Antibacterial activity of cow milk fermented by kefir grains against a number of pathogenic bacteria

Subject Areas : Industrial Food Microbiology

هادی کوهساری ¹ , Seyede Sorayya Sajjadi ² , Araz Soltan Saedifar ³ , Maryam Sadegh Shesh Poli ⁴

1 - استادیار گروه میکروبیولوژی، واحد آزادشهر، دانشگاه آزاد اسلامی، آزادشهر، ایران
2 - Graduated student, Department of Microbiology, Minudasht branch, Islamic Azad University, Minudasht, Iran
3 - Graduated student, Department of Microbiology, Minudasht branch, Islamic Azad University, Minudasht, Iran
4 - Graduated Ph.D of Molecular Medicine, Golestan University of Medical Sciences, Gorgan, Iran

Received: 2023-08-02 Accepted : 2024-11-07 Published : 2024-11-10

Keywords: Kefir, Antibacterial activity, Cow milk, Pathogenic bacteria,

Abstract :

Kefir beverage is one of the oldest fermented milk products, which is a natural probiotic and a complex of microbial symbiotic that is obtained from the fermentation of milk by kefir grains. The study aimed antibacterial activity of kefir samples prepared with cow milk against 10 pathogenic bacteria. Kefir grains were added to cow milk (Full-fat and low-fat) and fermentation was done at 25°C and 37°C. Grains were separated from kefir extract and the antibacterial activity of kefir extract was evaluated against 10 pathogenic bacteria by well method. Kefir samples prepared at 37°C compared to 25°C samples showed more antibacterial activity against S. aureus, P. aeruginosa and native K. pneumoniae isolated. The most antibacterial activity of kefir samples against E. faecalis and S. dysenteriae was related to the samples prepared with low-fat milk at 37°C, respectively, with the average diameter of inhibition zone of 18.5 and 12.5 mm. The samples prepared with full-fat milk in 25°C and 37°C indicated more antibacterial activity with the diameter of inhibition zone of 22 and 19 mm against the standard K. pneumoniae strain, respectively. Significant difference was not observed about milk type and fermentation temperature effect on antibacterial activity against E. coli, both native isolate and standard strain and S. typhimurium (P<0.05). B. cereus showed significant resistance to kefir samples. Kefir prepared with cow milk is recommended due to significant antibacterial activity.

References:

Full-Text:

فعالیت ضدباکتریایی شیر گاو تخمیرشده بوسیله دانه‌های کفیر علیه تعدادی از باکتریهای بیماری‌زا

فعالیت ضدباکتریایی شیر گاو تخمیرشده ...

چکیده

نوشیدنی کفیر از قدیمی‌ترین محصولات تخمیری شیر است که پروبيوتيك طبيعي و کمپلکسی از یک مجموعه همزیستی میکروبی است که از تخمیر شیر به‌وسیله دانه‌های کفیر حاصل می‌شود. هدف از مطالعه حاضر بررسی فعالیت ضدباکتریایی نمونه‌های کفیر تهیه‌شده با شیر گاو علیه 10 باکتری بیماری‌زا می‌باشد. دانه‌های کفیر به شیر گاو (پرچرب و کم چرب) افزوده و عمل تخمیر در 25 و 37 درجه سانتیگراد انجام شد. دانه‌ها از عصاره کفیر جدا و فعالیت ضدباکتریایی عصاره کفیر علیه 10 باکتری بیماریزا با روش چاهک مورد ارزیابی قرار گرفت. نمونه‌های کفیر تهیه شده در 37 درجه سانتیگراد در مقایسه با نمونه‌های 25 درجه سانتیگراد فعالیت ضدباکتریایی بیشتری علیه استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا و ایزوله بومی کلبسیلا پنومونیه، نشان دادند. بیشترین فعالیت ضدباکتریایی نمونه‌های کفیر علیه انتروکوکوس فکالیس و شیگلا دیسانتری مربوط به نمونه‌های تهیه‌شده با شیر کم‌چرب در دمای 37 درجه به‌ترتیب با میانگین قطر هاله عدم رشد 5/18 و 5/12 میلیمتر بود. نمونه‌های تهیه‌شده با شیر پرچرب در دمای 25 و 37 درجه سانتی‌گراد، به‌ترتیب با قطر هاله عدم رشد 22 و 19 میلیمتر، فعالیت ضدباکتریایی بیشتری علیه سویه استاندارد کلبسیلا پنومونیه نشان دادند. در‌خصوص اشریشیا کلی اعم از ایزوله بومی و سویه استاندارد و سالمونلا تیفی موریوم، اختلاف معناداری از نظر تاثیر نوع شیر و دمای تخمیر بر فعالیت ضدباکتریایی در بین تیمارها مشاهده نشد (05/0<P). باسیلوس سرئوس مقاومت قابل‌ملاحظه‌ای نسبت به نمونه‌های کفیر از خود نشان داد. با‌توجه به فعالیت ضدباکتریایی قابل توجه نمونه‌های کفیر تهیه‌شده با شیر گاو استفاده از این نوشیدنی تخمیری توصیه می‌شود.

کلمات کلیدی: کفیر، فعالیت ضد باکتریایی، شیر گاو، باکتریهای بیماریزا

مقدمه

تاریخچه استفاده از میکروارگانیسم هاي زنده در غذا به ویژه باکتریهاي تولید کننده اسید لاکتیک به منظور حفظ و بهبود سلامت انسان بسیار طولانی است. فرآورده هاي لبنی اولین نوع از محصولات پروبیوتیکی بوده اند که مورد استفاده بشر قرار گرفته اند. پروبیوتیک‌ها میکروارگانیسم‌هاي زنده‌اي هستند که وقتی به مقدار کافی از آن ها مصرف می شود اثرات مفیدي بر سلامت انسان دارد (Fuller, 1989). پروبیوتیک ممکن است یک سویه واحد، یا مجموعه ای از میکروارگانیسمهای مختلف باشد که میتوانند از طریق فعالیتهای سیستم ایمنی ، فعالیت های متابولیک و مانع در برابر فرآیندهای پاتولوژیک، باعث افزایش سلامتی شود. کفیر مثالی از یک پروبیوتیک است که انواع مختلفی از باکتری های و مخمرها در آن حضور دارند (Simova, et al., 2002).

نوشیدنی کفیر از جمله قدیمی‌ترین محصولات تخمیری شیر است که يك پروبيوتيك طبيعي و نوشابه‌ای الکلی-لاکتیکی است که از تخمیر شیر به وسیله دانه های کفیر حاصل می شود. مصرف كفير در ارتقاي سلامت مؤثر است و سبب بالا بردن سيستم ايمني بدن، متعادل كردن فشار خون، درمان بيماريهاي گوارشي و كاهش سطح كلسترول سرم مي‌شود و همچنين داراي فعاليتهاي ضد باكتريايي، ضد قارچي و ضدتوموري مي باشد (Farnworth, 2005).

طیف وسیعی از ترکیبات فعال زیستی از جمله اسیدهای آلی، CO2، پراکسید هیدروژن، اتانول، پپتیدهای فعالی زیستی، اگزوپلی‌ساکاریدهایی مانند کفیران، باکتریوسین ها از تخمیر دانه های کفیر تولید می شوند که به طور مستقل یا با یکدیگر مزایای سلامتی مختلفی مرتبط با مصرف کفیر را باعث می شوند. محصولات اصلی تخمیر کفیر، اسید لاکتیک، اتانول، و CO2 هستند که ویسکوزیته، اسیدیته و مقدار کم الکل این نوشیدنی را مهیا می کنند. اجزای جزئی از جمله دی استیل ، استالدهید، اتیل و اسیدهای آمینه نیز به طعم این نوشیدنی تخمیری کمک می کنند (Rattray and O’Connel, 2011).

در طـي فرايند تخمير باكتري هاي لاكتيك موجود در دانه هـاي كفير، اسيد لاكتيك و مخمرها الكل و دي اكسـيد كـربن توليد مينمايند. مقادير اسيد لاكتيك، الكل و دي اكسـيدكربن موجود در كفير تحت تاثیر زمان و درجه حرارت گرمخانه گذاری تغییر می کند (Robinson, 1991).

دانه‌های کفیر، دانه‌های ژله مانندی شبیه گل‌کلم کوچک هستند. طول آنها 1 تا 3 سانتی متر، دارای لبه و شکل نامنظم و به رنگ سفید تا زرد و دارای یک بافت لزج اما محکم هستند (LaRivière, et al. 1967; Farnworth, 2005).

دانه‌های کفیر وقتی به شیر تازه منتقل می شوند، زنده می مانند و در این مدت تقریباً 20 ساعت رشد می کنند و جرم آنها 25 درصد افزایش می یابد (Farnworth, 2005).

دانه های کفیر نمونه ای از همزیستی بین مخمر و باکتریها است. میکرو فلور دانه‌های کفیر به‌طور قابل‌توجهی پایدار است و اگر تحت شرایط کشت و فیزیولوژیکی مناسب نگهداری و انکوبه شود، فعالیت خود را برای سال‌ها حفظ می‌کند. نسبت دانه به شیر، زمان و دما انکوبه گذاری، بهداشت در حین جداسازی دانه های کفیر، شستشوی دانه ها و نگهداری در سرما، همه به شدت بر کیفیت محصول و میکرو فلور دانه های کفیر تأثیر می گذارد (Gao and Li, 2016).

میکروارگانیسم های رایج جدا شده از دانه های کفیر در مناطق مختلف تفاوت هایی با هم دارند. باکتری‌های دانه‌ها معمولاً گونه‌های مختلف باکتری‌های اسید لاکتیک از جنس های لاکتوباسیلوس، لاکتوکوکوس، استرپتوکوکوس و لوکونوستوک هستند. همچنین باکتری های اسید استیک و گونه های استوباکتر در کنار مخمرهایی از جنس ساکارومایسس، کاندیدا، کلویورومایسس، زیگوساکارومایسس، رودوتورولا از میکروفلور موجود در دانه های کفیر می باشند. ترکیب میکروبی کلی کفیر پیچیده است و مشخص است که از منطقه ای به منطقه دیگر متفاوت است. محیط کشت نگهداری و شرایط نگهداری از عوامل اصلی منجر به تنوع میکروبی دانه های کفیر است (Schwan et al., 2014).

باکتری‌های اسید‌لاکتیک موجود در دانه‌های کفیر به دلیل توانایی رقابت و مهار رشد میکروارگانیسم‌های بیماری‍‌زا و عامل فساد، چه با تولید اسید‌لاکتیک و چه با افزایش بیان ترکیبات ضد‌میکروبی، توجه قابل توجهی را به خود جلب کرده‌اند (Kourkoutas, et al., 2007).

ظرفیت تولید مثلی دانه های کفیر به طور قابل توجهی تحت تاثیر شرایط رشد قرار دارد. در شرايط نامساعد، رشد دانه كفير مختل مي‌شود، ظاهر آنها بدتر مي‌شود و انعطاف پذیری آنها از دست می‌رود، کوچک می‌شوند و تعادل میکروبیولوژیکی آنها مختل می‌شود. در حالی که در شرایط مساعد، پس از پاساژهای متعدد در شیر، ظاهر معمولی، عملکردهای فیزیولوژیکی و خصوصیات تکنولوژیکی خود را بازیابی می‌کنند (Pop, et al., 2014).

ماده خام اصلی کفیر، شیر گاو است. این مطالعه با هدف بررسی فعالیت ضدباکتریایی نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو علیه 10 باکتری بیماریزا شامل استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، شیگلا دیسانتری، انتروکوکوس فکالیس، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا تیفی موریوم، اشریشیا کلی (ایزوله بومی و سویه استاندارد) و کلبسیلا پنومونیه (ایزوله بومی و سویه استاندارد)، انجام شد.

مواد و روش‌ کار

آماده سازی عصاره‌های کفیر

دانه های کفیر از فروشگاه پربیوتیک تهیه شد و فرایند احیاء و تخمیر دانه مطابق روش ارائه شده توسط عجم و کوهساری (2020) انجام شد. بطور خلاصه دانه ها با ساب کالچرهای متوالی در شیر به مدت 4 روز در 25 درجه سانتیگراد احیاء شدند. شیر هر 24 ساعت تعویض گردید. پس از احیاء، دانه های کفیر با آب مقطر استریل شسته شدند و 5 گرم از آن‌ها به 50 میلی لیتر شیر گاو پرچرب (25/3 درصد) و کم چرب (1 درصد) تلقیح شد و در دماهای 25 و 37 درجه سانتیگراد گرمخانه گذاری شدند. پس از بازه زمانی تخمیر (48 ساعت) دانه های کفیر از محصول تخمیری جدا شدند. عصاره های کفیر تا زمان انجام آزمون های فعالیت ضدباکتریایی در دمای یخچال نگهداری شدند. (Ajam and Koohsari, 2020)

آماده سازی سویه های باکتریایی مورد آزمون

فعالیت ضدباکتریایی نمونه های کفیر در مجموع علیه 10 باکتری مورد بررسی قرار گرفت. از این 10 باکتری، 7 باکتری گرم منفی شامل اشریشیا کلی (ایزوله بومی و سویه استاندارد PTCC 1338) ، شیگلا دیسانتري (PTCC 1188) ، سالمونلا تیفی موریوم (PTCC 1596)، سودوموناس آئروژینوزا (PTCC 1811) و کلبسیلا پنومونیه (ایزوله بومی و سویه استاندارد PTCC 1290) و سه باکتری گرم مثبت شامل استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، باسیلوس سرئوس (PTCC 1154) و انتروکوکوس فکالیس (PTCC 1778) بودند. سویه های استاندارد به صورت لیوفیلیزه از سازمان پژوهش هاي علمی و صنعتی ایران تهیه شدند و در آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشگاه آزاد اسلامی واحد گنبدکاووس در محیطBHI و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد احیاء شدند. آنگاه چند کلنی یک دست از کشت 24 ساعته هر باکتری به محیط کشت نوترینت براث تلقیح شد و در 37 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد تا کدورتی معادل 5/0 مک فارلند CFU/ml 108×5/1 حاصل شود (Weinstein, et al., 2018).

بررسی اثرات ضد باکتریایی به روش چاهک

فعالیت ضدباکتریایی عصاره‌های کفیر، بر اساس انتشار در آگار و با روش چاهک مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور از سوسپانسیون معادل نیم مک فارلند ( CFU/ml108× 5/1) باکتریهای پاتوژن مورد آزمون با سواپ استریل در سطح محیط کشت مولر هینتون آگار کشت یکنواخت تهیه شد. سپس با کمک چوب پنبه سوراخ‌کن استریل چاهک‌هایی به قطر 8 میلی‌متر در محیط حفر شد و 100 میکرولیتر از عصاره های کفیر در داخل چاهک‌ها ریخته و به مدت 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه گذاری شد. پس از این مدت با اندازه گیري قطر هاله عدم رشد در اطراف چاهک‌ها حساسیت یا مقاومت باکتري هاي مورد آزمون تعیین شد (Weinstein, et al., 2018).

تجزیه و تحلیل آماری

متغیرهای مستقل تحقیق شامل نوع کفیر (نمونه های کفیر تهیه شده از شیر گاو پرچرب و کم چرب)، دمای تخمیر (25 و37 درجه سانتیگراد) و نوع باکتری بیماری‌زا (10 گونه باکتری) و متغیر وابسته تحقیق فعالیت ضدباکتریایی (قطر هاله عدم رشد هر یک از باکتریهای بیماری زا در مواجه با نمونه‌های کفیر) نمونه‌های کفیر تهیه شده می باشند. هر آزمون حداقل در سه تکرار انجام شد و داده‌های حاصل بر اساس طرح کاملاً تصادفی و به کمک ANOVA یا آنالیز واریانس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مقایسه میانگین‌ها با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح معنی داری P<0.05 صورت گرفت و تجزیه تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم افزار SPSSو رسم نمودارها با نرم افزار Excel صورت پذیرفت.

نتایج

فعالیت ضدباکتریایی نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو علیه باکتری های مورد آزمون

جدول 1 و شکل 1 میانگین قطر هاله عدم رشد باکتریهای مورد آزمون را در مواجهه با نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو را نشان می دهد که حاکی از فعالیت ضدباکتریایی قابل توجه نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو است.

جدول 1. میانگین قطر هاله عدم رشد باکتریهای مورد آزمون در نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو

سطح معنی داری	شیر گاو کم چرب 25 درجه	شیر گاو پرچرب 25 درجه	شیر گاو کم چرب 37 درجه	شیر گاو پرچرب 37 درجه
43/0	15±1 abB	33/13±33/0 dB	5/18±5/1 aA	15±1bcB	انتروکوکوس فکالیس
66/0	-	12±0 dA	5/12±5/0 cdA	33/12±33/0 cA	شیگلا دیسانتری
-	-	-	10±0 dA	-	باسیلوس سرئوس
01/0	5/8±5/0 cB	-	5/12±5/0 cdA	12±57/0 cA	استافیلوکوکوس اورئوس
97/0	-	5/16±5/0 bcA	5/17±5/0 abA	33/16±21/3 abA	سالمونلا تیفی موریوم
00/0	9±0 cD	5/12±5/0dC	15±1 bcB	5/19±5/1 aA	سودوموناس آئروژینوزا
02/0	-	22±1 aA	15±1 bcB	5/19±5/0 aA	کلبسیلا پنومونیه (سویه استاندارد)
09/0	5/13±5/0 bB	5/15±5/0 cAB	17±1 abA	17±1 abA	کلبسیلا پنومونیه (ایزوله بومی)
38/0	5/15±5/0 aA	5/17±5/0 bA	5/15±5/0 bA	15±1bcA	اشریشیا کلی (ایزوله بومی)
13/0	15±0 abA	16±0 bcA	16±0 abA	5/17±5/0 abA	اشریشیا کلی (سویه استاندارد)
	00/0	00/0	00/0	03/0	سطح معنی داری

میانگین±انحراف معیار. حروف غیرمشابه کوچک در هر ستون بیانگر وجود اختلاف معنی دار در بین تیمارها می‌باشد (05/0P≤).

میانگین±انحراف معیار. حروف غیرمشابه بزرگ در هر ردیف بیانگر عدم وجود اختلاف معنی دار در بین تیمارها می‌باشد (05/0P≤).

شکل 1. میانگین قطر هاله عدم رشد باکتریهای مورد آزمون در نمونه های کفیر تهیه شده با شیر گاو

همانطور که در جدول 1 مشاهده می شود، نتایج مربوط به تاثیر نمونه های کفیر حاصل از شیر کم چرب و پر چرب در دمای 25 و 37 درجه بر باکتریهای انتروکوکوس فکالیس و شیگلا دیسانتری حاکی از عدم وجود اختلاف معنی دار در بین تیمارها می باشد (05/0<P). (شکل 2و 3). بیشترین فعالیت ضدباکتریایی نمونه های کفیر علیه انتروکوکوس فکالیس و شیگلا دیسانتری مربوط به نمونه های کفیر تهیه شده با شیر کم چرب در دمای 37 درجه سانتیگراد به ترتیب با میانگین قطر هاله عدم رشد 5/18 و 5/12 میلیمتر بود (جدول 1).

شکل 2. تاثیر نمونه های کفیر حاصل از شیر کم چرب و پر چرب در دمای 25 و 37 درجه بر باکتری انتروکوکوس فکالیس