان عناصر پاسخ دهنده به آنتی اکسیدان (Anti-oxidant response element) را تحت تاثیر قرار می دهند (Bekele et al., 2016). همچنین امکان تاثیر تاموکسیفن بر ظرفیت آنتی­اکسیدانی از طریق اجزای غیر‌آنزیمی دور از انتظار است، زیرا مکانیسمی که از طریق آن تاموکسیفن بتواند مولکول‌هایی از قبیل ویتامین C و ویتامینE   افزایش دهد، دور از ذهن است و تاکنون مطرح نشده است.  به طور خلاصه، تاموکسیفن خاصیت اکسیداتیو دارد که نمی‌تواند سبب افزایش ویتامین C شده و سایر مولکول­های دارای خواص آنتی اکسیداتیو غیر آنزیمی را القاء کند. همچنین، تاموکسیفن  با تولید MDA و تاثیر این عوامل از طریق مسیرهای سیگنالیگ بر بیان آنزیم­های آنتی‌اکسیدان اثرات خود را به شکل افزایش TAC نشان می‌دهد.

یکی دیگر از یافته‌های این تحقیق وجود یک همبستگی معنی­دار بین مقادیر آنتی‌اکسیدانی کل و MDA در جامعه 16عددی موش های صحرایی است. نکته جالب توجه این است که با افزایش MDA به عنوان یک بیومارکر استرس اکسیداتیو انتظار می‌رود که TAC کاهش یابد، چرا که نسبت این دو متغیر باید معکوس باشد. در این حالت با افزایش استرس کسیداتیو بخش غیر آنزیمی TAC مصرف و کمتر می‌شود.

به عنوان مثال کانوار و همکارانش نشان دادند با افزایش MDA مقدار ویتامین C کاهش می‌یابد (Kanwar, et al., 2020). لذا، می توان انتظار داشت که یک ارتباط منفی بین مقادیر MDA و آنتی اکسیدان تام برقرار باشد، درحالی­که در مطالعه حاضر با افزایش MDA مقدار TAC افزایش پیدا کرد. این یافته تاکیدی بر این نکته است که تغییرات در TAC به علت تغییرات بخش آنزیمی می‌باشد. در واقع افزایش TAC را می توان پاسخی به مقادیر افزایش یافته‌ی رادیکال‌های آزاد در سرم مدل حیوانی در نظر گرفت.

یکی دیگر از یافته­های این تحقیق وجود همبستگی بسیار قوی‌تر بین مقادیر MDA و TAC در گروه تیمارشده با تاموکسیفن بودند. این درحالی بود که در سه گروه دیگر همبستگی معنی­دار مشاهده نشد. در واقع می‌توان به این صورت استنتاج نمود که TAC و MDA تابع شرایط القایی و نه ایستایی است، بدین معنی که TAC در حالتی که حیوان به حالت ایستا و بدون تغییرات است، نمی‌تواند نشان‌دهنده استرس اکسیداتیو باشد. در حالی­که در شرایطی که استرس اکسیداتیو در مدل حیوانی یا انسان ایجاد شود، TAC در پاسخ به استرس افزایش پیدا می­کند. این نتایج توسط فیاضی و همکارانش در بیماران مبتلا به سکته مغزی ایسکمیک به عنوان یک مدل استرس اکسیداتیو قبلاً مورد بررسی و تایید قرار گرفته است (Fayyazi et al., 2023).

در بررسی‌های بافت­شناسی مشخص گردید هیچ تغییرات پاتوفیزیولوژیکی در سطح بافت روی نداده است. این موضوع را شاید بتوان به زمان کوتاه تیمارها نسبت داد.

به­طور کلی می‌توان نتیجه گرفت که استرادیول به عنوان یک هورمون طبیعی انتخاب­شده در فرآیند تکامل دارای خواص اکسیداتیو نبوده و تا حدودی خواص آنتی­اکسیدانی نشان می‌دهد. تاموکسیفن به عنوان یک مولکول مهارکننده گیرنده استروژن سبب استرس اکسیداتیو می‌شود. در نهایت، TAC به عنوان یک بیومارکر برای شرایط ایستایی اهمیت نداشته و بیشتر به کمک تحریک‌های اکسیداتیو در بخش آنزیمی القاء­ شده و در بخش غیرآنزیمی کاهش می‌یابد. لذا پیشنهاد می‌شود که در تحقیق‌های آتی از مدل‌های انسانی و کارآزمایی‌های بالینی برای بررسی­های بیشتر استفاده شود. دوره استفاده­ از استرادیول طولانی و حداقل در بازه زمانی چندین ماهه باشد. در بررسی اثرات تاموکسیفن پیشنهاد می‌گردد که اثرات اکسیداتیو و مسیرهای آن مشخص شود.

 

سپاسگزاری

بدینوسیله از زحمات جناب آقای دکتر امیر امنیت‌طلب و جناب آقای سیامک چراغیان بابت مساعدتشان در اجرای طرح کمال تقدیر و تشکر را داریم.

 

تعارض منافع

نویسندگان وجود هرگونه تعارض منافع را رد می‌کنند.

 

 

 

منابع

·       Ahmed, N.S., Samec, M., Liskova, A., Kubatka, P. and Saso, L. (2021). Tamoxifen and oxidative stress: an overlooked connection. Discover Oncology, 12(1): 17-18.

·       Alamri, A.M., Alkhilaiwi, F.A., Khan, N.U., Mashat, R.M  and Tasleem, M. (2024). Exploring pathogenic SNPs and estrogen receptor alpha interactions in breast cancer: An in silico approach. Heliyon, 10(17): 372-97.

·       Bekele, R.T., Venkatraman, G., Liu, R.Z., Tang, X., Mi, S., Benesch, M.G., et al. (2016). Oxidative stress contributes to the tamoxifen-induced killing of breast cancer cells: implications for tamoxifen therapy and resistance. Scientific Reports, 6: 21164.

·       Bhat, H.K., Calaf, G., Hei, T.K., Loya, T. and Vadgama, J.V. (2003). Critical role of oxidative stress in estrogen-induced carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(7): 3913-3918.

·       Russo, J. and Russo I.H. (2006). The role of estrogen in the initiation of breast cancer, The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 102(1-5): 89-96.

·       Bulbul, M., Aydın, T.B., Karaçor, T., Onderci, M., Nacar, M.C., Parlar, A., et al. (2022). Carbamazepine protects the endometrium against negative effects of estrogen in rats. Biotechnic & Histochemistry, 97(4): 254-260.

·       Clemons, M. and Goss, P. (2001). Estrogen and the risk of breast cancer. New England Journal of Medicine, 344(4): 276-285.

·       Fayyazi, F., Mamaghani, M.M., Abgharmi, B.A., Zarrini, G., Mosarrezaii, A., Charkhian, H. and Gholinejad, Z. (2023). N-Acetyl cysteine amide and cerium oxide nanoparticles as a drug delivery for ischemic stroke treatment: Inflammation and oxidative stress crosstalk. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 80: 127300.

·       Ferlay, J., Colombet, M., Soerjomataram, I., Parkin, D.M., Piñeros, M., Znaor, A., et al. (2021). Cancer statistics for the year 2020: An overview. International Journal of Cancer, 149(4): 778-789.

·       Beyssen, M., J. Lagorce, D. Clédat, A. Jambut and J. Buxeraud (2000). Antithyroid action of tamoxifen in the rat: in vivo and in vitro studies. Pharmacology, 61(1): 22-30.

·       Harburger, L.L., Saadi A. and K.M. Frick (2009). Dose-dependent effects of post-training estradiol plus progesterone treatment on object memory consolidation and hippocampal extracellular signal-regulated kinase activation in young ovariectomized mice. Neuroscience, 160(1): 6-12.

·       Green, C.J., Knight, J., Precious, S. and Simpkin, S. (1981). Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: a 10 year experience. Laboratory Animals, 15(2): 163-170.

·       Benzie, I.F. and Strain J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power: the FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239(1): 70-76.

·       Senthilkumar, M., Amaresan, N.  and Sankaranarayanan, A. (2021). Estimation of Malondialdehyde (MDA) by Thiobarbituric Acid (TBA) Assay. Plant-Microbe Interactions: Laboratory Techniques. New York, NY, Springer US: 103-105

·       Giaquinto, A.N., Sung, H., Newman, L.A., Freedman, R.A., Smith, R.A., Star, J., et al. (2024). Breast cancer statistics 2024. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 74(6); 477-495.

·       Kamińska, M., Ciszewski, T., Łopacka-Szatan, K., Miotła, P. and Starosławska, E. (2015). Breast cancer risk factors. Menopause Review/Przegląd Menopauzalny, 14(3): 196-202.

·       Kanwar, A., Mor, P. and Sonagara, V. (2020).  Status of lipid peroxidation and antioxidation in maxillary and vocal cord carcinoma. International Journal of Clinical Biochemistry and Research, 60(5):­17-20.

·       Khan, M. Z.I., Uzair, M., Nazli, A.  and Chen, Z.J. (2022). An overview on estrogen receptors signaling and its ligands in breast cancer. European Journal of Medicinal Chemistry, 114658.

·       Madeddu, C., Gramignano, G., Floris, C., Murenu, G., Sollai, G. and Maccio, A. (2014). Role of inflammation and oxidative stress in post‐menopausal oestrogen‐dependent breast cancer. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 18(12): 2519-2529.

·       Mehta, S.K. and Gowder, S.J.T. (2015). Members of antioxidant machinery and their functions. Basic Principles and Clinical Significance of Oxidative Stress, (11): 59-85.

·       Modugno, F., Zmuda, J.M., Potter, D., Cai, C., Ziv, E., Cummings, S.R., et al. (2005). Estrogen metabolizing polymorphisms and breast cancer risk among older white women. Breast Cancer Research and Treatment, (93): 261-270.

·       Nordenström, A., Ahmed, S.F., Van Den Akker, E., Blair, J., Bonomi, M., Brachet, C. , et al. (2022). Pubertal induction and transition to adult sex hormone replacement in patients with congenital pituitary or gonadal reproductive hormone deficiency: an Endo-ERN clinical practice guideline. European Journal of Endocrinology, 186(6): 9-49.

·       O'Bryan, S.M., Connor, K.R., Drummer, D.J., Lavin, K.M. and Bamman, M.M. (2022). Considerations for sex-cognizant research in exercise biology and medicine. Frontiers in Sports and Active Living, 4: 903992.

·       Petersen, O., Høyer, P. and Van Deurs, B. (1987). Frequency and distribution of estrogen receptor-positive cells in normal, nonlactating human breast tissue. Cancer Research, 47(21): 5748-5751. 

·       Rosen, E.M., Fan, S., Pestell, R.G. and  Goldberg, I.D. (2003). BRCA1 gene in breast cancer. Journal of Cellular Physiology, 196(1): 19-41.

·       Salama, S.A., Jamaluddin, M., Kumar, R., Hassan, M.H. and Al-Hendy, A. (2007). Progesterone regulates catechol-O-methyl transferase gene expression in breast cancer cells: distinct effect of progesterone receptor isoforms. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 107(3-5): 253-261.

·        Demirci-Çekiç, S., Özkan, G., Avan A.N., Uzunboy, S., Çapanoğlu E. and Apak R. (2022).  Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense,  Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 209: 114477.

·       Samavat, H. and Kurzer, M.S. (2015). Estrogen metabolism and breast cancer. Cancer Letters, 356(2): 231-243.

·       Singh, Z., Karthigesu, I.P., Singh, P. and Rupinder, K. (2014). Use of malondialdehyde as a biomarker for assessing oxidative stress in different disease pathologies: a review. Iranian Journal of Public Health, 43(Supple 3): 7-16.

·       Spink, D.C., Spink, B.C., Cao, J.Q., DePasquale, J.A., Pentecost, B.T., Fasco, M.J., et al. (1998). Differential expression of CYP1A1 and CYP1B1 in human breast epithelial cells and breast tumor cells. Carcinogenesis, 19(2): 291-298.

·       Steiner, M., Dunn, E. and Born, L. (2003). Hormones and mood: from menarche to menopause and beyond. Journal of Affective Disorders, 74(1): 67-83.

·       Stepniak, J. and Karbownik-Lewinska, M. (2016). 17 β-estradiol prevents experimentally-induced oxidative damage to membrane lipids and nuclear DNA in porcine ovary. Systems Biology in Reproductive Medicine, 62(1): 17-21.

·       Yu, Z., Jiao, Y., Zhao, Y. and Gu, W. (2022). Level of Estrogen in Females-The Different Impacts at Different Life Stages. Journal of Personalized Medicine, 12(12): 1995.

·       Zhang, K., Ping, L., Du, T., Wang, Y., Sun, Y., Liang, G., et al. (2021). A novel systematic oxidative stress score predicts the prognosis of patients with operable breast cancer. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 9441896.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

147