Subject Areas :

Seyyed Mohammad Mousavi pakza ¹ , Elahe Moatamed ² , Nasrin Soltani ³ , Mohaddeseh Mohsenpour ⁴ , Aliakbar Ebadi ⁵ , مطهره محسن پور ^{6 *}

1 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
2 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
3 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
4 -
5 - Rice Research Institute of Iran (RRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO) Rasht, Iran
6 - پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج

Received: 2024-11-23 Accepted : 2024-12-12 Published : 2025-04-14

Keywords:

Full-Text:



فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی

 

راهکاری نوین برای صرفه‌جویی در آب و افزایش تولید برنج: مهندسی ژنتیک با ژن‌های OsNAC5 و EPSPS

 

سيد محمد موسوي پاکزاد1، الهه معتمد1، نسرين سلطاني1، محدثه محسن‌پور2، علي اکبر عبادي3 و مطهره محسن پور1*

 

1.بخش مهندسي ژنتيک و ايمني زيستي، پژوهشگاه بیوتکنولوژي کشاورزي، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزي، کرج، ایران 

      2.گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران_شمال، تهران، ایران

      3.موسسه تحقيقات برنج کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزي، رشت، ایران

 

چکیده

سابقه و هدف: استفاده از روش‌های علمی برای حل مشکلات مرتبط با علف‌های هرز در کشت برنج می‌تواند روش‌های زراعی را متحول کند، به طوری که نیاز به غرقابی و سیستم‌های کرت‌بندی حذف شود و هزینه‌های تولید به طور قابل توجهی کاهش یابد. این مطالعه بر استفاده از فناوری‌های پیشرفته تمرکز دارد که با ترکیب ژن‌های تحمل به علف‌کش و ژن‌هایی که تحمل به خشکی یا افزایش عملکرد را فراهم می‌کنند، انجام می‌شود. 

مواد و روش‌ها: برای دستیابی به این هدف، یک سازه ژنی چندگانه طراحی شد که ژن تحمل به علف‌کش را در کنار ژن 5OsNAC، مرتبط با تحمل به خشکی، بهبود عملکرد و تغییر ساختار ریشه، در بر داشت. توالی کدکننده ژن 5 OsNAC بهینه‌سازی کدونی شده و تحت کنترل پیش‌بر3RCc و پایان‌بر 17tahsp قرار گرفت و همراه با کاست ژنی EPSPS در ناحیه T-DNA  یک  وکتور مبتنی بر Agrobacterium همسانه‌سازی شد. سازه ژنی حاصل با استفاده از Agrobacterium tumefaciens به برنج منتقل شد و مراحل انتخاب و باززایی به‌طور مستمر انجام گرفت.

يافته‌ها: آنالیز واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از آغازگرهای مختص ژن و سازه، حضور تراژن‌ها را در گیاهان باززایی‌شده در محیط انتخابی تأیید کرد. از این فرآیند، شش رخداد مستقل از انتقال سازه نوترکیب موسوم به 5pUhErN به دست آمد. این رخدادها با استفاده از واکنش PCR معکوس برای تفکیک رخدادهای مستقل و تعیین محل الحاق تراژن در گیاهان مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. 

نتيجه‌گيري: توسعه برنج با قابليت مصرف کمتر آب گامی مهم در جهت مواجهه با محدودیت‌های اقلیمی و منابع کشور است و نقشی کلیدی در حفظ امنیت غذایی و دستیابی به خودکفایی دارد. استفاده از این فناوری‌ها می‌تواند به پایداری تولید برنج در ایران کمک کرده و آن را در برابر چالش‌های محیطی مقاوم‌تر سازد.

 

واژه‌هاي کلیدی: مهندسي ژنتيک برنج، EPSPS،5 OsNAC، انتقال ترکيبي ژن‌ها، کاهش مصرف آب

 

 

 

 

 

 

 

A Novel Approach for Water Conservation and Yield Enhancement in Rice: Genetic Engineering with OsNAC5 and EPSPS Genes

 

Seyyed Mohammad Mousavi pakzad1, Elahe Moatamed1, Nasrin Soltani1, Mohaddeseh Mohsenpour2, Aliakbar Ebadi3, Motahhareh Mohsenpour1*

1. Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran

 2.Department of Microbiology, Faculty of Biology, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

3.Rice Research Institute of Iran (RRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO) Rasht, Iran

Abstract

Introduction: Utilizing scientific approaches to address weed-related challenges in rice cultivation could revolutionize farming methods, eliminating the need for flooded fields and plot-based systems while significantly reducing production costs. This study focuses on leveraging advanced technologies by combining herbicide tolerance genes with genes conferring drought tolerance or yield improvement. 

Methods: To achieve this, a multigenic construct was designed, incorporating a herbicide tolerance gene alongside OsNAC5, a gene associated with drought tolerance, improved yield, and root architecture modification. The coding sequence of OsNAC5 was codon-optimized and placed under the control of the RCc3 promoter and tahsp17 terminator, alongside an EPSPS gene cassette within the T-DNA region of an Agrobacterium-based vector. The resulting genetic construct was introduced into rice using Agrobacterium tumefaciens, followed by continuous selection and regeneration processes.

Results: Polymerase chain reaction (PCR) analysis using gene- and construct-specific primers confirmed the presence of transgenes in regenerated plants grown on selective media. Six independent transformation events of the recombinant construct, recombinant pUhErN5, were obtained. These events were further characterized by inverse PCR to distinguish individual events and identify transgene insertion sites. 

Conclusion: The development of these transgenic rice lines represents a significant step toward addressing the country’s climatic and resource constraints, supporting food security and self-sufficiency. The adoption of such technologies could contribute to the sustainability of rice production in Iran, ensuring resilience against environmental challenges.

Keywords: Rice Genetic Engineering, EPSPS, OsNAC5, Combined Gene Transfer, Reduced Water Use

 

 

 

 

 

 

 

مقدمه

 

عصر مهندسی ژنتیک به مفهوم عصر استفاده از روش‌های زیست‌شناسی مولکولی برای بهبود صفات و ویژگی‌های موجوداتی است که در کشاورزی، پزشکی و محیط زیست استفاده می‌شوند.  استفاده بهينه از آب در کشوري چون ايران که از نظر اقليمي داراي وضعيت خشک تا نيمه خشک است از اهميت ويژه‌اي در گسترش و توسعه فعاليت‌هاي کشاورزي برخوردار است. مبارزه  با علف هرز در مزارع برنج هزينه‌برترين بخش توليد اين محصول استراتژيك است.  در حال حاضر براي مبارزه با علف هرز اقدامات پرهزينه‌‌اي انجام مي‌شود،  مانند لايروبي انهار (براي تقليل جمعيت  بذر علف هرز باقي مانده از سال قبل)، كرت بندي (براي نگهداشتن آب)، غرقاب كردن زمين، تهيه نشا و نشاكاري (لازمه كشت غرقابي است)، استفاده از علف‌كش اختصاصي، وجين دستي.  طغيان علف هرز مي‌تواند موجب خسارت جبران ناپذيري به زراعت برنج شود. اين خسارت ممكن است تا 80 % هم برسد. بنابراين چنانچه بتوان معضل علف‌هرز را به نحو مطلوبي حل کرد مي‌توان تحولي در روش کشت برنج ايجاد کرد که  نيازمند   غرقابي و کرت‌بندي مزارع برنج نباشد.  با توجه به معضل خشکي در کشور و محدوديت آب از يک  طرف و توليد برنج با سيستم زراعي متداول در ايران (غرقابي) که نيازمند آب فراواني است از طرف ديگر، ايجاد واريته‌هاي متحمل به خشکي براي نيل به خود‌کفايي در اين محصول ضروري است.  کشت مستقیم برنج راه خوبی برای صرفه‌جویی در مصرف آب است.  مهمترین چالش در این سیستم کشت، کنترل علف‌های هرز است. روش‌های سنتی کنترل علف‌های هرز در برنج شامل وجین‌دستی است،  اما  به دلیل کمبود نیروی  کار در زمان بحرانی وجین و افزایش هزینه‌های نیروی کار،  این روش با مشکلاتي همراه است و در سطح زياد جوابگو نيست. علف‌کش‌ها نقش کلیدی در کنترل علف‌های هرز دارند و امروزه به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرند(1).

برنج از جنبه فيزيولوژيك نياز چنداني به آب ندارد. دو دليل اصلي براي توليد غرقابي برنج عنوان شده است. دليل اول كنترل علف هرز از طريق غرقابي و كشت نشايي است (4-2) و دليل دوم خنثي كردن pH خاك است (4).  در واقع چنانچه برنج اين دو مشكل را نداشته باشد كشت غير غرقابي آن هم از جنبه كيفي (عطر و طعم) و هم از جنبه كمي توليد برتري خواهد داشت. ايجاد ارقام مهندسي شده متحمل به علفکش گليفوسيت با انتقال ژن EPSPS که در مقايسه با علف‌کش‌هاي رايج، ايمن و کاراست قدم اول در کاهش مصرف آب در کشت برنج خواهد بود.

نویسنده مسئول: استادیار ، بخش مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی کرج، ایران آدرس الکترونیک: [e-mail] تاریخ دریافت مقاله: ۰۳/۰۹/۱۴۰۳ تاریخ پذیرش: ۲۲/۰۹/۱۴۰۳

دربرنج ۱۴۰ ژن NAC (NAM-ATAF-CUC) رديابي شده است و تحقيقات نشان داده‌اند که ۱۸ مورد آنها در شرايط استرس القاء مي‌شوند. گزارش‌ها نشان مي‌دهد بيان در سطح زیاد 5 OsNAC  قطر ريشة برنج را افزايش داده و منجر به تحمل خشکي و افزايش عملکرد دانه در مزرعه مي‌شود(5). بيان   بالاي تنظيم كنندة رونويسي 9OsNAC و  5OsNAC قطر بافت آئرانشيم و استل ريشه در رقم Nipponbare را افزايش داده و ريشه‌هاي سبک و قطورتري توليد مي‌کند. ميزان محصول نهايي در اين گياهان در شرايط تنش خشكي بين ۲۰ تا ۷۰ % در مقايسه با شاهد افزايش نشان داده است(6و7).  همچنين بیش بیان ژن5OsNAC، تحمل به خشکی، شوری و دمای پایین در گیاهان تراریخته را افزایش مي‌دهد(8).  تاکاساکی و همکاران گزارشي با بیش بیان5OsNAC که يک   عامل رونویسی است، عملکرد این ژن را در تحمل به خشکی هم با روش خاموشي ژن توسط آر‌ان‌اي مداخله‌گر (RNAi) و هم با استفاده از بیش بیان آن در آرابیدوپسیس و برنج تراریخته مورد بررسی قرار دادند. بیش بیان5OsNAC تحت کنترل پيشبرهاي مختص ریشه در گیاه برنج، تحمل به خشکی و شوری را در طول مرحله رشد رویشی بهبود داد و مهم‌تر اينکه بیش بیان اين ژن در ریشه   به طور معنی‌داری تحمل به خشکی را در مرحله باردهی از طریق رشد ریشه‌های طويل با افزایش عملکرد دانه افزايش داد. ژن 5OsNAC همراه   با ABA نقش مهمی در حرکت دوباره Zn، Fe و آمینواسید‌ها از برگ  به بذر‌ها دارد(9).  بیش بیان 5OsNAC در گیاهان برنج منجر به انباشت پرولین و قندهای محلول و همچنین مقدار کمتر MDA (Malondiahdehyde) و H2O2 می‌شود. این تغییرات متابولیکی گیاهان را از کاهش آب و آسیب اکسیداتیو در شرایط تنش محافظت می‌کنند. بنابراین، 5OsNAC  تحمل به تنش در برنج را بدون ایجاد نقایص در رشد بهبود می‌بخشد(8 و10). علاوه بر اين بیان 5OsNAC ، با افزایش قطر ریشه برنج، سبب افزایش مقاومت به خشکی و افزایش بازده محصول در مزرعه می‌شود(6).  تاکنون ژن‌هاي مختلفي براي تغيير ساختار ريشه برنج مورد بررسي قرار گرفته‌اند(14-11، 5).  بهبود سیستم ریشه و توانایی جذب آب  بالا می‌تواند کلیدی برای توسعه ارقام برنج مناسب برای سیستم‌هاي کشاورزی مبتني بر صرفه‌جویی آب باشد. هدف از اين تحقيق انتقال ژن‌هاي EPSPS و 5OsNAC ايجادکننده تحمل  به علف‌کش و تحمل به خشکي به منظور صرفه‌جويي در مصرف آب و افزايش عملکرد در كشت برنج است.

 

مواد و روش‌ها

ساخت سازه چند ژني حاوي ژن‌هاي NRT و EPSPS

 

طراحي سازه‌هاي ژني با استفاده از نرم افزار 1Vector NT (Invitrogen) انجام شد. واکنش اتصال ابتدا در حامل‌ همسانه‌‌سازي تحت پيشبر مختص ريشه 3RCc در مورد ژن 5OsNAC بهينه سازي شده کدوني (15) انجام و سپس در حامل‌ دوگانه مختص انتقال ژن با واسطه اگروباکتريوم حاوي ژن نشانگر انتخابي مقاومت به هيگرومايسين قرار داده شد. مخلوط اتصال به سلول‌هاي مستعد تهيه شده از E. coli سوية Blue-1XL منتقل شد و روي محيط انتخابي LB حاوي ۵۰ ميلي‌گرم بر ليتر اسپکتينومايسين و ۱۰۰ ميلي‌گرم بر ليتر استرپتومايسين رشد داده شد. اثبات تراريختي پس از استخراج پلاسميد از کلوني‌هاي حاصل، با استفاده از هضم آنزيمي و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انجام گرفت. کليه مراحل همسانه‌‌سازي و آناليزهاي مولکولي با استفاده از دستورالعمل‌هاي سمبروک و همکاران (1989) انجام شد(16).  پلاسميد نوترکيب حاصل پس از تاييد، به روش آن و همکاران (1986) به اگروباکتريوم سويه 105EHA منتقل شد(17).

 

مواد گياهي و انتقال ژن

 

بذور برنج رقم هاشمی (دريافت شده از موسسه تحقيقات برنج رشت) براي انتقال ژن مورد استفاده قرار گرفتند. دو تا سه روز قبل از انجام هم‌کشتی،  باکتري بر روی محیط کشت LB همراه با آنتی‌بیوتیک‌های مناسب (۷۵ميلي‌گرم در ليتر ريف‌آمپيسين، ۱۰۰ ميلي‌گرم در ليتر استرپتومايسين و ۵۰ ميلي‌گرم در ليتر اسپکتينومايسين) کشت خطی شد. یک ساعت قبل از انجام هم‌کشتیِ با آگروباکتریوم، حدود یک لوپ پُر آگروباکتریوم از محیط LB برداشته و درون محیط تلقيح حاوی استوسیرینگون سوسپانسيون شد. چگالی نوری (OD600nm) باکتری روی ۳/۰ تنظیم شد. محلول تلقيح به مدت یک ساعت درون انکوباتور تاریک 25 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا برای انتقال ژن آماده شود. سپس حدود ۵ میکرولیتر از محلول آگروباکتریوم حاوي پلاسميد روی ريزنمونه‌ها چکانيده شد. ريزنمونه‌ها حدود ۷ روز در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد در انکوباتور تاریک   تلقیح شدند. پس از انجام هم­کشتی با آگروباکتریوم، ريزنمونه‌ها به محیط کشت استراحت منتقل شدند و در دمای ۳۰ درجه سانتی­گراد و نور مداوم به مدت 5 روز قرار داده شد. پس از رشد کالوس‌ها به اندازه مناسب در محیط استراحت، آنها به محیط کشت انتخابی حاوي هيگرومايسين (۵۰ميلي‌گرم در ليتر) منتقل شدند. کالوس‌های مقاوم جنین‌زا در محیط کشت انتخابی به محیط کشت پیش ‌باززایی منتقل و ۱۵ روز در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. کالوس­های مناسب دارای نقاط سبز رنگ در محیط کشت پیش باززایی انتخاب و به محيط باززايي و سپس به ترتيب به محيط يوشيدا و گلدان منتقل شدند. جزئيات بهينه‌سازي کشت بافت و انتقال ژن و محيط‌هاي کشت در "دستورالعمل فني باززايي بذر رسيده برنج با هدف انتقال ژن توسط آگروباکتريوم" با شماره فروست ۶۴۱۹۵، در پژوهشگاه بيوتکنولوژي کشاورزي توسط مجري و همکاران به چاپ رسيده است (34).

 

 

 

آنالیزهای مولکولی 

 

گياهاني که در کليه مراحل باززايي در محيط انتخابي حاوي هيگرومايسين زنده مانده و رشد کردند پس از استخراج دی‌ان‌ای ژنومی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي مختص ژن، مختص سازه و ناحيه‌اي از ژنوم برنج (100RG) به عنوان ژن کنترل داخلي آناليز شدند.

تفکيک رخدادها و تعيين محل الحاق تراژن در ژنوم برنج با استفاده از روش واکنش زنجيره‌اي پليمراز معکوس بهينه شده در پژوهشگاه بيوتکنولوژي کشاورزي (18) انجام شد. باند حاصل توالي‌يابي شد و تحت آناليز بيوانفورماتيک براي تعيين دقيق محل الحاق قرار گرفت. 

 

 

يافته‌ها

طراحي و ساخت سازه‌ها

 

قرار گرفتن کاست ژني 5OsNAC (بهينه‌سازي کدوني شده بر اساس نتايج قبلي(19) در کنار کاست ژني EPSPS در ناحيه T-DNAي سازه آگرباکتريومي با هضم آنزيمي و PCR تاييد شد.  سازه‌ نوترکيب حاصل موسوم به 5pUhErN حاوي ژن EPSPS تحت پيشبر يوبي‌کوئيتين و پايانبر NOS و 5OsNAC تحت پيشبر 3RCc و پايانبر 17Tahsp (از منشاء گندم) در ناحيه T-DNA سازه آگروباکتريومي است که اين کاست‌هاي ژني در خلاف جهت کاست ژني مقاومت به هيگرومايسين قرار دارند (شکل ۱).  سازه چند ژني حاصل مي‌تواند با استفاده از اگروباکتريوم براي تحمل به علف‌کش و بهبود ساختار ريشه و عملکرد در گياهان    به ويژه در تک لپه‌اي‌ها مورد استفاده قرار گيرد.

 

 

انتقال ژن

 

کالوس ­هایی   که      به احتمال تراژن‌ها را دريافت کرده بودند در محیط انتخابی حاوي ۵۰ ميلي گرم در ليتر هيگرومايسين دوام آورده و شروع به رشد کردند و همچنین کالوس­هایی که به عنوان شاهد غیرتراریخته در کنار کالوس­های تراریخته احتمالي قرار گرفتند از بین رفتند. به تدريج روند سبز شدن و باززايي کالوس­های جنین‌زا آغاز و توليد گياهچه کردند و سپس گیاهچه‌های مستقل در محيط ريشه‌زايي، ريشه‌دار شدند. آنتی­بیوتیک هیگرومایسین در تمامي مراحل تا قبل از انتقال گياهان به يوشيدا مورد استفاده قرار گرفت. انتقال گياهچه‌هاي کامل آنها به محلول يوشيدا انجام شد. پس از استقرار گیاهچه­های باززا شده در محلول یوشیدا به مدت یک ماه، این گیاهان آمادگی انتقال به خاک را پیدا کردند و تحت شرايط کنترل شده درگلخانه تراريخته پژوهشگاه بيوتکنولوژي کشاورزي تا مرحله بذرگيري و انجام آناليزهاي تکميلي نگهداري شدند.

 

 

آناليزهاي مولکولي

 

واکنش زنجيره‌اي پليمراز چندگانه مختص ژن و سازه

 

آناليز PCR با استفاده از آغازگرهای مختص سازه و ناحيه‌اي از ژنوم برنج (100RG) به عنوان شاهد داخلي براي گياهان تراريخته احتمالي که در مراحل انتخابي زنده مانده  و باززاشده بودند، انجام شد. مشاهده باند حدود bp1600 که ژن EPSPS را از ناحيه کدکننده پپتيد نشانه کلروپلاستي تا پايانبر NOS تکثير مي‌کند، حضور اوليه ژن را در گياهان تراريخته احتمالي اثبات کرد  (شکل ۲-ا). به منظور طراحي آغازگرهاي مناسبي که بتوان با استفاده از آنها بين تراژن و ژن مشابه داخلي تمايز قائل شد، آغازگرهاي 5OsNAC پس از هم رديفي توالي بهينه‌سازي شده کدوني با توالي اوليه طوري طراحي شدند که آغازگر داراي نوکلئوتيد متفاوت از نوکلئوتيدهاي تشکيل دهنده ژن داخلي در انتهاي ҆ 3  باشد (شکل ۲-ب).

 

شناسايي محل الحاق تراژن‌ها در ژنوم برنج رخداد حاصل از سازه سه ژني

 

نتايج واکنش PCR معکوس تفکيک رخدادهاي مورد بررسي را اثبات کرد (شکل ۳-ا). محل الحاق تراژن در پنج رخداد از شش رخداد حاصل از انتقال سازه 5pUhErN که هر دو ژن EPSPS و 5OsNAC را دريافت کرده بودند تعيين شد. آناليزهاي بيوانفورماتيک نشان داد در کروموزوم‌هاي شماره ۴، ۶، ۹ و در دو مورد کروموزوم شماره ۸ محل الحاق ناحيه T-DNA بودند که در سه رخداد در جهت مرز راست (RB) به مرز چپ (LB) و در دو رخداد به صورت مرز چپ به مرز راست الحاق صورت گرفته بود. نماي شماتيک و لوکوس ژني محل الحاق رخدادها در شکل ۲-ب نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

شکل ۱. نماي شماتيک ناحيه T-DNA سازه‌هاي نوترکيب 5pUhErN طراحي و ساخته شده در اين تحقيق.

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل۲. نتايج آناليز واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مختص سازه براي تعدادي از لاين‌هاي برنج حاصل از انتقال سازه 5pUhErN.

a. نتايج PCR چندگانه با استفاده از آغازگرهای مختص سازه (Gt-F و NOS-R) باند مورد انتظار bp1617 را در لاين‌هاي برنج تراريخته نشان داد و به صورت همزمان نمونه‌ها باند حدود bp950 مربوط به قطعه‌اي از ژنوم برنج (100RG) را نيز به عنوان کنترل داخلي نشان دادند؛ b. استفاده از آغازگرهای مختص ژن 5OsNAC باند مورد انتظار bp357 را در لاين‌هاي برنج تراريخته نشان داد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل ۳. نتايج PCR معکوس براي اثبات تفکيک رخدادهاي حاصل از انتقال سازه نوترکيب 5pUhErN.

a. تفکيک رخدادهاي برنج به روش SUN-iPCR؛ b. تعيين محل الحاق تراژن.

 

M، نشانگر اندازه وزن ملکولي (1Kb Plus-Biofact company)؛ W، کنترل بدون الگو (آب)؛ N، گياه شاهد غيرتراريخته به عنوان کنترل منفي؛ P، پلاسميد 5pUhErN (کنترل مثبت)؛ T، گياه تراريخته (حاوي ژن منفرد به دست آمده از طرح) به عنوان کنترل مثبت؛ ساير چاهک‌ها گياهان نسل 2Tحاصل از انتقال سازه نوترکيبpUhENRT .

 

 

جدول 1. رخدادهاي حاصل از سازه نوترکيب 5pUhErN.

کد تراريختي	سازه	رخداد	کد رخداد	محل الحاق T-DNA
M۰۰۴	pUhErN۵	۱	۰۶-E-rN۵-۰۱
M۰۰۷	pUhErN۵	۱	۰۶-E-rN۵-۰۱
M۰۲۵	pUhErN۵	۱	۰۶-E-rN۵-۰۱
M۰۶۰	pUhErN۵	۱	۰۶-E-rN۵-۰۱
M۰۱۶	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲	Chr.۸: ۲۱۷۱۸۹۰۴
M۰۲۳	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲
M۰۳۳	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲
M۰۳۸	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲	Chr.۸: ۲۱۷۱۸۹۰۴
M۰۴۳	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲	Chr.۸: ۲۱۷۱۸۹۰۴
M۰۴۴	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲
M۰۴۷	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲
M۰۸۶	pUhErN۵	۲	۰۶-E-rN۵-۰۲
M۰۰۲	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴: ۳۰۰۸۶۰۵۲ RB/LB
M۰۱۵	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴: ۳۰۰۸۶۰۵۲RB/LB
M۰۲۶	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴: ۳۰۰۸۶۰۵۲RB/LB
M۰۲۷	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴: ۳۰۰۸۶۰۵۲RB/LB
M۰۳۲	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴: ۳۰۰۸۶۰۵۲RB/LB
M۰۸۲	pUhErN۵	۳	۰۶-E-rN۵-۰۳	Chr.۴:۳۰۰۸۶۰۵۲ RB/LB
M۰۵۹	pUhErN۵	۴	۰۶-E-rN۵-۰۴	Chr.۶:۸۳۶۱۸۸, RB/LB
M۰۲۰	pUhErN۵	۵	۰۶-E-rN۵-۰۵
M۰۵۳	pUhErN۵	۵	۰۶-E-rN۵-۰۶	Chr۸: ۵۵۵۰۶۱۹LB/RB
M۰۱۲	pUhErN۵	۶	۰۶-E-rN۵-۰۶
M۰۲۱	pUhErN۵	۶	۰۶-E-rN۵-۰۶	Chr۹: ۳۳۷۵۰۳۶

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رخدادهاي حاصل در جدول ۱ خلاصه شده‌اند و خالص‌سازي آنها در حال انجام است. محل الحاق تراژن‌ها در دو رخداد (رخدادهاي شماره ۲ و ۵) حاصل که در کروموزوم شماره ۸ و هر دو در جهت LB به RB الحاق شده بودند، نواحي بين ژني تعيين شد. محل الحاق اين دو رخداد حدود ۱۶هزار باز با يکديگر اختلاف داشت و بنابراين مستقل بودن آنها با اطمينان اثبات شد. الگوي  باندي PCR معکوس نيز تفکيک اين دو رخداد را نشان داده بود. اين در حالي است که يکسان بودن الگوي باندي مشابه گياهان داراي کد تراريختي 016M، 038M و 043 Mکه بر اساس اطلاعات مراحل انتقال ژن نيز يک رخداد درنظر گرفته شده بودند دسته‌بندي آنها به عنوان رخداد شماره ۲ را با  اطمينان اثبات کرد. نتايج آناليز بيوانفورماتيک و الگوي باندي گياهان داراي کد تراريختي 002M، 015M، 026M، 027M، 032M و 082M را که حضور تراژن‌ها را در لوکوس يکساني از کروموزوم شماره ۴ به صورت LB به RB نشان مي‌دادند نيز باعث شد علاوه بر اطلاعات انتقال ژن با اطمينان بتوان اين گياهان را به عنوان رخداد شماره ۳ دسته بندي کرد. اين  لوکوس (۳۰۰۸۶۰۵۲) در اينترون سيزدهم ژني به نام                                                                              

 Os04t :0596500-02 Translation elongation factor EFTu/EF1A , C-terminal domain containing protein

رخدادهاي شماره 4 و 6 نيز درناحيه اينتروني ژن‌هايي در کروموزوم شماره 6 و 9 الحاق شده اند. چندين مشاهده الحاق در ناحيه اينتروني و عدم تاثير آن در رشد و باروري گياهان حاصل مي‌تواند اينطور تفسير شود که ژن موجود در ژنوم برنج که ناحيه T-DNA در اينترون آن الحاق مي‌شود، رونويسي شده و در اسپيلايسينگ پس از حذف اينترون‌ها و از جمله اينترون حاوي T-DNA بتواند mRNAي صحيح را تشکيل داده و مشکلي براي ترجمه پيش نيايد. از طرفي الحاق تراژن‌ها در يک ناحيه فعال از نظر رونويسي نيز مي‌تواند جالب  توجه باشد.

 

 

بررسي ايمني پروتئين حاصل از تراژن NAC5

 

توالي پپتيدي 5OsNAC مورد استفاده در اين تحقيق با طول ۳۲۹ اسيد آمينه در پايگاه AllergenOnline مورد بررسي قرار گرفت. آناليز ۲۵۰ قطعه ۸۰ اسيدآمينه‌اي در کل توالي اين پروتئين شباهت بالاي   35% با هيچ آلرژني نشان نداد (شکل ۴-a).  ولي آناليز ۳۲۲ قطعه پپتيد ۸ اسيدآمينه‌اي اين توالي با يک آلرژن دانه گرده منطبق شد (شکل ۴-b). آناليز کل توالي نيز شباهت بيش از ۵۰ درصد به آلرژن‌ها نشان نداد. اين ژن در تحقيق حاضر تحت پيشبر اختصاصي ريشه منتقل شده است و انتظار بر اين است در ساير بافت‌هاي گياهي بيان نشود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل ۴. نتايج پايگاه AllergenOnline براي بررسي احتمال آلرژي‌زايي پروتئين حاصل از تراژن NAC5.

 

استفاده از پيشبر مختص ریشه براي جلوگيري از اثرات ناخواسته بيان دائمي ژن‌ 5OsNAC بر محصول، مطلوب خواهد بود. تاييد تحمل به علف‌کش، بهبود صفات ريشه و اثر آنها بر عملکرد محصول نياز به آزمايشات مزرعه‌اي و بررسي دقيق فنوتيپ ريشه در مقايسه با شاهد در آزمايشات تکميلي و به ويژه بررسي تحمل به خشکي خواهند داشت.

بحث

 

تولید و استفاده از سازه‌هاي چندژني برای ایجاد گياهان تراریخته در مراحل آزمايشگاهي در گياهاني چون برنج، توتون، پنبه، گوجه فرنگي، گندم، سويا و جلبک در ايران انجام شده است (25-20).  ايرانيان در توليد برنج تراريخته پيشتاز بوده‌اند(26 و 27).  همچنين انتقال ژن 1DRO در کنار ژن­هاي 5OsNAC و 8OsEXPA (15) و نيز انتقال ژن 1PSTOL و 1OsDRO (28) براي بهبود ساختار ريشه، تحمل به خشکي و بهبود جذب عناصر غذايي گياه برنج و نيز انتقال دو ژن 4OsCKX و 1OsDRO (29) در کشور تا مرحله گلخانه­اي انجام شده است. انتقال همزمان ژن‌هاي 1PSTOL، 4OsCKX و 5OsNAC نيز به همين منظور گزارش شده است (30).  برای بهبود صفات مختلف در گیاهان انتقال همزمان چندین ژن داراي اهميت است و روش موثري است که مي‌تواند اصلاح صفات مورد نظر را تسهيل کرده و زمان رسیدن به هدف مورد نظر برای بهبود صفات گیاهان و اصلاح آنها را کاهش دهد. در گزارش Ye و همکاران (2000)، انتقال همزمان سه ژن دخیل در سنتز ویتامین آ به برنج منجر به افزايش ارزش غذايي آن و تولید این ویتامین در آندوسپرم برنج شد (31).  همچنين انتقال همزمان دو ژن دخیل در بهبود فرایند بیوسنتز لیگنین در درختان جنگلی موجب افزایش کارایی این سیستم در درختان شد(32). استفاده از روش‌هاي اصلاح سنتي در محصولات زراعی، به دلیل انتقال تعداد زيادي از ژن‌هاي نامطلوب به همراه ژن مورد نظر، ممکن است منجر به کاهش کیفیت محصول ­شود. به علاوه این روش­ها  زمان­بر و پر هزينه هستند. در پی انتقال دو ژن در تحقيق حاضر به رقم تجاری برنج هاشمی که مرغوبیت بالایی از نظر عطر و طعم دارد، انتظار بر این است که گياهان تراريخته حاصل از نظر بازارپسندی، مانند همتاي غيرتراريخته خود باشند. به منظور تایید این مساله، آزمايش­های اينهماني و بررسي صفات کيفي پس از خالص­سازی انجام خواهد شد. همچنين بررسي‌هاي ايمني‌زيستي تضمین بهره‌برداری از فواید قطعی بیوتکنولوژی مدرن و مدیریت آثار جانبی احتمالی کاربرد این فناوری را در پي داشته و استفاده از مزاياي مهندسي ژنتيک در جهت امنيت غذايي را در پي دارد (33).  در اين تحقيق دو ژن کانديد موثر در تحمل به علف‌کش و تحمل به خشکي به برنج رقم هاشمي منتقل شد. تاکنون انتقال همزمان اين دو ژن گزارش نشده است. چنانچه بتوان معضل علف‌هرز را در مزارع برنج به نحو مطلوبي حل کرد مي‌توان تحولي در روش کشت برنج ايجاد کرد که نيازمند غرقابي و کرت‌بندي مزارع برنج نباشد. مهندسي ژنتيک از فناوري‌هاي‌ ارزشمند براي حل معضل علف‌هرز، بهبود عملکرد، بهبود جذب عناصر غذايي است. اميد است پژوهش حاضر گام اوليه موثري جهت توليد گياهان برنج متحمل به علف‌کش به منظور کاهش مصرف آب در کشاورزي و بهبود عملکرد در کشور باشد.

 

 

 

 

 

 

نتيجه‌گيري

 

برنج، به‌عنوان یکی از محصولات استراتژیک کشاورزی، نقش حیاتی در امنیت غذایی ایران دارد. اما محدودیت‌های منابع آبی، خشکی و تغییرات اقلیمی، تولید پایدار این محصول را با چالش‌های جدی مواجه کرده است. روش سنتی تولید برنج که بر پایه کشت غرقابی استوار است، نیازمند مصرف بالای آب بوده و دلایل اصلی آن شامل کنترل علف‌های هرز و خنثی‌سازی pH خاک است. این در حالی است که برنج از نظر فیزیولوژیکی نیازی به این حجم آب ندارد. تغییر روش کشت برنج از غرقابی به کشت مستقیم به‌عنوان راهکاری مؤثر برای کاهش مصرف آب و بهبود بهره‌وری مطرح است. این تحقیق بر ایجاد ارقام برنج تراریخته با تحمل به علف‌کش و تحمل به خشکي متمرکز بود. با استفاده از مهندسی ژنتیک، ژن‌های EPSPS و 5OsNAC به برنج رقم هاشمی منتقل شدند که يک رقم که داراي محبوبيت و متناسب با ذائقه ايراني و بازارپسند در ايران است. ژن EPSPS به گیاه توانایی مقاومت در برابر علف‌کش گلیفوسیت را می‌دهد و به کاهش استفاده از علف‌کش‌های مضر و پرهزینه کمک می‌کند. ژن  5OsNAC  نيز در تحمل به خشکي و بهبود ساختار ريشه نقش دارد. سازه‌های نوترکیب این ژن‌ها با پیش‌بر یوبیکویتین و پایان‌بر 17Tahspدر ناحیه T-DNA سازه آگروباکتریومی طراحی و به برنج منتقل شدند. گياهان حاصل مي‌توانند به کاهش نیاز به کشت غرقابی کمک کنند.

 

 

تشکر و قدرداني

 

بدين‌وسيله از پژوهشگاه بيوتکنولوژي کشاورزي به دليل حمايت مالي در قالب طرح تحقيقاتي شماره ۹۸۰۱۰-۰۱۹-۰۵-۰۵-۰۱ تقدير و تشکر مي‌شود. همچنين با گراميداشت ياد و خاطره استاد بزرگوار جناب آقاي دکتر قره‌ياضي که تجربيات ارزشمند خود را بي‌دريغ در اختيار قرار دادند علو درجات اين استاد گرانقدر را از درگاه پروردگار عليم مسئلت داريم.

 

 

Reference

 

1.         Dehghannezhad H, Zaefarian F, Abbasi R, Nouralizadeh Otaghsara M. weed management methods in direct-seeded rice (Oryza sativa L.). J Crop Prod [Internet]. 2023;16(4):21–40. Available from: https://ejcp.gau.ac.ir/article_6784.html

2.         Bayer DE, Hill JE, Seaman DE. Rice (Oryza sativa). In: Principles of Weed Control in California Fresno, CA: California Weed Conf. 1985. p. 262–8.

3.         Monaco TJ, Weller SC, Ashton FM. Weed science: principles and practices. John Wiley & Sons; 2002.

4.         Sahrawat KL. Soil fertility in flooded and non-flooded irrigated rice systems. Arch Agron Soil Sci. 2012;58(4):423–36.

5.         Wu W, Cheng S. Root genetic research, an opportunity and challenge to rice improvement. F Crop Res. 2014;165:111–24.

6.         Jeong JS, Kim YS, Redillas MCFR, Jang G, Jung H, Bang SW, et al. OsNAC5 overexpression enlarges root diameter in rice plants leading to enhanced drought tolerance and increased grain yield in the field. 2013;10:101–14.

7.         Redillas MCFR, Jeong JS, Kim YS, Jung H, Bang SW, Choi YD, et al. The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions. Plant Biotechnol J. 2012;10(7):792–805.

8.         Takasaki H, Maruyama K, Kidokoro S, Ito Y, Fujita Y, Shinozaki K, et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice. Mol Genet Genomics. 2010;284(3):173–83.

9.         Sperotto RA, Ricachenevsky FK, Duarte GL, Boff T, Lopes KL, Sperb ER, et al. Identification of up-regulated genes in flag leaves during rice grain filling and characterization of OsNAC5, a new ABA-dependent transcription factor. Planta. 2009;230(5):985–1002.

10.         Song S-Y, Chen Y, Chen J, Dai X-Y, Zhang W-H. Physiological mechanisms underlying OsNAC5-dependent tolerance of rice plants to abiotic stress. Planta. 2011;234(2):331–45.

11.         Arai-Sanoh Y, Takai T, Yoshinaga S, Nakano H, Kojima M, Sakakibara H, et al. Deep rooting conferred by DEEPER ROOTING 1 enhances rice yield in paddy fields. Sci Rep. 2014;4:5563.

12.         Rogers ED, Benfey PN. Regulation of plant root system architecture: Implications for crop advancement. Curr Opin Biotechnol [Internet]. 2015;32(Figure 1):93–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2014.11.015

13.         Zhang T-Q, Chen Y, Liu Y, Lin W-H, Wang J-W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nat Commun. 2021;12(1):1–12.

14.         Kawai T, Shibata K, Akahoshi R, Nishiuchi S, Takahashi H, Nakazono M, et al. WUSCHEL-related homeobox family genes in rice control lateral root primordium size. Proc Natl Acad Sci. 2022;119(1):e2101846119.

15.         Zandi M, Hosseini R, Mohsenpour M, HOSSEINI SG, Ghareyazie B. Transformation of DRO1, OsNAC5, OsEXPA8 genes in order to improve rice root architecture modification and improved drought tolerance in rice. 2019;

16.         Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press; 1989.

17.         An G, Watson BD, Chiang CC. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system. Plant Physiol. 1986;81(1):301–5.

18.         Chamani Mohasses F, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Entesari M, Bidadi H, Molaahmad Nalousi A, et al. Efficient genetic transformation of rice using Agrobacterium with a codon-optimized chromoprotein reporter gene (ChromoP) and introducing an optimized iPCR method for transgene integration site detection. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2024;156(1):5.

19.         Chamani Mohasses F, Solouki M, Ghareyazie B, Fahmideh L, Mohsenpour M. Correlation between gene expression levels under drought stress and synonymous codon usage in rice plant by in-silico study. PLoS One. 2020;15(8):e0237334.

20.         Mohammadizadeh N, Tohidfar M, Mohsenpour M. Agrobacterium-Mediated Transformation of Wheat (Triticum Aestivum) Using Chitinase and Glucanase Genes. 2010;

21.         Raufi A, Tohidfar M, Soluki M, Mohsenpour M. Isolation and Cloning of Two Genes from PR1 Family and Construction of Treble Plasmids Containing 3 Groups of Genes for Producing Transformed Plants Resistant to Fungal Diseases. J Agric Biotechnol. 2012;3(2):27–46.

22.         Mohsenpour M, Tohidfar M, Jelodar NB, Jouzani GS. Designing a new marker-free and tissue-specific platform for molecular farming applications. J Plant Biochem Biotechnol. 2015;24(4).

23.         Mohkami A, Marashi H, Shahriary Ahmadi F, Tohidfar M, Mohsenpour M. Evaluation of Agrobacterium-mediated Transformation of Chlamydomonas reinhardtii using a Synthetic amorpha-4, 11-diene Synthase Gene. J Cell Mol Res. 2015;7(1):53–8.

24.         Mohsenpour M, Tohidfar M. Genetic Engineering of Plant Nuclear Genome for Specific gene Expression in Chloroplast Using Design and Transformation of Hybrid Sigma Factor. Crop Biotechnol. 2011;

25.         Saboori-Robat E, Solouki M, Habashi AA, Moshenpour M, Emamjomeh A. Design and construction of two-genes construct consists of 11 kDa delta zein and EPSPS genes in order to transform soybean to improve the methionine content and induce resistance to glyphosate herbicide. Crop Biotechnol. 2019;9(27):69–77.

26.         Ghareyazie B, Alinia F, Menguito CA, Rubia LG, De Palma JM, Liwanag EA, et al. Enhanced resistance to two stem borers in an aromatic rice containing a synthetic cryIA(b) gene. Mol Breed. 1997;3(5):401–14.

27.         Bennett J, Cohen MB, Katiyar SK, Ghareyazie B, Khush GS. Enhancing insect resistance in rice through biotechnology. Adv insect Control role transgenic plants. 1997;75–93.

28.         Kazemi M, Ghorbanzadeh Z, Pourhang L, Mousavi pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Rice genetic engineering using transformation of Deeper Rooting1 and Phosphorus-Starvation Tolerance1 genes. Agric Biotechnol J [Internet]. 2022;14(1):1–20. Available from: https://jab.uk.ac.ir/article_3211.html

29.         Ghorbanzadeh Z, Kazemi Alamouti M, Pourhang L, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Identificatioan and investigation of DRO1 gene in rice cultivar Hashemi and its simultaneous transfer with OsCKX4 gene to improve root structure. Crop Biotechnol [Internet]. 2022;11(36):49–62. Available from: https://cropbiotech.journals.pnu.ac.ir/article_8590.html

30.         Pourhang L, Ghorbanzadeh Z, Kazemi Alamuti M, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Multi-gene transformation evaluation of a serine/threonine protein kinase with a gene from the cytokinin oxidase/dehydrogenase family and a transcription factor induced under stress from the NAM-ATAF-CUC family to rice. Modares J Biotechnol. :0.

31.         Ye X, Al-Babili S, Klöti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, et al. Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science (80- ). 2000;287(5451):303–5.

32.         Li L, Zhou Y, Cheng X, Sun J, Marita JM, Ralph J, et al. Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees through multigene cotransformation. Proc Natl Acad Sci. 2003;100(8):4939–44.

33.         Mohsenpour M, Kahak S, Ghareyazie B. Genetic Engineering and Food Security. Strateg Res J Agric Sci Nat Resour [Internet]. 2018;3(2):195–208. Available from: http://srj.asnr.ias.ac.ir/article_112926.html

34. https://agrilib.areeo.ac.ir/book_11874.html