Manuscript ID : jknm-1203915 Visit : 61 Page: 1 - 15

Article Type: Original Research

Screening and cloning of the gene encoding dextranase enzyme from soil Streptomyces for use in dental cases

Subject Areas :

Ashkan Goodarzi ¹ , kumarss amini ^{2
*} , Mohaddeseh Larypoor ³

1 - islamic azad university tehran north branch
2 - Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran
3 - Department of Microbiology, North Branch of Islamic Azad University, Tehran, Iran

Received: 2024-10-21 Accepted : 2024-12-12 Published : 2025-04-14

Keywords:

Abstract :

References:

Full-Text:

غربالگری و کلونینگ ژن کد کننده آنزیم دکستراناز از استرپتومایسسهای خاک جهت استفاده در موارد دندان پزشکی

اشکان گودرزی1، کیومرث امینی2‌*، محدثه لاری پور3

1. دانشجوی دکتری،گروه میکروبیولوژی، دانشکده ی علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران

2. استاد تمام، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران

3. دانشیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده ی علوم زیستی، دانشگاه آزاد تهران شمال، تهران،ایران

چکیده

مقدمه: دکستراناز یکی از مهم‌ترین آنزیمهای درمانی و صنعتی است. به دلیل اهمیت و کاربرد گسترده این آنزیم، هدف از این مطالعه تعیین مولکولی ،کلونینگ و کینتیک آنزیم دکستراناز از استرپتومایسسهای خاک جهت استفاده در دندان پزشکی بود.

روش کار: پس از شناسایی و انجام تستهای بیوشیمیایی و مولکولی، استرپتومایسسهای خاک جداسازی شدند. از طریق واکنش PCR سویههای استرپتومایسس دارای ژن آنزیم دکستراناز مشخص شدند. اسیدیته و دمای بهینه به منظور تولید دکستراناز نیز تعیین گردید. ژن دکستراناز سویههای مثبت از طریق وکتور به باکتری میزبان اشرشیا کلی الحاق و از طریق تکنیک TA کلونینگ کلون شد. در پایان از طریق تکنیک Real Time PCR، بیان ژن دکستراناز در اشرشیا کلی XL1blue سنجیده شد.

نتایج: از غربالگری نمونه های خاک که بر اساس خصوصیات مورفولوژیک و بیوشیمیایی تعیین هویت شدند، در مجموع 12 ایزوله استرپتومایسس جداسازی شد. از 12 ایزوله تنها 3 ایزوله استرپتومایسس کویلیکالر دارای ژن دکستراناز بودند. اسیدیته بهینه دکستراناز 2/5 و دمای بهینه در محدوده 65-55 درجه سانتیگراد تعیین شد. صحت کلونینگ از طریق کلنی سلکشن، PCR و توالییابی محصول PCR تایید شد. نتایج Real time PCR نیز بیان ژن دکستراناز را در باکتری اشریشیا کلی XL1blue تایید نمود.

نتیجهگیری: نتایج این تحقیق نشان داد بررسی استرپتومایسس خاک بدلیل پتانسیل بالا در توليد دکستراناز، این سویه میتواند زمینهساز مطالعات آینده باشد و میتوان این ایزولهها را به عنوان کاندیدای مناسبی در طراحی و ساخت سویههای تولید کنندهی آنزیم معرفی نمود.

واژگان کلیدی: استرپتومایسس خاک، دکستراناز، کلونینگ

Screening and cloning of the gene encoding dextranase enzyme from soil Streptomyces for use in dental cases

Ashkan Gooderzi1‌, Kiumarss Amini2*, Mohaddeseh Larypoor3

1. PhD. student, Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran

2. Full Professor, Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran

3. Associate Professor, Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, North Tehran Azad University, Tehran, Iran
Abstract

Introduction: This study aimed to explore the molecular, cloning, and kinetic properties of the dextranase enzyme produced by Streptomyces isolated from soil, for potential applications in dentistry. Dextranase is an enzyme that breaks down dextran, a polysaccharide, and is important in both therapeutic and industrial fields, including use in blood substitutes, vasodilators, and the sugar industry.

Methods: Microbial enzymes, such as those from soil bacteria, are preferred over plant and animal-derived enzymes due to their variety, lower cost, and greater stability. Soil bacteria, in particular, are abundant sources of biologically active compounds with minimal toxicity, making them suitable for human treatment.

Results: The study isolated 12 Streptomyces strains from soil samples. After biochemical and molecular analysis, three strains, identified as Streptomyces quilicolor, were found to contain the dextranase gene. The optimal conditions for dextranase production were determined to be a pH of 5.2 and a temperature range of 55-65°C. The dextranase gene was successfully cloned into Escherichia coli using a TA cloning technique, and its expression was confirmed through Real-Time PCR.

Conclusion: The results suggest that Streptomyces from soil, with its high potential for dextranase production, could serve as a valuable resource for future industrial and therapeutic applications. The isolated strains are promising candidates for the development of efficient dextranase-producing strains, particularly for use in dental treatments and other clinical fields.

Key words: Soil Streptomyces, Dextranase, Cloning

مقدمه

نویسنده مسئول: استاد تمام، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ساوه

آدرس الکترونیک: Dr_kumarss_amini@yahoo.com

تاریخ دریافت مقاله: ۳۰/۰7/۱۴۰۳

تاریخ پذیرش: ۲۲/۰۹/۱۴۰۳

باکتريها متابولیتهاي ثانويه را براي دفاع در برابر میکروارگانیسمهاي ديگر تولید میکنند و اين متابولیتهاي ثانويه به عنوان منبعی از ترکیبات فعال زيستی براي استفاده هاي درمانی در انسان عمل مینمایند. آنزيمهاي میکروبی نسبت به آنزيمهاي مشتق شده از منابع گیاهی و جانوري مزيتهايی دارند که از آن جمله میتوان به تنوع فعالیتهاي کاتابولیکی، هزينه ارزانتر، منابع فراوان، مستمر و حتی کمیت و پايداري نسبی بیشتر آنها اشاره نمود. باکتري هاي خاکزی آنزيم هاي متفاوتی را بر اساس زيستگاه و ساختار اکولوژيکیشان تولید میکنند. از آنجايی که خاک به طور طبیعی مملو از باکتریهای مختلف میباشد، بنابراين محصولات میکروبی خاک به ويژه آنزيمها، ايمنی بیشتر و سمیتزايی سلولی کمتري داشته و در مجموع براي کارهاي درمانی در انسان مناسبتر میباشند. میکروارگانیسمهاي خاک منابع عظیم و پايداري براي استحصال ترکیبات فعال بیولوژيکی هستند (1). دکستراناز (E.C.3.2.1.11α-d-glucan-6-glucanohydrolase-1,6) یک آنزیم القایی است و میتواند به طور خاص، اندوهیدرولیز پیوندهای α-(1,6)-d- گلیکوزید را در مکانهای تصادفی دکستران کاتالیز کند. محصولات اصلی شامل ایزومالتوز، ایزومالتوتریوز، مقادیر کمی دی گلوکز و مجموعهای از پلی ساکاریدهای با جرم مولکولی کم میباشند (2). دکستراناز به طور گسترده در تولید دکسترانهای بالینی خاص استفاده شده است (3, 4). مولکول‌های دکستران تولید شده توسط دکستراناز با جرم مولکولی متوسط با وزن نسبتاً کم ۲۰ تا ۷۰ کیلو دالتون می‌توانند به عنوان گشاد کننده عروق خونی استفاده شوند و مولکول‌های با جرم مولکولی ۶ تا ۸ کیلو دالتون می‌توانند کمپلکس‌هایی با آهن برای درمان کم‌خونی شدید تشکیل دهند (5). در کاربردهای بالینی، دکستران بالینی خاص تولید شده توسط دکستراناز میتواند به عنوان یک جایگزین خون در مواقع اضطراری استفاده شود. در صنعت قند، از دکستراناز برای رفع شفافیت و بازده ضعیفی که دکستران میتواند در آب نیشکر ایجاد کند استفاده شده است (6-8). شایان ذکر است که این آنزیم را میتوان با دکستران تجاری برای سنتز مستقیم ایزومالتوز و ایزومالتوالیگوساکاریدهایی که اثرات پریبیوتیکی از خود نشان می دهند، استفاده نمود (6). گزارشهای قبلی پیشنهاد کرده است که دکستراناز ممکن است قادر به درمان پلاکهای دندانی باشد. از آنجایی که دکستراناز میتواند به طور موثر دکستران را در پلاکهای دندانی تجزیه کند، استفاده از این آنزیم به روشی موثر برای درمان پوسیدگی دندان تبدیل شده است (7, 9-11). به همین دلیل، استفاده از دکستراناز برای درمان پوسیدگی دندان، به ویژه با توجه به تخریب دکستران در پلاک های دندانی، توجه زیادی را به خود جلب کرده است (12-14). سلول‌های باکتریایی بیوفیلم‌هایی را به‌عنوان یک سد محافظ در برابر شرایط خارجی تشکیل می‌دهند و به عنوان مکانیسمی برای بهبود بقا و پراکندگی عمل می‌کنند (15). استرپتوکوکوس موتانس عامل اصلی پوسیدگی دندان در دندانهای انسان و تعدیل کننده کلیدی توسعه بیوفیلمهای پوسیدگیزا است. تجمع این باکتری پوسیدگیزا در بیوفیلم ممکن است منجر به شروع التهاب پریودنتال شود (16, 17). بنابراین، برداشتن بیوفیلم درمان اصلی التهاب پریودنتال است. دکستراناز قلیایی ممکن است برای درمان پوسیدگی دندان مناسب باشد زیرا انتظار می‌رود محصولات قلیایی دندان‌شویه نسبت به محصولات اسیدی با مینای دندان سازگارتر باشند. علاوه بر این، دکستراناز در دمای حدود ۳۷ درجه سانتیگراد به طور موثر عمل میکند و همچنین ممکن است به تخریب پلاکهای دندانی انسان کمک کند (18). در حال حاضر باکتریها و قارچها دو منبع اصلی برای تولید دکستراناز هستند (19). دکسترانازهای باکتری معمولاً پایداری حرارتی مطلوبی دارند اما فعالیت دکستراناز نسبتاً کمی دارند. با این حال، قارچ‌ها، رایج‌ترین منبع دکستراناز، دکسترانازهای اسیدی و مگاگرمی تولید می‌کنند که در مقادیر اسیدیته از ۵ تا ۵/۶ و دمای بالای ۵۰ درجه سانتی‌گراد کاتالیز می‌کنند و در شرایط قلیایی ناپایدار هستند. دکسترانازها به ندرت قادر به کاتالیز در شرایط قلیایی و دمای متوسط هستند (6). در تحقیق حاضر تلاش شد تا باکتریهای استرپتومایسس تولید کننده دکستراناز از منابع خاک جداسازی شده و سپس ژن کد کنندهی دکستراناز جهت افزایش تولید این آنزیم، کلون گردد.

مواد و روشها

نمونه برداری و جداسازی استرپتومایسس از خاک

نمونه برداری از خاک بر اساس مطالعات مشابه (۲۰) و همچنین فرمول کوکران، از ۵ ایستگاه در تهران انجام شد و از هر ایستگاه ۱۲ نمونه خاک از سطح تا عمق 5 سانتی متری جمع آوری شد. جداسازی استرپتومایسس با روش هایاکاوا و نونومورا انجام شد (21). برای این منظور ۱۰۰ میکرولیتر از هر مقدار از رقت‌های نهایی روی سطح هیومیک اسید-ویتامین آگار (اسید هیومیک محلول در آگار باکتریولوژیک ۲۰ گرم، MgSO4 ۵/۰ گرم، Na2HPO4 ۵ گرم، CaCO3 ۲/۰ گرم، اسید هیومیک ۱۰گرم، KCL ۲۰ گرم، سیکلوهگزیماید ۵ گرم و آب مقطر ۱ لیتر) کشت داده شد. پلیت های کشت شده در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد در تاریکی تا اسپوراسیون کلنیهای باکتری به مدت دو هفته انکوبه شدند. کلنی های باکتری بر اساس ویژگی های مورفولوژیکی با میکروسکوپ نوری شناسایی شدند. کلنی های نماینده استرپتومایسس برداشته شدند و روی پلیتهای آگار Bennet تازه (گلوکز ۱۰ گرم، عصاره مخمر ۱ گرم، پپتون ۲ گرم، عصاره گوشت گاو ۱ گرم، آگار باکتریولوژیک ۲۰ گرم و آب مقطر ۱ لیتر) کشت داده شد تا کلنی‌های استرپتومایسس خالص‌ به دست آمد (22).

تعیین هویت جدایههای باکتریایی مشکوک به استرپتومایسس

در خصوص تعیین هویت جدایههای باکتریایی از خصوصیات ماکروسکوپی کلنی ، خصوصیات میکروسکوپی (رنگآمیزی گرم)، تستهای بیوشیمیایی و شناسایی مولکولی استفاده شد. تستهای بیوشیمیایی شامل تست حرکت، ایندول، متیل رد، VP، سیترات، تولید پیگمان، هیدرولیز ژلاتین، احیای نیترات، اکسیداز، کاتالاز، هیدرولیز کازئین، هیدرولیز نشاسته، تست سوکروز و تست تولید SH2 بودند. در نهایت جهت تایید نهایی، شناسایی مولکولی نیز انجام گردید. برای این منظور از پرایمرهای عمومی برای تکثیر 16srDNA (پرایمر 8F و 1541R) به روش PCR استفاده گردید (23). سپس محصول PCR پس از ارزیابی کمی و کیفی با روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۵/۱ درصد، به منظور توالییابی برای شرکت Bioneer ارسال گردید و نتیجه سکانس در دیتابیس NCBI، BLAST شد تا سویهی مذکور شناسایی گردد.

جداسازی باکتریهای تولید کننده دکستراناز

جهت مشخص کردن ایزولههایی که توانایی تولید آنزیم دکستراناز را داشتند، از واکنش PCR با استفاده از پرایمر اختصاصی برای ژن کد کنندهی دکستراناز استفاده گردید. پرایمرها با استفاده از نرمافزار Primer3 طراحی شدند و با بلاست در پایگاه داده NCBI صحت عملکرد آنها ارزیابی شد. توالی پرایمر رفت و برگشت به ترتیب5’-GAATCCATGCAGACTCTCCTTGTGAGC-3’ و5’-AGGCTTTCACTGCATGGAAGCATAATC-3’ بود. سپس واکنش PCR با یک دناتوراسیون اولیه به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد، ۳۵ سیکل شامل دناتوراسیون به مدت ۳۰ ثانیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد، انلینگ به مدت ۴۰ ثانیه در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد و گسترش به مدت ۶۰ ثانیه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد و در نهایت یک چرخه گسترش نهایی به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد.

سنجش فعالیت آنزیم

فعالیت دکستراناز با تعیین سرعت هیدرولیز دکستران اندازه گیری شد. مخلوط واکنش مورد استفاده در سنجش دکستراناز حاوی ۱ میلی‌لیتر دکستران ۲ درصد در بافر استات ۲۰ میلی‌مولار(اسیدیته 2/5 ) ۲۰ میکرولیتر (۸/۰ میکروگرم) از محلول آنزیمی رقیق‌شده مناسب بود. پس از تسهیل تجزیه آنزیمی دکستران در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه، قندهای احیاکننده آزاد شده با استفاده از روش ۳،۵-دی نیتروسالیسیلیک اسید تعیین شدند. یک واحد (1 U) از فعالیت آنزیم به عنوان مقدار آنزیمی تعریف شد که بازده دکستران را هیدرولیز کرد و قندهای احیا کننده معادل ۱ میکرومول از مالتوز در دقیقه تحت شرایط فوق مورد ارزیابی قرار گرفتند (24).

تعیین شرایط بهینه فعالیت دکستراناز

تأثیر اسیدیته در محدوده ۹-۳ و در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه با استفاده از ۲/۰% دکستران به عنوان سوبسترا مورد ارزیابی قرار گرفت (24). اثر دما با انکوبه کردن دکستراناز در اسیدیته بهینه آن (۲/۵) در دماهای مختلف (از ۲۰ تا ۸۵ درجه سانتی گراد) به مدت ۱۰ دقیقه با استفاده از دکستران ۲/۰% به عنوان سوبسترا مورد بررسی قرار گرفت (24). شایان ذکر است مقدار دکستراناز با منحنی استاندارد گلوکز تعیین گردید.

کلون کردن ژن دکستراناز در باکتری اشریشیا کلی xl1blue

به منظور کلونینگ سریعتر و موثرتر محصول PCR از روش TA-Cloning (سیناکلون-ایران) استفاده شد. در این روش از یک وکتور خطی بنام PTG19-T که در انتهای ´3 آن باز تیمین قرار دارد استفاده می شود. این وکتور بعلاوه دارای ژن LacZ بمنظور غربالگری سفید/آبی، پرایمر M13 برای PCR و توالی یابی و آنزیم محدود کننده BamH1 می باشد. مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده، اتصال محصول PCR در وکتور کلونینگ PTG19-T انجام شد. سپس وکتور به میزبان اشرشیا کلی xl1blue انتقال یافت. پس از ترانسفورماسیون، باکتری روی پلیت LB آگار کشت داده شده و به مدت ۱ الی ۲ روز در 37 درجه سانتی گراد انکوبه و در نهایت صحت کلونینگ از طریق غربالگری سفید/آبی تایید گردید. همچنین با استفاده از پرایمر M13 که در وکتور وجود داشت، یک واکنش PCR برای تایید نهایی کلونینگ انجام شد (25).

بررسی بیان ژن دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده

با استفاده از واکنش real time-PCR بیان ژن دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده ارزیابی گردید. برای این منظور در حجم 20 میکرولیتر با استفاده از کیت SMOBIO LOT:IQ11002108901 کره جنوبی انجام شد. برای این منظور ۱۰ میکرولیتر از Prime Qmaster mix (2x) with syber green ، 5 میکرولیتر از DEPC water، ۱ میکرولیتر از پرایمر فوروارد، ۱ میکرولیتر از پرایمر ریورس، ۱ میکرولیتر از Rox dye و ۲ میکرولیتر از cDNA استفاده شد. تکثیر قطعههای مورد نظر در دستگاه BIO-RAD با برنامه دناتوراسیون اولیه ۹۵ درجه سانتی گراد برای ۱ دقیقه، تکثیر شامل ۹۵ درجه سانتی گراد برای ۳۰ ثانیه، ۵۹ درجه سانتی گراد برای مدت ۴۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی گراد برای ۶۰ ثانیه در ۳۵ چرخه انجام شد. از ژن بتا اکتین به عنوان کنترل داخلی تست استفاده شد (26).

یافته ها

غربالگری نمونههای خاک به منظور جداسازی استرپتومایسس

از غربالگری نمونه های خاک ارسالی به آزمایشگاه که بر اساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تستهای بیوشیمیایی تعیین هویت شدند در مجموع ۱۲ ایزوله استرپتومایسس جداسازی شد. از کلنی های مشکوک به استرپتومایسس رنگ آمیزی گرم انجام و از لحاظ وجود باکتریهای رشتهای گرم مثبت بررسی شدند. بررسی نتایج تست های بیوشیمیایی مورد نظر در خصوص تعیین هویت جدایه ها نیز در جدول ۱ ذکر شده است.

جدول 1- نتیجه تست های بیوشیمیایی جهت شناسایی جنس استرپتومایسس

تستهای بیوشیمیایی	رنگ آمیزی گرم	متیل رد	VP	سیترات	هیدرولیز نشاسته	هیدرولیز کازئین	احیای نیترات	اکسیداز	کاتالاز
نتایج	+	-	-	+	متفاوت در ایزولهها	+	-	+	+

شناسایی مولکولی ایزولههای استرپتومایسس

برای رسم درخت فیلوژنی از نرم‌افزار clustalX و Mega5 استفاده شد. در این مرحله از روش neighbor joining برای رسم درخت استفاده گردید. بررسی درخت فیلوژنی گونههاي مورد مطالعه و مقایسه با گونه هاي مشابه، روابط فیلوژنی بین گونههاي استرپتومایسس با استفاده از ژن 16SrDNA مورد بررسی قرار گرفت. نتایج درخت فیلوژنی به روش پیوند همجواري (NJ) نشان داد که گونه مورد بررسی با بوت استرپ ۱۰۰۰ و شباهت بالاي ۹۹ درصد، استرپتومایسس کویلیکالر میباشد (شکل ۱).

شکل ۱- درخت فیلوژنی رسم شده بر اساس توالی ژن 16SrDNA (گونه مورد مطالعه با دایره قرمز نشان داده شده است)

نتیجه آزمون PCR به منظور شناسایی ایزولههای دارای ژن دکستراناز

واکنش PCR برای ژن دکستراناز با پرایمرهای اختصاصی انجام شد. نتایج حاصل نشان داد که از ۱۲ سویه استرپومایسس جدا شده، ۳ سویه استرپتومایسس کویلیکالر واجد ژن دکستراناز بودند (شکل ۲).

شکل ۲- نتیجه PCR ژن های دکستراناز، C+: کنترل +، C-: کنترل منفی، نمونه1 و نمونه2: ژن دکستراناز مثبت، M: مارکر bp 100

اثرات اسیدیته و دما بر فعالیت آنزیم

اثرات اسیدیته و دمای واکنش بر فعالیت آنزیمی در محدوده اسیدیته از ۳ تا ۹ و محدوده دمایی ۲۰ تا ۸۵ درجه سانتیگراد با استفاده از دکستران به عنوان سوبسترا مورد بررسی قرار گرفت. اسیدیته بهینه دکستراناز تقریباً ۲/۵ بود و بیش از ۸۵ درصد از حداکثر فعالیت آن در محدوده اسیدیته برابر با ۶-۴ مشاهده شد (شکل 3-الف). دکستراناز حداکثر فعالیت را در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد نشان داد و بیش از ۸۵ درصد از حداکثر فعالیت خود را در محدوده دمایی ۶۵-۵۵ درجه سانتی گراد نشان داد (شکل ۳-ب).

الف

شکل ۳- فعالیت آنزیم دکستراناز در اسیدیته های مختلف (الف) و در دماهای مختلف (ب)

تایید کلونینگ ژن دکستراناز

پس از کلون کردن ژن دکستراناز، توسط کلنی سلکشن (آبی/سفید) سویه های کلون شده جداسازی شدند ( شکل ۴-الف). همچنین با استفاده از واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصی M13 که در وکتور وجود داشت، حضور وکتور در باکتریها تایید گردید (شکل ۴-ب). محصول PCR توالی یابی شده و در نهایت با بلاست توالی محصول PCR در پایگاه داده NCBI، حضور ژن دکستراناز در باکتری اشریشیا کلی xl1blue تایید شد (شکل ۴-ج).

$C:\Users\marzieh\AppData\Local\Temp\Rar$DIa0.319\blue white colony.jpg$

الف

۴- تایید کلونینگ ژن آنزیم دکستراناز در باکتری اشریشیا کلی از طریق کلنی سلکشن (الف)، واکنش PCR اختصاصی با پرایمر M13(ب) و بلاست توالی محصول PCR در پایگاه داده NCBI (ج) (در شکل ب +: کنترل مثبت، -: کنترل منفی، S: باکتری ترانسفورم شده).

بررسی بیان ژن دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده به منظور اطمینان از بیان ژن دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده، RNA کلنیها استخراج شده و پس از سنتز cDNA، با تست Real time PCR میزان بیان ژن دکستراناز در آنها بررسی گردید (شکل ۵). همان طور که در شکل 5 مشاهده میگردد در باکتریهای ترانسفورم شده بیان دکستراناز مشاهده میگردد در حالی که در باکتری کنترل منفی که ترانسفورم نشده بود، بیان مشاهده نشد. همچنین از خود باکتری استرپتومایسس کویلیکالر به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید و دادهها با آن نرمالایز شد. همانطور که مشاهده میشود بیان دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده نسبت به استرپتومایسس کویلیکالر بیشتر بود.

شکل ۵- بیان ژن دکستراناز در باکتری ترانسفورم شده در مقایسه با باکتری ترانسفورم نشده و سویهی استرپتومایسس کویلیکالر

بحث

با توجه به کاربردهای گستردهی آنزیم دکستراناز در پزشکی و صنعت، جداسازی این آنزیم از منابع میکروبی توجه محققان را به خود جلب کرده است. در تحقیق حاضر از منابع خاک جهت غربالگری باکتریهای استرپتومایسس تولید کنندهی دکستراناز استفاده گردید. در ابتدا 12 ایزولهی استرپتومایسس بر اساس ویژگیهای مورفولوژی و بیوشیمیایی جداسازی شدند و ارزیابی مولکولی نیز گونههای استرپتومایسس کویلیکالر را تایید نمود. در مرحلهی بعد واکنش PCR اختصاصی نشان داد که از این ۱۲ ایزوله، ۳ ایزوله دارای ژن دکستراناز میباشند. فعالیت آنزیمی در اسیدیته ها و دماهای مختلف بررسی شد و اسیدیته بهینه ۲/۵ و دمای بهینه در محدوده 65-55 درجه سانتیگراد برای دکستراناز تعیین شد. سپس ژن کد کنندهی دکستراناز به باکتری اشریشیا کلی وارد شد و مشخص گردید که ژن مذکور در باکتری ترانسفورم شده بیان میگردد. تحقیقات قبلی در مورد دکسترانازها بیشتر بر روی جهش (19)، غربالگری (27)، ساخت باکتری های دستکاری شده ژنتیکی (28, 29)، بهینه سازی محیط تخمیر (30) و شرایط تخمیر (31) و خواص خالص سازی و آنزیمی متمرکز شده بود (32-34)، در حالیکه در مطالعه حاضر به بررسی بیان ژن دکستراناز پرداخته شد. مطالعات کمی در مورد چگونگی تنظیم جرم مولکولی دکستران در طول تولید وجود دارد. از آنجایی که جرم مولکولی دکستران تا حد زیادی کاربرد آنها را تعیین می کند، یافتن راهی کارآمد برای کنترل این پارامتر ضروری است. هدف از مطالعه حاضر تعیین مولکولی، کلونینگ و کینتیک آنزیم دکستراناز از استرپتومایسسهای خاک جهت استفاده در دندان پزشکی بود. Ren و همکاران (2018) توانایی یک دکستراناز از یک باکتری دریایی به نام کاتینوولوم را ارزیابی کردند. آنها نشان دادند که یک دکستراناز قلیایی و سازگار با دمای پایین به نام کادیکس توسط این باکتری تولید میشود که میتواند برای جلوگیری از تشکیل بیوفیلمهای استرپتوکوکوس موتانس، یک پاتوژن اولیه در پوسیدگی دندان، استفاده شود. در این تحقیق نشان داده شد که کادکس دارای فعالیت ویژه U/mg ۲۳۰۹ و وزن مولکولی ۷۵ کیلو دالتون بود. کادکس حداکثر فعالیت را در اسیدیته برابر ۸ و دمای ۴۰ درجه سانتیگراد نشان داد و در دماهای زیر ۳۰ درجه سانتیگراد و اسیدیته بین ۵ تا ۱۱ نیز پایدار بود. در این گزارش بیان شده است که چندین معرف محصول شستشوی دندان، از جمله کربوکسی بنزن، اتانول، سدیم فلوراید و زایلیتول هیچ تاثیری بر فعالیت کادکس نداشتند (3). در مطالعهای Park و همکاران (2012) یک دکستراناز به نام TPDex را از ترموانیروباکتر سودوتانولیکوس جداسازی کردند. آنها نشان دادند که TPDex دارای جرم مولکولی ۷۰ کیلو دالتون و فعالیت آنزیمی U/mg ۷۳۷ میباشد. اسیدیته بهینه آن ۲/۵ بود و آنزیم در اسیدیته بین ۱/۳ و ۵/۸ در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد پایدار بود. TPDex بدون توجه به انواع دکستران، از جمله دکستران T۲۰۰۰، دکستران CB۷۴۲، و آلترنان، فعالیت دکستراناز وسیعی را نشان داد. TPDex بالاترین پایداری حرارتی را در بین دکسترانازهای مشخص شده نشان داد و میتواند آنزیمی مناسب برای استفاده در تولید قند بدون کاهش دما باشد (35).

دکستراناز تولید شده توسط لیپومایسس استارکیوز توسط KOENIG و DAY جداسازی گردید. آنزیم خالص شده چهار باند را روی ژل SDS/PAGE با جرم تخمینی ۷۴ کیلو دالتون، ۷۱ کیلو دالتون، ۶۸ کیلو دالتون و ۶۵ کیلو دالتون نشان داد. چندین نقطه ایزوالکتریک بین ۶/۵ و۱1/۶ نشان داده شد که تمام اشکال ایزوالکتریک فعال و از نظر کاتالیستی مشابه بودند. دکستراناز حاوی یک بخش کربوهیدرات (۸٪) بود. فعالیت بهینه آنزیم در اسیدیته برابر ۵ مشاهده شد با این حال این دکستراناز بین اسیدیته ۵/۲ و ۷ در دماهای کمتر از ۴۰ درجه سانتیگراد نیز پایدار بود (36).

Abdel-Naby و همکاران (1999) تولید دکستراناز در کشت استاتیک پنی سیلیوم فانیکولوسوم ۲۵۸ را مورد بررسی قرار دادند. حداکثر فعالیت آنزیم در اسیدیته برابر ۸ به دست آمد. آنها آنزیم را بر روی حاملهای مختلف با تکنیک های متفاوت تثبیت کردند. آنزیم تهیه شده با اتصال کووالانسی روی کیتوزان با استفاده از گلوتارآلدئید دارای بالاترین فعالیت بود و تا ۶۳ % از فعالیت ویژه اولیه خود را در مقایسه با دکستراناز آزاد حفظ کرد. آنزیم تثبیت شده اسیدیته بهینه، دمای واکنش بهینه، انرژی فعال سازی، ثابت میکائیلیس بالاتر و پایداری حرارتی بهبود یافته و همچنین مقادیر بالاتر ثابت نرخ غیرفعال سازی را نشان داد.

آنزیم تثبیت شده حدود ۸۰ % از فعالیت کاتالیزوری اولیه را حتی پس از ۱۲ دوره استفاده، حفظ کرد (37). با توجه به مطالعاتی که به آنها اشاره شد مشخص میگردد که تلاش برای یافتن دکسترانازهایی با بیشترین فعالیت آنزیمی یکی از موضوعات مورد توجه محققان بوده است و سویههای میکروبی مختلف تا کنون توانایی متفاوتی را در تولید انواع دکستراناز نشان دادهاند. در تحقیق حاضر نیز باکتری مولد ژن دکستراناز از بستر خاک جدا و ژن مورد نظر تخلیص شد و از طریق وکتور 19Ptg، الحاق ژن به باکتری اشرشیا کلیxl1blue صورت گرفت و کلونینگ انجام شد. کلونینگ در واقع برای افزایش تولید آنزیم مذکور انجام شد تا بتوان سویههای مهندسی شدهی تولید کنندهی دکستراناز با توانایی بالا رو توسعه داد.

نتیجه گیری

با توجه به شرايط ويژه حاکم بر خاک بخش اعظمی از آن دست نخورده است و میکروارگانیسمهايی که در آن زندگی میکنند قادر به تولید متابولیتهاي ثانويه منحصر به فردي هستند که اين متابولیتها میتوانند براي فعالیتهاي خاصی به کار روند. در این مطالعه با ارزیابی پتانسیل ضد میکروبی استرپتومایسسهای جدا شده از بستر خاک تهران، باکتری استرپتومایسس به عنوان منبع غنی از آنزیم دکستراناز معرفی و به عنوان یک سویه بومی به منظور تولید آنزيم دکستراناز شناخته شد. نتایج این تحقیق نشان داد استرپتومایسس خاک به دلیل پتانسیل بالا در توليد دکستراناز، میتواند زمینه ساز مطالعات آینده باشد و با مطالعه بیشتر متابولیتهای فعال استرپتومایسس های خاک میتوان گامی پیشرو در جهت توسعه آنزیمهای موثر برای درمان بیماری های عفونی ناشی از میکروارگانیسمهای مقاوم و درمان پوسیدگی های حاصل از میکروب های بیماریزا برداشت. در مطالعه حاضر تولید آنزيم دکستراناز از طریق وکتور نوترکیب و TAکلونینگ صورت گرفت و مطالعات بعدی می تواند در راستای بهینه سازی شرایط مختلف برای تولید این آنزیم باشد.

Reference

1. Himmel ME, Xu Q, Luo Y, Ding S-y, Lamed R, Bayer EA. Microbial enzyme systems for biomass conversion: emerging paradigms. Biofuels. 2010;1(2):323-41.

2. Bashari M, Eibaid A, Wang J, Tian Y, Xu X, Jin Z. Influence of low ultrasound intensity on the degradation of dextran catalyzed by dextranase. Ultrasonics Sonochemistry. 2013;20(1):155-61.

3. Ren W, Cai R, Yan W, Lyu M, Fang Y, Wang S. Purification and characterization of a biofilm-degradable dextranase from a marine bacterium. Marine drugs. 2018;16(2):51.

4. Shahid F, Aman A, Nawaz MA, Karim A, Ul Qader SA. Chitosan hydrogel microspheres: an effective covalent matrix for crosslinking of soluble dextranase to increase stability and recycling efficiency. Bioprocess and biosystems engineering. 2017;40(3):451-61.

5. Chan YJ, Chong MF, Law CL. An integrated anaerobic–aerobic bioreactor (IAAB) for the treatment of palm oil mill effluent (POME): Start-up and steady state performance. Process Biochemistry. 2012;47(3):485-95.

6. Khalikova E, Susi P, Korpela T. Microbial dextran-hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications. Microbiology and molecular biology reviews. 2005;69(2):306-25.

7. Ren W, Wang S, Lü M, Wang X, Fang Y, Jiao Y, et al. Optimization of four types of antimicrobial agents to increase the inhibitory ability of marine Arthrobacter oxydans KQ11 dextranase mouthwash. Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2016;34(2):354-66.

8. Wang D, Lu M, Wang S, Jiao Y, Li W, Zhu Q, et al. Purification and characterization of a novel marine Arthrobacter oxydans KQ11 dextranase. Carbohydrate Polymers. 2014;106:71-6.

9. Walker GV, Heng NC, Carne A, Tagg JR, Wescombe PA. Salivaricin E and abundant dextranase activity may contribute to the anti-cariogenic potential of the probiotic candidate Streptococcus salivarius JH. Microbiology. 2016;162(3):476-86.

10. Qiu Y-x, Mao M-y, Jiang D, Hong X, Yang Y-m, Hu T. Co-operative effect of exogenous dextranase and sodium fluoride on multispecies biofilms. Journal of Dental Sciences. 2016;11(1):41-7.

11. Marotta M, Martino A, De Rosa A, Farina E, Cartenı M, De Rosa M. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes. Process Biochemistry. 2002;38(1):101-8.

12. Eggleston G, Monge A. Optimization of sugarcane factory application of commercial dextranases. Process Biochemistry. 2005;40(5):1881-94.

13. Bowler G, Wones S. Application of dextranase in UK sugar beet factories. Zuckerindustrie. 2011;136(12):780-3.

14. Park T-S, Jeong H-J, Ko J-A, Ryu Y-B, Park S-J, Kim D-M, et al. Biochemical characterization of thermophilic dextranase from a thermophilic bacterium, Thermoanaerobacter pseudethanolicus. Journal of microbiology and biotechnology. 2012;22(5):637-41.

15. Bertrand E, Pierre G, Delattre C, Gardarin C, Bridiau N, Maugard T, et al. Dextranase immobilization on epoxy CIM® disk for the production of isomaltooligosaccharides from dextran. Carbohydrate polymers. 2014;111:707-13.

16. Purushe S, Prakash D, Nawani NN, Dhakephalkar P, Kapadnis B. Biocatalytic potential of an alkalophilic and thermophilic dextranase as a remedial measure for dextran removal during sugar manufacture. Bioresource technology. 2012;115:2-7.

17. Goulas AK, Cooper JM, Grandison AS, Rastall RA. Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans in a recycle membrane bioreactor by the combined use of dextransucrase and dextranase. Biotechnology and bioengineering. 2004;88(6):778-87.

18. Majeed A, Grobler SR, Moola MH. The pH of various tooth-whitening products on the South African market: scientific. South African Dental Journal. 2011;66(6):278-81.

19. Wang X, Lu M, Wang S, Fang Y, Wang D, Ren W, et al. The atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) method on the dextranase activity and structure. International journal of biological macromolecules. 2014;70:284-91.

20. Dehnad A, Esmaili E, Solouki M. Isolation and molecular identification chitinase-producing Streptomyces strains and examination of their in-vitro antagonistic effects. Biological Journal of Microorganism. 2015;4(15):123-34.

21. Hayakawa M, Nonomura H. Humic acid-vitamin agar, a new medium for the selective isolation of soil actinomyces. J Ferment Tech. 1987;65:501–9.

22. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA. Medical microbiology E-book: Elsevier Health Sciences; 2020.

23. Frank JA, Reich CI, Sharma S, Weisbaum JS, Wilson BA, Olsen GJ. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and environmental microbiology. 2008;74(8):2461-70.

24. Erhardt FA, Stammen S, Jördening H-J. Production, characterization and (co-) immobilization of dextranase from Penicillium aculeatum. Biotechnology letters. 2008;30(6):1069-73.

25. Kang HK, Kim SH, Park JY, Jin XJ, Oh DK, Soo Kang S, et al. Cloning and characterization of a dextranase gene from Lipomyces starkeyi and its expression in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2005;22(15):1239-48.

26. García B, Rodríguez E. Carbon source regulation of a dextranase gene from the filamentous fungus Penicillium minioluteum. Current Genetics. 2000;37(6):396-402.

27. Cai R, Lu M, Fang Y, Jiao Y, Zhu Q, Liu Z, et al. Screening, production, and characterization of dextranase from Catenovulum sp. Annals of microbiology. 2014;64(1):147-55.

28. Crawford B, Kasmidi M, Korompis F, Pollnac RB. Factors influencing progress in establishing community-based marine protected areas in Indonesia. Coastal Management. 2006;34(1):39-64.

29. Kim Y-M, Kim D. Characterization of novel thermostable dextranase from Thermotoga lettingae TMO. Applied microbiology and biotechnology. 2010;85(3):581-7.

30. Li K, Lu H, Hang F, Li S, Liu J. Improved dextranase production by Chaetomium gracile through optimization of carbon source and fermentation parameters. Sugar Tech. 2017;19(4):432-7.

31. Zohra RR, Aman A, Zohra RR, Ansari A, Ghani M, Qader SAU. Dextranase: hyper production of dextran degrading enzyme from newly isolated strain of Bacillus licheniformis. Carbohydrate polymers. 2013;92(2):2149-53.

32. Smith KV, Loughran J, Berry A, Dimitrakopoulos C. Developing scientific literacy in a primary school. International Journal of Science Education. 2012;34(1):127-52.

33. Sufiate BL, Soares FEdF, Moreira SS, Gouveia AdS, Cardoso EF, Braga FR, et al. In vitro and in silico characterization of a novel dextranase from Pochonia chlamydosporia. 3 Biotech. 2018;8(3):1-9.

34. Matt C, Hess T, Benlian A. Digital transformation strategies. Business & information systems engineering. 2015;57(5):339-43.

35. Park TS, Jeong HJ, Ko JA, Ryu YB, Park SJ, Kim D, et al. Biochemical characterization of thermophilic dextranase from a thermophilic bacterium, Thermoanaerobacter pseudethanolicus. J Microbiol Biotechnol. 2012;22(5):637-41.

36. KOENIG D, DAY D. The purification and characterization of a dextranase from Lipomyces starkeyi. European journal of biochemistry. 1989;183(1):161-7.

37. Abdel-Naby MA, Ismail A-MS, Abdel-Fattah AM, Abdel-Fattah AF. Preparation and some properties of immobilized Penicillium funiculosum 258 dextranase. Process Biochemistry. 1999;34(4):391-8

Share To

Article Url

Screening and cloning of the gene encoding dextranase enzyme from soil Streptomyces for use in dental cases