Synthesis and Characterization of Liposomal Nanocarriers Containing Pomegranate Flower Extract to Investigate Its Toxicity on the MCF-7 Breast Cancer Cell Line

Subject Areas : Journal of Animal Biology

Ayda Shafigh ¹ , Lida Eftekharivash ^{2 *} , Ali Akbar Seifi Ashkezari ³

1 - Department of Microbiology, Maragheh Brench, Islamic Azad University, Maragheh, Iran
2 - Department of Microbiology, Maragheh Brench, Islamic Azad University, Maragheh, Iran
3 - Medical Student, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

Received: 2024-09-02 Accepted : 2024-12-23 Published : 2025-05-27

Keywords: Breast cancer, Pomegranate flower extract, Liposome, MCF-7, MTT,

Abstract :

Although pomegranate flower extract has anticancer properties, it requires carriers to improve its efficacy by delivering it to the target cells. Therefore, this study focuses on the development of pomegranate flower extract-loaded nanoliposomes and investigates their effects on MCF-7 breast cancer cells. In this study, after extracting the pomegranate flower extract and determining properties such as the maximum wavelength and standard curves, the extract-loaded nanoliposomes were synthesized using the thin-film method. The physicochemical characteristics of the nanoliposomes, including encapsulation efficiency, drug release, size, and zeta potential, were evaluated using spectrophotometry and DLS, while their morphology was studied using Fe-SEM and AFM microscopy. Finally, the antitumor activity of the nanoliposomes containing the extract and the free extract was assessed on MCF-7 cancer cells using the MTT assay. The results showed that the encapsulation efficiency of the synthesized nanostructure was 73.2 ± 2.6%, and the maximum release of the extract under normal and cancerous cell conditions was 51.3 ± 1.4% and 67.2 ± 2.6%, respectively. The nanoparticle size was 155.7 ± 4.1 nm, their polydispersity index was 0.345, and the zeta potential was -17.1 ± 3.4 mV. Microscopic images indicated that the nanoparticles had a spherical and uniform shape with no aggregation or precipitation. The nanoliposomes containing the extract showed higher toxicity on MCF-7 cells compared to the free extract, exhibiting a lower IC50, while the blank system showed minimal toxicity to healthy fibroblast cells. The nanostructure developed in this study not only demonstrated favorable physicochemical properties but also effectively loaded the pomegranate flower extract and significantly enhanced its antiproliferative effects, making it a promising candidate for breast cancer research.

References:

1. Akbari, P., Taebpour M., Akhlaghi M., Hasan S.H., Shahriyari S., Parsaeian M., Haghirosadat B.F., Rahdar A., Pandey S. 2024. Regulation of the P53 tumor suppressor gene and the Mcl-2 oncogene expression by an active herbal component delivered through a smart thermo-pH-sensitive PLGA carrier to improve osteosarcoma treatment. Medical Oncology, 41(3):68.
2. Akhlaghi, M., Eftekharivash, L., Parnian, F., Taebpour, M., Rostamian, T., Zarezadeh Mehrizi, M., Haghirosadat, B.F. 2021. Synthesis and study of cellular and physicochemical properties of nanoliposomes containing aqueous extract of Hedera Helix. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 12(45):97-112.
3. Akhlaghi, M., Eftekharivash, L., Taebpour, M., Afereydoon, S., Ebrahimpour, M., Mehrizi, M.Z., fatemeh Haghirosadat, B. 2022. Improving the therapeutic performance of glycyrrhiza glabra hydroalcoholic extract using liposomal nano-carriers and their characterization. Disease and Diagnosis, 11(2):39-48.
4. Akhlaghi, M., Taebpour, M., Lotfabadi, N. N., Naghib, S. M., Jalili, N., Farahmand, L., Tofighi, D. 2022. Synthesis and characterization of smart stimuli-responsive herbal drug-encapsulated nanoniosome particles for efficient treatment of breast cancer. Nanotechnology Reviews, 11(1):1364-1385.
5. American cancer society. 2025. cancer facts and figures 2025. Atlanta american cancer.
6. Baghiani, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2019. Experimental study: experimental evaluation of phospholipid system containing doxorubicin HCL for use in chemotherapy. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 26(11):945-956.
7. Bahrami-Banan, F., Sheikhha, M.H., Ghasemi, N., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2018. Preparation and study of nano-niosomes containing doxorubicin and evaluation of its toxicity on acute myeloblastic leukemia cell line KG-1. Journal of Payavard Salamat, 12(4):309-323.
8. Deng, Y., Li, Y., Yang, F., Zeng, A., Yang, S., Luo, Y., Yin, W. 2017. The extract from Punica granatum (pomegranate) peel induces apoptosis and impairs metastasis in prostate cancer cells. Biomedicine and Pharmacotherapy, 93:976-984.
9. DeSantis, C.E., Ma, J., Gaudet, M.M., Newman, L. A., Miller, K. D., Goding Sauer, A., Siegel, R.L. 2019. Breast cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 69(6):438-451.
10. DeSantis, C.E., Ma, J., Goding Sauer, A., Newman, L.A., Jemal, A. 2017. Breast cancer statistics, 2017, racial disparity in mortality by state. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 67(6):439-448.
11. Eftekhari-Vash, L., Majdizadeh, M. 2024. Fabrication and physicochemical characterization of liposome systems containing Glycyrrhiza glabra hydroalcoholic extract and evaluation of toxicity of free and liposomal extract on healthy human fibroblast cell line (HFF) and MCF-7 breast cancer cell line. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 18(4):59-69.
12. Faria, A., Calhau, C. 2011. The bioactivity of pomegranate: impact on health and disease. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 51(7):626-634.
13. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S.S.K., Torchilin, V.P. 2020. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews, 156:4-22.
14. Ghafari, M., Haghiralsadat, F., Khanamani Falahati‐pour, S., Zavar Reza, J. 2020. Development of a novel liposomal nanoparticle formulation of cisplatin to breast cancer therapy. Journal of Cellular Biochemistry, 121(7):3584-3592.
15. Kirby, C. J., Gregoriadis, G. 2019. A simple procedure for preparing liposomes capable of high encapsulation efficiency under mild conditions. In Liposome Technology (pp. 19–27). CRC Press.
16. Ghashghaei, M., Akhlaghi, M. 2021. Investigation of nanoniosomal formulation containing doxorubicin effect on ovarian cancer cell line (OVCAR-3 cell line). New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 11(43):46-62.
17. Harashima, H., et al. 1994. Enhanced hepatic uptake of liposomes through complement activation depending on the size of liposomes. Pharmaceutical Research, 11:402-406.
18. Kamińska, M., Ciszewski, T., Łopacka-Szatan, K., Miotła, P., Starosławska, E. 2015. Breast cancer risk factors. Menopause Review/Przegląd Menopauzalny, 14(3):196-202.
19. Karimi-Moghddam, A., Nikounahad-Lotfabadi, N., Haghiralsadat, B.F., Majdizadeh, M. 2019. Investigating the effect of lipid nanoparticles containing silibinin anti-cancer drug on the growth of breast cancer MCF-7 cell line. Journal of Torbat Heydariyeh University of Medical Sciences, 6(4):1-12.
20. Li, K., Xiao K., Zhu S., Wang Y., Wang W. 2022. Chinese herbal medicine for primary liver cancer therapy: Perspectives and challenges. Frontiers in Pharmacology, 13:889799.
21. Lindner, L.H., Hossann, M. 2010. Factors affecting drug release from liposomes. Current Opinion in Drug Discovery and Development, 13(1):111-123.
22. Majdizadeh, M., Akbarzadeh, S., Al-Turnachy, H.H., Hemati, M., Akhlaghi, M., Haghiralsadat, B.F., Oroojalian, F. 2025. Synthesis of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil and investigating their stability, antimicrobial, antioxidant, and antiproliferative properties. Nanomedicine Journal, 12(1):122-139.
23. Majdizadeh, M., Rezaei-Zarchi, S., Movahedpour, A.A., Shahi Malmir, H., Sasani, E., Haghiralsadat, B.F. 2018. A new strategy in improving therapeutic indexes of medicinal herbs: Preparation and characterization of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil. SSU Journals, 25(11):853-864.
24. Mirzaei, F., Majdizadeh, M., Fatahi-Bafghi, A., Ehsani, R., Haghiralsadat, B. F. 2021. Fabrication and characterization of liposomal nano-carriers containing essential oils of Trachyspermum ammi to counteract Trichomonas vaginalis. Koomesh, 23(2):283-290.
25. Moghadam, R.N., Majdizadeh, M., Golbashy, M., Haghiralsadat, F., Hemati, M. 2024. Laboratory study: Synthesis and optimization of nano-niosomes containing Bunium persicum essential oil and investigating its toxicity on Trichomonas vaginalis parasite and HFF cell line. Heliyon, 10(16):e35967.
26. Mohseni, M., et al. (2021). A new therapeutic approach for the treatment of breast cancer using synthesis of liposomes containing silybinin and their characterization. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 11(44):57-70.
27. Momenimovahed, Z., Salehiniya, H. (2019). Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world. Breast Cancer: Targets and Therapy, 11:151-164.
28. Nagayasu, A., Uchiyama, K., Kiwada, H. 1999. The size of liposomes: A factor that affects their targeting efficiency to tumors and the therapeutic activity of liposomal antitumor drugs. Advanced Drug Delivery Reviews, 40(1–2):75-87.
29. Oun, R., Moussa, Y.E., Wheate, N.J. 2018. The side effects of platinum-based chemotherapy drugs: a review for chemists. Dalton Transactions, 47(19): 6645-6653.
30. Pande, S. 2023. Liposomes for drug delivery: Review of vesicular composition, factors affecting drug release, and drug loading in liposomes. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 51(1):428-440.
31. Parnian, F., Hekmati-Moghadam, S.H., Majdizadeh, M., Jebali, A., Haghiralsadat, B.F. 2020. Fabrication of niosomal nano-carriers containing aqueous extract of hedera helix and comparison of toxicity of free extract and niosome extract on HT29 colorectal cancer cell line. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 15(3):31-45.
32. Pearce, A., Haas, M., Viney, R., Pearson, S. A., Haywood, P., Brown, C., Ward, R. 2017. Incidence and severity of self-reported chemotherapy side effects in routine care: A prospective cohort study. PloS one, 12(10):e0184360.
33. Pornsunthorntawee, O., Chavadej, S., Rujiravanit, R. 2011. Characterization and encapsulation efficiency of rhamnolipid vesicles with cholesterol addition. Journal of Bioscience and Bioengineering, 112(1):102-106.
34. Rabani, E., Behzadi, R., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2022. Fabrication of liposomal formulation containing paclitaxel and comparison of its toxicity with non-liposomal paclitaxel on MCF-7 breast cancer cell line. Pars Journal of Medical Sciences, 18(2):26-40.
35. Sasani, E., Shahi Malmir, H., Daneshmand, F., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2020. Synthesis and physiochemical characterization of liponiosomal hybrid nano-carriers as carriers for doxorubicin HCl anti-cancer drug. Journal of Sabzevar University of Medical Sciences, 27(1):35-47.
36. Sasani, E., Shahi Malmir, H., Daneshmand, F., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2018. A new study on synthesis and optimization of PEGylated liponiosomal nanocarriers containing curcumin for use in cancer chemotherapy. SSU Journals, 26(6):528-541.
37. Shahi Malmir, H., Kalantar, S.M., Sasani, E., Asgari, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2019. Synthesis and optimization of niosomal carriers containing doxorubicin in order to achieve a final formulation with high potential in cancer cells’ temperature and acidity. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 26(10):879-894.
38. Sharma, P., McClees, S.F., Afaq, F. 2017. Pomegranate for prevention and treatment of cancer: an update. Molecules, 22(1):177.
39. Siyadatpanah, A., Norouzi, R., Mirzaei, F., Haghirosadat, B.F., Nissapatorn, V., Mitsuwan, W., Nawaz, M., Lourdes, M., Hosseini, S. A., Montazeri, M., Majdizadeh, M., Almeida, R. S., Hemati, M., Wilairatana, P., Douglas, H. 2022. Green synthesis of nano-liposomes containing Bunium persicum and Trachyspermum ammi essential oils against Trichomonas vaginalis. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 56(1):150-162.
40. Smith, M.C., Crist R.M., Clogston J.D., McNeil S.E., 2017. Zeta potential: A case study of cationic, anionic, and neutral liposomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 409:5779-5787.
41. Sun, Y.S., Zhao, Z., Yang, Z.N., Xu, F., Lu, H.J., Zhu, Z.Y., Zhu, H.P. 2017. Risk factors and preventions of breast cancer. International Journal of Biological Sciences, 13(11):1387.
42. Taebpour, M., Akhlaghi, M., Shahriary, S., Hajihosseini, S., Haghiralsadat, F., Oroojalian, F., Tofighi, D. 2022. Synthesis, physicochemical characterization and pharmaceutical function of niosomal nanoparticles-encapsulated bioactive compound for osteosarcoma treatment. Nanomedicine Journal, 9(3):205-215.
43. Taebpour, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2021. Fabrication and characterization of liposomal nanoparticles containing hydroalcoholic extract of Artemisia absintium and its toxicity on MCF-7 breast cancer cell line. Iranian Journal of Breast Diseases, 14(1):64-77.
44. Taebpour, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F., Akhlaghi, M. 2021. Fabrication of liposomal nanoparticles containing hydroalcoholic extract of Silybum marianum and evaluation of its toxicity on human osteosarcoma cancer cell line (SAOS-2) and evaluation effect of free hydroalcoholic extract of Silybum marianum and empty liposomes on healthy human fibroblast cell (HFF). Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 16(1):61-73.
45. 45. Taebpour, M., Majdizadeh, M., Nodoushan, F.S., Akhlaghi, M., Haghiralsadat, B.F. 2023. Evaluation and Comparison of Punica Granatum Peel and Flower Extract Toxicity on MCF-7 Breast Cancer Cell Line and Comparison of Antioxidant Activity of Punica Granatum Peel and Flower Extract. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 18(1):9-16.
46. Talei-Ardakani, N., Daneshmand, F., Mirhoseini, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2020. Fabrication and characterization of physicochemical niosomal nanocarriers containing quercetin flavonoids for therapeutic purposes. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 15(1):fa32-fa40
47. van den Boogaard, W.M., Komninos, D.S., Vermeij, W.P. 2022. Chemotherapy side-effects: not all DNA damage is equal. Cancers, 14(3):627.
48. Waks, A.G., Winer, E.P. 2019. Breast cancer treatment: a review. Jama, 321(3):288-300.
49. Zarehzadeh-Mehrizi, M., Majdizadeh, M., Zarezadeh-Mehrizi, M., Afshoun, A., Zhian-Mehrizi, M., Haghiralsadat, B.F. 2023. Investigating the performance of liposomal formulations containing clove essential oil made by thin layer and heat method in temperature and pH conditions similar to the mouth in order to be used in the research of oral and dental diseases. Experimental Animal Biology, 12(46):15-26.

Full-Text:



 

 

 

Synthesis and Characterization of Liposomal Nanocarriers Containing Pomegranate Flower Extract to Investigate Its Toxicity on the MCF-7 Breast Cancer Cell Line

 

Ayda Shafigh1, Lida Eftekhari-Vash1*, Ali Akbar Seifi Ashkezari2

 

1- Department of Microbiology, Maragheh Brench, Islamic Azad University, Maragheh, Iran

2- Medical Student, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

*Corresponding author: [e-mail]

Received: 2 September 2024                                 Accepted: 23 December 2024

DOI:

 

Abstract

Although pomegranate flower extract has anticancer properties, it requires carriers to improve its efficacy by delivering it to the target cells. Therefore, this study focuses on the development of pomegranate flower extract-loaded nanoliposomes and investigates their effects on MCF-7 breast cancer cells. In this study, after extracting the pomegranate flower extract and determining properties such as the maximum wavelength and standard curves, the extract-loaded nanoliposomes were synthesized using the thin-film method. The physicochemical characteristics of the nanoliposomes, including encapsulation efficiency, drug release, size, and zeta potential, were evaluated using spectrophotometry and DLS, while their morphology was studied using Fe-SEM and AFM microscopy. Finally, the antitumor activity of the nanoliposomes containing the extract and the free extract was assessed on MCF-7 cancer cells using the MTT assay. The results showed that the encapsulation efficiency of the synthesized nanostructure was 73.2 ± 2.6%, and the maximum release of the extract under normal and cancerous cell conditions was 51.3 ± 1.4% and 67.2 ± 2.6%, respectively. The nanoparticle size was 155.7 ± 4.1 nm, their polydispersity index was 0.345, and the zeta potential was -17.1 ± 3.4 mV. Microscopic images indicated that the nanoparticles had a spherical and uniform shape with no aggregation or precipitation. The nanoliposomes containing the extract showed higher toxicity on MCF-7 cells compared to the free extract, exhibiting a lower IC50, while the blank system showed minimal toxicity to healthy fibroblast cells. The nanostructure developed in this study not only demonstrated favorable physicochemical properties but also effectively loaded the pomegranate flower extract and significantly enhanced its antiproliferative effects, making it a promising candidate for breast cancer research.

 

Keywords: Breast cancer, Pomegranate flower extract, Liposome, MCF-7, MTT.

 

 

 

 

سنتز و مشخصه­یابی نانوحامل‌های لیپوزومی حاوی عصاره گل انار به منظور بررسی سمیت آن بر روی رده­ی سلولی MCF-7 سرطان پستان

آیدا شفیق1، لیدا افتخاری­وش1*، علی اکبر سیفی اشکذری2

1- گروه میکروبیولوژی، واحد مراغه، دانشگاه آزاد اسلامی، مراغه، ایران

2- دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت: 12/06/1403 تاریخ پذیرش: 03/10/1403

DOI:

چکیده

اگرچه عصاره گل انار دارای خواص ضدسرطانی است، اما برای کارایی بهتر نیازمند حامل‌هایی است که آن را به سلول هدف برساند. بنابراین این مطالعه به ساخت نانولیپوزوم‌های حاوی عصاره گل انار و بررسی اثرات آن بر سلول‌هایMCF-7 سرطان پستان می‌پردازد. در این بررسی، پس از استخراج عصاره گل انار و تعیین خصوصیاتی مانند طول موج ماکسیمم و منحنی‌های استاندارد، نانولیپوزوم‌های حاوی عصاره با روش فیلم نازک سنتز گردید. ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی نانولیپوزوم‌ها، از جمله میزان انکپسولاسیون، میزان رهایش دارو، اندازه و پتانسیل زتا، با اسپکتروفتومتری و DLS بررسی شد و مورفولوژی آن‌ها با میکروسکوپ‌های Fe-SEM و AFM مورد مطالعه قرار گرفت. در نهایت، ویژگی ضدتوموری نانولیپوزوم‌ها حاوی عصاره و عصاره آزاد بر روی سلول‌های سرطانی MCF-7 با روش MTT ارزیابی شد. نتایج نشان می‌دهد که، راندمان انکپسولاسیون نانوسامانه سنتز شده 6/2 ± 2/73 درصد و حداکثر میزان رهاسازی عصاره در شرایط سلولی نرمال و سرطانی به ترتیب 4/1 ± 3/51 و 6/2 ± 2/67 درصد است. اندازه نانوذرات 7/4 ± 1/155 نانومتر، شاخص پراکندگی آنها 345/0 و بار الکتریکی نانوذرات 4/3 ± 1/17- میلی‌ولت می‌باشد. تصاویر میکروسکوپی نشان داده که نانوذرات دارای شکل کروی و یکنواخت بوده و تجمع یا رسوبی ندارند. نانولیپوزوم‌های حاوی عصاره نسبت به عصاره آزاد از سمیت بالاتری بر سلول‌های MCF-7 برخوردار بوده و IC50 پایین­تری را نشان دادند در حالیکه سامانه بدون عصاره، سمیت ناچیزی را برای سلول‌های سالم فیبروبلاستی ایجاد نموده است. نانوسامانه سنتز شده در این مطالعه علاوه بر داشتن خواص فیزیکوشیمیایی مناسب، توانست به طور موثری عصاره گل انار را بارگیری و به طور چشمگیری خواص ضد تکثیری آن را افزایش دهد، بنابراین می­تواند در تحقیقات مرتبط با سرطان پستان مورد توجه قرار گیرد.

کلمات کلیدی: سرطان پستان، عصاره گل انار، لیپوزوم، MCF-7، MTT.

مقدمه

سرطان پستان یکی از شایع­ترین انواع سرطان‌ها در سراسر جهان است که با نرخ پنج برابری نسبت به سرطان‌های درگیر در حال رشد است. به عبارت دیگر سرطان پستان دومین علت مرگ و میر ناشی از سرطان بعد از سرطان ریه در زنان محسوب می‌شود. سرطان پستان از لحاظ خصوصیات پاتولوژیک بسیار ناهمگن است (41). در برخی موارد رشد آهسته با پیش آگاهی بالا و در برخی موارد دیگر تومورهای تهاجمی دارد (48). پیش­بینی­ها نشان می‌دهد که نه تنها شیوع سرطان پستان در سراسر جهان بلکه مرگ­ومیر ناشی از آن نیز در حال افزایش است، به طوری­که بر اساس آمار جهانی تا سال2050 نرخ ابتلا به سرطان پستان به 2/3 میلیون مورد جدید در سال می‌رسد که نیاز مبرم به اقدامات پیشگیرانه و درمانی را در حوزه­ی سلامت جامعه لازم شمرده است (9). در سال ۲۰۱۵، تقریباً 600 هزار مورد فوتی ناشی از آن گزارش شده است. هر سال، بیش از ۱.۵ میلیون زن، معادل ۲۵ درصد از کل زنان مبتلا به انواع سرطان‌ها، به سرطان پستان دچار می‌شوند (10). در ایالات متحده در سال 2025، تخمین زده می‌شود که 316950 مورد جدید سرطان پستان مهاجم در زنان و 2800 مورد در مردان تشخیص داده شود (5). فاکتور­های متعددی از جمله جنسیت، افزایش سن، هورمون‌های استروژن، سابقه خانوادگی، جهش‌های ژنتیکی و سبک زندگی ناسالم وجود دارند که می‌توانند احتمال ابتلا به سرطان پستان را افزایش دهند (18، 27). گزینه‌های فعلی درمانی سرطان شامل جراحی، شیمی درمانی و پرتودرمانی و یا ترکیبی از این گزینه‌ها است (4) در شیمی درمانی از داروهایی استفاده می‌شود که با تداخل در سنتز DNA و و اختلال در تقسیم میتوز، از تکثیر سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌شود. این فرایند می‌تواند علاوه بر سلول‌های سرطانی، به سلول‌های سالم بدن نیز آسیب برساند و عوارض جانبی ناخواسته و نامطلوبی از جمله کاهش اشتها، تهوع، ریزش مو، بیماری­های قلبی و غیره، ایجاد نماید (32، 47). علاوه بر این، از آنجا که دسترسی زیستی این داروها به بافت­های تومور نسبتاً ضعیف است، دوزهای بیشتری لازم است که منجر به سمیت زیاد در سلول‌های طبیعی و افزایش بروز مقاومت چندگانه به داروها می‌شود (29). بنابراین، مطلوب است که از روشی استفاده کنیم که بتواند سلول‌های سرطانی را بطور فعال هدف قرار دهد و از این طریق عوارض جانبی را درحین درمان، کاهش دهد. ظهور فناوری نانو در دو دهه گذشته تأثیر عمیقی بر روی درمان‌های بالینی داشته است. در مقایسه با عوامل شیمی درمانی معمولی، ناقلین مواد دارویی نانومقیاس با بهبود اثربخشی درمان، ضمن جلوگیری از سمیت در سلول‌های طبیعی به دلیل ویژگی­هایی مانند تجمع انتخابی بالا در تومورها از طریق افزایش نفوذپذیری و احتباس پتانسیل مقابله با برخی از این چالش­ها را نشان داده­اند (16، 42). لیپوزوم نوعی نانو حامل لیپیدی است که در سال­های اخیر توجه بسیاری از پژوهشگران حوزه رسانش هدفمند دارو را به خود جلب نموده است که با توجه به شباهت آن به سیستم­های بیولوژیکی، از زیست سازگاری بالایی برخوردار است. این مهم نشان دهنده یک پتانسیل امیدوار کننده به عنوان عاملی برای تحویل دارو است. طیف وسیعی از مواد نشان داده شده است که می‌توانند به­طور مؤثر در لیپوزوم‌ها برای دستیابی به درمانی بهتر کپسوله شوند (34، 6). گیاهان دارویی و مشتقات آنها مانند عصاره و اسانس آنها از جمله ترکیباتی هستند که می‌توانند درون نانوذرات دارو رسان بارگذاری گردند و تحقیقات زیادی نشان داده است که استفاده از آنها می‌تواند در درمان بیماری­هایی چون دیابت، بیماری­های عصبی، بیماری­های قلبی عروقی و سرطان مفید باشد (3، 13) این مواد به دلیل ماهیت طبیعیشان، زیست­­سازگاری بالایشان با بدن انسان، عوارض جانبی ناچیز و قیمت مناسبشان می‌توانند به عنوان داروهای جایگزین یا مکمل برای داروهای شیمیایی معرفی گردند. انار (granata Punica) از قدیمی­ترین میوه­های خوراکی است که بخش­های مختلف آن شامل، پوست، دانه، گل و آب دارای ترکیبات فلانوئیدی، آلکالوئیدی، اسیدهای آلی و غیره با خواص آنتی­اکسیدانت، ضدمیکروبی، ضدالتهابی و ضدسرطانی است (13، 38). عصاره میوه­ی انار توانایی مهار سیکلین کینازها را دارد که منجر به مهار رشد سلول سرطان و به دنبال آن آپوپتوز سلول‌های سرطانی انسانی می‌شود که با تغییر سطح Bax و Bcl-2 با آپوپتوز سلول سرطانی همراه است (8) در همین راستا، هدف از این مطالعه بررسی و مقایسه­ی خواص ضد سرطانی عصاره‌ هیدروالکلی گل انار لیپوزومال بر روی رده ی سلولی MCF-7 سرطان پستان است.

مواد و روش­ها

تهیه مواد: فسفاتیدیل  کولین80 (SPC80)، کلسترول و قرص Phosphate Buffered Saline(PBS) متعلق به شرکت Sigma آمریکا، ایزوپروپیل، کلروفرم و اتانول متعلق به شرکت Merck آلمان تهیه و خریداری شد. همچنین مواد شیمیایی استفاده شده در آنالیزهای سلولی شامل محیط کشت آماده DMEM، سرم جنین گاوی (FBS) و تریپسین به همراه آنتی­بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین متعلق به شرکت GIBCO ایالات متحده آمریکا خریداری و آماده­سازی شده­اند.

جمع­آوری و عصاره­گیری گل انار: در ابتدا گل انار جمع­آوری و نوع و گونه­ی آن به تایید متخصصان گیاه شناسی دانشگاه یزد رسید. این گل­ها سپس در سایه خشک گردیدند و بعد از پودر شدن به وسیله­ی آسیاب برقی، سایر مراحل به وسیله­ی پودرهای حاصله انجام شد. برای عصاره گیری از دستگاه سوکسله استفاده گردید که خود متشکل از چهار بخش اصلی بالن، هیتر، کندانسور و لوله­ی خروجی است. برای شروع عصاره­گیری، 50 گرم از پودر حاصله درون کاغذ کارتوش فشرده و در داخل ستون کندانسور قرار گرفت و با اضافه کردن 500 میلی­لیتر اتانول 70% به بالن سوکسله و اتصال آن به به دستگاه فرایند عصاره­گیری ادامه پیدا کرد. بعد از آن با اتصال منبع ورودی آب و خروجی کندانسور این فرآیند کامل گردید. عصاره­گیری در شش سیکل انجام گرفت و در آخر عصاره حاصله به وسیله کاغذ صافی واتمن تخلیص گردید. در آخرین مرحله به منظور تبخیر حلال عصاره درون ظروف شیشه ی و در دمای محیط قرار گرفتند و بعد، تا زمان استفاده در یخچال نگهداری گشتند (2).

بررسی طول موج جذبی ماکزیموم عصاره (ƛmax) و رسم نمودارهای استاندارد در بافر فسفات­سالین و ایزوپروپیل: به منظور به دست آوردن طول موج جذبی ماکزیموم عصاره در محدوده­ی نور مرئی از عصاره، محلول استوک به غلظت 1 میلی­گرم/میلی­لیتر در ایزوپروپیل و بافر PBS  ساخته شد. با استفاده از این محلول­ها و روش سری رقت­های متوالی، غلظت­های مختلفی از عصاره در محدوده­­ی 0 تا 1000 میلی­گرم/میلی­لیتر تهیه و با استفاده ااز دستگاه اسپکتروفتومتر (Epoch، آمریکا) طول موج جذبی عصاره در محدوده­ی نور مرئی (200 تا 800 نانومتر) در تمامی غلظت­های تهیه شده، خوانده شد. در آخر طول موجی که بیشتر میزان جذب در همه­ی غلظت­ها را داشت به عنوان طول موج جذبی ماکزیموم عصاره­ گل انار انتخاب گردید. این مرحله با سه بار تکرار صورت گرفت. برای رسم منحنی استاندارد عصاره در حلال ایزوپروپیل و PBS نیز با بهره­گیری از جذب­های به دست آمده در غلظت­های مختلف عصاره در هر یک از بافر­ها و با بهره­گیری از نرم­افزار Excel منحنی استاندارد عصاره در بافر­های مذکور رسم و منحنی خط آنها به دست آمد. آزمایشات این مرحله نیز مانند مرحله­ی قبل با سه با تکرار صورت گرفت (2) 

روش فیلم نازک و ساخت نانولیپوزوم­های حاوی عصاره گل انار: در این مطالعه برای سنتز نانوذرات لیپیدی حاوی عصاره از روش فیلم نازک استفاده گردید که خود شامل چندین مرحله است (2) : مرحله­ی اول: سنتز فیلم نازک: در مرحله اولیه، SPC80 و کلسترول با نسبت مولی 70:30، وزن‌بندی شده و سپس درون بالون مناسبی که با مقداری کلروفرم پر شده است، حل گردید. غلظت مشخصی از عصاره به مخلوط لیپیدی در بالون افزوده شد. سپس، بالون را روی دستگاه روتاری ایواپراتور (هایلدوف، آلمان) با دمای تنظیم شده 50 درجه سانتی‌گراد و سرعت چرخش 150 دور در دقیقه قرار دادیم تا طی 20 دقیقه، مخلوط به صورت یکدست و همگن درآید. در ادامه در شرایط خلا، حلال آلی را حذف می‌کنیم و در نهایت، یک لایه نازک لیپیدی در ته بالون تشکیل گردید. مرحله­ی دوم کاهش سایز با سونیکاسیون حمامی: در این مرحله برای کوچک‌سازی ذرات، از روش سونیکاسیون به حمامی به مدت 40 دقیقه استفاده شد. مرحله سوم همگن سازی با فیلتراسیون: در مرحله فیلتراسیون، برای حذف ناخالصی‌ها و ذرات با اندازه نامطلوب، از فیلترهایی با قطرهای 45/0 میکرومتر و 22/0 میکرومتر استفاده شد تا سوسپانسیون نهایی از آن‌ها عبور داده شود. مرحله­ چهارم; جداسازی عصاره آزاد و بارگیری نشده با روش کیسه دیالیز: برای حذف دارویی که در لیپوزوم‌ها جای نگرفته، از روش دیالیز استفاده شد. کیسه‌های دیالیز با وزن مولکولی 12 تا 14 کیلودالتون به کار رفتند تا داروی آزاد را جدا کنند و میزان رهایش دارو را مورد بررسی قرار دهند. کیسه‌های دیالیز پیش از استفاده، بین 2 تا 12 ساعت در آب مقطر 70 درجه سانتی‌گراد خیسانده شدند. سپس، محلول دارویی به درون کیسه دیالیز انتقال یافت و به بشری که حاوی 150 برابر حجم نمونه محلول بافر PBS منتقل شد. بشر دارای نمونه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در حمام یخ قرار گرفت و همزن کار گذاشته شد. فرآیند دیالیز در دو مرحله 30 دقیقه‌ای انجام شد و در هر مرحله، بافر تازه جایگزین بافر قدیمی شد. 

بررسی راندمان انکپسولاسیون نانولیپوزوم­های حاوی عصاره: لیپوزوم­های حاوی عصاره را با نسبت‌های 1 به 10، 1 به 20 و 1 به 40 با ایزوپروپیل مخلوط کردیم تا دیواره لیپیدی آن‌ها شکسته شود و عصاره محبوس در داخل آزاد گردد. در نهایت، میزان جذب عصاره آزاد شده در رقت‌های مختلف و در طول موج ماکسیمم مشخص شده را با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر اندازه‌گیری کردیم و با بهره‌گیری از منحنی استاندارد عصاره در ایزوپروپیل و رابطه زیر، درصد بارگذاری عصاره در لیپوزوم­ها را محاسبه کردیم (2):  × 100 = راندمان عصاره بارگذاری شده  

بررسی روند رهایش عصاره از نانوسامانه: مطالعه‌ای بر فرآیند آزادسازی عصاره از نانولیپوزوم­های تهیه‌شده انجام شد که در آن از تکنیک دیالیز استفاده گردید. در این تکنیک، حجمی معادل 20 میلی‌لیتر از لیپوزوم‌های دارای عصاره در داخل کیسه دیالیز قرار داده شد و برای مدت زمان 48 ساعت در کنار 200 میلی‌لیتر بافر PBS با نسبت 1 به 10، در شرایط دمایی و اسیدیته متفاوت (دمای 37 درجه سانتی‌گراد و pH معادل 4/7 (مطابق با شرایط فیزیولوژیک بدن) و (دمای 42 درجه و pH 4/5 (شرایط سلول سرطانی) نگهداری گردید. در فواصل زمانی مشخص و دوره‌ای (0.5، 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 12، 24 و 48 ساعت)، 1 میلی‌لیتر از محلول بافر اطراف کیسه دیالیز برداشته شده و مقدار مشابهی (1 میلی‌لیتر) از بافر تازه با دما و pH برابر جایگزین گردید. سپس، میزان جذب نمونه‌های برداشته شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ماکزیموم عصاره اندازه‌گیری و بر اساس منحنی استاندارد عصاره در بافر PBS، نمودار آزادسازی عصاره از نانوذرات ترسیم شد (2).

تعیین بار الکتریکی سطحی و اندازه نانوذرات: برای تعیین قطر ذرات نانو و بار الکتریکی سطحی آن‌ها (پتانسیل زتا)، از دستگاه زتا سایزر (مدل HORIBA) استفاده شد. اندازه‌گیری‌ها با استفاده از نور لیزر با طول موج 657 نانومتر و در زاویه 90 درجه در دمای 25 درجه سلسیوس انجام پذیرفت (2).

بررسی مورفولوژی نانوذرات: برای تحلیل و مطالعه بار سطحی نانوسیستم لیپوزومی که در این تحقیق ساخته شده است، حجمی معادل 25 میکرولیتر از محلول لیپوزومی بر روی یک شیشه میکروسکوپی قرار گرفت و در معرض هوا خشک شد. سپس نمونه‌ها به مدت کوتاهی با طلا پوشانده شدند تا هدایت الکتریکی پیدا کنند. در نهایت، با استفاده از میکروسکوپ الکترونی Fe-SEM و با توان 100 وات، ویژگی‌های سطحی نانوحامل‌ها از جمله زبری، شکل، همواری و تجمع‌یافتگی مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش، از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) برای مطالعه ویژگی‌های سطحی نانوذرات از جمله زبری، شکل‌گیری و تجمع استفاده شد. میکروسکوپ نیروی اتمی، که یک ابزار دقیق برای تحلیل سطوح با دقت نانومتری است، به ما امکان می‌دهد تا توپوگرافی سطحی نمونه‌ها را با استفاده از یک نوک بسیار تیز با طولی معادل 2 میکرون و قطری کمتر از 10 نانومتر بررسی کنیم (2).

رده­ی سلولی: در این مطالعه از سلول‌های سرطانی سرطان پستان رده­ی MCF-7 به عنوان سلول‌های سرطانی که از انسیتو پاستور تهران تهیه شدند استفاده گردید. همچنین از سلول های سالم فیبروبلاستی پوست ختنگاه انسان رده­ی HFF که از مرکز ناباروری (IVF) یزد به دست امدند به عنوان رده­ سالم و نرمال استفاده گردید. هر دو سلول­ در محیط DMEM و مطابق با پروتکل کشت سلولی ATCC (American Type Culture Collection) کشت داده شدند.

آماده­سازی محیط کشت: محلول کشت DMEM طبق دستورالعمل موجود در جدول 1، با استفاده از 500 میلی‌لیتر آب دیونیزه و استریل شده تهیه شد. پس از اینکه محلول به طور کامل همگن شد، 500 میکرولیتر از داروی ضد قارچ آمفوتریسین-B با غلظت 1 میکرولیتر بر میلی‌لیتر به محیط اضافه گردید. سپس، محیط کشت با افزودن 10 درصد سرم FBS غنی‌سازی شده و pH آن در محدوده 2/7 تا 4/7 تنظیم گردید. درنهایت، با استفاده از فیلتر 22/0 میکرومتری و رعایت شرایط استریل، محیط کشت زیر هود لامینار استریلیزه شد.

بررسی سمیت سلولی نانوذرات: آزمایش MTT، که بر اساس رنگ‌سنجی عمل می‌کند، بر پایه تبدیل کریستال‌های تترازولیوم زردرنگ (MTT) به فرمازان توسط آنزیم‌های ردوکتاز میتوکندریایی در سلول‌های زنده استوار است. با استفاده از آزمایش MTT، میزان بقای سلول‌ها پس از تماس با نانولیپوزوم­های حاوی عصاره در پلیت‌های 96 خانه با تراکم سلولی 1×104 برای هر چاهک (100 میکرولیتر کشت DMEM حاوی 10% FBS و 1% آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین) سنجیده شد. پس از انتقال سلول‌ها به چاهک‌ها، برای اطمینان از چسبندگی آن‌ها، 24 ساعت انکوباسیون انجام شد. سپس، محیط فوقانی چاهک‌ها خارج و با محیط کشت جدید حاوی فرم آزاد عصاره، عصاره لیپوزومال (غلظت­های 5/12، 25، 50، 100، 200، 400، 800، 1000 میکروگرم/میلی­لیتر) و لیپوزوم­های خالی (با سری رقت­های مشخص) تیمار شدند. پس از 72 ساعت، 20 میکرولیتر از محلول MTT با غلظت 5/0 میلی‌گرم/میلی‌لیتر در PBS با pH برابر 7 به هر چاهک اضافه و 4 ساعت دیگر انکوباسیون داده شد تا سلول‌های زنده فرصت متابولیزه کردن MTT را داشته باشند. پس از این مدت، محلول داخل چاهک‌ها خارج و 160 میکرولیتر DMSO برای حل کردن کریستال‌های فورمازان به هر چاهک افزوده شد. محلول درون چاهک‌ها به خوبی مخلوط و 30 دقیقه دیگر انکوبه شد. در نهایت، جذب نوری هر چاهک با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (مدلSynergy HTX، شرکت Bio Tek، آمریکا) در طول موج‌های 570 و 630 نانومتر خوانده و درصد بقای سلول‌ها با استفاده از رابطه زیر محاسبه گردید (2).  

 × 100 = میزان زنده­مانی سلول‌ها (%)

آنالیز آماری: برای تحلیل داده‌های آماری و تهیه چارت‌ها، از نسخه ششم نرم‌افزار پریسم بهره گرفته شد. تست ANOVA برای مقایسه گروه‌ها با در نظر گرفتن سطح خطای معناداری 5% به کار رفت. مقادیر P که از 5% بیشتر بودند، نادیده گرفته شدند. برای تجزیه­وتحلیل نتایج آزمون MTT، از نرم‌افزار مایکروسافت اکسل ورژن 2013 استفاده شد. همچنین، برای بررسی داده‌های FE-SEM، از نرم‌افزار ImageJ استفاده گردید.

 

 

جدول 1- مواد مصرفی به همراه وزن مورد استفاده شده برای ساخت محیط کشت DMEM

Table 1. Ingredients and weight used to make DMEM culture medium

DMEM (g)	NaHCO3 (g)	Penicillin (g)	Streptomycin (g)	L-Glutamine (g)
4.995	1.85	0.005	0.006	0.146

 

نتایج

 

طول موج ماکزیموم عصاره گل انار: بر اساس روشی که در بخش پیشین آورده شده، نمودار طیفی جذب عصاره گل انار در سطوح متفاوت غلظت، مشابه با نمایش داده شده در شکل 1 می‌باشد. بیشینه جذب این عصاره در طول موج 220 نانومتر رخ می‌دهد. لذا این طول موج به عنوان طول موج جذبی ماکزیموم در نظر گرفته شد و در سایر تحلیل­ها از آن استفاده گردید.

نمودارهای استاندارد عصاره گل انار در بافرهای فسفات سالین و ایزوپزوپانول: با بهره‌گیری از طول موج بیشینه جذبی عصاره گل انار، نمودارهای استاندارد برای این عصاره در محلول‌های ایزوپروپیل و PBS ترسیم شد. در محلول ایزوپروپیل (شکل 2)، نمودار استاندار به صورت خط مستقیم با فرمول Y=0.0028X-0.0054 و ضریب رگرسیون (R²) برابر با 0.9998مشاهده می‌شود. در محلول PBS (شکل3 ) نیز، نمودار به صورت خط مستقیم با فرمول Y=0.01118X-0.003406 و ضریب رگرسیون 9996/0 است.

اندازه و بار الکتریکی سطحی نانوسامانه ستز شده حاوی عصاره گل انار: جهت بررسی سایز نانولیپیوزوم­های حاوی عصاره از دستگاه زتا سایز استفاده گردید. نتایج نشان داد که سایز نانوذرات برابر با 7/4 ± 1/155 نانومتر است، که از نظر عددی در محدوده­ی مناسبی قرار می­گیرد. همچنین شاخص پراکندگی (PDI) برابر با 345/0 است. بار سطحی نانوذرات نیز به وسیله­ی دستگاه DLS اندازه­گیری گردید. بر اساس آن داده­ها می‌توان اینگونه استنباط کرد که پتانسیل زتای نانوذرات برابر با 4/3 ± 1/17- و نانو ذرات آنیونی هستند. نتایج اندازه ذرات و پتانسیل زتای نانو حامل‌ها در جدول 2 گزارش شده است.

میزان درونگیری نانو سامانه و میزان رهایش عصاره: در نانوسیستم تولید شده، میزان بارگیری عصاره گل انار با بهره‌گیری از منحنی کالیبراسیون مربوطه در محیط ایزوپروپیل و با استفاده از فرمولاسیون مشخص، محاسبه شده و به طور میانگین 2/73 درصد با انحراف معیار 6/2 درصد به دست آمده است. تحلیل روند آزادسازی عصاره در شرایط متغیر دما و pH و در بازه‌های زمانی متفاوت با استفاده از داده‌های استاندارد عصاره این گیاه در محلول PBS انجام پذیرفته و در نمودار مربوطه (شکل 4) نمایش داده شده است. مطالعه الگوی آزادسازی عصاره از نانوسیستم حاکی از آن است که سیستم مورد نظر دارای آزادسازی تدریجی و دو مرحله‌ای می‌باشد و در برابر عوامل محرک مختلف مانند دما و pH واکنش‌های متفاوتی را نشان می‌دهد. بالاترین میزان آزادسازی، که در طی 48 ساعت در شرایط فیزیولوژیک بدن به میزان 3/51 درصد با انحراف معیار 4/1 درصد رخ داده، در حالی که در شرایط سرطانی با دمای بیشتر و pH پایین‌تر، این میزان به 2/67 درصد با انحراف معیار 4/2درصد می‌رسد. بر اساس نمودار به دست آمده، آزادسازی عصاره از سیستم در دو مرحله انجام می‌شود؛ مرحله اول با آزادسازی سریع‌تر که در 8 ساعت اولیه رخ می‌دهد، ناشی از تفاوت قابل توجه در غلظت عصاره درون سیستم و محیط اطراف آن است، در حالی که مرحله دوم با کاهش شیب نمودار مشخص می‌شود که به دلیل کاهش تفاوت غلظت ایجاد شده است. نمودار شکل 4 الگوی رهایش عصاره از سامانه لیپوزومی در شرایط مشابه سلول‌های سرطانی و سالم نشان می‌دهد.

مورفولوژی نانوذرات حاوی عصاره: تصویر حاصل میکروسکوپ FE-SEM (شکل 5) نشان می‌دهد که نانو ذرات حاوی عصاره تشکیل گردیده و از مورفولوژی کروی و سطح صاف برخوردار هستند.  نتایج حاصل از بررسی سه بعدی نانوذرات حاوی عصاره گل انار به وسیله­ی AFM نیز در شکل 6 نشان داده شده است. بر اساس این تصاویر می‌توان نتیجه گرفت که نانوذرات دارای توپولوژی مناسب، کروی شکل و فاقد تجمع ناخواسته هستند که صحتی دیگر بر مورفولوژی مناسب نانو وزیکول­های لیپیدی سنتز شده در این مطالعه است.

سمیت نانوسامانه سنتز شده بر سلول‌های سرطانی با روش MTT: تست سمیت سلولی نشان می‌دهد که لیپوزوم­های فاقد عصاره سمیت ناچیزی بر سلول‌های سالم فیبروبلاست (HFF) داشته­اند، این یافته‌ها امیدوارکننده است که عوارض جانبی ناخواسته بر سلول‌های طبیعی بدن نیز کاهش خواهند یافت، که این امر زیست‌سازگاری نانولیپوزوم­ها را تأیید می‌کند (شکل 7). بر اساس نتایج آزمون MTT که پس از ۴۸ ساعت انکوباسیون بر روی سلول‌های MCF-7 با غلظت‌های متفاوت لیپوزومی و آزاد عصاره گل انار انجام شد، مشخص شد که سمیت لیپوزوم­های حاوی عصاره پس از این مدت به طور قابل توجهی (005/0  p <) بیشتر از حالت آزاد عصاره است (شکل 8). این آزمایش نه تنها خاصیت ضد تکثیری عصاره گل انار را بر روی سلول‌های سرطانی سرطان پستان تأیید می‌کند، بلکه نشان می‌دهد که عصاره در حالت لیپوزومی اثر سمی قوی‌تری بر سلول‌های سرطانی دارد (شکل 8). علاوه بر این، نتایج نشان می‌دهند که سمیت عصاره در حالت انکپسوله شده در تمامی غلظت‌ها به طور معناداری (005/0 > p) بیشتر از حالت آزاد است و باعث مرگ­ومیر بیشتری در این سلول‌های سرطانی می‌شود. همچنین مشاهده شده که با افزایش غلظت عصاره، در هر دو حالت، سمیت آن بر روی سلول‌های سرطانی افزایش می‌یابد. مقایسه میزان IC50 عصاره‌های آزاد و انکپسوله شده در شکل 9 نشان می‌دهد که لیپوزوم­های حاوی عصاره در غلظت‌ها و دوزهای کمتر می‌توانند سمیت بیشتری نسبت به حالت آزاد ایجاد کنند، چرا که IC50 عصاره در حالت آزاد برابر با 2/8 ± 6/426 میلی‌گرم/میلی‌لیتر و در حالت انکپسوله برابر با 1/4 ± 3/164 میلی‌گرم/میلی‌لیتر است، که این دو مقدار به طور معناداری متفاوت هستند.

 

 

جدول 2- ویژگی­های فیزیکوشیمیایی نانوسامانه سنتز شده

Table 2. Physicochemical characteristics of the synthesized nanosystem

Polydispersity index (PDI)	zeta potential (mV)	Size (nm)	Maximum release within 48 hours in cancer conditions  (%)	Maximum release within 48 hours under normal conditions  (%)	Encapsulation efficiency  (%)
0.345	-17.1 ± 3.4	155.1 ± 4.7	67.2 ± 2.6	51.3 ± 1.4	73.2 ± 2.6

 

 

شکل 1- طول موج جذبی عصاره در بازه 200 تا 800 نانومتر. بیشترین میزان جذب در طول موج 220 نانومتر مشاهده شد.

Fig. 1. Absorption wavelength of the extract in the range of 200 to 800 nm. The highest amount of absorption was observed at the wavelength of 220 nm.

 

 

شکل 2- نمودار استاندارد عصاره­ی گل انار در بافر  ایزوپزوپیل

Fig. 2. Standard curve of pomegranate flower extract in isopropyl

 

 

شکل 3- نمودار استاندارد عصاره­ی گل انار در بافر  PBS

Fig. 3. Standard curve of pomegranate flower extract in PBS buffer

 

 

شکل 4- بررسی روند رهاسازی عصاره از نانوسامانه لیپوزومی در پاسخ به محرک­های مختلف دما و pH. شکل نشان می‌دهد که نانوسامانه لیپیدی دارای رهایشی کنترل شده و آهسته است. براساس این شکل مشخص می‌شود که بیشترین میزان رهایش در 48 در شرایط نرمال 4/1 ± 3/51 و در شرایط سلول‌های سرطانی برابر است با  4/2 ± 2/67 درصد است.

Fig. 4. Examining the release process of the extract from the liposomal nanosystem in response to different stimuli of temperature and pH. The figure shows that the lipid nanosystem has a controlled and slow release. Based on this figure, it is clear that the highest release rate at 48 is 51.3 ± 1.4 in normal conditions and 67.2 ± 2.4 percent in cancer cells.

 

 

شکل 5-  تصویر به دست آمده از آنالیز نانولیپوزومهای حاوی عصاره با میکروسکوپ FE-SEM

Fig. 5. Image obtained from the analysis of nano-liposomes containing extract with FE-SEM microscope

 

شکل 6- تصویر به دست آمده  از بررسی نانولیپوزوم­های حاوی عصاره به وسیله­ی میکروسکوپ AFM

Fig. 6. Image obtained from examining nanoliposomes containing extract using AFM microscopy

 

 

شکل 7- بررسی سمیت نانولیپوزوم­های فاقد عصاره بر روی سالم HFF. نتایج حاصل از این آنالیز در طی 48 ساعت با استفاده از روش MTT نشان می‌دهد این نانوذرات سمیت بسیار کمی بر روی سلول فیبروبلاست (HFF) دارند.

Fig. 7. Toxicity study of extract-free nanoliposomes on healthy HFF. The results of this analysis over 48 hours using the MTT method show that these nanoparticles have very low toxicity on fibroblast cells (HFF).

 

 

شکل 8- بررسی سمیت سلولی نانوسامانه سنتز شده با روش MTT. با توجه به نمودار، اثر سمیت با افزایش غلظت در هر دو حالت آزاد و انکپسوله رابط مستقیم دارد و با افزایش غلظت سمیت افزایش میابد. همچنین سمیت عصاره انکپسوله در همه غلظت­ها نسبت به عصاره آزاد به طور معناداری بیشتر است. NS: فاقد اخلاف معنادار، **: p <0.005 و ***: p <0.005

Fig. 8. Evaluation of the cytotoxicity of the synthesized nanosystem by MTT method. According to the graph, the toxicity effect has a direct relationship with the increase in concentration in both free and encapsulated states, and the toxicity increases with the increase in concentration. Also, the toxicity of the encapsulated extract is significantly higher than the free extract in all concentrations. NS: No significant differences. **and***: p < 0.005.

 

شکل 9- بررسی میزان IC50 عصاره گل انار در حالت آزاد و انکپسوله با استفاده از آنالیز MTT. بر اساس این نمودار می‌توان اینگونه استنباط کرد که سمیت عصاره انکپسوله نسبت به عصاره آزاد، بر روی سلول­های رده­یMCF-7  سرطان پستان به طور معناداری افزایش پیدا کرده است. **: 005/0 p <

Figure 9. Checking the IC50 value of pomegranate flower extract in free and encapsulated state using MTT analysis. Based on this graph, it can be concluded that the toxicity of the encapsulated extract compared to the free extract has significantly increased on MCF-7 breast cancer cells. **: p < 0.005

 

بحث

 

استفاده از ترکیبات ضد تکثیری علیه سلول‌های سرطانی که دارای اثرات درمانی بالا و عوارض جانبی اندک باشد، لازم و ضروری است و در این بین ترکیبات گیاهی گزینه مناسبی برای این منظور است. ولی استفاده از آنها با چالش­هایی روبرو است که استفاده از نانوذرات بویژه حامل‌های لیپیدی نظیر لیپوزوم می‌تواند در کاهش این مشکلات موثر باشند. در این مطالعه نانو حامل‌های لیپوزومی حاوی عصاره گل انار را سنتز نموده و ضمن سنجیدن ویژگی­های فیزیکوشیمیایی آن، اثرات ضد تکثیری آن را بر رده سلولی MCF-7 سرطان پستان بررسی نمودیم. آمار و ارقام حاکی از ناکارآمدی روش­های درمانی کنونی در درمان سرطان پستان است. افزایش روز افزون تعداد مبتلایان به این بدخیمی در سرتاسر جهان و همچنین تعداد بالای مرگ­ومیر گزارش شده در میان مبتلایان از یک سو و مقاومت سلول‌های توموری در برابر شیمی‌درمانی و عوارض جانبی شدید ناشی آن از سوی دیگر، نیاز به یک استراتژی درمانی جدید را برای درمان این بدخیمی روشن می‌کند (26). بسیاری از مطالعات کارامدی استفاده از گیاهان و عصاره­های آنها را به عنوان عوامل ضد سرطان ایمن با عوارض جانبی کم برای مبارزه با سرطان تایید می‌کند (20). عصاره گل انار به دلیل برخورداری از ترکیبات فعال زیستی نظیر پانیکلاژین، الاژیک اسید و گالیک اسید از ویژگی­های ضدتکثیری علیه سلول‌های سرطانی برخوردار است. این ترکیبات با افزایش مسیرهای مرتبط با آپوپتوز سلولی از رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌کنند (45). نتایج پژوهش حاضر نشان می‌دهد که عصاره لیپوزومال گل انار نسبت به عصاره آزاد، خاصیت ضد تکثیری بیشتری علیه سلول‌های سرطانی MCF-7 پستان داشته است و سامانه بدون عصاره سمیت ناچیزی برای سلول‌های سالم فیبروبلاست ایجاد نموده است. کریمی مقدم و همکاران در 2019، طالعی اردکانی و همکاران در 2020 و پرنیان و همکاران در 2020 در پژوهش­های خود همانند پژوهش حاضر اثرات ضد تکثیری بیشتری را برای سامانه­های لیپیدی حاوی دارو نسبت به داروی آزاد علیه سلول‌های سرطانی گزارش نموده اند (19، 46، 31). برای مثال طائب­پور و همکاران در سال 2021 نشان دادند که با انکپسولاسیون عصاره خارمریم در لیپوزوم­ها، خاصیت ضدسرطانی آن افزایش و اثر کشندگی آن بر روی سلول‌های سرطانی سرطان استخوان رده­ی SAOS-2 افزایش می­یابد (44). در پژوهش حاضر نیز ما نشان دادیم که بارگذاری عصاره گل انار درون نانولیپوزوم سبب افزایش خاصیت ضدسرطانی آن بر روی سلول‌های سرطانی سرطان پستان می­گردد. به طوریکه  IC50 عصاره از 8/426 میکروگرم/میلی­لیتر در حالت آزاد به 3/164 میکروگرم/میلی­لیتر در حالت انکپسوله کاهش میابد که نشان از افزایش خاصیت ضدسرطانی و کاهش دوز مصرفی عصاره برای ایجاد سمیتی یکسان نسبت به حالت آزاد است. راندمان انکپسولاسیون دارو یا توانایی در بارگیری حداکثر میزان دارو از جمله­ی این ویژگی­ها است. این عامل به فاکتورهای مختلفی از جمله نوع و میزان مواد به کار رفته در سنتز نانوذرات و روش­های ساخت آنها بستگی دارد. راندمان انکپسولاسیون نانوذرات ساخته شده در این مطالعه برابر با 6/2 ±2/73% بود که کارآمدی این نانوذرات را اثبات می‌کند. در این مطالعه از SPC80 به جای SPC60 استفاده گردید که درجه­ی اشباع بالاتری نسبت به SPC60 دارد و سبب کاهش سیالت غشای نانوذرات می­گردد که به نوبه­ی خود می‌تواند میزان درون­گیری را در نانولیپوزوم­ها به دلیل کاهش سختی آنها، افزایش دهد (14) کلسترول نیز از جمله مواد دیگر در سنتز این نانوذرات بوده است. استفاده از کلسترول در سنتز نانوذرات بسیار مهم است چرا که یک اثر دوگانه و متناقص را در میزان درون­گیری نانوذرات ایجاد می‌کند. استفاده از نسبت مولی صحیح کلسترول در سنتز نانولیپوزوم­ها سبب پایداری غشای آنها و در نتیجه افزایش راندمان انکپسولاسیون در آنها میگردد. اما استفاده­ی بیش از اندازه با کمتر از اندازه از کلسترول سبب اختلال در ثبات و سیالیت غشای نانوذرات لیپیدی و در نتیجه کاهش میزان درون­گیری آنها می­گردد (15، 33). میزان بارگذاری عصاره در این پژوهش نسبت به پژوهش­های سال­های اخیر از جمله پژوهش مجدی زاده و همکاران در 2018، میرزایی و همکاران در 2021، طائب پور و همکاران در 2021 و افتخاری وش و همکاران در 2024 بیشتر می­باشد (45، 23، 24، 11). این تفاوت می‌تواند ناشی از نوع و ماهیت ماده بارگذاری شده و درصد مولی مواد تشکیل دهنده سامانه­های مورد استفاده در این پژوهش­ها باشد. اندازه­ نانوذرات نیز در انتخاب یک نانوحامل دارورسان نقش بسیار کلیدی بازی می‌کند. چرا که اندازه­ی نانوذرات سبب پایداری و توزیع مناسب آنها در دستگاه گردش خون انسان و در نتیجه رسانش دارو به بافت هدف می‌شود. نانوذرات با اندازه­ی بیشتر از 250 نانومتر به راحتی توسط سیستم ایمنی شناسایی و به عنوان عامل بیگانه حذف می­گردند. همچنین نانوذرات در این محدوده­ی سایز قادر نیستند تا توسط سیستم اندوتلیال پاکسازی گردند که موجب تجمع آنها در بافت­های بدن مانند کبد و کلیه و ایجاد اثرات ثانویه­ی ناخواسته گردند (17).  میزان کلسترول و فسفولیپید به کار رفته در سنتز نانوذرات لیپیدی اساسی­ترین نقش را در تعیین اندازه آنها بازی می‌کند. به طور کلی کاهش میزان فسفولیپید تا حدی که پایداری غشای نانوذرات را بر هم نزند می‌تواند سبب کاهش سایز نانوذرات گردد. به عبارت دیگر لیپوزوم­ها با محتوی کمتر از فسفولیپید اندازه­ی کوچکتر از لیپوزوم با محتوای فسفولیپیدی بیشتر دارد. افزایش کلسترول درون لیپوزوم­ها نیز با قرارگیری این مولکول در بین غشای دولایه نانوذرات پاسخ داده می‌شود که به نوبه­ی خود سبب افزایش سایز نانوذرات می­گردد (28). اندازه­ی نانوذرات در این مطالعه برابر با 7/4 ± 1/155 نانومتر است که عددی مطلوب به حساب می­آید. بارالکتریکی سطحی نانوذرات نیز در انتخاب آنها به عنوان نانوحامل‌های دارو رسان بسیار فاکتور مهمی است. اگرچه نظر می­رسد که ذرات با بار خیلی زیاد > 30± سبب پایداری کلوئید می­گردد چرا که این بار قوی سبب ایجاد نیروی دافعه­ی نیرومند بین ذرات تشکیل دهنده­ی کلوئید و جلوگیری از رسوب آنها و در نتیجه پایداری آن می­گردد اما در عمل و در سیستم گردش خون این ادعا صحیح نیست و دلیل آن سیستم ایمنی بدن میزبان است. سیستم ایمنی بدن انسان به سرعت مولکول­هایی که بار یکسانی با سلول‌های خونی ندارند را شناسایی و به آنها پاسخ می‌دهد که این پاسخ به شکل بلعیده شدن و پاکسازی به وسیله­ی ماکروفاژها یا مونوسیت­های خونی است. لذا ذراتی با بار خیلی مثبت یا خیلی منفی به راحتی در بدن حذف می­گردند (40). نانوسامانه سنتز شده در این مطالعه از نوع آنیونی و برابر با 4/3 ± 1/17- میلی ولت است که مطلوب و سازگار به حساب می­آید. Majdizadeh  و همکاران در 2025، Nafisi-Moghadam و همکاران در 2024، ساسانی و همکاران در 2021، شاهی و همکاران در 2019 و بهرامی بنان در 2018، در سال­های اخیر برای سامانه­های لیپیدی مورد استفاده در پژوهش­های خود، همانند پژوهش حاضر، پتانسیل زتای منفی را گزارش نموده و از آن به عنوان نوعی ویژگی مطلوب یاد کرده­اند (7، 22، 25، 35، 37). رهایش دارو از نانوسامانه نیز از جمله فاکتور­های مهم دیگر در انتخاب نانوذرات است. نانولیپوزوم­های ساخته شده در این مطالعه دارای رهایش آهسته و کنترل شده بودند. درجه آزادسازی دارو از نانوذرات تولیدی به فاکتورهای گوناگونی چون نوع و مقدار مواد مورد استفاده در ساختار نانوذرات وابسته است. به عنوان نمونه، افزایش مقدار کلسترول می‌تواند به افزایش درجه آزادسازی دارو از نانوذرات منجر شود، زیرا بالا رفتن سطح کلسترول در ساختار لیپوزوم‌ها موجب تشدید رقابت میان دارو و کلسترول برای قرار گرفتن در لایه‌های دوگانه فسفولیپیدی می‌شود، که این خود می‌تواند به افزایش درجه آزادسازی دارو کمک کند. از سوی دیگر، افزایش کلسترول می‌تواند به کاهش سیالیت غشای لیپوزومی منجر شود، که این نیز به نوبه خود، میزان آزادسازی دارو را از نانولیپوزوم‌ها بیشتر می‌کند (21، 30). نانوذرات سنتزشده می‌تواند به محرک­های محیطی پاسخ دهند و این پاسخ با تغییر در میزان رهاسازی دارو صورت میگیرد به طوریکه در دمای 37 درجه سانتی­گراد و pH 2/7 یا شرایط سلول نرمال میزان رهاسازی عصاره از نانوسامانه برابر با 4/1 ± 3/51 درصد است در حالیکه با افزایش دما به 42 درجه سانتی­گراد و کاهش pH به 4/5 که شرایط شبیه به شرایط سلول سرطانی است میزان رهایش به 6/2 ± 2/67 درصد افزایش می­یابد. که این افزایش پاسخ در حقیقت دستاورد این مطالعه به حساب می­آید چرا که با استفاده از این ویژگی می‌توان از ایجاد عوارض ناخواسته بر روی سلول‌های نرمال کاست. افزایش دما در اطراف نانوذرات سبب افزایش نفوذپذیری غشای لیپوزوم و در نتیجه افزایش میزان رهاسازی دارو می‌شود. کاهش pH نیز با ایجاد یک گرادیان پروتون در طول غشا به وسیله پروتونیزاسیون گروه­های آمینی موجود در عصاره باعث افزایش نفوذپذیری غشا و در نتیجه افزایش میزان رهاسازی دارو می­گردد (1). ساسانی و همکاران در 2019، طائب پور و همکاران در 2021، Siyadatpanah در 2023 و زارع زاده مهریزی در 2023 همانند پژوهش حاضر، رهایش دارو از سامانه­های لیپیدی مورد استفاده از پژوهش خود را آهسته رهش گزارش نموده­اند (36، 43، 39، 49). ما در این مطالعه موفق به سنتز نانولیپوزوم­های حاوی عصاره گل انار با ویژگی­های فیزیکوشیمیایی مناسب و رهایش آهسته و کنترل شده شدیم که توانستند به طور موثر سبب افزایش خاصیت ضدتکثیری عصاره بر روی سلول‌های سرطانی پستان نسبت به حالت آزاد آن گردند. همچنین نانوسامانه سنتز شده در این مطالعه توانست میزان رهاسازی عصاره را در پاسخ به محرک­های محیطی مانند افزایش دما و اسیدیته محیط افزایش دهد.

نتیجه­گیری

نانولیپوزوم­های حاوی عصاره انار با میزان انکپسولاسیون 6/2 ± 2/73 درصد، سایز 7/4 ± 1/155 نانومتر، شاخص پراکندگی 345/0 و بار الکتریکی 4/3 ± 1/17- میلی­ولت سنتز شده که دارای رهایش آهسته، پیوسته و کنترل شده 4/1 ±3/51 درصد در شرایط سلول نرمال و 6/2 ± 2/67 درصد در شرایط سلول سرطانی بودند، سنتز گردید که توانستند به طور چشمگیری سبب افزایش خاصیت ضدسرطانی عصاره بر روی سلول‌های سرطانی رده­ی MCF-7 سرطان پستان شوند و IC50 عصاره را از 8/426 میکروگرم/میلی­لیتر در حالت آزاد به 3/164 میکروگرم/میلی­لیتر در حالت انکپسوله کاهش دهند. همچنین نانولیپوزوم­های سنتز شده در این مطالعه از نوع زیست­سازگار بوده و از سمیت ناچیزی بر سلول‌های سالم بدن انسان برخوردار بودند.

منابع

1.       Akbari, P., Taebpour M., Akhlaghi M., Hasan S.H., Shahriyari S., Parsaeian M., Haghirosadat B.F., Rahdar A., Pandey S. 2024. Regulation of the P53 tumor suppressor gene and the Mcl-2 oncogene expression by an active herbal component delivered through a smart thermo-pH-sensitive PLGA carrier to improve osteosarcoma treatment. Medical Oncology, 41(3):68.

2.       Akhlaghi, M., Eftekharivash, L., Parnian, F., Taebpour, M., Rostamian, T., Zarezadeh Mehrizi, M., Haghirosadat, B.F. 2021. Synthesis and study of cellular and physicochemical properties of nanoliposomes containing aqueous extract of Hedera Helix. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 12(45):97-112.

3.       Akhlaghi, M., Eftekharivash, L., Taebpour, M., Afereydoon, S., Ebrahimpour, M., Mehrizi, M.Z., fatemeh Haghirosadat, B. 2022. Improving the therapeutic performance of glycyrrhiza glabra hydroalcoholic extract using liposomal nano-carriers and their characterization. Disease and Diagnosis, 11(2):39-48.

4.       Akhlaghi, M., Taebpour, M., Lotfabadi, N. N., Naghib, S. M., Jalili, N., Farahmand, L., Tofighi, D. 2022. Synthesis and characterization of smart stimuli-responsive herbal drug-encapsulated nanoniosome particles for efficient treatment of breast cancer. Nanotechnology Reviews, 11(1):1364-1385.

5.       American cancer society. 2025. cancer facts and figures 2025. Atlanta american cancer.

6.       Baghiani, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2019. Experimental study: experimental evaluation of phospholipid system containing doxorubicin HCL for use in chemotherapy. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 26(11):945-956.

7.        Bahrami-Banan, F., Sheikhha, M.H., Ghasemi, N., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2018. Preparation and study of nano-niosomes containing doxorubicin and evaluation of its toxicity on acute myeloblastic leukemia cell line KG-1. Journal of Payavard Salamat, 12(4):309-323.

8.       Deng, Y., Li, Y., Yang, F., Zeng, A., Yang, S., Luo, Y., Yin, W. 2017. The extract from Punica granatum (pomegranate) peel induces apoptosis and impairs metastasis in prostate cancer cells. Biomedicine and Pharmacotherapy, 93:976-984.

9.       DeSantis, C.E., Ma, J., Gaudet, M.M., Newman, L. A., Miller, K. D., Goding Sauer, A., Siegel, R.L. 2019. Breast cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 69(6):438-451.

10.       DeSantis, C.E., Ma, J., Goding Sauer, A., Newman, L.A., Jemal, A. 2017. Breast cancer statistics, 2017, racial disparity in mortality by state. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 67(6):439-448.

11.        Eftekhari-Vash, L., Majdizadeh, M. 2024. Fabrication and physicochemical characterization of liposome systems containing Glycyrrhiza glabra hydroalcoholic extract and evaluation of toxicity of free and liposomal extract on healthy human fibroblast cell line (HFF) and MCF-7 breast cancer cell line. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 18(4):59-69.

12.       Faria, A., Calhau, C. 2011. The bioactivity of pomegranate: impact on health and disease. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 51(7):626-634.

13.       Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S.S.K., Torchilin, V.P. 2020. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews, 156:4-22.

14.       Ghafari, M., Haghiralsadat, F., Khanamani Falahati‐pour, S., Zavar Reza, J. 2020. Development of a novel liposomal nanoparticle formulation of cisplatin to breast cancer therapy. Journal of Cellular Biochemistry, 121(7):3584-3592.

15.       Kirby, C. J., Gregoriadis, G. 2019. A simple procedure for preparing liposomes capable of high encapsulation efficiency under mild conditions. In Liposome Technology (pp. 19–27). CRC Press.

16.       Ghashghaei, M., Akhlaghi, M. 2021. Investigation of nanoniosomal formulation containing doxorubicin effect on ovarian cancer cell line (OVCAR-3 cell line). New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 11(43):46-62.

17.        Harashima, H., et al. 1994. Enhanced hepatic uptake of liposomes through complement activation depending on the size of liposomes. Pharmaceutical Research, 11:402-406.

18.       Kamińska, M., Ciszewski, T., Łopacka-Szatan, K., Miotła, P., Starosławska, E. 2015. Breast cancer risk factors. Menopause Review/Przegląd Menopauzalny, 14(3):196-202.

19.        Karimi-Moghddam, A., Nikounahad-Lotfabadi, N., Haghiralsadat, B.F., Majdizadeh, M. 2019. Investigating the effect of lipid nanoparticles containing silibinin anti-cancer drug on the growth of breast cancer MCF-7 cell line. Journal of Torbat Heydariyeh University of Medical Sciences, 6(4):1-12.

20.       Li, K., Xiao K., Zhu S., Wang Y., Wang W. 2022. Chinese herbal medicine for primary liver cancer therapy: Perspectives and challenges. Frontiers in Pharmacology, 13:889799.

21.       Lindner, L.H., Hossann, M. 2010. Factors affecting drug release from liposomes. Current Opinion in Drug Discovery and Development, 13(1):111-123.

22.       Majdizadeh, M., Akbarzadeh, S., Al-Turnachy, H.H., Hemati, M., Akhlaghi, M., Haghiralsadat, B.F., Oroojalian, F. 2025. Synthesis of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil and investigating their stability, antimicrobial, antioxidant, and antiproliferative properties. Nanomedicine Journal, 12(1):122-139.

23.       Majdizadeh, M., Rezaei-Zarchi, S., Movahedpour, A.A., Shahi Malmir, H., Sasani, E., Haghiralsadat, B.F. 2018. A new strategy in improving therapeutic indexes of medicinal herbs: Preparation and characterization of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil. SSU Journals, 25(11):853-864.

24.       Mirzaei, F., Majdizadeh, M., Fatahi-Bafghi, A., Ehsani, R., Haghiralsadat, B. F. 2021. Fabrication and characterization of liposomal nano-carriers containing essential oils of Trachyspermum ammi to counteract Trichomonas vaginalis. Koomesh, 23(2):283-290.

25.       Moghadam, R.N., Majdizadeh, M., Golbashy, M., Haghiralsadat, F., Hemati, M. 2024. Laboratory study: Synthesis and optimization of nano-niosomes containing Bunium persicum essential oil and investigating its toxicity on Trichomonas vaginalis parasite and HFF cell line. Heliyon, 10(16):e35967.

26.       Mohseni, M. 2021. A new therapeutic approach for the treatment of breast cancer using synthesis of liposomes containing silybinin and their characterization. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal, 11(44):57-70.

27.       Momenimovahed, Z., Salehiniya, H. 2019. Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world. Breast Cancer: Targets and Therapy, 11:151-164.

28.        Nagayasu, A., Uchiyama, K., Kiwada, H. 1999. The size of liposomes: A factor that affects their targeting efficiency to tumors and the therapeutic activity of liposomal antitumor drugs. Advanced Drug Delivery Reviews, 40(1–2):75-87.

29.       Oun, R., Moussa, Y.E., Wheate, N.J. 2018. The side effects of platinum-based chemotherapy drugs: a review for chemists. Dalton Transactions, 47(19): 6645-6653.

30.        Pande, S. 2023. Liposomes for drug delivery: Review of vesicular composition, factors affecting drug release, and drug loading in liposomes. Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology, 51(1):428-440.

31.       Parnian, F., Hekmati-Moghadam, S.H., Majdizadeh, M., Jebali, A., Haghiralsadat, B.F. 2020. Fabrication of niosomal nano-carriers containing aqueous extract of hedera helix and comparison of toxicity of free extract and niosome extract on HT29 colorectal cancer cell line. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 15(3):31-45.

32.       Pearce, A., Haas, M., Viney, R., Pearson, S. A., Haywood, P., Brown, C., Ward, R. 2017. Incidence and severity of self-reported chemotherapy side effects in routine care: A prospective cohort study. PloS one, 12(10):e0184360.

33.       Pornsunthorntawee, O., Chavadej, S., Rujiravanit, R. 2011. Characterization and encapsulation efficiency of rhamnolipid vesicles with cholesterol addition. Journal of Bioscience and Bioengineering, 112(1):102-106.

34.       Rabani, E., Behzadi, R., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2022. Fabrication of liposomal formulation containing paclitaxel and comparison of its toxicity with non-liposomal paclitaxel on MCF-7 breast cancer cell line. Pars Journal of Medical Sciences, 18(2):26-40.

35.       Sasani, E., Shahi Malmir, H., Daneshmand, F., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2020. Synthesis and physiochemical characterization of liponiosomal hybrid nano-carriers as carriers for doxorubicin HCl anti-cancer drug. Journal of Sabzevar University of Medical Sciences, 27(1):35-47.

36.       Sasani, E., Shahi Malmir, H., Daneshmand, F., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2018. A new study on synthesis and optimization of PEGylated liponiosomal nanocarriers containing curcumin for use in cancer chemotherapy. SSU Journals, 26(6):528-541.

37.       Shahi Malmir, H., Kalantar, S.M., Sasani, E., Asgari, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2019. Synthesis and optimization of niosomal carriers containing doxorubicin in order to achieve a final formulation with high potential in cancer cells’ temperature and acidity. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 26(10):879-894.

38.       Sharma, P., McClees, S.F., Afaq, F. 2017. Pomegranate for prevention and treatment of cancer: an update. Molecules, 22(1):177.

39.        Siyadatpanah, A., Norouzi, R., Mirzaei, F., Haghirosadat, B.F., Nissapatorn, V., Mitsuwan, W., Nawaz, M., Lourdes, M., Hosseini, S. A., Montazeri, M., Majdizadeh, M., Almeida, R. S., Hemati, M., Wilairatana, P., Douglas, H. 2022. Green synthesis of nano-liposomes containing Bunium persicum and Trachyspermum ammi essential oils against Trichomonas vaginalis. Journal of Microbiology, Immunology and Infection, 56(1):150-162.

40.       Smith, M.C., Crist R.M., Clogston J.D., McNeil S.E., 2017. Zeta potential: A case study of cationic, anionic, and neutral liposomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 409:5779-5787.

41.       Sun, Y.S., Zhao, Z., Yang, Z.N., Xu, F., Lu, H.J., Zhu, Z.Y., Zhu, H.P. 2017. Risk factors and preventions of breast cancer. International Journal of Biological Sciences, 13(11):1387.

42.       Taebpour, M., Akhlaghi, M., Shahriary, S., Hajihosseini, S., Haghiralsadat, F., Oroojalian, F., Tofighi, D. 2022. Synthesis, physicochemical characterization and pharmaceutical function of niosomal nanoparticles-encapsulated bioactive compound for osteosarcoma treatment. Nanomedicine Journal, 9(3):205-215.

43.       Taebpour, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2021. Fabrication and characterization of liposomal nanoparticles containing hydroalcoholic extract of Artemisia absintium and its toxicity on MCF-7 breast cancer cell line. Iranian Journal of Breast Diseases, 14(1):64-77.

44.       Taebpour, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F., Akhlaghi, M. 2021. Fabrication of liposomal nanoparticles containing hydroalcoholic extract of Silybum marianum and evaluation of its toxicity on human osteosarcoma cancer cell line (SAOS-2) and evaluation effect of free hydroalcoholic extract of Silybum marianum and empty liposomes on healthy human fibroblast cell (HFF). Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 16(1):61-73.

45.       Taebpour, M., Majdizadeh, M., Nodoushan, F.S., Akhlaghi, M., Haghiralsadat, B.F. 2023. Evaluation and Comparison of Punica Granatum Peel and Flower Extract

Toxicity on MCF-7 Breast Cancer Cell Line and Comparison of Antioxidant Activity of Punica Granatum Peel and Flower Extract. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 18(1):9-16.

46.       Talei-Ardakani, N., Daneshmand, F., Mirhoseini, M., Majdizadeh, M., Haghiralsadat, B.F. 2020. Fabrication and characterization of physicochemical niosomal nanocarriers containing quercetin flavonoids for therapeutic purposes. Journal of Knowledge and Health in Basic Medical Sciences, 15(1):fa32-fa40

47.       van den Boogaard, W.M., Komninos, D.S., Vermeij, W.P. 2022. Chemotherapy side-effects: not all DNA damage is equal. Cancers, 14(3):627.

48.       Waks, A.G., Winer, E.P. 2019. Breast cancer treatment: a review. Jama, 321(3):288-300.

49.        Zarehzadeh-Mehrizi, M., Majdizadeh, M., Zarezadeh-Mehrizi, M., Afshoun, A., Zhian-Mehrizi, M., Haghiralsadat, B.F. 2023. Investigating the performance of liposomal formulations containing clove essential oil made by thin layer and heat method in temperature and pH conditions similar to the mouth in order to be used in the research of oral and dental diseases. Experimental Animal Biology, 12(46):15-26.

183