Identification and evaluation of antidiabetic activity of bacteria isolated from Persian Gulf sponges

alpha-amylase, alpha-glucosidase, sponge-related bacteria, secondary metabolites, anti-diabetes, Persian Gulf

Subject Areas : Microbial Biotechnology

Atefeh Ansarizadeh ¹ , Farshid Kafilzadeh ² , Saeid Tamadoni Jahromi ³ , Mohammad Kargar ⁴ , Mohsen Gozari ⁵

1 - Department of Microbiology, Jahrom Branch, Islamic Azad University, Jahrom, Iran
2 - Department of Microbiology, Islamic Azad University, Jahrom Branch, Jahrom, Iran
3 - Persian Gulf and Oman Sea Ecology Research center, Iranian Fisheries Science Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Bandar abbas, Iran
4 - Department of Microbiology, Jahrom Branch, Islamic Azad University, Jahrom, Iran
5 - Persian Gulf and Oman Sea Ecology Research Center, Iranian Fisheries Sciences Research Institute, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Bandar Abbas, Iran

Received: 2023-06-10 Accepted : 2023-10-07 Published : 2023-11-13

Keywords: alpha-amylase, alpha-glucosidase, sponge-related bacteria, secondary metabolites, anti-diabetes, Persian Gulf,

Abstract :

Background and purpose: Screening and identification of bacteria associated with sponges is an important step in the discovery of new drugs. The purpose of this research was to isolate and identify bacteria associated with sponges around Hormuz Island and to find bacteria that produce metabolites that inhibit the activity of alpha-glucosidase and alpha-amylase enzymes. Materials and methods: In this study, 25 samples of Haliclona and Niphatea sponges were collected from 6 stations. Identification was done based on phenotypic characteristics. Bacteria were cultured in broth nutrient medium and their secondary metabolites were extracted by ethyl acetate. The inhibition rate of metabolites against alpha-amylase and alpha-glucosidase was evaluated based on colorimetric methods. The toxicity of metabolites against normal umbilical cord endothelial cell line was investigated. The productive bacteria were identified by polyphasic taxonomy approach. Results: A total of 105 bacteria were isolated. Vibrio and Bacillus bacteria with 32.81% and 17.19% in Haliclona sp. and 19.51% and 34.15% in Niphatea sp. The metabolites extracted from 3 isolates inhibited amylase enzyme activity with IC50 values ranging from 0.248 to 366.8 µg/ml. Also, 4 isolates produced inhibitory metabolites against alpha-glucosidase enzyme in IC50 values from 159.4 to 670.9 µg/ml. Based on the results of polyphasic identification of capable isolates including Bacillus pumilus HH 165, Pseudomonas lurida HH 124, Streptomyces sp. HN 235, Bacillus tequilensis HN 231. Conclusion: In this study, 3 strains of bacteria producing inhibitory compounds, including alpha-ambellase and alpha-glucosidase enzymes, and without cytotoxicity were identified. The mentioned bacteria can be suitable candidates in diabetes studies.

References:

1. Khan S, Malik A. Exploring the Diversity of Marine Microbiome in Response to Changes in the Environment. Microbiomes and the Global Climate Change: Springer; 2021. p. 81-92.
2. Gozari M, Alborz M, El-Seedi HR, Jassbi AR. Chemistry, Biosynthesis and Biological Activity of Terpenoids and Meroterpenoids in Bacteria and Fungi Isolated from Different Marine Habitats. European Journal of Medicinal Chemistry. 2021;210:112957.
3. Voser TM, Campbell MD, Carroll AR. How different are marine microbial natural products compared to their terrestrial counterparts? Natural Product Reports. 2022;39(1):7-19.
4. Lu W-Y, Li H-J, Li Q-Y, Wu Y-C. Application of marine natural products in drug research. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2021;35:116058.
5. García-Jiménez B, García JL, Nogales J. FLYCOP: metabolic modeling-based analysis and engineering microbial communities. Bioinformatics. 2018;34(17):i954-i63.
6. Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim S-K. Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives. Microbiol Res. 2013;168(6):311-32.
7. Gozari M, Bahador N, Mortazavi MS, Eftekhar E, Jassbi AR. An “olivomycin A” derivative from a sponge-associated Streptomyces sp. strain SP 85. 3 Biotech. 2019;9(12):439-51.
8. Gozari M, Bahador N, Jassbi AR, Mortazavi M, Eftekhar E. Antioxidant and cytotoxic activities of metabolites produced by a new marine Streptomyces sp. isolated from the sea cucumber Holothuria leucospilota. Iranian Journal of Fisheries Sciences. 2018;17(2):413-26.
9. Gozari M, Bahador N, Jassbi AR, Mortazavi MS, Hamzehei S, Eftekhar E. Isolation, distribution and evaluation of cytotoxic and antioxidant activity of cultivable actinobacteria from the Oman Sea sediments. Acta Oceanologica Sinica. 2019;38(12):84-90.
10. Hadfield MG. Developmental symbiosis: a sponge larva needs symbiotic bacteria to succeed on the benthos. Curr Biol. 2021;31(2):R88-R90.
11. Posadas N, Baquiran JIP, Nada MAL, Kelly M, Conaco C. Microbiome diversity and host immune functions influence survivorship of sponge holobionts under future ocean conditions. The ISME Journal. 2022;16(1):58-67.
12. Imada C. Enzyme inhibitors and other bioactive compounds from marine actinomycetes. Antonie Van Leeuwenhoek. 2005;87(1):59-63.
13. Mayer AM, Pierce ML, Howe K, Rodríguez AD, Taglialatela-Scafati O, Nakamura F, et al. Review Marine Pharmacology in 2018: Marine Compounds with Antibacterial, Antidiabetic, Antifungal, Anti-Inflammatory, Antiprotozoal, Antituberculosis and Antiviral Activities; Affecting the Immune and Nervous Systems, and other Miscellaneous Mechanisms of Action. Pharmacological Research. 2022:106391.
14. Banerjee P, Mandhare A, Bagalkote V. Marine natural products as source of new drugs: an updated patent review (July 2018-July 2021). Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2022;32(3):317-63.
15. Hooper J. Sponguide. Guide to sponge collection and identification (version 2003). John NA Hoo-per Qld Museum, Australia. 2003.
16. Seidel V. Initial and bulk extraction of natural products isolation. Natural products isolation. 2012:27-41.
17. Chen Z, Hao J, Wang L, Wang Y, Kong F, Zhu W. New α-glucosidase inhibitors from marine algae-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-3434. Scientific reports. 2016;6(1):1-9.
18. Hansawasdi C, Kawabata J, Kasai T. α-Amylase inhibitors from roselle (Hibiscus sabdariffa Linn.) tea. Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2000;64(5):1041-3.
19. Peng S, Zhao M. Pharmaceutical bioassays: methods and applications: John Wiley & Sons; 2009.
20. Goto M. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd edn, vol 2, part B. Springer, USA. 2005:404-6.
21. Williams S, Goodfellow M, Alderson G, Wellington E, Sneath P, Sackin M. Numerical classification of Streptomyces and related genera. Microbiology. 1983;129(6):1743-813.
22. Kieser T. Practical streptomyces genetics: John Innes Foundation, Norwich, England.; 2000.
23. Heuer H, Krsek M, Baker P, Smalla K, Wellington E. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients. Appl Environ Microbiol. 1997;63(8):3233-41.
24. Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim S-K. Pharmaceutically active secondary metabolites of marine actinobacteria. Microbiol Res. 2014;169(4):262-78.
25. Heim NA, Knope ML, Schaal EK, Wang SC, Payne JL. Cope’s rule in the evolution of marine animals. Science. 2015;347(6224):867-70.
26. Zhang H, Lee YK, Zhang W, Lee HK. Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve: isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2006;90(2):159-69.
27. Jiang S, Li X, Zhang L, Sun W, Dai S, Xie L, et al. Culturable actinobacteria isolated from marine sponge Iotrochota sp. Mar Biol. 2008;153(5):945-52.
28. Selvin J, Gandhimathi R, Kiran GS, Priya SS, Ravji TR, Hema T. Culturable heterotrophic bacteria from the marine sponge Dendrilla nigra: isolation and phylogenetic diversity of actinobacteria. Helgoland marine research. 2009;63(3):239-47.
29. Gozari M. Selective Isolation of the Persian Gulf Sponge-associated Actinobacteria and Evaluation of Cytotoxic and Antioxidant activity of Their Metabolites. Journal of Oceanography. 2020;11(41):39-48.
30. Colwell RR, Grimes DJ. Nonculturable microorganisms in the environment: ASM press; 2000.
31. Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchinson CR. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol. 2005;71(8):4840-9.
32. Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, Hill RT. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile. Appl Environ Microbiol. 2001;67(1):434-44.
33. Kaur N, Kumar V, Nayak SK, Wadhwa P, Kaur P, Sahu SK. Alpha‐amylase as molecular target for treatment of diabetes mellitus: A comprehensive review. Chemical Biology & Drug Design. 2021;98(4):539-60.
34. Pirian K, Moein S, Sohrabipour J, Rabiei R, Blomster J. Antidiabetic and antioxidant activities of brown and red macroalgae from the Persian Gulf. Journal of Applied Phycology. 2017;29(6):3151-9.
35. Akshatha V, Nalini M, D'souza C, Prakash H. Streptomycete endophytes from anti‐diabetic medicinal plants of the Western Ghats inhibit alpha‐amylase and promote glucose uptake. Letters in applied microbiology. 2014;58(5):433-9.
36. Cao Y, Gong Y, Liu L, Zhou Y, Fang X, Zhang C, et al. The use of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as an in vitro model to assess the toxicity of nanoparticles to endothelium: a review. Journal of Applied Toxicology. 2017;37(12):1359-69.
37. Zhang S, Song W, Nothias L-F, Couvillion SP, Webster N, Thomas T. Comparative metabolomic analysis reveals shared and unique chemical interactions in sponge holobionts. Microbiome. 2022;10(1):1-14.
38. Church DL, Cerutti L, Gürtler A, Griener T, Zelazny A, Emler S. Performance and application of 16S rRNA gene cycle sequencing for routine identification of bacteria in the clinical microbiology laboratory. Clinical microbiology reviews. 2020;33(4):e00053-19.

Full-Text:



شناسایی و ارزیابی فعالیت ضد دیابتی ترکیبات استخراج شده از باکتری های مرتبط با اسفنج های جزیره هرمز

 

چکیده

سابقه و هدف : باکتریها به عنوان منبع تولید ترکیبات زیست فعال نقش مهمی در اکتشاف داروهای جدید دارند. هدف از پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتریهای مرتبط با اسفنج های پیرامون جزیره هرمز و بررسی توانایی آنها جهت تولید ترکیبات بازدارنده فعالیت آنزیم های آلفا گلوکوزیداز و آلفا آمیلاز بود.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه مقطعی-توصیفی، 25 نمونه از اسفنج‌های هالیکلونا و نیفاتس از عمق 10 تا 15 متری از 6 ایستگاه پیرامون جزیره هرمز بوسیله غواصی جمع آوری شد. پس از جداسازی و خالص‌سازی، شناسایی اولیه باکتریها بر اساس ویژگیهای فنوتیپی صورت گرفت. به منظور غربالگری، باکتریها در محیط کشت تولید تلقیح شدند. سپس با استفاده از روش استخراج مایع- مایع بوسیله اتیل استات استخراج ترکیبات انجام شد. بازدارندگی ترکیبات در مقابل آنزيم‌های آلفا آميلاز و آلفا گلوکوزیداز بوسیله روش‌های رنگ‌سنجي ارزیابی شد. سمیت ترکیبات بازدارنده علیه رده سلولی نرمال اندوتلیلال بند ناف مورد بررسی قرار گرفت. باکتریهای منتخب بر اساس ویژگی‌های فتوتیپی و ژنوتیپی شناسایی شدند.

یافته ها: در کل حدود 105 جدایه باکتری جداسازی گردید. از این تعداد 64 جدایه از اسفنج هالیکلونا و 41 جدایه از اسفنج نیفاتس جداسازی شد. باکتریهای ویبریو و باسیلوس فراوانی غالب را تشکیل دادند. ترکیبات استخراج شده از 3 جدایه با مقادیر IC50 متغیر ازg/ml µ 0/248 تا 8/366 فعالیت آنزیم آمیلاز را ممانعت کردند. همچنین 4 جدایه مولد متابولیت‌های بازدارنده علیه آنزیم آلفا‌گلوکوزیداز در مقادیر IC50 ازg/ml µ 4/159تا 9/670 بودند. جدایه‌های توانمند شامل Bacillus pumilus، Pseudomonas lurida، Streptomyces sp. ، Bacillus tequilensis بودند.

نتیجه گیری: نتایج این مطالعه منجر به شناسایی 3 سویه باکتری مولد ترکیبات بازدارنده آنزیم های آلفا آمبلاز و آلفا گلوکوزیداز و فاقد سمیت سلولی گردید. با توجه به نقش این دو آنزیم در بیماری دیابت باکتریهای مذکور می توانند کاندیدای مناسبی در مطالعات تکمیلی باشند.

 کلمات کلیدی: آلفا آمیلاز ، آلفا گلوکوزیداز، باکتری های مرتبط با اسفنج، متابولیت های ثانویه، دیابت، خلیج فارس

 

مقدمه:

اکوسیستم‌ های دریایی به عنوان متنوع ترین اکوسیستم کره زمین از قابلیت های منحصر به فردی برای مطالعات اکتشاف ترکیبات طبیعی برخوردار هستند(1). وجود زیستگاه های مختلف با شرایط محیطی متفاوت همچون میزان دسترسی به مواد مغذی، حضور نور، میزان شوری، pH ،دما، فشار و اکسیژن زمینه تنوع زایی را در این اکوسیستم بزرگ موجب شده است(2). ترکیبات طبیعی دریایی فرصتی فوق العاده را برای دستیابی به ترکیبات متنوع و منحصر به فرد فراهم نموده و به توسعه صنعت تولید دارو منجر شده است(3). ارگانیسم های مولد ترکیبات طبیعی در تمامی تاکسون های حیات یافت می شوند. در این میان نقش میکروارگانیسم های دریایی به دلیل تولید ترکیبات منحصر به فرد بسیار مورد توجه می باشد(4). استفاده از ترکیبات طبیعی زیست فعال با منشاء میکروبی در صنایع داروسازی در حال گسترش بوده و این ترکیبات در زمینه های مختلف از جمله ایمنی درمانی ، شیمی درمانی سرطان و ضد التهابی کاربردهای وسیعی دارند. ترکیبات ثانویه تولید شده توسط باکتریهای دریایی، طیف وسیعی از فعالیت های زیستی همچون خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد سرطانی، ضد دیابت، کشنده یا متوقف کننده رشد سلول، ضد التهابی، ضد انگلی، ضد ویروسی، آنتی اکسیدان و ضد رگ زایی را از خود نشان می دهند (5-9).

اسفنج های دریایی به شاخه روزن داران تعلق داشته و با فیلتر کردن حجم قابل توجهی از آب پیرامون خود با استفاده از یک سیستم پیشرفته تغذیه می کنند. بدینوسیله بسیاری از میکروارگانیسم ها، جلبک ها و ذرات آلی را جذب نموده و از طریق فاگوسیتوز هضم می نمایند(10). باکتریها می توانند تا 60 درصد زیست‌توده اسفنج معادل 108 تا 109 باکتری در هر گرم از بافت اسفنج را تشکیل دهند (11). 

دیابت یک اختلال متابولیک در بدن است. در این بیماری، توانایی تولید انسولین در بدن از بین می رود و یا بدن در برابر تولید انسولین مقاوم شده و بنابراین انسولین تولیدی نمی تواند عملکرد طبیعی خود را انجام دهد (11). مهار کننده های آلفاگلوکوزیداز، از مهمترین داروهای خوراکی ضد افزایش گلوکز خون می باشند (12). آنزیم آلفاگلوکوزیداز نقش مهمی در هضم و جذب قندها دارد. این آنزیم در پرزهای روده کوچک قرار گرفته و با شکستن پیوندهای آلفا یک به چهار گلیکوزیدی در طی مرحله نهایی هیدرولیز، چند قندی ها، سه قندی ها و دو قندی ها را به گلوکز و تک قندی های دیگر تبدیل می نماید (13). ترکیبات  بازدارنده با اتصال به جایگاه فعال آنزیم از ورود سوبسترا ممانعت نموده و مانع از کاتالیز واکنش توسط آنزیم می گردند. اگرچه تاکنون ترکیبات ضد دیابتی مختلفی از موجودات دریایی همچون شکم پایان، اسفنج ها و حلزون ها جداسازی شده است اما گزارش های معدودی در خصوص مهارکننده های آنزیمی جداسازی شده از باکتری های دریایی ارائه شده است (12). این مهارکننده ها جذب گلوکز را به تاخیر انداخته و متابولیسم ساکارز به گلوکز را مهار می کنند(13). با وجود پیشرفت در طراحی دارو، هنوز هم نیاز مبرم به داروهای جدید با منشاء طبیعی برای مقابله با بیماری های مختلف از جمله دیابت وجود دارد(14). هدف اصلی از اجرای مطالعه حاضر دستیابی به فرآورده های میکروبی بازدارنده فعالیت آنریم های آلفا آمیلاز و آلفا گلوکوزیداز از باکتریهای مرتبط با اسفنج های پیرامون جزیره هرمز بود.

 

مواد و روشها:

 الف( نمونه برداری از اسفنج ها: در اردیبهشت 99 حدود 25 نمونه اسفنج بوسیله غواصی از ارگانیسم های دریایی از عمق حدود 10 تا 15 متری آب های پیرامون جزیره هرمز جمع آوری شده و بر اساس ویژگیهای مورفولوژیک شامل ویژگیهای مورفومتریک و مورفومریستیک از قبیل شناسایی اسپیکول ها توسط پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان شناسایی گردیدند(15) (شکل 1).

 

شکل1- نمونه های اسفنج جمع آوری شده .A. نیفاتس.  B . هالیکلونا

 

ب( جداسازی و شناسایی اولیه باکتریها: اسفنج های نمونه برداری شده، پس از شستشو با آب دریای استریل و هموژن شدن در هاون های استریل در محیط های کشت با فرمولاسیون سازگار با شرایط زیست طبیعی آنها کشت شدند. از محیط کشت هایMarine  zobell agar، Glycerol asparagine agar و Marine sponge agar برای جداسازی باکتریها استفاده شد(7).

ج) تولید و استخراج ترکیبات ثانویه از باکتریها: جدایه های مورد نظر با تراکمCFU/ml  105 در محیط کشت نوترینت براث تغییر یافته کشت داده شد. جهت سازگاری محیط کشت با شرایط فیزیولوژیک باکتریهای دریایی از آب دریا برای ساخت محیط کشت استفاده شد. پس از گرماگذاری در دمایC ° 30 در مدت 48 ساعت مایع تخمیری حاصله برداشت شده و با استفاده از پمپ خلاء با فیلتر 48/0 میکرونی صاف گردید(16). مایع تخمیری فیلتر شده با استفاده از روش استخراج مایع- مایع با حجم معادل از حلال اتیل استات در 2 مرحله استخراج شد. فاز آلی استخراج شده جمع آوری شده و تحت خلا با سیستم تبخیر کننده چرخان خشک گردید.

 

د) سنجش میزان بازدارندگی فعالیت آنزیم آلفا گلوکوزیداز: غلظت های متوالی (µg/ml 1250، 625، 5/312، 25/156، 12/78، 39) از متابولیت استخراج شده در بافر فسفات سدیم (pH 6.8) حل شد. 10 میکرولیتر از هر غلظت با 20 میکرولیتر بافر فسفات سدیم و 20 میکرولیتر پارا-نیتروفنیل آلفا-دی- گلوکوزید (با غلظت mM 2) در میکروپلیت 96 خانه مخلوط و در C ° 37 به مدت 5 دقیقه انکوبه گردید. 10 میکرولیتر آنزیم آلفا گلوکوزیداز (خریداری شده از شرکت سیگما) رقیق شده به میزانU/ml  2/0 (با استفاده ازM  01/0 بافر فسفات سدیم) به هر چاهک اضافه شد. پس از انکوباسیون در C ° 37 به مدت 15 دقیقه  جذب نوری نمونه ها در طول موج 405 نانومتر توسط میکروپلیت ریدر (BioTek) ثبت شد. در نمونه بلانک به جای آنزیم از بافر فسفات سدیم استفاده شد. آکاربوز به عنوان کنترل مثبت در غلظت های مشابه غلظت ترکیبات استخراج شده مورد سنجش قرار گرفت. استفاده از کنترل مثبت جهت کنترل کیفی آزمون و مقایسه با نمونه های تست انجام شد. میزان فعالیت بازدارندگی با معادله ذیل محاسبه شد(17).

100 ×] [1- (ODtest - ODblank) =درصد بازدارندگی

 

ه) سنجش میزان بازدارندگی فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز: سنجش میزان مهار آنزيم آلفاآميلاز توسط ترکیبات استخراج شده بر اساس روش رنگ سنجي DNSA (Dinitrosalicylic acid) انجام شد (18). محلول واکنش شامل 500 میکرولیتر PBS حاوی  mg/ml5/0 آنزیم آلفا آمیلاز (شرکت سیگما) و غلظت‌های متوالی (µg/ml 1250، 625، 5/312، 25/156، 12/78، 39) از عصاره متابولیت‌ها در لوله های آزمایش بود. پس از 10 دقیقه انکوباسیون در C ° 25 ، 500 میکرولیتر محلول نشاسته 1% در PBS اضافه شد. سپس واکنش با افزودن یک میلی لیتر DNSA متوقف گردید. مخلوط واکنش به مدت 5 دقیقه جوشانده شد و پس از سرد شدن با 10 میلی لیتر آب مقطر رقیق شد. جذب نوری نمونه ها در 540 نانومتر خوانده شد. از آکاربوز به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. جهت محاسبه درصد مهار كنندگي نمونه ها ميزان مالتوز نمونه ها بر اساس منحني كاليبراسيون مالتوز كه بر مبناي0-70 درصد (V/W) رسم شده بود محاسبه گرديد. سپس ميزان درصد بازدارندگی با استفاده از معادله ذیل انجام شد.

100 ×] [(Ac – Abc)-(Aa-Aab) / (Ac-Abc) =درصد بازدارندگی

Ac: جذب نوری واکنش حاوی آنزیم و بدون مهار کننده  

Abc: جذب نوری واکنش بلانک فاقد آنزیم و حاوی حلال

Aa: جذب نوری واکنش حاوی نمونه مورد آزمون (غلظت های مختلف عصاره) و آنزیم

Aab: جذب نوری واکنش بلانک حاوی نمونه مورد آزمون بدون آنزیم

 

و) ارزیابی فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات دارای فعالیت بازدارنده: فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات دارای فعالیت بازدارنده آنزیمی علیه رده های سلولی نرمال اندوتلیلال بند ناف انسانHUVEC)  (در غلظت های مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور از روش رنگ سنجی با معرف تترازولیومMTT  استفاده شد. L µ 100 محیط کشت DMEM حاوی سلول با تعداد نهایی 104×1 سلول در میلی لیتر به هر چاهک در میکروپلیت 96 خانه ای اضافه و در دمای°C  37 در حضور 5 درصد دی اکسید کربن به مدت 24 ساعتگرماگذاری شد. غلظت های400، 200 ، 100، 50، 25 و 5/12، 25/6، 12/3 میکروگرم بر میلی لیتر از هر عصاره در محیط کشت DMEM تهیه شد. از هر رقت lµ 100 به هر چاهک افزوده شد و میکروپلیت به مدت 36 ساعت دیگر با شرایط قبلی گرماگذاری گردید. پس از اتمام دوره،l µ 50 محلول MTT با غلظت mg/ml5 افزوده شد و 3 ساعت با شرایط قبلی گرماگذاری گردید. بدنبال آن l µ 100 معرف حل کننده حاوی DMSO و متانول با نسبت 4 به 1 به هر چاهک افزوده شد. جذب هر چاهک بوسیله Microplate reader در طول موجnm  550 ثبت گردید. این آزمون با سه تکرار انجام شد و فعالیت سیتوتوکسیک هر نمونه با معادله زیر محاسبه شد. IC50 نمونه ها با رسم منحنی دوز- پاسخ با استفاده از نرم افزار Graphpad prism 6 تعیین شد(19).

ز: شناسایی جدایه های مولد ترکیبات ثانویه بازدارنده: جدایه های دارای فعالیت بازدارندگی بر اساس استراتژی شناسایی چند وجهی باکتریها که در برگیرنده ویژگیهای مورفولوژیک، فیزیولوژیک، بیوشیمیایی،  ژنتیک می باشد مورد شناسایی قرار گرفتند. مورفولوژی میکروسکوپی جدایه های مولد منتخب با استفاده از زنگ آمیزی گرم بررسی گردید. مورفولوژی ماکروسکوپی شامل میزان رشد سویه ها، رنگ کلونی، تشکیل اسپور و تولید پیگمان محلول در آب بود. شناسایی فیزیولوژیک و بیوشیمیایی با بررسی رشد باکتریها در محدوده تعیین شده دما، pH و شوری سنجش شد (20). همچنین تولید آنزیم‌های تشخیصی شامل اکسیداز، کاتالاز، نیترات ردوکتاز و آمیلاز سنجش شد (21).

ض: شناسایی ژنتیکی جدایه های مولد: استخراج DNA ژنومی جدایه های مولد با استفاده از روش استخراج CTAB  انجام شد(22). بدین منظور پس از تهیه بیومس مناسب مراحل مختلف لیز سلولی ، پروتئین زدایی و خالص سازی DNA ژنومی  صورت گرفت. کمیت DNA استخراج شده در طول موج های 230،260 و 280 نانومتر با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری بررسی و غلظت DNA ژنومی استخراج شده محاسبه شد.کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از روش الکتروفورز روی ژل آگاروز 1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. تکثیر ژن 16SrRNA جدایه های منتخب با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) انجام شد. از جفت پرایمرهای (5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′) 27F و1492R (5′ACGGCTACCTTGTTACGA3′) جهت تکثیر ژن مربوطه استفاده شد(23). محصول PCR حاصله طبق دستورالعمل شرکت Promega  کره جنوبی آماده سازی و به شرکت مزبور ارسال شد. تعیین توالی ژن 16SrRNA با استفاده از روش Sanger و تکنیک Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit انجام گردید. شناسایی و تعیین میزان شباهت ژن16SrRNA جدایه ها با سویه های موجود در بانک ژن NCBI با استفاده از نرم افزار  Megablastانجام شد.

آنالیزهای آماری: آزمون های جداسازی و ارزیابی تنوع باکتریها با سه تکرار انجام شد. نتایج به صورت میانگین و درصد فراوانی بیان شد. نتایج سنجش فعالیت بازدارندگی متابولیت ها علیه آنزیم های آلفا آمیلاز و الفا گلوکوزیداز با در نظر گرفتن 3 تکرار بصورت تریپلیکیت انجام شد. تعیین IC50 بر اساس آزمون رگرسیون و با استفاده از نرم افزار Graphpad prism 6 انجام شد.  نتایج به صورت میانگین IC50 ±خطای استاندارد(SE) بیان گردید. نتایج سنجش فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات بازدارنده نیز بصورت میانگین IC50 ±خطای استاندارد(SE) ارائه شد.

یافته‌ها

الف) در کل تعداد 105 جدایه باکتری از نمونه های اسفنج پیرامون جزیره هرمز جداسازی گردید. از این تعداد، 64 جدایه از نمونه های اسفنج هالیکلونا و41 جدایه از نمونه های اسفنج نیفاتس جداسازی شدند. نتایج شناسایی اولیه باکتریها و درصد فراوانی هر یک از آنها در شکل های 2 و 3  نشان داده شده است. 

 

 

 

شکل 2: تنوع زیستی باکتریهای جدا شده از اسفنج هالیکلونا جمع‌آوری شده از جزیره هرمز

 

شکل 3: تنوع زیستی باکتریهای جداشده از اسفنج نیفاتس جمع‌آوری شده از جزیره هرمز

ب) سنجش میزان بازدارندگی از فعالیت آنزیم آلفا گلوکوزیداز: ارزیابی فعالیت بازدارندگی ترکیبات استخراج شده از 105 جدایه بدست آمده از نمونه های اسفنج نشان داد 3 جدایه مولد ترکیبات مهارکننده فعالیت آنزیم آلفا گلوکوزیداز با مقادیر IC50 کمتر ازg/ml µ 1250 بودند. در میان متابولیت‌های استخراج شده بیشترین فعالیت بازدارنده متعلق به جدایه  HH165با IC50 به میزان µg/ml 0/248 بود. (جدول 1).

ج) سنجش میزان بازدارندگی از فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز: ارزیابی فعالیت بازدارندگی ترکیبات استخراج شده از 105 جدایه بدست آمده از نمونه های اسفنج نشان داد 4 جدایه مولد ترکیبات مهارکننده فعالیت آنزیم آمیلاز با مقادیر IC50 کمتر ازg/ml µ 1250 بودند. درمیان ترکیبات استخراج شده بیشترین فعالیت بازدارنده متعلق به HH 165جدایه با مقدار IC50 به میزانg/ml µ 4/159بود (جدول 1).

جدول 1- نتایج غلظت های بازدارنده از فعالیت آنزیم‌های آلفا آمیلاز و آلفا گلوکوزیداز توسط ترکیبات استخراج شده

 

جدایه	غلظت بازدارنده آلفا آمیلاز	غلظت بازدارنده آلفا گلوکوزیداز
	IC50 ±SE (µg/ml)
Pseudomonas lurida HH 124	±4/397 29/36	± 6/329 27/25
Bacillus pumilus HH 165	11±4/159/43	17±0/248/61
Bacillus tequilensis HN 231	±9/670 26/11	>1000
Streptomyces enissocaesilis HN 235	±0/420 25/54	±8/366 78/26
Acarbose	±32/78 15/14

د) ارزیابی سمیت ترکیبات استخراج شده از باکتریهای مولد ترکیبات بازدارنده: نتایج سنجش سمیت ترکیبات بازدارنده نشان داد که ترکیبات استخراج شده از جدایه HN 235 بر روی رده سلولی اندوتلیال بند ناف انسانیHUVEC با IC50 به میزان µg/ml 56/78 بالاترین فعالیت سیتوتوکسیک را ارائه نمود. بررسی تصاویر میکروسکوپی سلولهای تیمار شده و کنترل بدون تیمار کاهش قابل ملاحظه تعداد سلولهای زنده و تغییرات مورفولوژیک آنها را تایید نمود (شکل 4). ترکیبات بازدارنده استخراج شده از 3 جدایه توانمند شامل HH 124، HH 165 و HN 231 در غلظت های مورد آزمون فعالیت ستوتوکسیک نشان ندادند.

 

              

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4- تاثیر فعالیت سیتوتوکسیک ترکیبات بازدارنده بر مورفولوژی و فراوانی رده سلولی HUVEC. A. سلولهای موجود درچاهک کنترل B. سلولهای تیمار شده (بزرگنمایی 200X).

و) شناسایی جدایه های مولد ترکیبات بازدارنده:

نتایج شناسایی خصوصیات مورفولوژیک و بیوشیمیایی انجام گرفته بر روی جدایه ها را می توان در جدول 2 مشاهده نمود. نتایج آنالیز تطابق توالی ژن 16SrRNA بیانگر همولوژی حدود 97 تا 100 درصدی میان جدایه های مولد ترکیبات بازدارنده با سویه های شاخص ثبت شده در بانک ژن NCBI بود. این نتایج نشان داد جدایه HH 165  به میزان 88/99 درصد با سویه Bacillus pumilus ATCC 7061 تشابه داشت. آنالیز Blast  همچنین نشان داد ژن 16S rRNA جدایه HH 124 به میزان 47/99 درصد با همین ژن در سویه Pseudomonas lurida P513/18 تشابه داشتند (جدول 4-21). در حالیکه جدایه HN 231 به میزان 100 درصد با سویه Bacillus tequilensis 10b تشابه نشان داد. همچنین میزان تشابه جدایه  HN 235 معادل 84/97 درصد با سویه Streptomyces enissocaesilis NRRL B-16365 ثبت شد. توالی ژن 16S rRNA سویه‌های شناسایی شده با شماره‌های دستیابی OP801623.1، OP801416.1، OP801418.1، OP801669.1 در بانک ژن NCBI ثبت شدند. نتایج حاصل از آنالیز فیلوژنتیک میان سویه های مولد متابولیت های بازدارنده و نزدیکترین سویه های شاخص بر اساس توالی ژن 16S rRNA و یا استفاده از الگوی Neighbour joining نشان داد سویه های موجود در درخت فیلوژنتیکی رسم شده در 3 خوشه مجزا قرار گرفته اند. سویه های HN 231 و HH 165 دریک خوشه مشترک واقع شدند اگرچه سویه HN 231 مسیر تکاملی جداگانه ای را تشکیل داده است. در خوشه دوم ایجاد شده سویه Pseudomonas lurida HH 124 قرار گرفتند که مسیر تکاملی جداگانه ای با سویه های دارای بیشترین تشابه ژنتیکی با خود نشان داد. در خوشه بعدی سویه Streptomyces enissocaesilis HN 235 قرار گرفت. این سویه نیز خط تکاملی جداگانه ای را نشان داد (شکل5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- ویژگی های مورفولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک جدایه های مولد ترکیبات بازدارنده

Streptomyces enissocaesilis HN 235	Pseudomonas lurida HH 124	Bacillus tequilensis HN 231	Bacillus pumilus HH 165	ویژگی‌ها
+	-	+	+	واکنش گرم
-	-	+	+	تولید اسپور
+	+	+	+	گلوکز	مصرف منابع کرین
+	+	+	+	فروکتوز
+	-	+	+	زایلوز
+	-	+	-	آرابینوز
+	-	-	-	رامنوز
-	-	+	+	سوکروز
+	+	+	-	رافینوز
+	-	+	+	گالاکتوز
+	+	-	-	اینوزیتول
+	-	+	-	لاکتوز
-	+	+	+	والین	مصرف منابع نیتروژن
+	-	-	+	آرژینین
-	-	-	+	اورنیتین
+	-	-	+	آسپاراژین
40-10	45-20	45-5	45-5	محدوده دمای رشد °C
9-5	9-6	9-5	9-5	محدوده pHرشد
10-0	8-0	10-0	10-0	محدوده تحمل شوری (ppt)
-	+	+	+	اکسیداز
+/-	+/+	+/-	+/-	اکسیداسیون تخمیر
+	+	+	+	کاتالاز
-	-	-	-	سولفید هیدروژن
+	+	-	-	احیا نیترات
-	-	+	+	وژ-پروسکوئر
-	+	-	-	ژلاتین
+	+	-	-	سیترات
+	-	-	-	آرژینین دهیدرولاز
-	+	-	-	اورنیتین دکربوکسیلاز
-	+	-	-	لیزین دکربوکسیلاز
-	-	-	+	رنگدانه

 

 

 

Bacillus Pumilus HH 165

Bacillus sp. strain CASMBLAKS32

Bacillus tequilensis HN 231

Bacillus sp. strain HA-68

Pseudomonas lurida HH 124

Pseudomonas lurida strain P 513/18

Pseudomonas paralactis strain DSM 29164

Streptomyces enissocaesilis HN 235

Streptomyces marinus strain Sp0807

Streptomyces reniochalinae strain LHW50302

Sulfolobus acidocaldarius strain NR 043400

100

100

80

100

99

95

98

65

0.050

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 5: درخت فیلوژنتیک سویه های مولد متابولیت های بازدارنده و نزدیکترین سویه های موجود بر اساس روش Neighbour joining. اعداد نشان داده شده در کنار گره ها بیانگر میزان Bootstrap است. نوار مقیاس بیانگر جایگزینی 5 نوکلئوتید در 100 نوکلئوتید می باشد. سویه Sulfolobus acidocaldarius strain NR 043400 به عنوان Outgroup در نظر گرفته شد.

 

بحث:

در سالهای اخیر برنامه های گسترده ای برای اکتشاف ترکیبات بازدارنده فعالیت آنزیمی از منابع دریایی در سرتاسر دنیا طراحی و اجرا شده است. باکتریهای مرتبط با اسفنج های دریایی نقش برجسته ای در بیوتکنولوژی میکروبی ایفا نموده و بدین منظور هدف غربالگری در این مطالعه قرار گرفتند (24 و25).

 بررسی الگوی تنوع زیستی باکتریهای مرتبط با اسقنج های نمونه برداری شده از پیرامون جزیره هرمز نشان داد که نمونه های متعلق به جنس هالیکلونا با حدود 10 جنس مختلف از باکتریها، میزبان طیف متنوع تری از باکتریها بودند. در حالیکه در نمونه های اسفنج نیفاتس این تنوع به 7 جنس باکتری محدود شد (شکل های2 و 3). لازم به ذکر است این الگو تنها به باکتریهای قابل کشت با روش های جداسازی مورد استفاده در این مطالعه منحصر می شود و نمی تواند گویای تنوع باکتریایی اسفنج میزبان باشد. لیکن از نظر مقایسه تنوع باکتریهای قابل کشت در نمونه های مورد بررسی بدلیل یکسان بودن تکنیک های جداسازی قابل توجه می باشد. در این مطالعه غلبه جنس های ویبریو و باسیلوس در نمونه های مورد بررسی مشهود بود. در برخی مطالعات با هدف جداسازی اکتینوباکتریها غلبه استرپتومایسس ها در نمونه های اسفنج گزارش شد. برای نمونه ژانگ و همکارانش در یک مطالعه اعلام نمودند 6/73 درصد از جدایه های بدست آمده از اسفنج Hymeniacidon perleve به گونه های استرپتومایسس تعلق داشتند (26). نتایج مطالعه دیگری در زمینه تنوع زیستی اکتینوباکتریهای مرتبط با اسفنج دریایی Iotrochota sp. نشان داد اعضای جنس استرپتومایسس غالب جمعیت اکتینوباکتریها مرتبط با این اسفنج را تشکیل دادند(27). نتایج بررسی تنوع زیستی اکتینوباکتریهای مرتبط با اسفنج Dendrilla  nigra نشان داد استرپتومایسس ها  91/23 درصد جدایه های اکتینوباکتری را دربر گرفتند (28). نتایج مطالعه گذری و همکاران نشان داد 43/25 درصد باکتریهای جداسازی شده از اسفنج هالیکلونا متعلق به اکتینوباکتریها بود که از این میان 70 درصد را گونه های استرپتومایسس را تشکیل دادند(29). به نظر می رسد دلیل اصلی این تفاوت الگوی تنوع زیستی هدف مطالعات انجام شده و اعمال تیمارهای آنتخابی و محیط های کشت اختصاصی برای جداسازی باکتریها می باشد. در حالیکه در مطالعه حاضر از محیط های کشت اختصاصی استفاده نشد.

 دستیابی به باکتریهای مولد ترکیبات بازدارنده فعالیت آنزیمی پیچیده و در عین حال دارای اهمیت می باشد. از جنبه اول پروفایل باکتریایی اسفنج ها در مکان های نمونه برداری مختلف با توجه به پارامترهای متعدد متغیر بوده و بیشتر باکتریها در شرایط آزمایشگاهی غیر قابل کشت می باشند(30-32). نتایج سنجش فعالیت بازدارندگی ترکیبات استخراج شده نشان داد بترتیب 3 و 4 جدایه معادل 86/2 و 81/3 درصد از کل باکتریهای جداسازی شده، مولد ترکیبات مهارکننده فعالیت آنزیم های آلفا گلوکوزیداز و آلفا آمیلاز در غلظت های معنادار بودند. ترکیبات مهار کننده فعالیت آنزیم های مذکور می توانند نقش مهمی در کاهش جذب گلوکز در خون از طریق مهار فعالیت آنزیم های آلفا آمیلاز یا آلفا گلوکوزیداز به عنوان آنزیم های هیدرولیز کننده کربوهیدراتها ایفا نمایند(33). در مطالعه حاضر میزان IC50 فعالیت این متابولیت ها ازg/ml µ 4/159 تا 9/670 برای آلفا آمیلاز متغیر بود. این در حالی است که این میزان برای عصاره های جلبکی نمونه برداری شده از خلیج فارس حدود g/ml µ 420 تا 5/7 گزارش شده است(34). در مطالعه دیگری مقدار IC50 فعالیت مهارکنندگی ترکیبات استخراج شده از باکتری Streptomyces longisporoflavus به میزانg/ml µ 3/162 گزارش شد(35). اگرچه مقایسه میزان فعالیت مهارکنندگی عصاره ترکیبات استخراج شده بدلیل تفاوت غلظت یا خلوص ماده موثره در این عصاره ها قابل اتکا نمی باشد لیکن ارزیابی اولیه ای از توان بازدارندگی در مطالعات غربالگری ارائه می نماید.

در مطالعه حاضر به منظور بررسی سمیت ترکیبات از تست سمیت روی رده سلولی انسانی اندوتلیال بند ناف انسان استفاده شد. در مطالعات غربالگری ترکیبات طبیعی برای سنجش سمیت سلولی ترکیبات استخراج شده از رده های سلولی انسانی یا حیوانی به عنوان مدل استفاده می شود. در مطالعه حاضر نیز از سلول HUVEC که یک رده سلولهای طبیعی اندوتلیال بندناف جنین انسان است به عنوان مدل برون تنی استفاده شد. این رده سلولی از سایر رده های سلولی طبیعی در دسترس تر است. می توان آن را با پروتکل های استاندارد با حداقل نیازهای غذایی و محیطی کشت و نگهداری کرد. از منابع تجاری قابل خریداری است. بسیاری از مارکرهای مهم داخل سلولی را تولید می کند. همچنین نتایج حاصل از تست روی آن را می توان به مدل های درون تنی تعمیم داد(36). نتایج سنجش فعالیت سیتوتوکسیک نشان داد ترکیبات ثانویه استخراج شده از جدایه های HN 235 در مقابل رده سلولی HUVEC فعالیت سیتوتوکسیک معادلg/ml µ 56/78 نشان دادند. از اینرو این جدایه بدلیل سمیت ترکیبات استخراج شده از مطالعات تکمیلی حذف شد. تولید ترکیبات سیتوتوکسیک توسط باکتریهای همزیست با اسفنج ها در مطالعات مختلف گزارش شده است. ارگانیسم های دریایی از قبیل اسفنج ها با تولید ترکیبات سیتوتوکسیک راهبرد دفاعی خود را در مقابل شکارچیان و پاتوژن ها در زیستگاه هایشان اعمال می نمایند(37). بر اساس نظریه وجود منشاء میکروبی بخشی از متابولیت های ثانویه موجود ارگانیسم های دریایی، لزوما باید گونه های معینی از باکتریهای همزیست بطور دائمی و اختصاصی با ارگانیسم میزبان مرتبط بوده و به ایفای عملکرد بپردازند(10). نتایج بررسی سمیت همچنین نشان داد ترکیبات بازدارنده استخراج شده از جدایه های HH 124، HH 165 و HN 231 در غلظت های مورد بررسی فاقد سمیت بودند. این نتیجه می تواند ضمن تایید ایمنی این ترکیبات، ضریب درمانی آنها را در مطالعات درون تنی ارتقاء بخشد. اگرچه ضروری است سایر اثزات فارماکولوژیک این ترکیبات بر آنزیم های دخیل در متابولیسم انسانی مورد بررسی قرار گیرد.

با توجه به نتایج آزمون های شناسایی پلی فازی می توان بیان نمود اکثر جدایه های منتخب، سویه های متفاوتی از سویه های شاخص بوده و می توانند به عنوان منابعی جدید از ترکیبات زیست فعال مورد مطالعه بیشتر قرار گیرند. آنالیز تطابق ژنتیکی سویه های منتخب با نزدیکترین سویه ها بر اساس ژن 16S rRNA انجام شد. توالی ژن 16S rRNA به عنوان یک ژن اورتولوگ و ساعت ملکولی بطور گسترده در مطالعات فیلوژنتیک باکتریها مورد مطالعه قرار گرفته است. ترتیب توالی این ژن به میزان بالایی حفاظت شده و اطلاعات دقیقی را برای تمایز در سطح گونه و جنس فراهم نموده است(38). مطابقت نتایج حاصل از شناسایی فیزیولوژیک، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک جدایه های مولد با نتایج شناسایی ژنتیک آنها ماهیت این جدایه‌ها را نشان داد. بر این اساس، سویه‌های مولد با عنوان Bacillus pumilus HH 165، Pseudomonas lurida HH 124، Bacillus tequilensis HN 231 شناسایی شدند. همچنین سویه Streptomyces sp. HN 235 که دارای تشابه 84/97 درصدی با نزدیکترین سویه های شاخص ثبت شده در بانک ژن بود از نظر ویژگیهای فنوتیپی نتایج متفاوتی نشان داد. از اینرو برای مطالعات پیشرفته شناسایی پیشنهاد گردید.

نتیجه گیری:

 مطالعه حاضر منجر به ایجاد درک جدیدی از تنوع زیستی باکتریهای قابل کشت مرتبط با جوامع اسفنج پیرامون جزیره هرمز گردید. همچنین پتانسیل بالای فعالیت بازدارندگی ترکیبات تولید شده توسط این باکتریها در مقابل آنزیم های آلفا آمیلاز و آلفا گلوکوزیداز را مشخص شد. این نتایج می توان شاهد دیگری بر نقش فعال جمعیت های باکتریایی مرتبط با اسفنج ها ارائه نماید. مطالعه حاضر یک استراتژی کارامد را برای غربالگری باکتریها از اسفنج های دریایی ارائه نمود. نتیجه این پژوهش دستیابی به 4 سویه باکتری مولد ترکیبات بازدارنده در مقابل آنزیم های دخیل در بیماری دیابت بود. نتایج این مطالعه عدم سمیت 3 متابولیت استخراج شده در مقابل سلولهای طبیعی انسانی را تایید نمود. بنابر این در صورت تایید آزمون های تکمیلی فارماکولوژیک می توان از سویه های مذکور به عنوان کاندیدای بالقوه در مطالعات درون تنی داروهای ضد دیابت استفاده نمود.

ملاحظات اخلاقی:

نویسندگان تمامی  نکات اخلاقی اعم از سرقت ادبی، عدم انتشار دوگانه وتحریف داده‌ها و داده‌سازی رادر این مقاله رعایت کرده اند.

تشکر و قدر دانی :

نویسندگان این مقاله از حوزه معاونت پژوهشی و همکاری کارکنان محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد جهرم و پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان در اجرای این تحقیق تشکر و قدردانی می نمایند.

تعارض منافع

وجود ندارد.

 

 

 

References:

1.        Khan S, Malik A. Exploring the Diversity of Marine Microbiome in Response to Changes in the Environment. Microbiomes and the Global Climate Change: Springer; 2021. p. 81-92.

2.        Gozari M, Alborz M, El-Seedi HR, Jassbi AR. Chemistry, Biosynthesis and Biological Activity of Terpenoids and Meroterpenoids in Bacteria and Fungi Isolated from Different Marine Habitats. European Journal of Medicinal Chemistry. 2021;210:112957.

3.        Voser TM, Campbell MD, Carroll AR. How different are marine microbial natural products compared to their terrestrial counterparts? Natural Product Reports. 2022;39(1):7-19.

4.        Lu W-Y, Li H-J, Li Q-Y, Wu Y-C. Application of marine natural products in drug research. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2021;35:116058.

5.        García-Jiménez B, García JL, Nogales J. FLYCOP: metabolic modeling-based analysis and engineering microbial communities. Bioinformatics. 2018;34(17):i954-i63.

6.        Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim S-K. Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives. Microbiol Res. 2013;168(6):311-32.

7.        Gozari M, Bahador N, Mortazavi MS, Eftekhar E, Jassbi AR. An “olivomycin A” derivative from a sponge-associated Streptomyces sp. strain SP 85. 3 Biotech. 2019;9(12):439-51.

8.        Gozari M, Bahador N, Jassbi AR, Mortazavi M, Eftekhar E. Antioxidant and cytotoxic activities of metabolites produced by a new marine Streptomyces sp. isolated from the sea cucumber Holothuria leucospilota. Iranian Journal of Fisheries Sciences. 2018;17(2):413-26.

9.        Gozari M, Bahador N, Jassbi AR, Mortazavi MS, Hamzehei S, Eftekhar E. Isolation, distribution and evaluation of cytotoxic and antioxidant activity of cultivable actinobacteria from the Oman Sea sediments. Acta Oceanologica Sinica. 2019;38(12):84-90.

10.        Hadfield MG. Developmental symbiosis: a sponge larva needs symbiotic bacteria to succeed on the benthos. Curr Biol. 2021;31(2):R88-R90.

11.        Posadas N, Baquiran JIP, Nada MAL, Kelly M, Conaco C. Microbiome diversity and host immune functions influence survivorship of sponge holobionts under future ocean conditions. The ISME Journal. 2022;16(1):58-67.

12.        Imada C. Enzyme inhibitors and other bioactive compounds from marine actinomycetes. Antonie Van Leeuwenhoek. 2005;87(1):59-63.

13.        Mayer AM, Pierce ML, Howe K, Rodríguez AD, Taglialatela-Scafati O, Nakamura F, et al. Review Marine Pharmacology in 2018: Marine Compounds with Antibacterial, Antidiabetic, Antifungal, Anti-Inflammatory, Antiprotozoal, Antituberculosis and Antiviral Activities; Affecting the Immune and Nervous Systems, and other Miscellaneous Mechanisms of Action. Pharmacological Research. 2022:106391.

14.        Banerjee P, Mandhare A, Bagalkote V. Marine natural products as source of new drugs: an updated patent review (July 2018-July 2021). Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2022;32(3):317-63.

15.        Hooper J. Sponguide. Guide to sponge collection and identification (version 2003). John NA Hoo-per Qld Museum, Australia. 2003.

16.        Seidel V. Initial and bulk extraction of natural products isolation. Natural products isolation. 2012:27-41.

17.        Chen Z, Hao J, Wang L, Wang Y, Kong F, Zhu W. New α-glucosidase inhibitors from marine algae-derived Streptomyces sp. OUCMDZ-3434. Scientific reports. 2016;6(1):1-9.

18.        Hansawasdi C, Kawabata J, Kasai T. α-Amylase inhibitors from roselle (Hibiscus sabdariffa Linn.) tea. Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 2000;64(5):1041-3.

19.        Peng S, Zhao M. Pharmaceutical bioassays: methods and applications: John Wiley & Sons; 2009.

20.        Goto M. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology 2nd edn, vol 2, part B. Springer, USA. 2005:404-6.

21.        Williams S, Goodfellow M, Alderson G, Wellington E, Sneath P, Sackin M. Numerical classification of Streptomyces and related genera. Microbiology. 1983;129(6):1743-813.

22.        Kieser T. Practical streptomyces genetics: John Innes Foundation, Norwich, England.; 2000.

23.        Heuer H, Krsek M, Baker P, Smalla K, Wellington E. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients. Appl Environ Microbiol. 1997;63(8):3233-41.

24.        Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim S-K. Pharmaceutically active secondary metabolites of marine actinobacteria. Microbiol Res. 2014;169(4):262-78.

25.        Heim NA, Knope ML, Schaal EK, Wang SC, Payne JL. Cope’s rule in the evolution of marine animals. Science. 2015;347(6224):867-70.

26.        Zhang H, Lee YK, Zhang W, Lee HK. Culturable actinobacteria from the marine sponge Hymeniacidon perleve: isolation and phylogenetic diversity by 16S rRNA gene-RFLP analysis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2006;90(2):159-69.

27.        Jiang S, Li X, Zhang L, Sun W, Dai S, Xie L, et al. Culturable actinobacteria isolated from marine sponge Iotrochota sp. Mar Biol. 2008;153(5):945-52.

28.        Selvin J, Gandhimathi R, Kiran GS, Priya SS, Ravji TR, Hema T. Culturable heterotrophic bacteria from the marine sponge Dendrilla nigra: isolation and phylogenetic diversity of actinobacteria. Helgoland marine research. 2009;63(3):239-47.

29.        Gozari M. Selective Isolation of the Persian Gulf Sponge-associated Actinobacteria and Evaluation of Cytotoxic and Antioxidant activity of Their Metabolites. Journal of Oceanography. 2020;11(41):39-48.

30.        Colwell RR, Grimes DJ. Nonculturable microorganisms in the environment: ASM press; 2000.

31.        Schirmer A, Gadkari R, Reeves CD, Ibrahim F, DeLong EF, Hutchinson CR. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol. 2005;71(8):4840-9.

32.        Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, Hill RT. Phylogenetic diversity of bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile. Appl Environ Microbiol. 2001;67(1):434-44.

33.        Kaur N, Kumar V, Nayak SK, Wadhwa P, Kaur P, Sahu SK. Alpha‐amylase as molecular target for treatment of diabetes mellitus: A comprehensive review. Chemical Biology & Drug Design. 2021;98(4):539-60.

34.        Pirian K, Moein S, Sohrabipour J, Rabiei R, Blomster J. Antidiabetic and antioxidant activities of brown and red macroalgae from the Persian Gulf. Journal of Applied Phycology. 2017;29(6):3151-9.

35.        Akshatha V, Nalini M, D'souza C, Prakash H. Streptomycete endophytes from anti‐diabetic medicinal plants of the Western Ghats inhibit alpha‐amylase and promote glucose uptake. Letters in applied microbiology. 2014;58(5):433-9.

36.        Cao Y, Gong Y, Liu L, Zhou Y, Fang X, Zhang C, et al. The use of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as an in vitro model to assess the toxicity of nanoparticles to endothelium: a review. Journal of Applied Toxicology. 2017;37(12):1359-69.

37.        Zhang S, Song W, Nothias L-F, Couvillion SP, Webster N, Thomas T. Comparative metabolomic analysis reveals shared and unique chemical interactions in sponge holobionts. Microbiome. 2022;10(1):1-14.

38.        Church DL, Cerutti L, Gürtler A, Griener T, Zelazny A, Emler S. Performance and application of 16S rRNA gene cycle sequencing for routine identification of bacteria in the clinical microbiology laboratory. Clinical microbiology reviews. 2020;33(4):e00053-19.

 

 

 

 

Identification and evaluation of antidiabetic activity of compounds extracted from bacteria associated with sponges around Hormoz Island-Persian Gulf

 

Background and objectives: Bacteria as a source of production of bioactive compounds play an important role in the discovery of new drugs. The purpose of this research was to isolate and identify bacteria associated with sponges around Hormoz Island and assess their ability to produce compounds that inhibit the activity of alpha-glucosidase and alpha-amylase enzymes.

Materials and methods: In this cross-sectional-descriptive study, 25 samples of Haliclona and Niphates sponges were collected by diving from 10-15 meters depth from 6 stations around Hormuz Island. After isolation and purification, primary identification of bacteria was done based on phenotypic characteristics. For the purpose of screening, bacteria were inoculated in the production medium. Then the compounds were extracted using the liquid-liquid extraction method with ethyl acetate. The inhibition of compounds against alpha-amylase and alpha-glucosidase enzymes was evaluated by colorimetric methods. The toxicity of the inhibitory compounds against the normal umbilical cord endothelial cell line was investigated. Selected bacteria were identified based on phenotypic and genotypic characteristics.

Results: In total, about 105 bacterial isolates were isolated from sponge samples from Hormoz Island. Of these, 64 isolates from the sponge Haliclona sp. and 41 isolates from the sponge Niphates sp. It was isolated. Vibrio and Bacillus bacteria were the dominant frequency. The extracts from 3 isolates inhibited amylase enzyme activity with IC50 values varying from 0.248 to 366.8 µg/ml. Also, 4 isolates produced inhibitory metabolites against alpha-glucosidase enzyme in IC50 values from 159.4 to 670.9 µg/ml. Based on the polyphasic identification results the potent isolates were identified as Bacillus pumilus, Pseudomonas lurida, Streptomyces sp., and Bacillus tequilensis.

Conclusion: The results of this study led to the identification of 3 bacterial strains producing inhibitory compounds against alpha-amylase and alpha-glucosidase enzymes without cytotoxicity. Considering the role of these two enzymes in diabetes, the isolated bacteria can be suitable candidates for further studies.

 

Keywords: alpha-amylase, alpha-glucosidase, sponge-related bacteria, secondary metabolites, anti-diabetes, Persian Gulf

..

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---