The Status of Broiler Farms in Terms of the Distribution Pattern of Resistant Escherichia coli Bacteria and Resistance Genes to Fluoroquinolone Antibiotics Using Polymerase Chain Reaction (PCR) Method

Subject Areas : Journal of Animal Biology

Dariush Behzadpour ¹ , Kaveh Madhoush ² , Behzad Kaviani ^{3 *} , Seyyed Mohammad Reza Tabatabaei Mehr ⁴

1 - anDepartment of Veterinary Medicine, Rasht Branch, Islamic Azad University, Rasht, Ir
2 - Technical Manager of Health Monitoring System Laboratory, Rasht, Iran
3 -
4 - Department of Veterinary Medicine, Rasht Branch, Islamic Azad University, Rasht, Iran

Received: 2025-02-18 Accepted : 2025-05-12 Published : 2025-07-02

Keywords: Drug resistance genes, Poultry, The spread of antibiotic resistance, Polymerase chain reaction,

Abstract :

Poultry colibacillosis is one of the most common pathogens in poultry and antibiotics play a significant role in controlling this disease. The aim of the present study was to study the frequency of Escherichia coli bacteria in broiler chickens in Guilan province and investigate the pattern of drug resistance due to the horizontal transfer of genes through plasmid-type resistance genes to quinolones and the detection of qnrA and qnrB genes in antibiotic-resistant isolates. Escherichia coli bacteria were collected from pericarditis and perihepatitis lesions of 128 broiler chickens belonging to 26 broiler farms in Guilan province. The antibiotic sensitivity of each isolate was evaluated by disc diffusion method. The presence of qnrA and qnrB plasmid genes were checked by polymerase chain reaction using specific primers. Results showed that out of 128 pieces of chicken carcasses collected in autumn and winter, 21 pieces contained bacteria, and in 4 pieces, this bacteria was isolated from both liver and heart tissues. From 25 isolates of Escherichia coli; 24 isolates showed resistance to enrofloxacin, 23 isolates to danofloxacin, 24 isolates to flumequin and 16 isolates to norfloxacin. Out of 16 isolates resistant to all four quinolone antibiotics, 14 isolates carried qnrA and qnrB genes, 8 isolates had qnrA gene, 13 isolates had qnrB gene, and 7 isolates had both genes. Totally, the results of this research showed that the resistance to quinolone antibiotics is high and qnrA and qnrB genes are spread in Guilan province and qnrB gene is more abundant.

References:

1. Abdelgader S.A., Shi D., Chen M., Zhang L., Hejair H.M.A., Muhammad U. 2018. Antibiotics resistance genes screening and comparative genomics analysis of commensal Escherichia coli isolated from poultry farms between China and Sudan. Biomedical Research International, 26: 5327450.
2. Adelowo O.O., Fagade O.E., Agersø Y. 2014. Antibiotic resistance and resistance genes in Escherichia coli from poultry farms, southwest Nigeria. Journal of Infection in Developing Countries, 8 (9): 1103-1012.
3. Awad A., Arafat N., Elhadidy M. 2016. Genetic elements associated with antimicrobial resistance among avian pathogenic Escherichia coli. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2016; 15 (59): 1-8.
4. Belotindos L.P. 2021. Characteristics of Escherichia coli isolated from livestock and related materials in the Philippines. Ph.D. Thesis. Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP.
5. CLSI, 2018. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals. 4th Ed. CLSI Supplement VET08. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute.
6. Dolatyabi S., Peyghambari S.M. 2020. A review of fluoroquinolones and their use in poultry. The 7th Scientific Research Conference on the Development and Promotion of Agricultural Sciences and Natural Resources of Iran, Tehran.
7. Ebrahimian M., Mohammadi-Sichani M. 2018. The frequency of plasmid qnr genes in quinolone-resistant isolates of Escherichia coli causing urinary tract infection. Journal of Isfahan Medical School, 36 (499): 1213-1218. [Persian].
8. Ghaniei A., Mojaverrostami S., Lotfallahzadeh B., Darzi Lemraski M., Sepehrnia P., Imani Jajarmi A. 2014. Geographical and seasonal variation in antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broiler chicken carcasses in Iran. European Journal of Experimental Biology, 4: 173-177.
9. Ghasemian S.O., Mahmoudipour H. 2023. Isolation, identification and antibiotic resistance patterns of Escherichia coli isolated from broiler chickens with Coli Bacillus to fifteen common antibiotics in Iran's poultry industry. Veterinary Microbiology, In Press [Persian].
10. Gholami F., Mehrabian S., Tabarsi Z., Amini K. 2019. Investigation of isolated enterobactin genes isolated from food (poultry meat) by multiplex-PCR method. Journal of Comparative Pathobiology, 16 (2): 2819-2826 [Persian].
11. Gregova G., Kmetova M., Kmet V., Venglovsky J., Feher A. 2012. Antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from a poultry slaughterhouse. Annals of Agricultural and Environmental Medicine, 19: 75-77.
12. Horri M., Gholami-Ahangaran, M. 2022. The frequency of qnra and sul1 genes in Escherichia coli isolated from pericarditis and perihepatitis lesions of broilers in Isfahan province. Animal Physiology and Development, 15 (2): 47-58. [Persian]
13. Jafari R., Ghanbarpour R., Ghorbanpour Najafabadi M., Miyahi M. 2014. Determination of antibiotic resistance patterns in Escherichia coli isolated from healthy broiler chickens and those suffering from septicemia in air. Journal of Veterinary Microbiology, 11 (2): 116-109. [Persian]
14. Karimi P., Jafarpour M., Nazemi A. 2011. Molecular identification of enrofloxacin resistance genes in Escherichia coli isolated from broiler chickens in Tehran and Tonekabon. Islamic Azad University Veterinary Journal, 5 (2): 61-68. [Persian]
15. Katzung B.G., Kruidering-Hall M., Trevor A.J. 2019. Katzung & Trevor’s Pharmacology Examination and Board Review. 12th Edition, 592 p.
16. Liu B.-T., Liao X.-P., Yang S.-S., Wang X.-M., Li L.-L., Sun J. 2012. Detection of mutations in the gyrA and parC genes in Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes from diseased food-producing animals. Journal of Medical Biotechnology, 61: 1591-1599.
17. Naimi S. 2015. Resistance to Antibiotics (Antimicrobial Drugs), the sixth book "Rational Use of Drugs". From the Training Set for Health Volunteers. Deputy Health Minister of the Ministry of Health and Medical Education. [Persian]
18. Zaghari M., Zhendi M., Parhizkar S. 2023. Evaluation of the effects of Bacillus coagulans on functional traits and microbial flora of the gastrointestinal tract of broilers. Research on Animal Production, 13 (38): 19-27 [Persian].
19. Ponce-Rivas E., Muñoz-Márquez M.-E., Khan A.A. 2012. Identification and molecular characterization of class 1 integrons in multiresistant Escherichia coli isolates from poultry litter. Applied Environmental Microbiology, 78 (15): 5444-5447.
20. Rodríguez-Martínez J.M., Cano M.E., Velasco C., Martínez-Martínez L., Pascual A. 2011. Plasmid-mediated quinolone resistance: an update. Journal of Infection Chemotherapy, 17 (2): 149-82.
21. Salah F.D., Soubeiga S.T., Ouattara A.K., Sadji A.Y., Metuor-Dabire A., Obiri-Yeboah D. 2019. Distribution of quinolone resistance gene (qnr) in ESBL-producing Escherichia coli and Klebsiella spp. in Lomé, Togo. Antimicrobial Resistance and Infection Control, 8: 104.
22. Seo K.W., Lee Y.J. 2021. Molecular characteristics of fluoroquinolone-resistant Escherichia coli from broiler breeder farms. Poultry Science, 100: 101250.
23. Shams Goli S., Moradli Gh.A., Amini K. 2016. Molecular identification of adhesion virulence, necrosis and hemolysin genes in UPEC and APEC strains isolated from clinical and poultry samples. Applied Biology, 7 (26): 35-42. [Persian]
24. Tabatabaei R., Nasirian A. 2003. Isolation, identification and antimicrobial resistance patterns of E. coli isolated from chicken flocks. Iranian Journal of Pharmacology and Therapeutics, 2: 39-42.
25. Yang H., Chen S., White D.G., Zhao S., McDermott P., Walker R., Meng J. 2004. Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China. Journal of Clinical Microbiology, 42: 3483-3489.
26. Zahraei Salehi T., Farashi Bonab S. 2006. Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains isolated from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. International Journal of Poultry Science, 5: 677-684.

Full-Text:



زیست­شناسی جانوري، سال هفدهم، شماره چهارم، تابستان 1404، صفحات 92-79، بهزادپور و همکاران

 

 

The Status of Broiler Farms in Terms of the Distribution Pattern of Resistant Escherichia coli Bacteria and Resistance Genes to Fluoroquinolone Antibiotics Using Polymerase Chain Reaction (PCR) Method

 

Darioush Behzadpour1*, Kaveh Madhoush2, Behzad Kaviani3, Seyyed Mohammad Reza Tabatabaei Mehr1

 

1- Department of Veterinary Medicine, Rasht Branch, Islamic Azad University, Rasht, Iran

2- Health Monitoring System, Rasht, Guilan, Iran

3- Department of Horticultural Science, Rasht Branch, Islamic Azad University, Rasht, Iran

*Corresponding author: [e-mail]

Received: 18 February 2025                                 Accepted: 12 May 2025

DOI:

 

Abstract

Poultry colibacillosis is one of the most common pathogens in poultry and antibiotics play a significant role in controlling this disease. The aim of the present study was to study the frequency of Escherichia coli bacteria in broiler chickens in Guilan province and investigate the pattern of drug resistance due to the horizontal transfer of genes through plasmid-type resistance genes to quinolones and the detection of qnrA and qnrB genes in antibiotic-resistant isolates. E. coli bacteria were collected from pericarditis and perihepatitis lesions of 128 broiler chickens belonging to 26 broiler farms in Guilan province. The antibiotic sensitivity of each isolate was evaluated by disc diffusion method. The presence of qnrA and qnrB plasmid genes were checked by polymerase chain reaction using specific primers. Results showed that out of 128 pieces of chicken carcasses collected in autumn and winter, 21 pieces contained bacteria, and in 4 pieces, these bacteria was isolated from both liver and heart tissues. From 25 isolates of Escherichia coli; 24 isolates showed resistance to enrofloxacin, 23 isolates to danofloxacin, 24 isolates to flumequin and 16 isolates to norfloxacin. Out of 16 isolates resistant to all four quinolone antibiotics, 14 isolates carried qnrA and qnrB genes, 8 isolates had qnrA gene, 13 isolates had qnrB gene, and 7 isolates had both genes. Totally, the results of this research showed that the resistance to quinolone antibiotics is high and qnrA and qnrB genes are spread in Guilan province and qnrB gene is more abundant.

 

Keywords: Antibiotics, Drug resistance genes, Poultry, E. coli, PCR.

 

 

 

 

وضعیت مرغداری‌های گوشتی از نظر الگوی پراکندگی باکتری‌های مقاوم اشرشیا کولی و ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های فلوروکینولون با روش واکنش زتجیره‌ای پلیمراز (PCR)  

داریوش بهزادپور۱*، کاوه مدهوش۲ ، بهزاد کاویانی ۳، سید محمدرضا طباطبائی­مهر1

۱- گروه دامپزشکی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

۲- سامانه پایش سلامت، رشت، گیلان، ایران

۳- گروه باغبانی، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت: 30/11/1403 تاریخ پذیرش: 22/02/1404

DOI:

چکیده

کلی‌باسیلوز طیور یکی از شایع‌ترین عوامل بیماری‌زای طیور می‌باشد و آنتی‌بیوتیک‌ها نقش بارزی در کنترل این بیماری بر عهده دارند. هدف از پژوهش حاضر، مطالعه فراوانی باکتری اشریشیا کولی (E. coli) در جوجه‌های گوشتی استان گیلان و بررسی الگوی مقاومت دارویی به دلیل انتقال افقی ژن‌ها، به‌واسطه ژن‌های مقاومت از نوع پلاسمیدی به کینولون‌ها و ردیابی ژن‌های qnrA و qnrB در جدایه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک بود. باکتری‌های E. coli از ضایعات پری‌کاردیت و پری‌هپاتیت 128 قطعه مرغ گوشتی متعلق به 26 مرغداری گوشتی استان گیلان جمع‌آوری شدند. حساسیت آنتی‌بیوتیکی هر یک از جدایه‌ها به روش انتشار دیسک مورد بررسی قرار گرفت. حضور ژن‌های پلاسمیدی qnrA و qnrB به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی بررسی گردیدند. نتایج نشان داد که از 128 قطعه تلفات مرغداری که در فصول پاییز و زمستان جمع‌آوری شدند، 21 قطعه حاوی باکتری بودند و در 4 قطعه از هر دو بافت کبد و قلب این باکتری جدا شد. از 25 جدایه E. coli؛ 24 جدایه به انروفلوکساسین، 23 جدایه به دانوفلوکساسین، 24 جدایه به فلومکوئین و 16 جدایه به نورفلوکساسین مقاومت نشان دادند. از 16 جدایه مقاوم به هر چهار آنتی‌بیوتیک کینولون، 14 جدایه حامل ژن‌های qnrA  و qnrB بودند که 8 جدایه دارای ژن qnrA و 13 جدایه دارای ژن qnrB و 7 جدایه دارای هر دو ژن بودند. در مجموع، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های کینولون در صد بالایی را نشان می‌دهد و ژن‌های qnrA و qnrB در استان گیلان گسترش یافته و ژن qnrB فراوانی بیشتری دارد.

کلمات کلیدی: آنتی‌بیوتیک‌ها، ژن‌های مقاومت دارویی، طیور، اشریشیا کولی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز.

مقدمه

 

اشرشیا کولی (Escherichia coli)، نوعی باسیل گرم­منفی از خانواده انتروباکتریاسه ‌است که به‌طور شایع در روده جانوران خونگرم وجود دارد. وجود این باکتری در آب و غذا معرف آلودگی آن با مدفوع می‌باشد. E. coli به تنهایی و یا همراه با سایر عوامل بیماری‌زا، یکی از شایع‌ترین عوامل بیماری‌زا در طیور (با میزان مرگ ­و میر ۵ تا ۵۰ درصد) به‌شمار می‌رود. باکتری E. coli مولد کلی‌باسیلوز پرندگان (APEC) با اخذ ژن‌های عفونت‌زا از سایر باکتری‌ها تبدیل به یک باکتری عفونت‌زای خارج روده‌ای شده و با تضعیف سیستم ایمنی بدن انسان و حیوانات، ایجاد بیماری می‌کند (۱، ۲). مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک به بزرگ‌ترین تهدید سلامت جهانی و امنیت غذایی تبدیل شده است. یک مشکل روزافزون در مورد E. coli و بسیاری از باکتری‌های دیگر، بروز مقاومت آنتی‌بیوتیکی در این میکروارگانیسم‌ها است. بخشی از این مشکل، در اثر مصرف بی‌رویه آنتی‌بیوتیک توسط انسان به وجود آمده است، اما بخش دیگر را می‌توان یکی از عواقب استفاده از این ترکیبات، به‌عنوان محرک‌های رشد در غذای حیوانات دانست (۳). کینولون‌ها آنتی‌بیوتیک‌های با طیف وسیعی هستند که روی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی مؤثرند. فلوروکینولون‌ها به‌طور مستقیم با مهار DNA-جیراز، به‌ویژه در باکتری‌های گرم منفی و توپوایزومراز IV، به‌ویژه در باکتری‌های گرم مثبت، در سنتز DNA باکتری‌ها تداخل ایجاد می‌کنند. مهار توپوایزومراز IV توسط فلوروکینولون‌ها باعث جلوگیری از تکرار مرحله‌ای که برای رونویسی و تکثیر طبیعی لازم است، می‌شود. بهره‌گیري از فلوروکینولون‌ها در درمان پنومونی بسیار مرسوم است، اما مقاومت به این دارو نیز سیر صعودي پیدا کرده است (۴، ۵). ژن‌های پلاسمیدی خانواده qnr که به ژن‌های PMQR شهرت دارند متعلق به یک خانواده پنتاپپتیدهاي تکراري بوده و با مهار اتصال کینولون‌ها به DNA-جیراز و توپوایزومراز  IVازDNA  حفاظت می‌کنند. این ژن‌ها منجر به افزایش 8 تا 32 برابری در میزان MIC کینولون‌ها می‌شوند (۶). تا کنون تعداد کثیری از الل‌های ژن qnr در کروموزوم و پلاسمیدهای خانواده انتروباکتریاسه شناسایی شده‌اند که تعدادشان بالغ بر 100 ژن qnr می‌باشد که در قالب 5 خانواده از ژن‌هاي qnr یعنی qnrA، qnrB، qnrC، qnrD و qnrS طبقه‌بندی می‌شوند (۷). برای مطالعه عناصر ژنتیکی مرتبط با مقاومت ضدمیکروبی بین جدایه‌های E. coli در بیماری‌های طیور گوشتی، بررسی نتایج آنتی‌بیوگرام نشان داده است که بیشترین مقاومت به آنتی­بیوتیک‌های آمپی‌سیلین، تتراسایکلین، اسید نالیدیکسیک و کلرامفنیکل وجود دارد. مقاومت در برابر کینولون  gyrA برابر ۳/۵۶ درصد بود (۸). مکانیسم‌های مقاومت در 36 گونه E. coli جداشده از نمونه‌های زباله، بستر، خاک و آب مزارع مرغداری در جنوب غربی نیجریه مقاومت 30 جدایه (۹۴ درصد) را به بیش از یک آنتی‌بیوتیک نشان داد (۹). غربالگری ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها و آنالیز ژنومیک مقایسه‌ای E. coli نشان داد که سویه‌های E. coli از روده حیوانات و انسان‌ها، دارای محدوده وسیعی از ژن‌های مقاومت به دارو هستند. بسیاری از جدایه‌ها به بیش از یک آنتی‌بیوتیک مقاوم بودند. ژنوم D107 تعداد قابل توجهی از ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها مانند ermA و mphD را نشان داد که در ژنوم D4 وجود ندارد. محیط مزارع مرغداری در کشورهای مختلف ممکن است به‌عنوان یک مخزن بالقوه ژن‌های مقاومت ضدمیکروبی عمل کرده و همچنین تفاوت‌های تکاملی سویه‌ها از نظر بیان ژن‌های مقاوم را نشان دهد (۱۰). در مطالعه‌ای که در کشور کره در سال 2021 میلادی روی جوجه‌های گوشتی انجام شد، از تعداد 23 جدایه E. coli مقاوم به کینولون‌ها که دارای ژن‌های qnr بودند، 4/9 درصد مربوط به qnrS، 6/6 درصد qnrA و 8/3 درصد از نوع qnrB بوده‌اند (۱۱). در پژوهشی دیگر، از 96 جدایه E. coli مورد بررسی، 53 جدایه (16/40 درصد) نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های گروه فلوروکینولون‌ها مقاوم بودند. همچنین، حضور ژن qnrA در 18 جدایه (96/33 درصد)، ژن qnrB در 8 جدایه (10/15 درصد) و ژنqnrS  در 5 جدایه (43/9 درصد) از 53 جدایه مقاوم نسبت به فلوروکینولون توسط آزمونPCR  تأیید گردید (۱۲). همچنین در مطالعه دیگری در ایران 17 الگوی مقاومت دارویی در بین 30 جدایه E. coli نسبت به 15 آنتی‌بیوتیک پرمصرف در صنعت طیور شناسایی گردید که 26 جدایه (۶۷/۸۶ درصد) به بیش از یک الگو تعلق داشتند، در حالی‌که 4 جدایه دیگر (۳۳/۱۳ درصد) هر کدام فقط به یک الگو تعلق داشتند. نتایج این بررسی نشان داد که مقاومت جدایه‌ها نسبت به اکثریت داروهای با مصرف رایج در صنعت طیور ایران بالا می‌باشد که لزوم اجرای قوی طرح پایش ملی برای مقاومت ضدمیکروبی و مصرف اصولی آنتی‌بیوتیک‌ها ضروری به‌نظر می‌رسد (۱۳). با توجه به اهمیت موضوع مقاومت آنتی‌بیوتیکی و شیوع آن در طیور پرورشی استان، هدف از پژوهش حاضر بررسی اختصاصی الگوی پراکندگی باکتری‌های مقاوم E. coli و ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های فلوروکینولون در مرغداری‌های گوشتی با استفاده از روش PCR بود.

مواد و روش‌ها

نمونه‌های اخذ شده در این پژوهش، تعداد 128 قطعه از تلفات مرغداری‌های گوشتی بوده که به‌صورت تصادفی از 26 فارم، از مرغداری‌های سراسر استان گیلان جمع‌آوری شده و در اسرع وقت به آزمایشگاه انتقال داده شدند. از هر سالن مرغداری، بین 2 تا 4 نمونه اخذ گردید. نمونه‌ها از مرغداری‌هایی جمع‌آوری شدند که تلفات غیر عادی نداشتند. در آزمایشگاه پس از کالبد گشایی، از قلب و کبد لاشه‌ها در شرایط استریل کنار شعله با سوزاندن سطح قلب و کبد نمونه‌برداری شد و به‌وسیله سوآپ استریل در محیط‌های کشت بلاد آگار، مکانکی آگار و ائوزین متیلن بلو آگار مرک ساخت آلمان کشت داده شد. در نمونه‌برداری از لاشه‌ها، به‌علت اینکه غیر ازE. coli ، سایر باکتری‌ها حائز اهمیت نبودند، از نمونه‌برداری از نای، مفاصل و کیسه صفرا صرف‌نظر گردید. سپس پلیت‌ها به‌مدت 24 ساعت در شرایط هوازی و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از خروج پلیت‌ها از انکوباتور و بررسی آنها، نمونه‌هایی که هیچ رشدی در آنها صورت نگرفته بود، کنار گذاشته شدند. کلنی‌های باکتریایی که فقط در بلاد آگار رشد کردند و در بقیه محیط‌ها رشدی نداشتند، به‌عنوان گرم مثبت تلقی شده و کنار گذاشته شدند. نمونه‌هایی که در محیط مکانکی آگار رشد کردند و رنگ محیط را به زرد تغییر دادند، E. coli منفی تلقی شدند و کنار گذاشته شدند. نمونه‌هایی که در محیط کشت ائوزین متیلن بلو آگار، جلای سبز فلزی نشان دادند و همچنین در محیط مک‌کانکی آگار تشکیل کلنی صورتی دادند به احتمال قریب به یقین E. coli مثبت بودند که پس از رنگ‌آمیزی گرم و مشاهده باسیل‌های گرم منفی کشت افتراقی جهت تایید انجام شد. در مورد بقیه نمونه‌ها که در هر سه محیط رشد داشتند ولی تشخیص با قطعیت ممکن نبود و نمونه‌هایی که احتمالا E. coli مثبت بودند، برای اطمینان پس از رنگ‌آمیزی گرم و مشاهده باسیل‌های گرم­منفی اکسیداز منفی کشت افتراقی (اندول، متیل رد، ووگس پروسکوئر، سیترات، اوره و لایزین آیرون آگار) با استفاده از محیط‌های کشت ساخت شرکت مرک انجام شد. در نهایت، 25 جدایه E. coli به‌دست آمد. بعد از تفکیک 25 جدایه باکتریایی، از کلونی‌های خالص E. coli هر جدایه موصوف جهت تهیه غلظت، معادل کدورت نیم مک‌فارلند برداشته شد. برای تهیه کدورت، از دستگاه اسپکتروفتومتر UNICO ساخت آمریکا در طول موج ۶۲۵ نانومتر استفاده شد. جذب‌های بین 08/0 تا 13/0 معادل کدورت نیم مک‌فارلند بودند. از کدورت مذکور توسط سواپ استریل روی محیط کشت مولر هینتون آگار مرک ساخت کشور آلمان جهت انجام آنتی‌بیوگرام به‌روش انتشار دیسکKirby-Bauer  کشت داده سپس دیسک‌های آنتی‌بیوگرام با استفاده از پنس و در شرایط استریل با فاصله حداقل دو سانتی‌متر از هم و یک سانتی‌متر از لبه پلیت‌ها قرار داده شدند و پلیت‌ها به‌مدت 18 الی 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تحت انکوباسیون قرار گرفتند. اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد هر داروی ضد میکروبی بر اساس جداول استاندارد CLSI انجام شد و باکتری در یکی از دسته‌های مقاوم، نیمه‌حساس و حساس قرار گرفت (۱۴، ۱۵). در پژوهش حاضر، برای 25 جدایهE. coli ، از چهار دیسک آنتی‌بیوتیک: انروفلوکساسین (Enrofloxacin) 5 میکروگرم، دانوفلوکساسین (Danofloxacin) 10 میکروگرم، فلومکوئین (Flumequine) 30 میکروگرم و نورفلوکساسین (Norfloxacin) 10 میکروگرم، ساخت شرکت پادتن طب استفاده شد. برای استخراج DNA پلاسمیدی، ابتدا باکتری E. coli در محیط LB (Lauria Bertani Broth) مرک ساخت آلمان کشت داده و در دمای 37 درجه سلسیوس به‌مدت 24 ساعت انکوبه گردید. سپس محتویات لوله کشت، سانتریفیوژ گردید و از رسوب حاصل برای استخراج پلاسمید استفاده شد. استخراج DNA پلاسمیدی بر اساس شیوه‌نامه کیت استخراج، ساخت شرکت سیناژن انجام شد. ژن‌های مقاومت در برابر فلوروکینولون که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت شامل ژن‌های qnrA و qnrB بودند. توالی ژن‌های موصوف با استفاده از سایت NCBI برای دو ژن مذکور به‌دست آمد و پرایمرهای اختصاصی با استفاده از نرم‌افزارOligo  نسخه ۷، به‌منظور تکثیر آنها طراحی و سپس بلاست گردید. توالی‌های طراحی‌شده برای ساخت به شرکت سینا کلون داده شد. برای تکثیر ژن‌های qnrA  و qnrB آزمون PCR در حجم 25 میکرولیتری و ویال مستر میکس حاوی دزوکسی نوکلئوزید تری­فسفات، Taq-پلیمراز، بافر، کلرید منیزیم، آب دو بار تقطیر شده استریل، پرایمرهای فوروارد، ریورس و DNA الگو استخراجی با استفاده از دستگاه ترمال سایکلر شرکت Applied Biosystem مدل en61327 و بر اساس اطلاعات مندرج در جدول 1 انجام شد. محصول PCR روی ژل آگارز حاوی رنگ Safe stain در حضور لدرDNA  کنترل مثبت و کنترل منفی روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد و باندهای تشکیل‌شده روی ژل بر اساس اندازه، تحت نور ماورای بنفش ارزیابی گردیدند. سپس ژل آگارز از قالب خارج شده و داخل دستگاه ژل داک ساخت شرکت دنا ژن تجهیز قرار داده شد و از آن عکس تهیه گردید. با توجه به طول ژن که قبلا محاسبه شده بود و از مقایسه باندهای تشکیل شده با لدر وجود یا عدم وجود ژن‌های مورد نظر تحت بررسی قرار گرفت.

 

 

جدول 1- پرایمرهای طراحی شده

Table 1. Designed primers

Gene length	Annealing temperature	Primer sequence	Gene name
562 bp	58°C for 60 sec.	(F) 5-AGA GGA TTT CTC ACG CCA GG-3 (R) 5-TGC CAG GCA CAG ATC TTG AC-3	qnrA
562 bp	48°C for 60 sec.	(F) 5-ATG ACG CCA TTA CTG TAT AA–3 (R) 5-GAT CGC AAT GTG TGA AGT TT-3	qnrB

 

نتایج 

 

در مجموع، 128 نمونه از 26 فارم مرغداری، بین سنین 3 تا 47 روز جمع‌آوری شدند که از این تعداد، 21 نمونه (۴/۱۶ درصد) حاوی باکتری E. coli بود، كه در 4 مورد از نمونه‌های مورد بررسی، از هر دو بافت کبد و قلب این باکتری جدا شد. بنابراین، 25 جدایه اشرشيا كولي (۵۳/۱۹ درصد)، از 128 نمونه جوجه گوشتی مورد بررسی به‌دست آمد. پراکندگی نمونه‌های مثبت از نظر جدایه E. coli از نظر آماری معنادار بود (05/0p ≤). بیشترین فراوانی (۲۰ درصد) مربوط به شهرهای رشت، آستانه اشرفیه و املش بود (جدول ۲، شکل ۱). همه نمونه‌های مورد بررسی از شهرستان املش از نظر E. coli آلوده بودند. حساسيت باكتري‌هاي جداشده به داروهاي ضد ميكروبي نشان داد که فقط یک مورد از باکتری‌های جداشده (4 درصد) به همه آنتي‌بيوتيك‌هاي مورد بررسي حساس بود. بيشترين مقاومت، نسبت بـه آنتي‌بيوتيك نورفلوكساسين بود كه سه مورد از جدایه‌ها (12 درصد) نسبت به آن حساس و 16 جدایه (64 درصد) مقاوم بودند. حساسیت نسبت به سه آنتي‌بيوتيك دیگر مشابه و برابر 4 درصد از موارد جداسازی شده بود. مقاومت همزمان نسبت به دو آنتي‌بيوتيك، در 24 جدايه (96 درصد) مشاهده شد، همچنین تعداد 23 (92 درصد) و 16 (64 درصد) مورد از جدايه‌ها به‌ترتیب همزمان به سه و چهار آنتي‌بيوتيك مورد بررسی مقاوم بودند. جداول 3 و 4 و شکل ۲ توزیع الگوي مقاومت آنتی‌بیوتیکی در 25 جدایه اشریشيا كولي به‌دست آمده از نمونه‌های مرغ را نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد بررسی نشان می‌دهد. میانگین سن گله در نمونه‌های جوجه‌های گوشتی مثبت از نظر جدایه اشرشيا كولي، 44/25 و در نمونه‌های منفی، 43/25 روز بود که از نظر آماری معنادار نبود (p ≥ 05/0). تعداد 15 مورد از 25 جدایه‌ به‌دست آمده (60 درصد)، در محیط کشت EMB جلای فلزی داشتند، که از این تعداد 9 جدایه (36 درصد) از کبد و 16 مورد (64 درصد) از قلب نمونه‌های مرغ به‌دست آمدند.‏ نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان داد که ارتباط بین بافت و جلای فلزی در محیط EMB از نظر آماری معنادار بود، به‌ طوری ‌که 100 درصد جدایه‌های کبد فاقد جلای فلزی در محیط EMB و ۷۵/۹۳ درصد از جدایه‌های قلب دارای جلای فلزی بودند (روش آماری K2، 05/0 p ≤). تعداد 16 نمونه از 25 نمونهE. coli  که به هر چهار آنتی‌بیوتیک کینولون مقاومت نشان داده بودند، برای انجامPCR  جدا شده و در مرحله بعد، تخلیص ژنومی جدایه‌های E. coli انجام شد. درجه خلوص و غلظت DNA موجود در جدایه‌ها توسط الکتروفورز نمونه‌ها روی ژل آگاروز یک درصد (شکل‌ ۳) تعیین گردید که همه نمونه‌ها از درجه خلوص و غلظت مناسبی برخوردار بودند. سپس، تکثیر ژن‌های qnrA و qnrB در جدایه‌های E. coli با پرایمرهای مورد نظر و برنامه PCR بهینه‌شده انجام شد و نتایج واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز نشان‌دهنده تکثیر ژن‌های مورد بررسی در 14 جدایه از 16 جدایه بود. بر اساس شکل ۳، هر دو ژن‌ qnrA و qnrB باندی معادل 562 جفت باز را روی ژل آگاروز نشان دادند. تعداد 14 جدایه از 16 جدایه مورد بررسی (۵/۸۷ درصد)، حداقل یکی از ژن‌های qnrA یا qnrB را حمل می‌کنند. همچنین، ارزیابی فراوانی ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های کینولون نشان داد که از میان ژن‌های مورد بررسی، ژن qnrB دارای بیشترین فراوانی می‌باشد. نتایج بررسی حالت‌های مختلف ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتری E. coli در جدول ۵ و شکل ۴ نشان داده شده است. کلیه جدایه‌های حامل هر دو ژن مورد بررسی، از بافت قلب به‌دست آمدند (7 جدایه از 16 جدایه، معادل 75/43 درصد). از طرف دیگر، کلیه جدایه‌های استخراج شده از بافت کبد نیز تنها حامل ژن qnrB بودند (25 درصد) (جدول ۶). بررسی فراوانی ژن‌های qnrA و qnrB نشان داد که از 16 جدایه E. coli مقاوم به هر چهار نوع آنتی‌بیوتیک، 8 جدایه (50 درصد) دارای ژن qnrA بودند که از این میان، 7 جدایه (5/87 درصد) دارای جلای فلزی بودند. همچنین، تعداد 13 جدایه (25/81 درصد) دارای ژن qnrB بودند که از این میان، 8 جدایه (53/61 درصد) جلای فلزی داشتند و 5 جدایه (46/38 درصد) فاقد جلای فلزی بودند. فقط یک جدایه از مجموع 8 جدایه دارای ژن qnrA و فاقد ژن qnrB بودند. به عبارت دیگر، 7 جدایه (75/43 درصد) از مجموع 16 جدایه مورد بررسی دارای هر دو ژن qnrA و qnrB بودند. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که حضور همزمان ژن‌های qnrA و qnrB در 7 جدایه از 16 جدایه مورد بررسی، سبب افزایش قابل توجه مقاومت این باکتری نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد بررسی شده است.

 

 

جدول 2 - توزیع پراکندگی نمونه‌های منفی و مثبت از نظر جدایه E. coli در سطح استان گیلان

Table 2. Distribution of negative and positive samples in terms of E. coli isolates in Guilan province

Negative [No. (%)]	Positive [No. (%)]	City
29 (27.1)	5 (20)	Rasht
10 (9.3)	4 (16)	Langaroud
9 (8.4)	2 (8)	Roudbar
12 (11.12)	2 (8)	Roudsar
8 (7.5)	0 (0)	Anzali
4 (3.7)	0 (0)	Shaft
3 (2.8)	5 (20)	Astaneh Ashrafieh
11 (10.3)	0 (0)	Rezvanshahr
8 (7.5)	1 (4)	Sowme éh Sara
0 (0)	5 (20)	Amlash
5 (4.7)	1 (4)	Lahidjan
8 (7.5)	0 (0)	Fooman

 

جدول 3 - الگوي مقاومت آنتی‌بیوتیکی در 25 جدایه E. coli به‌دست آمده از جوجه‌های گوشتی نسبت به چهار آنتي‌بيوتيك مورد بررسي

Table 3. Antibiotic resistance pattern in 25 E. coli isolates obtained from broiler chickens to the four antibiotics studied

Antibiotic type	Sensitive cases [No. (%)]	Semi-sensitive cases [No. (%)]	Resistant cases [No. (%)]
Enrofloxacin	1 (4)	0	24 (96)
Danofloxacin	1 (4)	1 (4)	23 (92)
Flumequine	1 (4)	0	24 (96)
Norfloxacin	3 (12)	6 (24)	16 (64)

 

جدول 4- مقاومت همزمان به آنتي‌بيوتيك‌ها در 25 نمونه باكتري E. coli جداشده از جوجه‌های گوشتی در گیلان

Table 4. Simultaneous resistance to antibiotics in 25 E. coli bacteria samples isolated from broilers in Guilan

Antibiotic type	Resistant cases [No. (%)]
Enrofloxacin + Flumequine	24 (96)
Enrofloxacin + Flumequine + Danofloxacin	23 (92)
Enrofloxacin + Flumequine + Danofloxacin + Norfloxacin	16 (64)

 

جدول ۵- فراوانی ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتری E. coli

Table 5. Frequency of antibiotic resistance genes in E. coli bacteria

Percentage	Number	Evaluated genes
50	8	qnrA
81.25	13	qnrB
43.75	7	qnrA و qnrB

 

جدول ۶- فراوانی ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بافت‌های مورد بررسی

Table 6. Frequency of antibiotic resistance genes in the investigated tissues

Antibiotic resistant gene		Number	Percentage	Tissue
qnrA	qnrB
+	+	7	43.75	Heart
+	-	1	6.25	Heart
_	+	2	12.5	Heart
-	-	2	12.5	Heart
_	+	4	25	Liver

 

 

شکل 1- درصد نمونه‌های مثبت به کل نمونه‌های اخذ شده در هر شهرستان

Fig 1. The percentage of positive samples to the total samples taken in each city

 

 

شکل 2- الگوي مقاومت آنتی‌بیوتیکی در 25 جدایه E. coli به‌دست آمده از جوجه‌های گوشتی نسبت به چهار آنتي‌بيوتيك مورد بررسي

Fig 2. Antibiotic resistance pattern in 25 E. coli isolates obtained from broiler chickens to the four antibiotics studied

 

شکل ۳- الکتروفورز محصول PCR ژن qnrA (A) و qnrB (B) روی ژل آگاروز

Fig 3. Electrophoresis of qnrA (A) and qnrB (B) gene PCR product on agarose gel

 

 

شکل ۴- فراوانی ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتری E. coli

Fig 4. Frequency of antibiotic resistance genes in E. coli bacteria

 

بحث

 

آنتی‌بیوتیک‌ها به دلیل نوع عملکردشان در رشد و پیشگیری از بیماری‌ها، به طور گسترده‌ای در صنعت دامپروری استفاده می‌شوند و این موضوع باعث مقاومت میکروب‌ها به آنتی‌بیوتیک در دام، طیور و انسان شده است. پتانسیل دستکاری میکروبیوتا در طیور برای افزایش بیشتر در بهره‌وری، از اهمیت تجاری و علمی زیادی برخوردار است که منجر به استفاده از پروبیوتیک‌ها در صنعت طیور می‌شود. میکروبیوتای موجود در دستگاه گوارش طیور، علاوه  بر ایفای نقش مهم در حفاظت از پرنده در مقابل پاتوژن‌ها و توسعه سیستم ایمنی، نقش مهمی در تغذیه حیوان ایفا می‌کند. یک مطالعه نشان داد که 21 درصد از تغییرات توده چربی شکم مرغ را می‌توان به ترکیب میکروبیوتای روده نسبت داد (۱۶). میکروفلور روده به عنوان یک مانع موثر در برابر میکروارگانیسم‌های فرصت‌طلب و بیماری‌زا عمل می‌کند و "مقاومت میکروبی" یکی از مهمترین عملکردهای آن است. متابولیسم باکتری می‌تواند منجر به اثرات سودمند از جمله تولید ویتامین‌ها، تعدیل سیستم ایمنی، افزایش هضم و جذب خوراک، مهار گونه‌های مضر و حذف مواد سرطان‌زا و سایر سموم شود. با وجود تمام پيشرفت‌هايی كه در صنعت پرورش طيور گوشتی و خصوصاً مرغ انجام شده است، باز هم بيماري‌هاي منتقل شونده از طريق مصرف گوشت آلوده گريبان‌گير بسياري از اقشار جامعه است. از بين مطالعاتی كه در اين زمينه انجام شده‌اند، توانايی بالاي باكتري E. coli به عنوان عاملی براي فساد گوشت مرغ، به مراتب بیشتر گزارش شده است (۱۷). E. coli مهمترين پاتوژن گرم منفی و ميله‌اي شکلی است كه موجب بروز مسموميت غذايی مهلک در انسان می‌گردد. اين باكتري قابليت انتقال از حيوانات به ويژه طيور را به علت تماس نزديک با انسان و مصرف گوشت آن داشته و می‌تواند خطر بالقوه در انتقال سويه‌هاي مقاوم و عوامل حدت داشته باشد. عفونت‌هاي ناشی از E. coli از اهميت ويژه‌اي در صنعت طيور برخوردار است. بررسی الگوی پراکندگی باکتری‌های مقاوم E. coli و بررسی ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های فلوروکینولون در مرغداری‌های گوشتی با استفاده از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و نتایج به دست آمده از آنتی‌بیوگرام سویه‌های E. coli جدا شده از موارد کلی باسیلوز طیور در مطالعه اخیر نشان می‌دهد که درصد بالایی از جدایه‌ها به آنتی‌بیوتیک‌های فلوروکینولون که جزء آنتی‌بیوتیک‌های معمول و رایج در صنعت طیور هستند، مقاومت نشان می‌دهند. یافته‌های پژوهش حاضر نشان داد که آلودگی به E. coli در جوجه‌های گوشتی استان گیلان، درصد نسبتاٌ بالایی را به خود اختصاص داده است. باکتری E. coli در هر سنی در جوجه‌های گوشتی مشاهده شده و شدت آن وابسته به سن نیست. به دلیل مصرف بی‌رویه آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت مرغداری کشور، مقاومت دارویی چندگانه در باکتری E. coli فزونی یافته و شایع‌ترین آن به‌دلیل مقاومت به‌واسطه پلاسمید می‌باشد که از مشکلات عمده مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سراسر جهان نیز محسوب می‌گردد. در ارتباط با مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های کینولون مورد آزمایش در این پژوهش، بیشترین مقاومت مربوط به انروفلوکساسین و فلومکوئین و کمترین مقاومت مربوط به نورفلوکساسین بود که دلیل آن‌را می‌توان به عدم استفاده از نورفلوکساسین در صنعت طیور کشور نسبت داد، در صورتی که انروفلوکساسین بیشترین استفاده را در صنعت طیور به خود اختصاص داده است. برخی مطالعات، مقاومت به انروفلوکساسین را در جوجه‌های گوشتی، 81 درصد گزارش کردند (۱۸)، در صورتی که در پژوهش حاضر مقاومت به این آنتی‌بیوتیک، ۹۶ درصد بود. این یافته، لزوم جلوگیری از استفاده بی‌رویه و بی‌دلیل از آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور توسط مرغداران را برجسته‌تر می‌کند. اما سایر مطالعات در ایران مربوط به استان‌های فارس، تهران، خوزستان و آذربایجان شرقی نشان می‌دهد که این الگو تا حدود زیادی مشابه است و نشان از توسعه مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های E. coli دارد. در همین رابطه، جعفری و همکاران (۲۰۱۴) بیشترین مقاومت آنتی‌بیوتیکی را در جدایه‌های E. coli طیور در اهواز با  90 درصد مقاومت نسبت به انروفلوکساسین مشاهده کردند (۱۹). قانعی و همکاران (۲۰۱۴) در تحقیقی که در استان اصفهان  به عنوان قطب صنعتی کشور به انجام رساندند اعلام داشتند که مقاومت 70 درصدی در برابر انروفلوکساسین و نیز مقاومت 50 درصدی در برابرسولفانامید به علاوه تری‌متوپریم نشان‌دهنده مقاومت بالای جدایه‌های E. coli نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های پرمصرف در صنعت پرورش طیور در اصفهان است (۲۰). رفیعی طباطبایی و نصیریان (۲۰۰۳) در تهران بیشترین مقاومت را مربوط به تتراسایکلین (94 درصد) و سپس سولتریم (56 درصد) و انروفلوکساسین (۴۴ درصد) گزارش کردند (۲۱). زهرایی صالحی و فراشی بناب (۲۰۰6) در تبریز نیز بیشترین مقاومت را نسبت به داکسی‌سایکلین گزارش کردند (88 درصد) اما مقاومت در برابر انروفلوکساسین نیز با  76 درصد در رده سوم قرار داشت (۲۲). مصرف گسترده انروفلوکساسین به تنهایی و مصرف هم‌زمان با برخی از خانواده‌های آنتی‌بیوتیکی می‌تواند دلیل این مقاومت بالا باشد که در مزارع پرورش طیور در سراسر ایران مورد استفاده قرار می‌گیرد. علاوه بر آن، مطالعات خارج از کشور نیز نشان می‌دهد که این آنتی‌بیوتیک در سایر کشورها نیز از مقاومت بالایی برخوردار است و بیشترین درصد مقاومت را به خود اختصاص داده است. در بررسی Gregova و همکاران (۲۰۱۲) در اسلواکی و Yang و همکاران (۲۰۰۴) در چین نیز بیشترین مقاومت در جدایه‌های E. coli طیور نسبت به انروفلوکساسین گزارش شده است (۲۳، ۲۴). وجود مقاومت بالای آنتی‌بیوتیکی نسبت به انروفلوکساسین، سولفونامید به همراه متوپریم، فلورفنیکل و داکسی‌سایکلین می‌تواند به دلیل استفاده متداول از این آنتی‌بیوتیک‌ها در کنترل بیماری کلی باسیلوز باشد که تجویز پی در پی این آنتی‌بیوتیک‌ها، گاهی بدون انجام آزمون‌های حساسیت آنتی‌بیوتیکی باعث ظهور و گسترش میکروارگانیسم‌های مقاوم به این آنتی‌بیوتیک‌ها شده است. از آن جایی که ژن‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی در گسترش مقاومت در بین میکروارگانیسم‌ها نقش عمده‌ای دارند، اخیراً برای شناسایی سویه‌های مقاوم بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. در مطالعه حری و غلامی آهنگران (۲۰۲۲) در اصفهان به پایش ژن‌های مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های فلوروکینولون و سولفونامید که از نظر دامپزشکی و پزشکی واجد اهمیت هستند، پرداخته شد (۲۵). در مطالعه اخیر از  50 سویه E. coli مورد بررسی، 21 جدایه (42 درصد) دارای ژن مقاومت به کینولون و 15 جدایه (30 درصد) دارای ژن مقاومت به سولفانامیدها بودند (۳). در همین راستا، Ponce-Rivas و همکاران (۲۰۱۲) نشان دادند که حدود 52 درصد از جدایه‌های E. coli واجد ژن qnrA بوده و در مجموع حدود 73 درصد از جدایه‌ها یکی از ژن‌های مقاومت کینولون را دارا بودند که در بسیاری از جدایه‌ها ژن‌های qnr همراه با کلاس یک اینتگرون ردیابی نمودند (۲۶). فراوانی بالا و حدود  48 درصدی Sul1 (ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک سولفانامید) در سویه‌های مقاوم علیه سولفانامیدها و نیز ردیابی 54 درصدی ژن  qnrA در سویه‌های مقاوم به کینولون‌ها نشان می‌دهد که علاوه بر ژن‌های مورد بررسی، ژن‌های دیگری هم در مقاومت علیه سولفانامیدها و کوینولون‌ها نقش دارند و بروز مقاومت آنتی‌بیوتیکی مستلزم وجود ژن و بیان مناسب ژن است تا منجر به ظهور فنوتیپ مقاومت شود. سویه‌های حامل ژن‌های مقاومت و بیماری‌زا می‌توانند به عنوان مخزن ژن‌های مقاومت در محصولات طیور و مصرف کننده نهایی یعنی انسان باشند (۳). با توجه به گسترش ژن‌های مقاومت به‌واسطه پلاسمید، ممانعت از مصرف خودسرانه و بی‌رویه آنتی‌بیوتیک‌ها در مرغداری‌های کشور به‌طور اکید توصیه می‌گردد. چنانچه ژن‌های مذکور در سویه‌های E. coli حساس به کینولون‌ها مشاهده شوند، احتمال ایجاد موتاسیون در ایجاد این وضعیت خارج از تصور نخواهد بود. طی مطالعات انجام شده امکان جهش در کدون‌های 83 و 87 از gyrA و کدون‌های 426 و 466 از gyrB نشان داده شده است (۱). یافته‌های این مطالعه نشان داد که ژن qnrB تنها در جدایه‌های کبدی باکتری E. coli حضور داشت، در حالی که در جدایه‌های قلبی هر دو ژن qnrA و qnrB شناسایی شدند. این الگوی پراکندگی ممکن است به واسطه مجموعه‌ای از عوامل بیولوژیکی و اکولوژیکی تبیین گردد. نخست، تفاوت‌های فیزیولوژیکی بین بافت کبد و قلب می‌تواند در بقای پلاسمیدها و بیان ژن‌های مقاومتی نقش ایفا کند؛ به‌ویژه اینکه کبد به‌عنوان اندامی غنی از آنزیم‌های متابولیک و سم‌زدا، ممکن است محیطی انتخابی علیه پلاسمیدهای بزرگ‌تر و پرهزینه‌تر نظیر آن‌هایی که qnrA را حمل می‌کنند، فراهم کند (۲۷). از سوی دیگر، حضور هم‌زمان دو ژن qnrA و qnrB در جدایه‌های قلبی ممکن است منعکس‌کننده ورود چندین کلون متفاوت از E. coli به این اندام باشد یا ناشی از سازگاری بهتر پلاسمیدهای ترکیبی با شرایط خاص فیزیولوژیکی و همودینامیکی قلب باشد (۲۸). همچنین تنظیم اپی‌ژنتیکی بیان ژن‌های مقاومت توسط عوامل درون‌زای میزبان نظیر سطح اکسیژن، pH و میزان فلزات سنگین می‌تواند به سرکوب یا افزایش بیان برخی ژن‌ها در بافت‌های خاص منجر گردد. در نهایت، هزینه زیستی مرتبط با هر پلاسمید نیز نقش تعیین‌کننده‌ای دارد؛ به‌گونه‌ای که پلاسمیدهای حامل qnrA در مقایسه با qnrB، بار متابولیکی بیشتری برای سلول میزبان ایجاد می‌کنند که ممکن است در محیط‌های پرتنش مانند کبد، موجب حذف انتخابی آن‌ها شود (۲۹). توجه به استانداردها و مقررات ایمنی زیستی در مرغداری‌ها از اهمیت بالایی برخوردار است. در ایران، علی‌رغم وجود برخی چارچوب‌های قانونی، نظارت بر مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در مرغداری‌ها همچنان ناکافی است. برای کاهش این بحران، اجرای مجموعه‌ای از اقدامات ایمنی زیستی بر اساس استانداردهای سازمان جهانی بهداشت دام (WOAH) و سازمان جهانی بهداشت (WHO) ضروری است (۳۰، ۳۱). همچنین استفاده از روش‌های آزمایشگاهی دقیق‌تر برای شناسایی ژن‌های مقاومت، همچون Real-time PCR یا توالی‌یابی کل ژنوم، می‌تواند در آینده اطلاعات ژرف‌تری برای سیاست‌گذاری ارائه دهد. در مجموع، بررسی‌های حاضر نشان داد که بدون دخالت‌های مدیریتی، آموزشی و قانونی گسترده، روند گسترش مقاومت آنتی‌بیوتیکی در مرغداری‌ها، به‌ویژه در سویه‌های E. coli، می‌تواند به یک تهدید جدی برای سلامت عمومی منجر شود.

نتیجه‌گیری

پژوهش حاضر نشان داد که درصد قابل توجهی از قطعات تلفات مرغداری‌ها در استان گیلان به باکتری E. coli آلوده هستند. این آلودگی‌ها به‌ویژه در رابطه با مقاومت بالای جدایه‌های این باکتری به آنتی‌بیوتیک‌های خانواده کینولون، از جمله انروفلوکساسین و دانوفلوکساسین، اهمیت بیشتری پیدا می‌کند. در این مطالعه، ۹۶ درصد از جدایه‌های E. coli به انروفلوکساسین و ۹۲ درصد به دانوفلوکساسین مقاومت نشان دادند. در میان سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها، بیش از ۸۷ درصد حامل ژن‌های مقاومت qnrA و qnrB بودند که به وضوح نشان‌دهنده گسترش این ژن‌های مقاومت در استان گیلان است. از طرفی، این یافته‌ها بر لزوم توجه به پایش و کنترل دقیق مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور تأکید می‌کند. ایجاد مقاومت دارویی در باکتری‌ها، می‌تواند به انتقال این مقاومت‌ها از طریق زنجیره غذایی به انسان‌ها منجر شود. بنابراین، نظارت دقیق و مدیریت بهینه مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها در صنعت طیور، به‌ویژه از طریق پایش مولکولی ژن‌های مقاومت، برای حفاظت از سلامت انسان و حفظ اثربخشی درمان‌ها ضروری است. در این راستا، استفاده از روش‌های جایگزین مانند پروبیوتیک‌ها، که می‌توانند به کنترل عفونت‌ها و ارتقاء سلامت روده کمک کنند، می‌تواند به‌عنوان یک راهکار مؤثر در بهبود عملکرد صنعت طیور و حفاظت از سلامت انسان مطرح گردد.

 

منابع

1. Karimi P, Jafarpour M, Nazemi A. Molecular identification of enrofloxacin resistance genes in Escherichia coli isolated from broiler chickens in Tehran and Tonekabon. Vet J. 2011;5(2):61-68. [In Persian]

2. Shams Goli S, Moradli GhA, Amini K. Molecular identification of adhesion virulence, necrosis and hemolysin genes in UPEC and APEC strains isolated from clinical and poultry samples. Appl Biol. 2016;7(26):35-42. [In Persian]

3. Naimi S. Resistance to antibiotics (antimicrobial drugs), the sixth book "Rational Use of Drugs". From the Training Set for Health Volunteers. Deputy Health Minister of the Ministry of Health and Medical Education. 2015. [In Persian]

4. Dolatyabi S, Peyghambari SM. A review of fluoroquinolones and their use in poultry. The 7th Scientific Research Conference, Development and Promotion of Agricultural Sciences and Natural Resources of Iran.. Tehran, 2020.

5. Katzung BG, Kruidering-Hall M, Trevor AJ. Katzung and Trevor’s Pharmacology Examination and Board Review. 12th Edition. 2019; 592 p.

6. Rodríguez-Martínez JM,  Cano ME,  Velasco C,  Martínez-Martínez L, Pascual A. Plasmid-mediated quinolone resistance: an update. J Infect Chemother. 2011;17(2):149-182.

7. Salah FD, Soubeiga ST, Ouattara AK, Sadji AY, Metuor-Dabire A, Obiri-Yeboah D. Distribution of quinolone resistance gene (qnr) in ESBL-producing Escherichia coli and Klebsiella spp. in Lomé, Togo. Antimicrob. Resist. Infect Control. 2019; 8:104.

8. Awad A, Arafat N, Elhadidy M. Genetic elements associated with antimicrobial resistance among avian pathogenic Escherichia coli. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2016;15(59):1-8.

9. Adelowo OO, Fagade OE, Agersø Y. Antibiotic resistance and resistance genes in Escherichia coli from poultry farms, southwest Nigeria. J. Infection Dev. Countries. 2014;8(9):1103-1012.

10. Abdelgader SA, Shi D, Chen M, Zhang L, Hejair HMA, Muhammad U., et al. Antibiotics resistance genes screening and comparative genomics analysis of commensal Escherichia coli isolated from poultry farms between China and Sudan. Biomed. Res. Int. 2018;26:5327450.

11. Seo KW, Lee YJ. Molecular characteristics of fluoroquinolone-resistant Escherichia coli from broiler breeder farms. Poultry Sci. 2021;100:101250.

12. Ebrahimian M, Mohammadi-Sichani M. The frequency of plasmid qnr genes in quinolone-resistant isolates of Escherichia coli causing urinary tract infection. J Isfahan Univ Med Sci. 2018;36(499):1213-1218. [In Persian]

13. Ghasemian SO, Mahmoudipour H. Isolation, identification and antibiotic resistance patterns of Escherichia coli isolated from broiler chickens with Coli Bacillus to fifteen common antibiotics in Iran's poultry industry. Vet Microbiol. 2024;19(1):80-90.  [In Persian]

14. Belotindos LP. Characteristics of Escherichia coli isolated from livestock and related materials in the Philippines. Ph.D. Thesis. Hokkaido Univ. Collection Scholarly Acad. Papers. 2021; HUSCAP.

15. CLSI. 2018. Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals. 4th Ed. CLSI Supplement VET08. Wayne, PA: Clinic. Lab. Standards Instit. 2018.

16. Zaghari M, Zhendi M, Parhizkar S. Evaluation of the effects of Bacillus coagulans on functional traits and microbial flora of the gastrointestinal tract of broilers. Res. Anim Prod. 2023;13(38):19-27. [In Persian]

17. Gholami F, Mehrabian S, Tabarsi Z, Amini K. Investigation of isolated enterobactin genes isolated from food (poultry meat) by multiplex-PCR method. J Comp Pathobiol. 2019;16(2):2819-2826. [In Persian]

18. Liu B-T, Liao X-P, Yang S-S, Wang X-M, Li L-L, Sun J. Detection of mutations in the gyrA and parC genes in Escherichia coli isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance genes from diseased food-producing animals. J Med Biotechnol. 2012;61:1591-1599.

19. Jafari R, Ghanbarpour R, Ghorbanpour Najafabadi M, Miyahi M. Determination of antibiotic resistance patterns in Escherichia coli isolated from healthy broiler chickens and those suffering from septicemia in air. J Vet Microbiol. 2014;11(2):116-109. [In Persian]

20. Ghaniei A, Mojaverrostami S, Lotfallahzadeh B, Darzi Lemraski M, Sepehrnia P, Imani Jajarmi A. Geographical and seasonal variation in antimicrobial susceptibility of Escherichia coli isolated from broiler chicken carcasses in Iran. Eur J Exp Biol. 2014;4:173-177.

21. Tabatabaei R, Nasirian A. Isolation, identification and antimicrobial resistance patterns of E. coli isolated from chicken flocks. Iran J Pharmacol Ther. 2003; 2(2):39-42.

22. Zahraei Salehi T, Farashi Bonab S. Antibiotics susceptibility pattern of Escherichia coli strains isolated from chickens with colisepticemia in Tabriz province, Iran. Int J Poult Sci. 2006;5:677-684.

23. Gregova G, Kmetova M, Kmet V, Venglovsky J, Feher A. Antibiotic resistance of Escherichia coli isolated from a poultry slaughterhouse. Ann Agric Environ Med. 2012;19:75-77.

24. Yang H, Chen S, White DG, Zhao S, McDermott P, Walker R, Meng J. Characterization of multiple-antimicrobial-resistant Escherichia coli isolates from diseased chickens and swine in China. J Clin Microbiol. 2004;42:3483-3489.

25. Horri M, Gholami-Ahangaran M. The frequency of qnra and sul1 genes in Escherichia coli isolated from pericarditis and perihepatitis lesions of broilers in Isfahan province. Anim Physiol Dev. 2022; 15(2):47-58. [In Persian]

26. Ponce-Rivas E, Muñoz-Márquez M-E, Khan AA. Identification and molecular characterization of class 1 integrons in multiresistant Escherichia coli isolates from poultry litter. Appl Environ Microbiol. 2012; 78(15):5444-5447.

27. Vanacker M, Lenuzza N, Rasigade J-P. The fitness cost of horizontally transferred and mutational antimicrobial resistance in Escherichia coli. Front Microbiol. 2023; 14: 1186920.

28. Helekal D, Keeling M, Grad YH, Didelot X. Estimating the fitness cost and benefit of antimicrobial resistance from pathogen genomic data. J R Soc Interface. 2023; 20(203):20230074.

 29. San Millan A, MacLean RC. Fitness costs of plasmids: a limit to plasmid transmission. Microbiol Spectr. 2017;5(5): MTBP-0016-2016.

30. WHO (World Health Organization). Critically Important Antimicrobials for Human Medicine. 6th Revision, Geneva. Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789241515528. 2019.

31. WOAH (World Organization for Animal Health). OIE standards, guidelines and recommendations on antimicrobial resistance and the use of antimicrobial agents. Paris. Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/ global-initiatives/antimicrobial-resistance. 2021.

 

 

84