The importance and characteristics of sperm diluents

gh moghaddam ¹ (Professor, Department of Animal Sciences, Faculty of Agriculture, Tabriz University)
parisa shafaati ² (department of Animal Science, university of Tabriz)

Submited date : 2023-04-30 accepted date : 2024-01-02

Keywords: sperm, cryopreservation, Additives, Seminal plasma, cooled preservation,

Abstract :

Despite the significant progress in sperm cryopreservation methods in recent years, the research has proven that long-term storage of sperm in freezing and cold storage causes serious damage to sperm. The occurrence of fat peroxidation and the metabolism of spermatozoids causes the destruction of spermatozoa during freezing and storage. Temperature shock, the formation of intracellular ice crystals, cellular dehydration, increased salt concentration and osmotic shock may occur during the freezing and thawing process. In addition, cryopreservation causes harmful structural changes in the plasma membrane. Changes in membrane permeability to some ions such as calcium during the freezing and thawing process have been reported. Also, during cryopreservation, the formation of intracellular and extracellular ice causes cell destruction and death. The sperm plasma membrane is the main site of damage during the freezing and thawing process and is very sensitive to lipid peroxidation due to the presence of many unsaturated fatty acids. These changes may be having a role in the accumulation of toxic products of metabolism, mainly reactive oxygen species (ROS) that are generated through lipid peroxidation of sperm membranes. In small amounts, ROS play an important role in sperm capacitation, increased sperm motility, acrosome reaction, and oocyte fertilization in humans, cows, horses, pigs, and rams. For this purpose, to solve these problems, various antioxidants, preservatives and chelators are used in sperm extenders.

Full-Text:



اهمیت و خصوصیات رقیق‌کننده‌های اسپرم

 (دریافت مقاله: پذیرش نهایی: )

 

چکیده

با وجود پیشرفت​های چشمگیری که در روشهای نگهداری انجمادی اسپرم در طول سالهای اخیر صورت گرفته است، تحقیقات ثابت کرده که نگهداری طولانی مدت اسپرم در حالت انجماد و نگهداری سرمایی آسیب جدی به اسپرم وارد می​کند. به وجود آمدن پراکسیداسیون چربی و متابولیسم خود اسپرماتوزوئیدها در هنگام انجماد و نگهداری سبب از بین رفتن اسپرماتوزوئیدها می‌شود. شوک دمایی، شکل کریستالهای یخ داخل سلولی، دهیدراتاسیون سلولی، افزایش غلظت نمکها و شوک اوسموتیک در طول فرآیند انجماد و یخ‌گشایی ممکن است صورت گیرد. علاوه بر این، نگهداری انجمادی تغییرات مضر ساختاری در غشای پلاسما ایجاد می​کند. تغییرات در نفوذپذیری غشا نسبت به برخی از یونها مثل کلسیم در طول فرآیند انجماد و یخ‌گشایی گزارش شده است. همچنین در هنگام نگهداری انجمادی تشکیل یخ داخل و خارج سلولی سبب تخریب و مرگ سلولی می‌شود. غشای پلاسمایی اسپرم محل اصلی آسیب در طی فرآیند انجماد و ذوب است و به دلیل دارا بودن اسیدهای چرب غیراشباع زیاد، در مقابل پراکسیداسیون لیپیدها بسیار حساس است. این تغییرات ممکن است در تجمع محصولات سمی ناشی ازمتابولیسم، به طور عمده از گونه­های فعال اکسیژن (Reactive oxygene species) که از طریق پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای اسپرم ایجاد می شوند، نقش داشته باشد. گونه های فعال اکسیژن در  مقادیر کم، نقش مهمی در کاپاسیته شدن اسپرم، افزایش تحرک اسپرم، واکنش آکروزوم و لقاح تخمک را در انسان، گاوها، اسب ها، خوک ها و قوچ ها دارد. بدین منظور جهت رفع این مشکلات از مواد مختلف آنتی‌اکسیدانی، حفاظت‌کننده‌ها و همچنین کلاتورها در رقیق­کننده­های اسپرم استفاده می‌شود.

کلیدواژه­ها: افزودنی­ها، نگهداری انجمادی، نگهداری سرمایی، اسپرم، سمینال­پلاسما

بررسی منابع

تلقیح مصنوعی

تلقيح مصنوعي ارزشمندترین کار مدیریتی و مهم‌ترين روشی است كه تاکنون برای ارتقا ژنتیکی حیوانات مزرعه‌‌ای ابداع گردیده است. از زمانی که تلقیح مصنوعی برای اولین بار در نظر گرفته شد، حفظ مایع منی در دام­های اهلی مورد توجه قرار گرفت (Salamon and Maxwell, 1995). تلقیح مصنوعی¹(AI) تقریبا تنها تکنیک مهم اختراع شده جهت بهبود ژنتیکی حیوانات است (Hafez, 1987). یک روش تکثیری است که از طریق آن منی به دست آمده از دام نر با استفاده از ابزار مخصوص در دستگاه تناسلی ماده قرار داده می‌شود و به علت عدم تماس مستقیم تولید مثلی ازانتقال بیماری­های عفونی تولید مثل  جلوگیری می­شود (Shafaati Alishah et al., 2021). با انتخاب چند حیوان نر، اسپرم کافی برای تلقیح هزار حیوان ماده در سال فراهم می‌شود. در مقابل بطور نسبی، نتایج کمتری به ازای هر ماده در سال حتی با وجود انتقال رویان تولید می‌شود (Hafez, 1987). اگرچه تلقیح مصنوعی فایده‌ی فراوان و قابل پذیرشی در پرورش گاوهای شیری به روش صنعتی در اکثر کشورهای پیشرفته داشته، ولی هنوز پذیرش جهانی را در پرورش گوسفند دریافت ننموده است (Shafaati Alishah et al., 2020). تلقیح مصنوعی موفق تحت تأثیر پارامترهای متعددی است که یکی از اصلی‌ترین پارامترها دسترسی به اسپرم‌های بارور است که این امر تنها در یک فرآیند انجماد موفق حاصل می‌شود (Watson, 2000). همچنین بستگی به توانایی جمع‌آوری مؤثر، ارزیابی و نگهداری منی از نرهای باکیفیت برای استفاده دزهای بیشتر تلقیح می‌باشد (Ferdinand et al., 2012) ،البته کیفیت اسپرم قوچ تحت تاثیر فصول سال می باشد چون جزو دام های هست که جفت گیری فصلی دارد (Moghaddam et al., 2012).

ترکیبات و خصوصیات سمینال‌پلاسما

ترکیب بیوشیمیایی مایع منی یا سمینال‌پلاسما در بین گونه‌ها بسیار پیچیده و متغیر است. پیشرفتها در تکنولوژی‌های تولیدمثلی نقش سمینال‌پلاسما را به عنوان یک محیط مغذی- محافظتی برای اسپرم‌های موجود در آن آشکار ساخته است. برخی از ترکیبات سمینال‌پلاسما برای متابولیسم اسپرم، همچنین عملکرد، زنده‌مانی و انتقال اسپرم در دستگاه تناسلی ماده بسیار ضروری است. سمینال‌پلاسما درحقیقت یک مایع مرکب با عملکرد شیمیایی خاصی از واسطه­های انزال است (Juyana and Stella, 2012) که PH آن در قوچ و گاو نر کمی اسیدی و در شترها کمی بازی است. ترکیبات بیوشیمیایی سمینال‌پلاسمای حاصله از رته‌تستیس، اپیدیدیم و غدد جنسی ضمیمه‌ی مجرای تناسلی نر ناشناخته است (Mann and Lutwak-Mann, 1981). پیش از این اعتقاد بر این بود که تمام غدد ضمیمه‌ی جنسی می‌توانند به علت مشابهت جنینی و یا ساختارهای مورفولوژیکی، از لحاظ آناتومیک و عملکردی همگن باشند. تشخیص و شناسایی چندین ماده در ترشحات غدد ضمیمه‌ی جنسی مثل اسید سیتریک، پروستات فسفاتاز، فروکتوز و فسفریل کولین راه را برای درک و مطالعه‌ی فعالیت‌های مختلف شیمیایی ترشحی این غدد و نقش احتمالی آنها برای اسپرم باز کرد ه است (Mann, 1964). مشاهده شده است که استفاده از مایع منی نگهداری شده برای تلقیح مصنوعی در گونه‌های اهلی که شامل رقیق‌سازی یا حذف سمینال‌پلاسما است منجر به پایین آمدن نرخ باروری در مقایسه با جفت‌گیری طبیعی می‌شود (Tummaruk et al., 2000) . 

-       ترکیبات بیوشیمیایی سمینال‌پلاسما و عملکردهای آنها

سمینال‌پلاسما از یونها (Na+، K+، Zn+، Ca2+، Mg+ و Cl ̶)، ترکیبات انرژی‌زا (فروکتوز، سوربیتول، گلیسریل فسفوکولین)، ترکیبات آلی (اسید سیتریک، اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئین‌های با وزن مولکولی کم و زیاد، لیپیدها، هورمون‌ها، سیتوکین‌ها) تشکیل شده است. ترکیبات نیتروژنی مثل آمونیاک، اوره، اسیداوریک و کراتینین و ترکیبات کاهنده مثل اسید آسکوربیک و هیپوتائورین نیز در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد (Juyana and Stella, 2012).

عملکرد سمینال‌پلاسما در فیزیولوژی طبیعی با انزال اسپرم و بقای آن در دستگاه تولیدمثلی ماده همراه است. نقش سمینال‌پلاسما در بلوغ اسپرم در گونه‌های مختلف بررسی شده است. مهمترین نقش‌های مختلف سمینال‌پلاسما شامل:

1)       فعال­سازی و افزایش تحرک اسپرم

2)       بافرینگ جهت بهبود محیط مغذی و اسمزی مطلوب

3)       جلوگیری از فعال شدن قبل از بلوغ در طی انتقال فیزیولوژیکی اسپرم و تثبیت غشای پلاسما با مهارکننده‌های ظرفیت پذیری

4)       حفاظت از اسپرم‌ها از فاگوسیتوز و تخریب در محیط التهابی در اسب

5)       تنظیم انتقال و زدودگی اسپرم

6)       تسریع تخمک‌گذاری در گاوها و القای تخمک‌گذاری در خوک و شتر

7)       کمک به فعل و انفعالات اسپرم-تخمک

8)       فعال‌سازی بیان سیتوکین‌های جنینی و کمک به آماده‌سازی رحم برای گسترش امبریو

9)       تأثیر بر روی باروری

افزون بر این افزودن سمینال‌پلاسما یا ترکیبات آن به اسپرم پس از یخ‌گشایی جذب اکسیژن و جنبندگی اسپرم را افزایش می‌دهد (White et al., 1987) و حتی کمک می‌کند تا بعضی از پروتئین‌های سطحی بهبود یابند (Domı´nguez et al., 2008)، آسیب سرمایی بر روی غشای پلاسمایی در اسپرم قوچ را برگشت می‌دهد و تمامی پارامترهای کیفی اسپرم را افزایش می‌دهد (Maxwell et al., 2007).

1- پروتئین‌ها

سمینال‌پلاسما حاوی پروتئین‌های متعددی است که بسیاری از آنها حاصل ترشح اپیدیدیم و وزیکول‌های سمینال هستند (Chandonnet et al., 1990). افزودن و حذف انواع پروتئین‌های سمینال‌پلاسما در طول بلوغ در اپیدیدیم و زمان انزال نقش مهمی در حفظ پایداری سمینال‌پلاسما (Desnoyers and Manjunath, 1992)، جنبایی (Henricks et al., 1998)، ظرفیت‌پذیری (The´rie´n et al., 1998) و اثر متقابل تخمک-اسپرم و باروری (Yanagimachi, 1994) بازی می‌کند. همچنین نشان داده شده است که پروتئین‌های سمینال‌پلاسما می‌توانند نفوذ اسپرم به اووسیت را افزایش دهند (El-Hajj Ghaoui et al., 2007). همچنین می‌توانند فاگوسیتوز و اتصال به سلول‌های مرده و سلول‌های چند هسته‌ای را از طریق فعالیت پروتئازی خود ترویج دهند (Dacheux et al., 2003). علاوه بر این بین مقدار پروتئین کل و توانایی انجماد منی قوچ یک همبستگی مثبت گزارش شده است (Barrios et al., 2000).اسپرم پستانداران جنبایی و توانایی تشخیص و باروری اووسیت‌ها را از طریق فعل و انفعالات دائمی و پی در پی به وسیله‌‌ی پروتئین‌های موجود در مایع اپیدیدیم به دست می‌آورند. عمده پروتئین‌های اپیدیدیم شامل لاکتوفرین، کلاسترین، پروکاتپسینD و پروتئین انتقال دهنده‌ی کلسترول هستند. پیش بینی شده است که پروتئین‌های مختلف اپیدییدم با تغییر سطح غشای اسپرم یا ترکیبات و یا کمک به حفظ یکپارچگی اسپرم، نقش‌های مختلفی را بر عملکرد اسپرم دارند (Juyana and Stella, 2012).

2- اسیدهای آمینه و آنزیم‌ها

طیف وسیعی از اسیدهای آمینه در سمینال‌پلاسما وجود دارد و بیشتر اینها از بیضه‌ها یا اپیدیدیم نشأت گرفته اند. غلظت آنها بعد از انزال به دلیل فعالیت گسترده‌ی پروتئولیتیک افزایش می‌یابد که در مایع منی قرار می‌گیرند (Mann, 1964). اسیدهای آمینه به عنوان یک ماده شیمیایی به راحتی قابل اکسیداسیون برای انرژی هستند و منجر به فعل و انفعالات در منی می­شوند (Neumark H and Schindler, 1967). بیشترین غلظت اسیدهای آمینه در سمینال‌پلاسما مربوط به گلوتامیک اسید است که با سطح بالای فعالیت گلوتامیک اگزالواستیک ترانسفراز همراه است (Flipse, 1960). L- آرژنین در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد و به عنوان منبع انرژی برای حرکت نرمال اسپرم‌ها در شکل آرژنین فسفریک اسید فعالیت می‌کند (Patel et al., 1998). سایر آنزیم‌های سمینال‌پلاسما شامل آسپارتات آمینوترانسفراز، گلوتامین پیروات ترانس آمیناز، آلانین آمینوترانسفراز، آلکالین فسفاتاز و لاکتات دهیدروژناز هستند. این آنزیم‌ها به عنوان شاخص‌های خوبی از کیفیت مایع منی هستند زیرا پایداری اسپرم را بیان می­کنند (Sirat et al., 1996). منبع احتمالی این آنزیم‌ها به نظر می‌رسد که بیضه‌ها یا اپیدیدیم باشد زیرا همبستگی مثبت با غلظت اسپرم و همبستگی منفی با حجم اسپرم دارند (Kareskoski and Katila, 2008) و حضور فعالیت‌های آنزیم‌ها به دنبال فصل تولیدمثلی است (Gu¨ndog˘un, 2006).

3- آنتی‌اکسیدانها

اسپرم در برابر پراکسیداسیون لیپیدی توسط گونه‌های آزاد اکسیژن (ROS) مثل هیدروژن پراکسید (H2O2)، سوپراکسید آنیون (O2 ̶)، نیتریک اکسید و رادیکال هیدروکسیل (-OH) بسیار حساس هستند. در مایع منی گاو و قوچ، ROS‌ها به طور عمده توسط اسپرم‌های مرده از طریق واکنش اکسیداز-کاتالاز، آمینواسید آروماتیک تولید می‌شوند  (Upreti et al., 1998). از لحاظ فیزیولوژیک ROSها نقش مهمی در ظرفیت‌پذیری اسپرم ، واکنش آکروزومی و تثبیت میتوکندری کپسول در قطعه‌ی میانی در گاو دارندو اثرات مفید آنها روی عملکرد اسپرم به طبیعت و غلظت ROS خاص درگیر، بستگی دارد (De Lamirande and Gagnon, 1992). سوپر اکسید آنیون و نیتریک اکساید در ایجاد هپارین شرکت می‌کند در حالیکه هیدروژن پراکسیدها اسپرم گاو را در هنگام انزال به ظرفیت‌پذیری تحریک می‌کنند (O’Flaherty et al., 1999).

برای حفظ فعالیت‌های فیزیولوژیکی مناسب، تعادل بین تولید ROSها و بازیافت آنها در محیط اطرافی سلولهای اسپرم ضروری است. در غیر این‌صورت هرگونه عدم تعادل باعث اختلال در عملکرد اسپرم از طریق استرس اکسیداتیو خواهد شد (Kim and Parthasarathy, 1998). برای محافظت اسپرماتوزوا از استرس اکسیداتیو، اسپرماتوزئیدهاو سمینال‌پلاسما دارای آنزیم‌هایی هستند که به نام سوپراکسید دیسموتاز (SOD)²، گلوتاتیون ردوکتاز (GR)³، گلوتاتین پراکسیداز (GPX)⁴ و سوبستراهای آن (GSH⁵ و GSSG⁶) و کاتالاز ⁷(CAT) شناخته می‌شوند. به طور شگفت‌آوری سمینال‌پلاسما حاوی غلظت بالایی از آنتی‌اکسیدانها نسبت به سایر مایع‌های بیولوژیکی مثل سرم خون است (Mann, 1964) و آنتی‌اکسیدانهایی که عمدتا در سمینال‌پلاسما وجود دارند، کمبود آنزیم‌های سیتوپلاسمی را جبران می‌کنند.

یک آنزیم اپیدیدیمی مثل کاتالاز اسپرماتوزوا را از آسیب اکسیداتیو در لومن اپیدیدیم محافظت می‌کند درحالیکه SOD و GP ترشح شده از وزیکول سمینال بعد از انزال از اسپرم حفاظت می‌کند (Zubkova and Robaire, 2004). محل تجمع SOD در آکروزوم، post acrosome و دم، GPX در post acrosome و ابندای سر و GR در دم اسپرم نشان داده شده است (Martı et al., 2008). از سه ایزوآنزیم SOD CuZn-SOD)، Mn-SOD و EC-SOD(خارج سلولی) فعالیت CuZn-SOD بالاست و فعالیت های Mn-SOD و EC-SOD در سمینال‌پلاسما بسیار پایین است (Eghbali et al., 2008). SOD خود به خود O2 ̶ را از شکل O2 و H2O2 دیسموتاز می‌کند درحالیکه کاتالاز، H2O2 را به O2 و H2O تبدیل می‌کند (Alvarez et al., 1987).

یکی دیگر از ویژگی‌های مهم سیستم پاک‌کننده‌ی آنتی‌اکسیدانی سمینال‌پلاسما در رابطه با غلظت بالای GSH است. گلوتاتیون یک سوبسترا برای آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز حاوی سلنیوم است (آنزیم اصلی در حذف پراکسیدهای هیدروژن) و گلوتاتیون ترانسفراز (آنزیمی که واکنش‌های کووالانتی گلوتاتیون را با مواد الکتروفیلیک کاتالیز می‌کند) است. گلوتاتیون به عنوان دهنده‌ی الکترون عمل می‌کند و می‌تواند به طور مستقیم (از طریق گروه تیولیک) با هیدروژن پراکسید، سوپراکسید آنیون و رادیکال‌های هیدروکسیل و گروه سولفیدیریل آن و همچنین با رادیکال‌های آلکوکسیل و هیدروپراکسیها واکنش نشان دهد (Lenzi et al., 1996). گلوتاتیون ردوکتاز، GSH را از گلوتاتیون اکسید شده (GSSG) احیا می‌کند. در طول عملکرد آنتی‌اکسیدانی، گلوتاتیون در فروکتولیز اسپرماتوزویید نیز درگیر است (Slaweta and Laskowaska, 1987). این یک کوآنزیم از 1و3- دی فسفو گلیسیریک آلدئید دهیدروژناز است که منجر به اکسیداسیون تریوزفسفات به فسفوگلیسریک اسید می‌شود که به اسیدپیرویک و اسید لاکتیک تبدیل می‌شودکه باعث بهبود فعالیت متابولیکی و جنبندگی اسپرماتوزوا می‌شود (Sinha et al., 1996).

عوامل ضد پراکسیداسیون در انزال به اسپرم‌ها متصل شده و آنها را از پراکسیداسیون لیپیدی در طول گذر از دستگاه تناسلی ماده محافظت می‌کنند. GPX و SOD به طور عمده در پیشگیری از شوک سرمایی دخالت دارند (Martı et al., 2008). سطوح آنتی‌اکسیدانی سیستم‌های دفاعی بسته به گونه، فصل و نوع انزال متفاوت است (Ollero et al., 1996).

4- یون‌ها

عملکرد اسپرم به شدت وابسته به محیط یونی است (Hamamah and Gatti, 1998). تفاوت در سطوح مواد معدنی رژیم غذایی می‌تواند اثر منفی در غلظت یونهای سمینال‌پلاسما بگذارد. کاتیون‌هایی مثل  Na، K، Ca و Mg در تعادل اسمزی به کار می‌روند و اجزای بسیاری از آنزیم‌های مهم هستند (Cevik et al., 2007).

سدیم کاتیون اصلی در سمینال‌پلاسما است به استثنای منی گاو که در آن غلظت Ca بسیار بالاست (Setchell and Brooks, 1988). پتاسیم یک عنصر طبیعی و مهارکننده است و غلظت بالای K در سمینال‌پلاسما متابولیسم اسپرم را کاهش داده و درنتیجه حرکت اسپرم نیز کاهش می­یابد (Massa´nyi et al., 2003). کلسیم واکنش آکروزومی را در پستانداران راه می‌اندازد و همچنین با جنبندگی اسپرم در ارتباط است (Kaya et al., 2002). منیزیم تقریبا در تمامی سیستم‌های آنزیمی یافت می‌شود و به عنوان یک نشانگر ترشح وزیکول سمینال است (Wong et al., 2001) و می‌تواند در جنبندگی اسپرم نقش ایفا کند (Jobim et al., 2004). یک همبستگی مثبت بین مقدار منیزیم و سلولهای زنده بدون آپاپتوز در قوچ مشاهده شده است (Juyana and Stella, 2012). یک همبستگی منفی بین مرفولوژی اسپرم‌های غیرطبیعی با غلظت‌های فسفر، کلسیم و سدیم و همچنین یک همبستگی مثبت با غلظت K در منی گاو دیده شده است. مس (Cu) برای بسیاری از آنزیم‌ها مثل CuZn-SOD لازم است. اخیرا چندین محقق بین محتوای Cu و جنبندگی اسپرم در سمینال‌پلاسمای بوفالو همبستگی مثبتی مشاهده کرده اند (Eghbali et al., 2008). عنصر روی (Zn) یک فعالیت آنتی‌اکسیدانی محافظتی را اعمال می‌کند (Gavella and Lipovac, 1998) و به نظر می‌رسدکه عامل اصلی فعالیت ضدباکتریایی سمینال‌پلاسما است. روی نقش مهمی در کنترل حرکت به وسیله‌ی کنترل مصرف انرژی از طریق سیستم‌های آدنوزین تری فسفات و از طریق تنظیم ذخایر انرژی فسفولیپیدی ایفا می‌کند (Hidiroglou and Knipfel, 1984).

توزیع یونهای عمده بین اسپرم و سمینال‌پلاسما ممکن است مبنایی برای تغییرات در کیفیت منی انزال‌های متوالی مختلف باشد و باید در تفسیر و ارزیابی باروری در نظر گرفته شود. بسیاری از مطالعات انجام شده بر روی خواص یونهای سمینال پلاسما در منی انسان انجام گرفته است. اطلاعات روی عملکرد خاص یونهای سمینال‌پلاسما در نشخوارکنندگان اندک است و پیشنهاد می‌شود که روی عملکرد آنها روی اسپرماتوزوا بیشتر بررسی شود (Juyana and Stella, 2012).

5- قندهای احیاکننده

فروکتوز اصلی‌ترین ساکارید موجود در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان است. فروکتوز از گلوکز خون سنتز می‌شود که توسط غدد ضمیمه‌ی جنسی با نحریک تستسترون تولید می‌شوند (Kumar and Farooq, 1994) و غلظت آن در سمینال‌پلاسما در طول فصل تولیدمثل افزایش می‌یابد (Matsuoka et al., 2006). نقش مهمی در متابولیسم دارد زیرا اسپرماتوزوا فروکتوز را برای تولید ATP استفاده می‌کند (Sanchez-Partida et al., 1999). بدنه‌ی پروستات به نظر می‌رسد منبع اصلی فروکتوز باشد. مقادیر کمتر توسط غدد لنفاوی مثانه، مجاری دفران آمپولا و pars disseminata پروستات تولید می‌شود (El-Manna et al., 1986). غلظت فروکتوز در سمینال‌پلاسما اغلب به عنوان شاخصی از وضعیت آندروژنی حیوان استفاده می‌شود زیرا ترشح آن به شدت تحت کنترل سطح آندروژن خون است (Mann and Lutwak-Mann, 1981). اطلاعات در مورد غلظت فروکتوز کل در سمینال‌پلاسمای گونه‌های مختلف می‌تواند در تعیین غلظت‌های مناسب فروکتوز جهت اضافه کردن رقیق‌کننده‌های منی کمک کند (Juyana and Stella, 2012).

یک قند احیا کننده‌ی دیگر به نام سوربیتول در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد. اسپرم قوچ دارای آنزیم سوربیتول دهیدروژناز است که تبدیل سوربیتول به فروکتز را ممکن می‌سازد و به عنوان سوبسترای متابولیک استفاده می‌شود (Setchell and Brooks, 1988). ترکیب قند سمینال‌‌پلاسما با باروری ارتباط دارد و عمدتا اهمیت آن برای تولید انرژی در اسپرم است (Garner et al., 2001).

6- لیپیدها

یکی از ویژگی‌های کلیدی در عملکرد اسپرماتوزوئید، ترکیب چربی در غشای پلاسمایی و سمینال‌پلاسما است. پروفیل‌های لیپیدی شامل کلسترول، فسفولیپیدها، دی‌گلیسریدها، تری‌گلیسریدها و استرهای مومی است. منبع احتمالی لیپید در سمینال‌پلاسما می‌تواند اپیدیدیم و همچنین اسپرم‌ها باشد (Pickett and Komarek, 1966). لیپیدهای سمینال به ویژه فسفولیپیدها و کلسترول، ارتباط خاصی در ساختار و عملکرد غشای پلاسمایی اسپرم دارند (Cross, 1998) و ممکن است نقش مهمی در ساختار اسپرم، متابولیسم، ظرفیت‌پذیری اسپرم و باروری گامت‌های ماده داشته باشد (Hafez, 1987). انواع مختلف فسفولیپیدهای موجود در سمینال‌پلاسما شامل فسفاتیدیل کولین(کولین پلاسموژن) ، فسفاتیدیل اتانولامین، اسفینگومیلین، فسفاتیدیل سرین، فسفاتیدیل اینوزیتول، لایزوفسفاتیدیل اتانولامین، لایزوفسفاتیدیل کولین، دی فسفاتیدیل گلیسرول و فسفاتیدیک اسید می‌باشد که پلاسمینوژن فسفولیپید اصلی سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان است.

اگرچه فروکتوز اصلی‌ترین ماده‌ی تولیدکننده‌ی انرژی است، اسپرم‌ها ممکن است از فسفولیپیدها برای تولید انرژی در صورت عدم وجود کربوهیدرات‌ها استفاده کنند (Scott T W and Dawson, 1968). مصرف فسفولیپیدها توسط اسپرم‌ها ممکن است بر یکپارچگی غشای اسپرم تأثیر بگذارد که ممکن است در فهم توان کم باروری اسپرم منجمد-یخ‌گشایی شده مهم باشد. کمپلکس گلیسرول(گلیسرول فسفوریل کولین) ممکن است یک منبع مهم انرژی برای اسپرماتوزوا در مجرای تولیدمثلی ماده باشد (White and Wallace, 1961). مطالعات روی منی قوچ نشان داد که کاهش غلظت اسپرم و جنبنایی با کاهش محتوای لیپید سمینال‌پلاسما همراه است (Taha et al., 2000). بررسی‌ها بر روی عملکردهای واقعی لیپیدهای سمینال‌پلاسما در اسپرم نشخوارکنندگان ممکن است فرآیند نگهداری سرمایی را بهبود ببخشد زیرا انتقال پروتئین‌ها از طریق غشای اسپرم به وسیله‌ی توزیع لیپیدها در امتداد غشا تنظیم می‌شود (Parks and Graham, 1992).

7- هورمون‌ها و سیتوکین‌ها

هورمون‌هایی مانند استروژن­ها، پروژسترون، تستسترون، هورمون لوتئینه­کننده (LH)، پرولاکتین و پروستاگلندین‌ها در سمینال‌پلاسمای نشخوارکنندگان وجود دارد. عملکرد خاص این هورمون‌ها در سمینال‌پلاسما ناشناخته است (Juyana and Stella, 2012). هورمون‌های استروئیدی و پروستاگلندین نتیجه‌ی فعالیت سلول‌های لایدیگ، اپیدیدیم، وزیکول سمینال و پروستات وهمچنین خود اسپرم‌ها هستند زیرا سلول اسپرم هم حاوی آروماتاز و هم سیکلوکسیژناز است (Hess et al., 2001). پروفیل‌ هورمونی سمینال‌پلاسما در گونه‌های مختلف متفاوت است. سمینال‌پلاسمای قوچ حاوی مقادیر پایین غلظتهای استروژن و تستسترون در مقایسه با سمینال‌پلاسمای گاو نر است. مایع منی قوچ حاوی مقدار مناسبی از پروستاگلندین است که برای تحریک فعالیت انقباضی سرویکس و رحم و بهبود انتقال اسپرم در میش‌ها شناخته می‌شود و سطح پروستاگلندین وابسته به فصل است (Shore et al., 2003). سیدهو و گیل (1992) یک همبستگی منفی بین سطوح ایمنی فعال پرولاکتین در مایع منی و جنبایی و زنده‌مانی اسپرم مشاهده کرده‌اند (Sidhu and Gill, 1992). غلظت پروستاگلندین‌ها، تستسترون و استروژن در مایع منی به عنوان نشان‌دهنده‌ی وضعیت تولیدمثل گاو و قوچ پیشنهاد شده است ( Dimov and Georgiev, 1977).

8- PH

تنظیم PH داخل­سلولی برای عملکرد سلول ضروری است. قابل توجه است که چندین دستگاه انتقال‌دهنده‌ی یون و آنزیم‌هایی که حذف آنها باعث ناباروری می‌شود، یا وابسته به PH داخل‌سلولی یا به تنظیم آن بستگی دارند. در میان آنها کانال Ca2+، سولفات، کانال K+، تبادل ویژه‌ی Na+/H+ اسپرم و آدنیل سیکلاز بیشتر حائز اهمیت هستند. بدین ترتیب واضح است که تنظیم PH داخل‌سلولی برای فیزیولوژی اسپرم از اهمیت زیادی برخوردار است (Nishigaki et al., 2014).

حفظ PH داخل‌سلولی⁸(PH سیتوپلاسمی یا PHi) در داخل مرزهای فیزیولوژیکی برای عملکرد سلول اساسی است. بیشتر فرآیندهای سلولی تحت‌تأثیر و در محدوده‌ی PHi محدود می‌شوند. دامنه‌ی تغییرات PHi بر وضعیت یونیزاسیون اسیدهای ضعیف تأثیر می‌گذارد (Boron, 2004). بنابراین به عنوان اسیدگر فعالیت متابولیکی، سیتوزول و سلول‌ها می‌توانند در معرض PH خارجی قرار بگیرند که عدم تنظیم PHi می‌تواند عواقب عملکردی شدیدی را داشته باشد. به طور کلی، سلول‌ها PHi خود را از طریق چند مکانیسم پویا تنظیم می‌کنند که با تعادل در میزان تولید، حذف، انتقال و بافرینگ H+ تعیین می‌شود. سلول‌ها سرعت فعالیت انتقال یون‌های غشای پلاسمایی را کم و زیاد می‌کنند تا مراکز اسیدی را تحریک یا متوقف کنند (Ruffin et al., 2014). همان طور که پیش بینی شده است انتقالگرهای HCO3̶ و H+ از جمله بازیگران کلیدی در تنظیم PHi هستند. سلول‌ها می‌توانند تغییرات شدید در عبور از یک حالت فعال یا خاموش را نشان دهند، وضعیتی که اغلب باعث یک تغییر ناگهانی در PH می‌شود.

روش­های نگهداری اسپرم

1-نگهداری اسپرم به شکل مایع (نگهداری سرمایی)

  در این روش ابتدا سیمن در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با رقیق کننده مخلوط می­شود و حدود 30 دقیقه در این دما نگه می­دارند تا اثر آنتی­بیوتیکی رقیق­کننده اعمال شود و سپس به تدریج تا 5 درجه سانتی‌گراد سرد می­کنند. رقیق­کننده­ای که برای رقیق کردن سیمن می­توان استفاده نمود شامل زرده تخم مرغ،گلوکز، سیترات یا شیر گاو (چربی گرفته یا نگرفته) وشیر با قابلیت نگهداری مدت طولانی می­باشد. این رقیق­کننده­ها اسپرماتوزوییدها را تا حد امکان در مقابل شوک سرمایی، در مدت سرد کردن محافظت می­نماید، برای کنترل رشد میکروبی، باید 1000 واحد بین­المللی پنی­سیلین و 1 میلی­گرم استرپتومایسین به هر میلی­لیتر رقیق کننده اضافه گردد Evanc, 1987,Soultanpour et al., 2014)). سیمن جمع­آوری شده  بدون افزودن زرده تخم مرغ  را می­توان در داخل ظرف­ آب در یخچال بدون نیاز به رقیق­کننده به مدت 48-24 ساعت نگه­داری کرد. البته زرده تخم مرغ به عنوان یک رقیق­کننده­ی ساده می­تواند تعداد میش­هایی که به وسیله آن تلقیح می­شوند را دو برابر کند (Evans and Maxwel, 1989).

2-نگهداری اسپرم به شکل منجمد (نگهداری انجمادی)

ذخیره‌ی اسپرم راه مفیدی جهت نگهداری منابع ژنتیکی برای برخی از گونه‌های در خطر است. اولین کوشش جهت نگهداری سرمایی اسپرم پستانداران در چند دهه‌ی قبل صورت گرفته است. وقتی که منی منجمد شده و در دمای خیلی پایین، یعنی در ازت مایع در 196- درجه‌ی سانتی‌گراد نگهداری شود، واکنش‌های متابولیکی اسپرماتوزوا متوقف می‌شود. این کار امکان نگهداری منی برای مدت طولانی و در نتیجه ذخیره‌ی ژن­ها برای استفاده‌ی آینده و تضمین در مقابل از دست دادن نرهای منحصربفرد را مهیا می‌نماید. همچنین حمل و نقل داخلی و بین‌المللی منی آسان شده و می توان آن را خارج از دوره‌ی تولیدمثل، جمع‌آوری و ذخیره نمود در نتیجه وقتی‌که منی بصورت منجمد ذخیره شود، استفاده از نرها، گسترش خیلی زیادی می‌یابد (مموئی، 2000).

اثرات مخرب سردسازی و انجماد اسپرم

فرآیند انجماد به دلیل ایجاد تنش های اسمزی و اکسیداتیوی، اثرات مضری بر DNA، میتوکندری، ساختار غشای پلاسمایی و عملکرد اسپرم پستانداران، کاهش در جنبندگی و زنده‌مانی اسپرم، تغییرات در مرفولوژی اسپرم (در غشای پلاسمایی و تغییرات آکروزومی )و افزایش رادیکال‌های آزاد دارد (Shafaati Alishah et al., 2020). نخستین آسیب‌های ناشی از سرما یا انجماد اسپرم، در غشای آن بروز می‌کند. استرس‌های حرارتی در طی سردسای بر غشا وارد می‌شود. در نتیجه‌ی این امر، تغییراتی در توزیع فسفولیپیدهای سرتاسر هر دو لایه‌ی غشا ایجاد شده و علاوه بر اینکه ممکن است باعث جداشدن ساختمان غشایی شود (Hammerstedt et al., 1990).

موفقیت انجماد اسپرم در طی چند دهه­ی گذشته به آرامی پیشرفت کرده و امروزه نسبتا استاندارد­سازی شده است. با این حال انجماد حتی با تکنیک­های روز نیز روی عملکرد و باروری اسپرم اثر مخرب دارد به طور کلی قابلیت زیست اسپرم 50 درصد کاهش می­یابد در حالی که ظرفیت باروری ممکن است تا هفت برابر تحت تاثیر قرار می­گیرد. اندامک­های مختلف اسپرم تحت تاثیر اثرات مخرب انجماد قرار می­گیرند. القای واکنش زودرس آکروزومی، تغییر عملکرد میتوکندری، کاهش تحرک و اختلال در تراکم کروماتین که همگی باروری و قابلیت زیست اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهند.

جهت مقابله با این مشکلات در حین انجماد و یا بعد از پروسه‎‌ی یخ‌گشایی استفاده از رقیق‌کننده‌ها و محافظت‌کننده‌های مناسب بسیار ارزشمند و مهم می‌باشد.

انواع افزودنی‌ها به مایع منی برای نگهداری اسپرم مایع (نگهداری در یخچال در دمای 5 درجه سانتی‌گراد) و انجماد (نگهداری در ازت مایع در دمای 196- درجه سانتی‌گراد)

پس از اسپرم­گیری و ارزیابی، نمونه سیمن را می­توان به دو حالت مایع و منجمد تلقیح کرد. در هر دو حالت حجم نمونه سیمن باید افزایش یابد، به گونه­ای که بتوان شمار اسپرم مورد نیاز برای هر بار تلقیح حیوان ماده را در حجمی که کارکردن با آن آسان باشد، در اختیار داشت. به این فرایند رقیق­کردن گویند. محلولی (مایعی) را که برای این هدف به کار برده می­شود، رقیق­کننده یا اکستندر می­نامند (Zamiri, 2006).

 ذخیره­سازی موفق اسپرم (به صورت مایع و منجمد) نیاز به کاهش متابولیسم سلولی دارد تا طول عمر سلول افزایش یابد. برای رسیدن به این هدف و بهبود کیفیت اسپرم، استفاده از یک رقیق­کننده­ی مناسب ضروری می­باشد. برای حفظ حرکت و ظرفیت باروری و یکپارچگی غشای اسپرم ترکیبات گوناگونی به رقیق­کننده افزوده می­شود (Allai et al., 2018).

رقیق­کننده­ی اسپرم از اجزایی تشکیل شده است که از اسپرم در برابر عوامل مخرب محیطی در خارج از دستگاه تولید­مثل جلوگیری می­کند. اسپرم در منی رقیق نشده، برای مدت کوتاهی زنده می­ماند و سرد کردن آهسته منی تا دمای 5 درجه سانتی‌گراد سبب مرگ بسیاری از اسپرم ها می­شود. بنابراین، مایع رقیق­کننده، افزون بر این که باید برای رقیق­کردن مناسب باشد، لازم است که اسپرم­ها را در خلال سرد­شدن حفظ کند و دوره­ی زنده­مانی آنها را افزایش دهد. رقیق کننده باید خاصیت بافری داشته باشد تا بتواند لاکتیک اسید ناشی از متابولیسم سلولی را خنثی کند و PH را ثابت نگه دارد. همچنین رقیق­کننده باید از اسپرم در برابر شوک سرمایی محافظت کند و از رشد و تکثیر باکتری­ها جلوگیری کند و مواد غذایی لازم برای فعالیت سلول را مهیا کند (Rigby et al., 2001). از ابتدای به کار­گیری تکنیک تلقیح مصنوعی، رقیق­کننده­های مختلفی جهت نگهداری اسپرم در شرایط مایع و منجمد استفاده شده است. محققین استرالیایی پس از مقایسه­ی تعدادی از رقیق­کننده­های اسپرم قوچ، استفاده از بافر تریس، فروکتوز و زرده تخم مرغ را برای نگهداری در شرایط مایع و اضافه کردن 5 درصد گلیسرول به بافر تریس را برای نگهداری در شرایط انجماد، پیشنهاد نمودند (Salamon and Maxwell, 2000).

1-       افزودنی‌ها به عنوان محافظت‌کننده در برابر سرما و انجماد

یکی از علل اصلی تخریب و مرگ سلولی در طی انجماد، تشکیل یخ داخل و خارج سلولی می­باشد. عمل اولیه­ی حفاظت­کننده­ها کاهش سرعت تشکیل یخ و اندازه­ی کریستال یخ می باشد. با مقدار کافی حفاظت­کننده، تخریب انجمادی می­تواند حداقل شود. در حالیکه غلظت بالای آن می­تواند موجب تخریب و مسمومیت اسمزی شود (Shafaati Alishah et al., 2020).

زرده تخم­مرغ  یکی از اجزای اساسی رقیق­کننده سیمن است که به عنوان یک محافظت­کننده سرمایی عمل می­کند و از آسیب غشا جلوگیری می­کند (Anand et al., 2017). همچنین مقادیر پروتئین، فسفولیپیدها و کلسترول را تنظیم کرده و متعاقباً از غشای پلاسمایی در برابر آسیب ناشی از دما محافظت می­کند (Ferreira et al., 2014). اگرچه افزودن زرده تخم­مرغ ترکیبات یونی رقیق­کننده را تغییر می­دهد، با این وجود به دلیل محافظت عالی از اسپرم توصیه می­شود (Celeghini et al.,2008). همچنین، تأثیرات مفیدی بر روی زنده­ماندن اسپرم به عنوان محافظ غشای پلاسمایی و آکروزوم در برابر شوک سرما دارد (Amirat et al., 2004). فسفولیپیدها، کلسترول و لیپوپروتئین­هایی با چگالی کم زرده تخم­مرغ به طور خاص به عنوان اجزای محافظ شناخته شده­اند (Anton, 2007). عمل محافظتی زرده تخم­مرغ ممکن است به فسفولیپیدها، کلسترول و لیپوپروتئین­هایی با چگالی بالا (HDL) و محتوای لیپوپروتئین­هایی با چگالی کم (LDL) نسبت داده شود که باعث حفظ موثر اسپرم در برابر شوک سرما و همچنین در فرآیند انجماد - ذوب می­شود (Anand et al., 2017). از این نظر، وجود زرده تخم­مرغ در رقیق­کننده تریس (هیدروکسی متیل آمینو متان)  در هنگام انجماد به علت محافظت، آسیب کمتری به اسپرم وارد می­شود (Khumran et al., 2017). زرده تخم­مرغ حاوی برخی آنتی­اکسیدان­های مؤثر مانند فسوویتین و آلفا توکوفرول است که سبب کاهش اکسیداسیون واکنش زنجیره­ای و پراکسیداسیون لیپید غشای اسپرم می­شود (Alcay et al., 2015).

بسیاری از ترکیبات برای بررسی اثربخشی به عنوان محافظت‌کننده‌ی سرمایی اسپرم، مورد آزمایش قرار گرفتند ولی بسیاری از پروتکل‌های محافظتی سیمن هنوز استفاده از گلیسرول را در رقیق کننده، مناسب‌تر می‌دانند. در برخی موارد، احتمالا سایر محافظت‌کننده‌ها مثل دی متیل سولفوکساید برای اسپرم فیل ترجیح داده شده است (Jones, 1973).

انتخاب محافظ سرمایی در بسیاری از تحقیقات مورد آزمون و خطا قرار گرفته است. شاید به این دلیل است که توضیح کامل و رضایت‌بخشی برای عمل حفاظت‌کننده‌های سرمایی وجود ندارد. گلیسرول به همراه موادی مانند متانول، اتیلن گلیکول، 1و2- پروپان دی اول (پروپیلن گلیکول)، بوتان دی اول، استامید و دی متیل سولفوکساید (DMSO) جزء گروهی هستند که به سیتوپلاسم سلول نفوذ می‌کند (Holt, 2000).

همرستد و گراهام (1992) اشاره کردند که از آنجا که گلیسرول به داخل سلول می‌رود احتمالا ویسکوزیته‌ی سیتوپلاسمی را تحت‌تأثیر قرار می‌دهد در نتیجه نرخ کل فرآیندها را محدود می‌کند. شواهد نشان می‌دهد که ویسکوزیته‌ی سیتوپلاسمی در بین گونه‌ها متفاوت است. گلیسرول می‌تواند اثرات خاصی بر اسپرم گونه‌ها  بگذارد ، البته این استدلال را می‌توان به سایر محافظت‌کننده‌های نفوذکننده مثل DMSO، اتیلن گلیکول و متانول نیز اعمال کرد. همچنین به طور تجربی نشان داده شده است که گلیسرول قادر به وارد شدن بین دو لایه‌ی غشایی است.  همچنین گزارش کردند که قرارگرفتن سلول‌ها در معرض 5/0 مولار گلیسرول در رقیق کننده، اثر محافظ کنندگی حدود 1 میلی‌مولار داخل‌سلولی را خواهد داشت. این ممکن است به دلیل خواص غشایی سلول با تحریک تغییرات در بسته‌بندی لیپیدی کمک کند و از این رو پایداری و نفوذپذیری آب غشای پلاسمایی تغییر یابد(Hammerstedt et al., 1992). همرستد و همکاران (1990) در مورد توان گلیسرول به عنوان سوبسترا بیان کرده‌اند که آن می‌تواند وضعیت بیوانرژتیک اسپرم را تغییر دهد. شاید تعادل بین سنتز ATP و مصرف آن را تغییر می‌دهد. در صورت  کمبود ATPدر طول سردسازی ممکن است که کنترل متابولیسمی در فرآیندهای سلولی وابسته به یون به خطر بیفتد و سبب غیرفعال شدن فسفولیپازها و پروتئازها و آسیب غیرقابل برگشت سلولی شود (Hammerstedt et al., 1990).

2-آنتی­بیوتیک­ها

رقیق­کننده­ی استفاده شده برای ذخیره­سازی اسپرم  حاوی مقادیر زیادی از مواد مغذی لازم برای ادامه­ی فعالیت اسپرم و زندهمانی آن در محیط آزمایشگاهی است اما این مواد مغذی به باکتری­ها هم اجازه­ی رشد می­دهند. برای جلوگیری از آلودگی میکروبی، باید تمام وسایلی که در کار اسپرم­گیری و رقیق­سازی استفاده می­شوند کاملا استریل باشند. ولی نمی­توان جلوی برخی آلودگی­های میکروبی را گرفت چون میکرب می­تواند از طریق خود اسپرم و انزال  نیز وارد رقیق کننده شده و باعث کاهش راندمان فرآیند انجماد از طریق تولید رادیکال­های آزاد شود و در نتیجه میزان زنده­مانی و باروری کاهش یابد. در قوچ­ها، سیمن معمولاً با واژن مصنوعي جمع­آوری مي­شود كه ممكن است به باكتري­هاي سطح آلت تناسلي آلوده شود. در نتیجه، باکتری­ها ممکن است کیفیت مایع منی را در حین ذخیره­سازی به خطر بیندازند و دستگاه تولیدمثل میش را آلوده کنند. برای کم کردن این عوارض جانبی،  آنتی­بیوتیک­ها در رقیق­کننده­های سیمن اضافه می کنند تا از رشد باکتری جلوگیری شود (Salamon and Maxwell, 2000)، که برای نزدیک به 40 سال پنی­سیلین (1000 واحد بین­المللی) و استرپتومایسین (1 میلی­گرم) در رقیق­کننده استفاده می­شوند. پس از آن از پلی­میکسین B استفاده گردید و امروزه از جنتامایسین، تایلوزین، لینکومایسین و اسپکتینومایسین (6000 میکروگرم) نیز در رقیق­کننده استفاده می­شود (Zamiri, 2006).

3-افزودنی‌ها به عنوان گیرنده‌ی آب

انواع افزودنی‌ها که به عنوان گیرنده‌ی آب با حفظ تعادل اسمزی باعث حفاظت اسپرم‌ها در طی فرآیند سردسازی و انجماد می‌شوند شامل، گلوکز، فروکتوز، رافینوز، تره‌هالوز و غیره می‌باشند. عملکردهایی که قندها در رقیق­کننده منی ممکن است بر عهده داشته باشند عبارتند از: تأمین سوبسترایی که به آسانی قابل متابولیز باشد، کمک به متابولیسم فروکتوز، نگهداری تعادل اسمزی، اثر بر روی ساختار اسپرم و کاهش نسبتی که اسپرم توسط رقیق­کننده و دمای پایین آسیب دیده (که این ممکن است مربوط به نگهداری تعادل اسمزی باشد) (Lapwood and Martin, 1966).

1-3  گلوکز

ورستیجن و همکاران (2005) گزارش کردند که کاهش گلوکز موجب کاهش درصد اسپرم متحرک و افزایش اسپرم­های استاتیک در سگ می­شود (Verstegen et al., 2005).

-فروکتوز

فروکتوز قندی بوده که به راحتی به انرژی تبدیل می­شود. اضافه کردن فروکتوز می­تواند یک منبع انرژی اصلی برای اسپرم باشد. استفاده از قند­هایی مثل فروکتوز، سوکروز، گلوکز، ترهالوز و رافینوز در رقیق­کننده منی می­تواند تحرک اسپرم را افزایش دهد. قند در رقیق­کننده منی می­تواند به عنوان نگهدارنده­ی فشار اسمزی، منبع انرژی و حفاظت­کننده استفاده شود (Rasad and Simanjuntak, 2011).

2-3رافینوز

رافینوز تری­ساکارید متشکل از گالاکتوز، گلوکز، و فروکتوز است. رافینوز نفوذپذیري کمی در غشاي سلولی داشته و نقش حفاظت از یخ­زدگی دارد و در تعامل با لیپیدها و پروتئین­هاي غشاي اسپرم، تشکیل کریستال­هاي یخ درون سلولی را در طول انجماد کاهش و باعث حفظ فشار اسمزي می­گردد (Piri Bagcheh Jacky et al., 2013). رافینوز برای جلوگیری از تشکیل یخ خارج سلولی، فراهم کردن هایپرتونیسیته و افزایش تشکیل حالت میکروکریستال استفاده می­شود (DSarıözkan et al., 2012). رافینوز تری­ساکاریدی شبیه دیگر قندهاست که از طریق واکنش با غشای لیپیدی و پروتئین­ها خطر تشکیل کریستال یخ را کاهش داده که موجب دهیدراسیون اسمزی در طول حفاظت انجمادی می­شود. رافینوز در اکثر فرایندها برای مسدود کردن مقدار یخ خارج سلولی، فراهم کردن هایپرتونیسیته و افزایش تشکیل یخ­های کم پایدار و یا حالت­های کریستالی ریز استفاده می­شود و همچنین موجب حفاظت DNA در برابر آسیب­های انجمادی می­شود (Bucak et al., 2013). ساری­اوزکان و همکاران (2012) گزارش کردند که استفاده از قندها اثر مفیدی روی نگهداری تحرک، مورفولوژی سالم و یکپارچگی DNA اسپرم موش صحرایی در برابر آسیب خنک­سازی می­گذارد و رافینوز اثر محافظتی قوی­تری نسبت به ترهالوز و فروکتوز در حفظ تحرک اسپرم دارد(Sarıözkan et al., 2012; Dovlati et al., 2015 ). رافینوز یک ترکیب تری­ساکارید نفوذناپذیر بوده که در نگهداری فشار اسمزی مهم بوده و بنابراین به عنوان حفاظت­کننده عمل می­کند (Tuncer et al., 2010). تأثیر حفاظتی تری­ساکاریدها نسبت به مونو و دی­ساکاریدها گزارش شده­است. درجه بندی تأثیر­گذاری قندها در تثبیت پروتئین و لیپید غشای سلول به ترتیب زیر می­باشد: رافینوز ˂ ساکاروز ˂ لاکتوز ˂ فروکتوز ˂ گلوکز (Salamon and Maxwell, 2000)

3-3 تره‌هالوز

تره‌هالوز دي ساکاریدي متشکل از دو واحد گلوکز و قندهاي می باشد که C12H22O11.2H2O غیراحیاکننده با فرمول شیمیایی با غلظت بسیار زیاد در اکثر موجوداتی که امکان مقاومت در برابر دهیدراتاسیون کامل را دارند مانند قارچ­ها، مخمرها و برخی باکتري­ها وجود دارد. بررسی بر محتواي تره­هالوز مخمرها اثبات کرد که تره­هالوز به عنوان یک محافظت­کننده با کارایی بالا و تقویت­کننده مقاومت ترکیبات سلولی از قبیل غشاهاي پلاسمایی و پروتئین­ها عمل می­کند که این یافته­ها استفاده از تره­هالوز را به عنوان یک ماده محافظ در زمینه­هاي متنوعی سبب شده است (Piri Bagcheh Jacky et al., 2013). تره­هالوز به طور گسترده در طبیعت وجود دارد، و یکی از منابع انرژی شناخته شده در بدن اکثر ارگانیسم­های زنده بوده و می­تواند در بسیاری از ارگانیسم­ها از جمله باکتری­ها، قارچ­ها، حشرات، گیاهان و بی­مهرگان یافت می­شود و از بدن موجودات زنده در برابر تنش­های مختلف مانند خشکی، انجماد و فشار اسمزی حفاظت می­کند. موجودات غیرآبزی از طریق تولید مقدار زیادی تره­هالوز قادر به تحمل کمبود آب می­باشند. همچنین در ثبات غشا و دیگر مجموعه­های ماکرومولکولی تحت شرایط حاد زیست محیطی نقش کلیدی دارد (Higashiyama, 2002; Dovlati et al., 2016 ).

 تره‌هالوز دی­ساکاریدی شناخته شده برای تثبیت پروتئین­ها و غشای بیولوژیکی در طی فرایند­هایی مثل انجماد می­باشد. نمونه­هایی از توانایی تره­هالوز شامل حفظ ساختار زیستی سلول­های قرمز خون لیوفیلیز شده، انجماد پوست جنین، اووسیت انسان، سلول­های هماتوپویتیک، جنین موش و اندام­های برنامه­ریزی شده برای پیوند می­باشد. تره­هالوز توسط موجودات مختلف در پاسخ به شرایط استرس مانند دهیدراسیون تولید می­شود (Pérez et al., 2009) و از این طریق با انجام نقش حفاظت­کنندگی در برابر اثرات اسمزی و اشکال خاص واکنش با فسفولیپیدهای غشا، ایجاد محیط هایپرتونیک، باعث جلوگیری از دهیدراسیون اسمزی سلول قبل از انجماد شده و از این رو آسیب سلول را توسط کریستال یخ کاهش می­دهد و در بسیاری از گونه­های غیرآبزی در غلظت بالا یافت می­شود (Shankar-Reddy et al., 2010; Motta et al., 2014). این ترکیب نسبت به دیگر قندها حفاظت بهتری را در برابر خشکی ایجاد می­کند زیرا توانایی بالایی برای جایگزینی آب و کریستاله شدن دارد (Watanabe et al., 2003). شواهد نشان می­دهد که تره­هالوز با کاهش دمای فاز انتقال لیپید خشک اسپرم­ها را در فاز کریستال مایع در عدم حضور آب محافظت می­کند. همچنین از پروتئین­های حساس در حین خشک شدن محافظت می­کند و احتمالاً به طور مستقیم با پروتئین خشک از طریق اتصال هیدروژن بین گروه هیدروکسیل و باقیمانده­های قطبی واکنش می­دهد (Elbein et al., 2003). سه مکانیسم برای تره­هالوز در رابطه با عمل پایداری غشا ذکر شده است: 1- واکنش با فسفولیپید و افزایش سطح این مولکول­ها در یک لایه­ی فسفولیپید 2- افزایش سیالیت غشا 3- کاهش شرکت در فاز انتقال ژل به مایع در محلول­های حجیم (Rudolph et al., 1986).

4-افزودنی‌ها به عنوان آنتی‌اکسیدان

استرس اکسیداتیو و نیتروزاتیو زمانی اتفاق می‌افتد که  مقدار اکسیدان‌ها (گونه‌های فعال اکسیژن یا ROS و گونه‌های نیتروژن فعال یا RNS) افزایش یافته و آنتی اکسیدان ها کاهش یابند. زمانی که نمونه‌های اسپرم به مدت معینی در دمای پایین نگهداری می­شوند، ROSها افزایش یافته و آنتی­اکسیدان­ها کاهش می­یابند. استفاده از آنتی­اکسیدان­ها در رقیق­کننده می­تواند تا حدود زیادی از این امر جلوگیری کند. اولین مورد مکمل آنتی اکسیدانی خوراکی است، رویکردی که به طور گسترده در بررسی های مختلف بر روی گامت های نر و ماده در انسان مورد بحث قرار گرفته است. دومین مورد، مکمل آنتی اکسیدان ها در محیط های مورد استفاده در فن آوری های کمک باروری، عمدتا در رقیق­کننده­های مایع منی است که برای نگهداری نمونه ها استفاده می شود. در این زمینه، استفاده از آنتی اکسیدان ها در فرآیند انجماد-یخ­گشایی به طور گسترده عمیقا مورد بحث قرار گرفته است (Pezo et al., 2021; Aitken et al., 2020). با این حال، اثر استفاده از آنتی اکسیدان ها در رقیق­کننده­های مورد استفاده برای نگهداری سرمایی مایع منی به طور عمیق مورد بررسی قرار نگرفته است. نتایج به دست آمده در مطالعات انجمادی ممکن است برای نگهداری سرمایی قابل اجرا نباشد. تفاوت های اساسی بین فرآیند انجماد و نگهداری سرمایی وجود دارد، مانند شوک اسمزی، سمیت برودتی و یا وجود کریستال های یخ. علاوه بر این، متابولیسم سلولی عملاً در نمونه های منجمد متوقف می شود، در حالی که در نگهداری سرمایی، متابولیسم اسپرم به طور کامل متوقف نمی شود و تعداد اسپرم های مرده به تدریج در طول زمان افزایش می یابد. 

در طی نگهداری در دمای یخچال، معمولاً از 4 تا 17 درجه سانتی‌گراد، اسپرم ها دستخوش تغییراتی می شوند که می تواند توانایی لقاح آنها را به خطر بیندازد. نگهداری به صورت مایع در یخچال متابولیسم اسپرم را کاهش می دهد، اما آن را به طور کامل متوقف نمی­کند (Maxwell and Stojanov, 1996). در دمای 5 درجه سانتی‌گراد، پمپ Na+/K+ به اندازه کافی کار نمی کند و غلظت Na+ درون سلولی را افزایش می دهد (Vishwanath Shannon, 2000). علاوه بر این، در طول نگهداری سرمایی، جریان کلسترول افزایش می یابد و ممکن است ظرفیت­پذیری زودرس یا اگزوسیتوز آکروزوم رخ دهد (Peruma et al., 2013). 

1-4-آنتی­اکسیدان­های آنزیمی

آنزیم­های آنتی­اکسیدانی حاضر در اسپرم یا سمینال­پلاسما شامل SOD، GPx و CAT هستند. آنتی­اکسیدان­ SOD مهمترین آنزیم آنتی­اکسیدانی در سمینال­پلاسما است و سلول را در برابر O2- از طریق کاتالیز تغییر شکل آنیون H2O2 محافظت می­کند. علاوه بر آن، این عمل از واکنش OH- ،که بسیار واکنش­پذیر است، با O2- که منجر به تولید H2O2 می­شود، جلوگیری می­کند. افزودن SOD به رقیق­کننده در حضور یا عدم حضور دیگر آنتی­اکسیدان­ها موجب بهبود جنبایی و زنده­مانی اسپرم­ها در مقایسه با گروه شاهد گونه­های مختلف شده است ولی در سگ و گوسفند این اثرات همیشه مشاهده نگردیده است.

آنتی­اکسیدان CAT با کاتالیز H2O2 به آب از سلول محافظت می­کند. نشان داده شده است که افزودن CAT به همراه SOD به رقیق­کندده­های اسپرم حیوانات اهلی تأثیر بسزایی در افزایش میزان جنبایی خواهد داشت (Maxwell and Stojanov, 1996; Peruma et al., 2013) ولی اثر آن روی اسب اثبات نشده است (Aurich et al., 1997; Ball et al., 2001).

آنزیم GPx اثرات آنتی­اکسیدانی خود را با استفاده از شکل کاهش­یافته‌ی گلوتاتیون (GSH) به عنوان دهنده الکترون برای کاهش  H2O2 به آب اعمال می­کند. به سبب این واکنش، GSH  به گلوتاتیون دی سولفید (GSSG) اکسید می­شود، بنابراین در نهایت یکی دیگر از اعضای خانواده آنزیم­های GSH، گلوتاتیون ردوکتاز (GR) مسئولیت بازسازی GSH را با انتقال یک پروتون از NADPH به GSSG  انجام می­دهد (Agarwal and Aponte-Mellado, 2012). علیرغم اهمیت آن در کاهش H2O2، در 25 سال گذشته مطالعات اندکی با استفاده از GPx به تنهایی در نگهداری سرمایی اسپرم استفاده شده است و تنها در چند مطالعه از آن در ترکیب با سایر آنتی‌اکسیدان‌ها در سگ‌ها و اسب‌ها و گوسفند استفاده شده است (Del Prete et al., 2018; Falchi et al., 2018; Del Prete et al., 2019). مطالعات دیگری در مورد تأثیر GPx بر پارامترهای کیفیت اسپرم پس از انجماد/یخ­گشایی گزارش شده است، اما نتایج آن قطعی نیست (Angrimani et al., 2019; Mousavi et al., 2019). عملکرد آنتی اکسیدانی GPx مشروط به حضور GSH و H2O2 می­باشد و آن نیز به نوبه خود تحت تأثیر حضور SOD قرار می­گیرد. این ممکن است دلیلی باشد که GPx بیشتر در ترکیب با سایر مواد آنتی­اکسیدانی مورد مطالعه قرار گرفته است.

2-4 آنتی­اکسیدان­های غیر آنزیمی

- اسیدهای آمینه و پپتیدهای کوچک

اثرات آنتی­اکسیدانی بسیاری از اسیدهای آمینه و پپتیدهای کوچک مثل گلوتاتیون (GSH)، سیستئین، هیپوتائورین، تائورین، کارنیتین، گلوتامین، پرولین یا متیونین در بسیاری از مطالعات مربوط به نگهداری سرمایی در فاز مایع گزارش شده است. تیول­ها (-SH) مثل سیستئین،

به همراه گلوتامات و گلایسین یکی از اجزای GSH که گروه -SH را به این پپتید کوچک می‌رساند. در میان همه اینها، GSH گسترده­ترین آنتی­اکسیدان مورد مطالعه در مایع منی سردسازی شده، عمدتا در خوک، گوسفند و گاو است (Miguel et al., 2021). GSH یک ترکیب با وزن مولکولی پایین است که از اسیدآمینه­های سیستئین، گلوتامات و گلایسین تشکیل شده است. این پپتید کوچک عمل آنتی­اکسیدانی خود را به دو صورت انجام می­دهد:

1. خنثی­کننده مستقیم ROS، عمدتاً به دلیل وجود -SH ناشی از باقی­مانده سیستئین

2. حفظ سایر آنتی­اکسیدان­ها مانند ویتامین C یا E در فرم فعال آنها 

علاوه بر این، GSH  با ترمیم پروتئین‌های آسیب‌دیده، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدهای پراکسید شده و حفظ حالت کاهشی گروه‌های سولفیدریل پروتئین‌ها، از سلول‌ها محافظت می‌کند (Miro´nczuk et al., 2018). به ویژه در قوچ­ها، اکثر مطالعات هیچ اثر مثبتی از رقیق­کننده حاوی GSH پیدا نکردند. این امکان وجود دارد که در مورد GSH، غلظت ممکن است تعیین­کننده باشد و ممکن است بسته به گونه متغییر باشد. در گاو و خوک، به نظر می­رسد غلظت بهینه بین5/0 تا 5/1 میلی­مولار متغیر باشد (Zhang et al., 2016) ، اما در گوسفند، غلظت­های مورد مطالعه بسیار بیشتر از سایر گونه ها بود (Shi et al., 2020).

آمینواسید دیگری که مرتبط با GSH است سیستئین می­باشد. سطوح بالای این اسیدآمینه برای اطمینان از سطوح کافی GSH ضروری است، زیرا تحت شرایط استرس اکسیداتیو/نیتروزاتیو دسترسی بیشتر به سیستئین ممکن است نیاز باشد. زمانی­که سیستئین اکسید می­شود در یک واکنش برگشت­پذیر به سیستین تبدیل می­شود. سیستین، GSH را افزایش داده و به دنبال آن ظرفیت آنتی­اکسیدانی را هم در اسپرم تازه و هم انجماد-یخ­گشایی شده افزایش می­یابد (Miguel et al., 2021).

تائورین یک سولفونیل اسیدآمینه از سیستئین است و هیپوتائورین واسط آن به عنوان آنتی­اکسیدان در رقیق­کننده­های اسپرم استفاده می­شود. به طور کلی تائورین از کاهش میزان جنبندگی و تحرک اسپرم، زنده­مانی و یکپارچگی آکروزوم در طول نگهداری سرمایی در گونه­های مختلف جلوگیری می­کند. با این حال اثرات مفیدی در قوچ گزارش نشده است (Li  et al., 2017).

کارنیتین یک ترکیب قطبی است که به شدت در بدن پراکنده شده و به ویژه در بافت‌های نیازمند انرژی بالا مانند اپیدیدیم متمرکز می­شود (Zhai et al.,2007; Heidari et al., 2022). از آنجایی که این ترکیب نقش مهمی در انتقال اسیدهای چرب به داخل میتوکندری اسپرم دارد، نقش کلیدی در تحرک اسپرم ایفا می­کند که مقادیر زیادی انرژی از طریق بتا اکسیداسیون فراهم می­کند. در واقع افزایش تحرک اسپرم در مایع اپیدیدیم با غلظت کارنیتین مرتبط است. با این حال، کارنیتین یک آنتی­اکسیدان موثر است، که (1) با اجازه دادن به اسیدهای چرب برای عبور از غشاهای میتوکندری، دسترسی لیپیدها را برای پراکسیداسیون کاهش می­دهد، (2) محافظت از سیستم آنتی­اکسیدانی آنزیم های آنتی­اکسیدانی CAT، SOD  و GPx و جلوگیری از آسیب پراکسیداتیو و (3) دارای عمل مهار مستقیم  رادیکال­های آزاد مانند O2- یا H2O2  است (Gülçin, 2006). کارنیتین به عنوان یک آنتی­اکسیدان در برخی از مطالعات بر روی اسب، خوک و خرگوش استفاده شده است و موجب بهبود پارامترهای کیفی اسپرم مثل جنبایی، زنده­مانی و یکپارچگی آکروزوم در طی نگهداری سرمایی شده است.

همچنین سایر اسیدهای آمینه مانند گلوتامین و پرولین به طور کلی اثرات شامل افزایش تحرک اسپرم، زنده ماندن و کاهش ROS در طول نگهداری سرمایی در مقایسه با گروه های شاهد نشان دادند. در این راستا، گلوتامین یک پیش ساز اسید آمینه GSH است و پرولین بر اساس ساختار آمین ثانویه خود دارای خواص آنتی اکسیدانی است. متیونین آمینواسیدی است که قادر است با عمل به عنوان یک اسیدآمینه پیش­ساز برای سیستئین و همچنین به دلیل ظرفیت آن در واکنش با اکسیدان­ها برای تشکیل متیونین سولفوکسید از سلول­ها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت کند (Levine et al., 1999).

- ویتامین­ها، کاروتنوئیدها و پلی­فنل­ها

ویتامین E، ویتامین C، پلی­فنل­ها و کاروتنوئیدها به عنوان آنتی­اکسیدان­های طبیعی شناخته می­شوند که جهت محافظت از تخریب اسپرم در طی نگهداری سرمایی و انجماد استفاده می­شوند(Safa et al., 2016). ویتامین E به مجموعه­ای از توکوفرول­ها (α، β، γ، δ) و توکوترینول­ها (α، β، γ، δ) اشاره دارد. در میان آنها، آلفا توکوفرول قوی­ترین آنتی­اکسیدان محلول در چربی است و می­تواند زنجیره واکنش لیپوپراکسیداسیون را با اهدای یک الکترون به یک رادیکال لیپیدی یا هیدروپراکسید لیپیدی مسدود کند و خود را به رادیکال توکوفروکسیل نسبتاً پایدار تبدیل کند. توکوفروکسیل را می­توان با واکنش با سایر آنتی اکسیدان ها مانند ویتامین C یا GSH به شکل فعال توکوفرول تبدیل کرد (Amorini et al., 2021). ترولوکس یک آنالوگ سنتتیک محلول در آب ویتامین E می­باشد. تأثیر ویتامین E چه به شکل آلفا توکوفرول و چه به شکل ترولوکس در بسیاری از مطالعات نگهداری سرمایی در اکثر گونه­های حیوانات اهلی (اسب، قوچ، بز و خوک) به اثبات رسیده است.

ویتامین C یک آنتی­اکسیدان محلول در آب است که به عنوان یک عامل کاهش­دهنده عمل کرده و می­تواند یک یا دو الکترون اهدا کند و خود را به ترتیب به رادیکال آسکوربیل یا دهیدروآسکوربیک اسید (DHA) اکسید کند. سپس DHA را می­توان با اکسیداسونGSH  به GSSG  به شکل کاهش­یافته تبدیل کرد. عمل آنتی­اکسیدانی ویتامین C شامل یک عمل مهار مستقیم طیف گسترده ای از RONS از جمله رادیکال­های هیدروکسیل، سوپراکسید و پراکسی­نیتریت و یک اثر مهار غیر مستقیم رادیکال­های چربی دوست با کاهش رادیکال توکوفروکسیل به شکل فعال آن توکوفرول است (Kojo, 2005). نشان داده شده است که ویتامین C در فاز نگهداری سرمایی تأثیر معنی­داری روی پارامترهای اسپرم نداشت (Ball et al., 2001; Foote et al., 2002; Michael et al., 2009). تنها آریچ و همکاران (1997) تأثیر مثبتی را گزارش کردند که در غلظت­های بالا بود و بایستی توجه کرد که غلظت­های بالا سمی هستند (Aurich et al., 1997). افزودن ویتامین B12 یه رقیق کننده اسپرم قوچ توانست درصد جنبایی و زنده مانی را نسبت به گروه شاهد افزایش و درصد اسپرم های غیر طبیعی را کاهش دهد (pourseif et al. 2012).

اخیرا پلی­فنل­هایی مثل رسوراتول، کوئرستین، پروسی­آنیدین، هیدروکسی­تروزول و 3و4 هیدروکسی­فنیل گلیکول به عنوان آنتی­اکسیدان در نگهداری سرمایی و انجماد اسپرم استفاده می­شوند. پلی­فنل­ها متابولیت­های ثانویه مشتق شده از گیاهان هستند که با واحدهای فنلی متعدد مشخص می شوند. این ترکیبات از نظر ساختاری بسیار متنوع هستند و شامل چهار کلاس اصلی هستند: اسیدهای فنولیک، فلاوونوئیدها (مانند کوئرستین)، استیلبن­ها (مانند رسوراترول) و لیگنان­ها. به دلیل ساختار شیمیایی آنها، این ترکیبات آنتی­اکسیدان­های طبیعی هستند که تمایل به اکسیداسیون دارند، که به آنها اجازه می­دهد رادیکال­های آزاد را رهگیری کنند و از سلول ها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت کنند. علاوه بر این، برخی از پلی­فنل­ها دارای یک اثر آنتی­اکسیدانی آنزیمی هستند زیرا می­توانند آنزیم­های آنتی­اکسیدانی را تنظیم کنند (Amidi et al., 2016).

3-4 سایر مواد آنتی­اکسیدانی

برخی از هورمون­ها، از جمله ملاتونین، خواص آنتی­اکسیدانی نشان می­دهند (Chainy and Sahoo, 2020). ملاتونین یک ایندول مشتق شده از تریپتوفان است که در طول شب توسط غده صنوبری سنتز و ترشح می­شود. این هورمون علاوه بر نقشی که در تنظیم چرخه شبانه­روزی یا تولیدمثل فصلی در پستانداران دارد، عملکرد آنتی­اکسیدانی قابل توجهی نیز دارد. گیرنده­های ملاتونین در اسپرم انسان، همستر و قوچ وجود دارد (Ortiz et al., 2011)، اما در اسپرم اسب نر یافت نشده است (Balao et al., 2011).

ملاتونین هم یک اثر آنتی­اکسیدانی مستقیم در از بین بردن برخی از گونه­های فعال اکسیژن و نیتروژن (Reactive oxygen and nitrogen species  یا RONS) ، مانند –OH، O2-، ONOO- و –NO و یک اثر آنتی­اکسیدانی غیرمستقیم با تحریک فعالیت آنتی­اکسیدان­های درونی مانندCAT، SOD یا GPx نشان داده است (Chainy and Sahoo, 2020). ملاتونین به عنوان یک آنتی­اکسیدان در رقیق­کنندها در چندین مطالعه روی گاو، گوسفند، خوک، خرگوش و اسب مورد استفاده قرار گرفته است و افزایش قابل توجهی در تحرک اسپرم، زنده­مانی و کاهش لیپیدپراکسیداسیون نسبت به گروه­های شاهد مشاهده گردیده است. باعث افزایش میزان بلاستوسیست شده و اثرات مضر H2O2 را بر اسپرم و تولید جنین آزمایشگاهی کاهش داده است (Jang et al., 2010).

لیکوپن یک کاروتنوئید قرمزرنگ که در میوه‌ها و سبزیجاتی مانند گوجه‌فرنگی، هویج یا گریپ­فروت یافت می‌شود، به عنوان یک آنتی‌اکسیدان قوی با اثربخشی دو برابر کاروتن و ۱۰ برابر توکوفرول از آن یاد شده است (Rao et al., 2006). اثرات آنتی­اکسیدانی آن عمدتاً به ساختار شیمیایی آن نسبت داده می­شود. تایید شده است که لیکوپن می­تواند ONOO-، دی اکسید نیتروژن و همچنین رادیکال­های تیول و سولفونیل را از بین ببرد (Muzandu et al., 2006). اخیرا شیخ الاسلامی و همکاران (2020) مشاهده کردند که افزودن لیکوپن به رقیق­کننده باعث افزایش تحرک و زنده ماندی و کاهش لیپید پراکسیداسیون اسپرم سگ در مقایسه با گروه شاهد شد (Sheikholeslami et al., 2020).

سلنیوم کوفاکتور یا فعال­کننده­ی آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز است که یکی از قوی­ترین آنتی­اکسیدان­های طبیعی می­باشد و تجزیه­ی پراکسیدازهای لیپیدی و هیدروژن پراکسید را کاتالیز می­کند (Hill et al., 1996). آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز رادیکال­های آزاد درون سیتوپلاسم را نابود می­کند (Ozbal et al., 2008). به طور معمول، غلظت اکثر عناصر در کبد بالاتر از سایر اندام ها است اما در مورد سلنیوم، بیشترین غلظت آن در بیضه ها است. غلظت بالای سلنیوم در بیضه­ها نشان دهنده­ی نقش حفاظتی این عنصر و آنزیم­های مرتبط با آن در اسپرماتوژنز می­باشد. کمبود سلنیوم در حیوانات مزرعه ای باعث تغییر و شکنندگی بخش میانی اسپرم، میتوکندری­های بخش میانی و پیچیدگی دم اسپرم می­شود (Shi et al., 2010). در مطالعه­ای که بر روی خوکچه­ها انجام شده است،مشخص شده است که کمبود طولانی مدت سلنیوم در جیره­ی غذایی خوکچه­های هندی، باعث کاهش غلظت و تحرک اسپرم و بروز قطرات سیتوپلاسمی در اسپرم می­شود(Liu et al., 1982; Agarwal and Sekhon, 2010). بین فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز سمینال پلاسما و تراکم اسپرم ارتباط مثبت و معنی­داری وجود دارد و با افزایش فعالیت این آنزیم درصد اسپرماتوزوئیدهای با مورفولوژی طبیعی و درصد اسپرم­های زنده در کل نمونه افزایش می­یابد (Mohammadi et al., 2008). در پژوهشی از سوی براون و بوک مشخص شد که سلنیوم جز ضروری برای اسپرماتوژنز می­باشد (Brown and Burk, 1973). اثرات مثبت تجویز سلنیوم بر خصوصیات اسپرم شامل غلظت، میزان زنده­مانی، تحرک و مورفولوژی اسپرم مردان نشان داده شده است (Agarwal et al., 2004). برای تاثیر بیشتر و جلوگیری از مسمومیت سلنیومی ، بیشتر از فرم نانو سلنیوم در رقیق کننده ها استفاد می شود(Nateq et al., 2020; Nateq et al., 2021 )

سیلیمارین فلاونوئیدی است که به عنوان یک آنتی­اکسیدان قوی تنظیم­کننده­ی مقدار گلوتاتیون درون سلولی و تثبیت­کننده­ی غشای سلولی مطرح است (Momeni et al., 1393). مکانیسم عمل سیلیمارین از طریق تحریک RNA ریبوزومی و محافظت از غشای سلولی از آسیب اکسیداتیو است. همچنین فعالیت آنزیم­های SOD و GPx را تحریک می­کند (Wellington and Jarvis, 2001). سیلیمارین به عنوان افزودنی طبیعی به منی، آن را طی انجماد و سردسازی محافظت می­کند و علاوه بربهبود زنده­مانی بعد از یخ­گشایی، درصد اختلالات اسپرم را کاهش داده و درصد اسپرم سالم و درصد تحرک را بهبود می­بخشد(Behnam et al., 2022).

5- افزودنی­ها تحت عنوان کلاتور و گیرنده­ی یون­ها

کلسیم یک نقش حیاتی در جنبندگی اسپرم و همچنین فرآیند اتصال غشا در طول واکنش آکروزومی بازی می​کند. اتصال به شکاف زونا یا پروژسترون یک افزایش در غلظت کلسیم داخل‌سلولی ناشی از بازشدن کانال‌های کلسیمی یا آزادشدن کلسیم از ذخایر داخل‌سلولی را ایجاد می​کند. افزایش در غلظت کلسیم داخل‌سلولی باعث فعال شدن فسفاتیدیل اینوزیتول 4و5 بیس فسفات(  PIP2 ) می​شود که فسفولیپاز آن را هیدرولیز کرده و دو پیامبر ثانویه به نام دی آسیل گلیسرول و اینوزیتول 1و4و5 تری فسفات( IP3 ) را بوجود می​آورد. IP3 آزاد شدن کلسیم از ذخایر داخل‌سلولی را تحریک کرده و دی آسیل گلیسرول پروتئین‌کیناز سیتوپلاسمیک و فسفولیپاز A2 را فعال می​کند. این وقایع یک بار دیگر باعث یک افزایش در غلظت کلسیم می​شوند. سرانجام مقادیر بالای کلسیم که قبل از واکنش آکروزومی رخ می​دهد با هم PIP2 را هیدرولیز کرده و فرآورده​ی حاصله از فعالیت فسفولیپاز A2، دپلیمریزاسیون و اتصال غشا را سبب می​شود که اتفاق نهایی واکنش آکروزومی است. بر این اساس کلاتورهای کلسیم مثل EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) و EGTA (اتیلن گلیکول بیس آمینواتیلن اتر تترا استیک اسید) در برخی از مطالعات عملکرد اسپرم را بهبود بخشیده​اند (Keshtgar et a., 2016; Shafaati Alishah et al., 2020).

افزودن EDTA و EGTA در رقیق‌کننده‌ی منی کلسیم را کلات می‌کند و غلظت آن را در غشای پلاسمایی کاهش می‌دهد. EDTA یون‌های دیگر را نیز کلات می‌کند و همچنین ممکن است در مهار پراکسیداسیون لیپیدی نقش داشته باشد (Holt, 2000).

6-افزودنی­های طبیعی به رقیق­کننده

استفاده از صمغ­ها در رقیق­کننده­ی اسپرم پیشنهاد شده است. پلی ساکاریدهای گیاهی و مشتقات اصلاح شده آنها به طور گسترده در پزشکی استفاده می شوند. پلی ساکاریدها اصلاح کننده های بالقوه واکنش های بیوشیمیایی هستند. آنها دارای فعالیت های نرم کنندگی، پوشش دهنده، تنظیم سیستم ایمنی، ضد سرفه، ضد التهاب، ضد اسپاسم، ضد آلرژی، آنتی اکسیدان و ضد میکروب هستند. صمغ­ها از درختان هلو، زردآلو، گیلاس و بادام می­توانند ترشح شوند. صمغ درخت زردآلو نسبت به سایر صمغ­ها PH نزدیکتری به منی قوچ دارد (Samaei et al., 1396). در ترکیب خود دارای آرابینوز است که از قندهای احیاکننده است که خاصیت آنتی­اکسیدانی دارد. دارای ترکیبات فنولیک است که این ترکیبات از عوامل آنتی­اکسیدانی هستند و به عنوان پایان­دهنده­های رادیکال­های آزاد عمل می­کنند (Mahmoudi et al., 2010). صمغ­ها به علت ساختمان پلی­ساکاریدی که دارند بسیار هیدروفیل هستند و به راحتی تا 400 برابر خود آب جذب کرده و ذخیره می­کنند که می­توانند تشکیل کریستال یخ داخل سلول اسپرم را کاهش دهند. صمغ­ها به دلیل داشتن گلوکز در ترکیبات خود می­توانند انرژی اسپرم را نیز تأمین کنند. همچنین به دلیل داشتن ترپنوئیدها که دارای خاصیت ضدباکتریایی هستند، می­توانند با کاهش باکتری­ها در رقیق­کننده هم از رقابت باکتری­ها با اسپرم­ها جلوگیری کنند و هم با کاهش مواد زاید حاصل از متابولیسم باکتری­ها از اسیدی شدن PH محیط جلوگیری کرده و زنده­مانی اسپرم­ها را افزایش دهند. همچنین با کاهش تراکم باکتری­ها مصرف مواد مغذی توسط باکتری­ها را کاهش داده و درنتیجه تولید ROS ها را نیز کاهش می­دهد. صمغ زردآلو به دلیل داشتن دی­ساکاریدها و پلی­ساکاریدها ،که نمی­توانند از غشای اسپرم عبور کنند و با فسفولیپازهای غشای اسپرم تقابل می­کنند و باعث به هم زدن نظم غشا می­شوند، ایجاد رشته­های سلولی می­کنند و باعث زنده­مانی بهتر اسپرم می­شوند (Khanzadeh et al., 2021). همچنین صمغ درخت زردآلو با داشتن اسیدگلوکرونیک، که خاصیت سم­زدایی در بدن را دارد ، با ترکیب با مواد سمی آن­ها را بی­خطر می­سازد و احتمالا از این طریق نیز می­تواند در رقیق­کننده مواد زاید را پاکسازی کرده و در متابولیسم اسپرم نقش ایفا کند. افزودن کافئین به رقیق کننده اسپرم قوچ درصد صفات حرکتی و زنده مانی و مقادیر گلوتاتیون پراکسیداز و ظرفیت اکسیدانی کل را نسبت به گروه شاهد افزایش داد( Alipour et al.,2018).

نتیجه گیری

انجماد منی پستانداران، تحولی اساسی در نگهداری منی و حفاظت از انجماد سلول اسپرم به وجود آورده و راهی برای حفظ پروتوپلاسم سلول جنسی می­باشد که می­تواند با حفظ DNA گونه­ها، در دامپروری، آبزی­پروری و حفظ تنوع زیستی کاربرد زیادی داشته باشد و بانک­های ذخیره­ی اسپرم می­توانند همراه با دیگر تکنولوژی­های تولید­مثلی، در بهبود نژادها و حفاظت گونه های وحشی و بومی در حال انقراض نقش مهمی داشته باشند. همچنین با انجماد اسپرم، امکان انتقال به فاصله­های خیلی دور، کنترل بیماری­ها و حفظ بانک­های ژنتیکی ممکن می­گردد. با استفاده از انجماد اسپرم­ها و تکنیک­های تولیدمثلی، بسیاری از مشکلات باروری حیوانات آزمایشگاهی، دامی و انسانی قابل حل می­باشد. به طورکلی، کیفیت اسپرم یخ گشایی شده از روی فاکتورهای مهمی مانند تحرک، درصد اسپرم­های زنده و سلامت آکروزوم آنها ارزیابی می­شود. بر اساس مطالعاتی که محققین مختلف با استفاده از سطوح مختلف انواع افزودنی­ها به رقیق­کننده­ی اسپرم منجمد یا رقیق­کنده­های سرمایی روی انواع مختلف حیوانات به انجام رساندند مشاهده گردیده است که استفاده از افزودنی­های مختلف می­تواند توانایی زنده­مانی، جنبایی، یکپارچگی آکروزوم و سایر پارامترهای کیفی اسپرم را تا حدود زیادی بهبود ببخشد.

تعارض منافع

نویسندگان اعلام می­دارند که هیچگونه تضاد منافعی ندارند.

منابع

Agarwal, A. and Sekhon, L.H. (2010). The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility. Human Fertility, 3: 217-225.

Agarwal, A., Aponte-Mellado, A., Premkumar, B.J., Shaman, A. and Gupta, S. (2012). The effects of oxidative stress on female reproduction: A review. Reproductive Biology and Endocrinology, 10: 1-31.

Agarwal, A., Nallella, K.P., Allamaneni, S.R. and Said, T.M. (2004). Role of antioxidant in treatment of male infertility: an overview of the literature. Reproductive Biomedicine, 8: 616-27.

Aitken, R.J. and Drevet, J.R. (2020). The Importance of Oxidative Stress in Determining the Functionality of Mammalian Spermatozoa: A Two-Edged Sword. Antioxidants, 9: 111-128

Alcay, S., Toker, M.B., Gokce, E., Ustuner, B., Onder, N.T., Sagirkaya, H., et al. (2015). Successful ram semen cryopreservation with lyophilized egg yolk-based extender. Cryobiology, 71(2): 329-333.

Allai, L., Benmoula, A., Marciane da Silva, M., Nasser, B. and El Amiri, B. (2018). Supplementation of ram semen extender to improve seminal quality and fertility rate. Animal Reproduction Science, 192: 6–17.

Allai, L., Benmoula, A., Silvamaia, M., Nasser, B. and Elamiri, B. (2018). Supplementation of ram semen extender to improve seminal quality and fertility rate. Animal Reproduction Science, 192:6-17.

Alipour, P., Daghigh Kia, H. Moghaddam,Gh. and Ebrahimi, M.2018.Evaluation caffeine antioxidant properties on Ghezel ram sperm quality after freeze- thawing. Revue de Medecine Veterinaire, 10-12:233-240.

 

Alvarez, J.G., Touchstone, J.C., Blasco, L. and Storey, B.T. (1987). Spontaneous lipid peroxidation and production of hydrogen peroxide and superoxide in human spermatozoa superoxide dismutase as major enzyme protectant against oxygen toxicity. Journal of Andrology, 8:338–348.

Amidi, F., Pazhohan, A., Shabani Nashtaei, M., Khodarahmian, M. and Nekoonam, S. (2016). The role of antioxidants in sperm freezing: A review. Cell Tissue Bank, 17: 745–756.

Amirat, L., Tainturier, D., Jeanneau, L., Thorin, C., Gérard, O., Courtens, J.L., et al. (2004). Bull semen in vitro fertility after cryopreservation using egg yolk LDL: a comparison with Optidyl®, a commercial egg yolk extender. Theriogenology, 61(5):895-907.

Amorini, A.M., Listorti, I., Bilotta, G., Pallisco, R., Saab, M.W., Mangione, R., et al. (2021). Antioxidant-Based Therapies in Male Infertility: Do We Have Sufficient Evidence Supporting Their Effectiveness? Antioxidants, 10: 220.

Anand, M., Baghel, G. and Yadav, S. (2017). Effect of egg yolk concentration and washing on sperm quality following cryopreservation in Barbari buck semen. Journal of Applied Animal Research, 45(1):560-565.

Anand, M., Baghel, G. and Yadav, S. (2017). Effect of egg yolk concentration and washing on sperm quality following cryopreservation in Barbari buck semen. Journal of Applied Animal Research, 45(1):560-565.

Angrimani, D.S.R., Silva, R.O.C., Losano, J.D.A., Dalmazzo, A., Tsunoda, R.H., Perez, E.G.A., et al. (2019). Extender Supplementation with Antioxidants Selected after the Evaluation of Sperm Susceptibility to Oxidative Challenges in Goats. Animal Biotechnology, 30: 21–29.

Anton, M. (2007). Low-density lipoproteins (LDL) or Lipovitellenin Fraction. In: Bioactive egg compounds. Berlin/Heidelberg, Springer-Verlag. 7-12.

Asadpou, R., Pourseif, M.M., Moghaddam, Gh., Jafari, R., Tayefi, H. and Mahmodi, H.2012.ffect of vitamin B12 addityion to extenders on some physiochemical paraameters of semen in crossbred rams. African Journal of Biotechnology, 11:11741-11745.

Aurich, J.E., Schönherr, U., Hoppe, H. and Aurich, C. (1997). Effects of antioxidants on motility and membrane integrity of chilled-stored stallion semen. Theriogenology, 48: 185–192.

Balao Da Silva, C.M., MacÍas-García, B., Miró-Morán, A. González-Fernández, L., Morillo-Rodriguez, A., Ortega-Ferrusola, C., et al. (2011). Melatonin reduces lipid peroxidation and apoptotic-like changes in stallion spermatozoa. Journal of Pineal Research, 51: 172–179.

Ball, B.A., Medina, V., Gravance, C.G. and Baumber, J. (2001). Effect of antioxidants on preservation of motility, viability and acrosomal integrity of equine spermatozoa during storage at 50C. Theriogenology, 56: 577–589.

Barrios, B., Pe´rez-Pe´, R., Gallego, M., Tato, A., Osada, J. and Muin˜o-Blanco, T. (2000). Seminal plasma proteins revert the cold-shock damage on ram sperm membrane. Biology Reproduction, 63: 1531–1537.

Behnam, M., Moghaddam,Gh., Daghigh kia, H., qasqmi panahi,B. and Nateq, S. 2022. Effect of of silymarin on the membrane integrity, viability and motlility of ram frozen sperm. Journal of Animal Science Researches, 32:95-105. (in persian)

Boron, W.F. (2004). Regulation of intracellular pH. Advances in physiology education, 28: 160–179.

Brown, D.G. and Burk, R.F. (1973). Selenium retention in tissue and sperm of rats fed a torula yeast diet. Journal of Nutrition, 102: 102-108.

Bucak, M.N., Keskin, N., Taşpınar, M., Çoyan, K., Başpına, N., Cenariu, M.C., et al. (2013). Raffinose and hypotaurine improve the post-thawed Merino ram sperm parameters. Cryobiology, 67(1), 34-39.

Celeghini, E.C.C., De Arruda, R.P., De Andrade, A.F.C., Nascimento, J., Raphael, C.F. and Rodrigues, P.H.M. (2008). Effects that Bovine Sperm Cryopreservation Using Two Different Extenders have on Sperm Membranes and Chromatin. Animal Reproduction Science 104: 119-131.

Cevik, M., Tuncer, P.B., Tas demer, U. and Ozgurtas, T. (2007). Comparison of spermatological characteristics and biochemical seminal plasma parameters of normozoospermic and oligoasthenozoospermic bulls of two breeds. Turkish journal of veterinary and animal sciences, 31:381–387.

Chainy, G.B.N. and Sahoo, D.K. (2020). Hormones and oxidative stress: An overview. Free Radical Research, 54: 1–26.

Chandonnet, I., Roberts, K.D., Chapdelaine, A. and Manjunath, P. (1990). Identification of heparin-binding proteins in bovine seminal plasma. Molecular reproduction and development, 26:313–318

Chatdarong, K., Chaivechakarn, A., Thuwanut, P. and Ponglowhapan, S. (2012). Effects of Cold Storage Prior to Freezing on Superoxide Dismutase, Glutathione Peroxidase Activities, Level of Total Reactive Oxygen Species and Sperm Quality in Dogs. Reproduction in Domestic Animals, 47: 274–277.

Cross, N.L. (1998). Role of cholesterol in sperm capacitation. Biology of reproduction, 59:7–11.

Dacheux, J., Gatti, J.L. and Dacheux, F. (2003). Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation. Microscopy research and technique, 61: 7–17.

De Lamirande, E. and Gagnon C. (1992). Reactive oxygen species and human spermatozoa II depletion of adenosine triphosphate plays an important role in the inhibition of sperm motility. Journal of andrology, 13: 379–386.

Del Prete, C., Ciani, F., Tafuri, S., Pasolini, M.P., Della Valle, G., Palumbo, Vet al. (2018). Effect of superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase supplementation in the extender on chilled semen of fertile and hypofertile dogs. Journal of Veterinary Science 19: 667.

Del Prete, C.; Stout, T., Montagnaro, S., Pagnini, U., Uccello, M., Florio, P., et al. (2019). Combined addition of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase improves quality of cooled stored stallion semen. Animal Reproduction Science, 210: 1-10.

Desnoyers, L. and Manjunath, P. (1992). Major proteins of bovine seminal plasma exhibit novel interactions with phospholipid. The Journal of biological chemistry. 267: 10149–10155.

Dimov, V. and Georgiev, G. (1977). Ram semen prostaglandin concentration and its effect on fertility. Journal of animal science, 44:1050–1054.

Domı´nguez, M.P., Falcinelli, A., Hozbor, F., Sa´nchez, E., Cesari, A. and Alberio, R.H. (1992). Theriogenology, 200869: 564–573.

Dovlati, P., Moghaddam, Gh, Daghigh kia, H., Taghizadeh, A. and Rafat, A. 2015.The effect of adding different raffinose concentrations in the diluents in semen cryopreservation of different breeds of ram at reproductive season. Journal of Animal Science Researches, 25:121-132. (in persian).

Dovlati, P., Moghaddam, Gh. and Ahmadian, H.2016.Evaluation of the effects of cysteine and trehalose on long- term cryopreservation of ram semen.Journal of Agri-Food and Applied Sciences, 4:1-6.

 

 

Eghbali, M., Alvi-Shoushtari, S.M. and Rezaii, S.A. (2008). Effects of copper and superoxide dismutase content of seminal plasma on buffalo semen characteristics. Pakistan journal of biological sciences. 11: 1964–1968.

Eghbali, M., Alvi-Shoushtari, S.M. and Rezaii, S.A. (2008). Effects of copper and superoxide dismutase content of seminal plasma on buffalo semen characteristics. Pakistan journal of biological sciences, 11:1964–1968.

Elbein, A.D., Pan, Y.T., Pastuszak, I. and Carroll, D. (2003). New insights on trehalose: a multifunctional molecule, Glycobiology. 13(4): 17-27.

El-Hajj Ghaoui, R., Gillan, L., Thomson, P.C., Evans, G. and Maxwell, W.M.C. (2007). Effect of seminal plasma fractions from entire and vasectomized rams on the motility characteristics, membrane status, and in vitro fertility of ram spermatozoa. Journal of andrology. 28: 109–122.

El-Manna, M.M., Tingari, M.D. and Ahmed, A.K. (1986). Studies on camel semen II biochemical characteristics. Animal reproduction science, 12:223–231.

Evanc, G. (1987). Salmon's artificial insemination of sheep and goats. Star printery pty ltd,

Evans, G. and Maxwel, W.M.C. (1989). Salamon’s artificial insemination of sheep and goats. Butter worth &Co. Ltd, London.

Falchi, L., Galleri, G., Zedda, M.T., Pau, S., Bogliolo, L., Ariu, F. and Ledda, S. (2018). Liquid storage of ram semen for 96 h: Effects on kinematic parameters, membranes and DNA integrity, and ROS production. Livestoc Science, 207: 1–6.

Ferdinand, N., Thomas, T.T., Augustave, K., Herny, D.F., Ferdinand, T. and Etienne, P.T. (2012). Effects of Buck Age, Storage Duration, Storage Temperature and Diluent on Fresh West African Dwarf Buck Semen. Journal of reproduction and fertility. 3: 58-66.

Ferreira, V.D.S., Mello, M.R.B.D., Fonseca, C.E.M.D., Dias, A.C.F., Cardoso, J.M., Silva, R.B. et al. (2014). Effect of seminal plasma and egg yolk concentration on freezability of goat semen. Revista Brasileira de Zootecnia. 43(10): 513-518.

Flipse, R.J. (1960). Metabolism of bovine semen IX glutamic oxaloacetic and glutamic pyruvic transaminase activities. Journal of dairy science, 43: 773–776.

Foote, R.H., Brockett, C.C. and Kaproth, M.T. (2002). Motility and fertility of bull sperm in whole milk extender containing antioxidants. Animal Reproduction Science, 71: 13–23.

Garner, D.L., Thomas, C.A., Gravance, C.G., Marshall, C.E., DeJarnette, J.M. and Allen, C.H. (2001). Seminal plasma addition attenuates the dilution effect in bovine sperm. Theriogenology, 56:31–40.

Gavella, M. and Lipovac, V. (1998). In vitro effect of zinc on oxidative changes in human semen. Andrologia, 30:317–323.

Gu¨ndog˘un, M. (2006). Some reproductive parameters and seminal plasma constituents in relation to season in Akkaraman and Awassi rams. Turkish journal of veterinary and animal sciences, 30: 95–100.

Gülçin, I. (2006). Antioxidant and antiradical activities of L-carnitine. Life Science, 78: 803–811.

Hafez, E.S.E. (1987). Semen evaluation In: Hafez, ESE, ed. Reproduction in Farm Animals. 5th ed. Philadelphia, PA: Lea & Febiger; 455–480.

Hafez, E.S.E. (1987). Semen evaluation In: Hafez, ESE, ed. Reproduction in Farm Animals. 5th ed. Philadelphia, PA: Lea & Febiger; 455–480.

Hamamah, S. and Gatti, J.L. (1998). Role of the ionic environment and internal pH on sperm activity. Human reproduction, 13:20–30.

Hammerstedt, R.H. and Graham, J.K. (1992). Cryopreservation of poultry sperm: the enigma of glycerol. Cryobiology, 29: 26–38.

Hammerstedt, R.H. and Graham, J.K., Nolan, J.P. (1990). Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. Journal of andrology, 11: 73–88.

Heidari, M., qasqmi panahi,B., Moghaddan, Gh., Daghigh kia, H. and Masoudi, R.2022. L-carintine improves quality parameters and epigenetic patterns of Bucks froen- thawed semen. Animal Reproduction Science, 247:1-7.

 

Henricks, D.M., Kouba, A.J., Lackey, B.R., Boone, W.R. and Gray, S.L. (1998). Identification of insulin-like growth factor I in bovine seminal plasma and its receptor on spermatozoa: influence on sperm motility. Biology of reproduction .59: 330–337.

Hess, R.A., Zhou, Q., Nie, R., Oliveira, C., Cho, H., Nakaia, M., et al. (2001). Estrogens and epididymal function. Reproduction, fertility and development, 13:273–283.

Hidiroglou, M. and Knipfel, J.E. )1984(. Zink in mammalian sperm: a review. Journal of dairy science, 67:1147–1156.

Higashiyama, T. (2002). Novel functions and applications of trehalose. Pure and applied Chemistry. 74(7), 1263-1269.

Hill, K.E., Xia, Y., Akesson, B., Boeglin, M.E. and Burk, R.F., (1996). Selenoprotein P concentration in plasma is an index of selenium status in selenium-deficient and selenium-supplemented Chines subjects. Journal of Nutrition, 126(1): 138-145

Holt, W.V. 2000. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science. 62: 3-22.

Jang, H.Y., Kim, Y.H., Kim, B.W., Park, I.C., Cheong, H.T., Kim, J.T., et al. (2010). Ameliorative effects of melatonin against hydrogen peroxide-induced oxidative stress on boar sperm characteristics and subsequent in vitro embryo development. Reproduction in Domestic Animals, 45: 943–950.

Jobim, M.I.M., Oberst, E.R., Salbego, C.G., Souza, D.O., Wald, V.B., Tramontina, F., et al. (2004). Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their relation with semen freezability. Theriogenology, 61:255–266.

Jones, R.C. (1973). Collection, motility and storage of spermatozoa from the African elephant Loxodonta Africana. Nature, 243: 38–39.

Juyena, N.S. and Stella. (2012). Seminal Plasma: An Essential Attribute to Spermatozoa. Journal of andrology, 33(4): 536-551.

Kareskoski, M. and Katila, T. (2008). Components of stallion seminal plasma and the effects of seminal plasma on sperm longevity. Animal reproduction science, 107: 249–256.

Kaya, A., Aksoy, M. and Tekeli, T. (2002). Influence of ejaculation frequency on sperm characteristics, ionic composition and enzymatic activity of seminal plasma in rams. Small ruminant research 44:153–158.

Keshtgar, S., Gharesi-Fard, B., Iravanpour, F. and Kazerooni, M. (2016). Combined effect of Trolox and EDTA on frozen-thawed sperm quality. Iranian journal of medical sciences, 41(3): 230–237.

Khanzadeh, P., Moghaddam, G., Daghigh kia, H., Rafat, S.A., and moradi, R. (2021). The effect of apricot Tree gum on the quality of frozen and melted ram sperm in the breeding season. Iranian Journal of ASpplied Animal Science, 11: 749-760.

Khumran, A., Yimer, N., Rosnina, Y., Ariff, M., Wahid, H., Kaka, A., et al. (2017). Supplementation of Antioxidant BHT to Different Bull Semen Extenders Enhances Semen Quality after Chilling. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science, 40 (1): 131 - 142.

Kim, J.G. and Parthasarathy, S. (1998). Oxidation and the spermatozoa. Seminars in reproductive medicine, 16:235–339.

Kojo, S. (2005). Vitamin C: Basic Metabolism and Its Function as an Index of Oxidative Stress. Current Medicinal Chemistry, 11: 1041–1064.

Kumar, A. and Farooq, A. (1994). Effect of oxytocin on the concentration of fructose in the accessory glands of mouse. Life sciences, 55:19–24.

Lapwood, K.R. and Martin, I.C.A. (1966). The Use of Monosaccharides, Disaccharides, and Trisaccharides in Synthetic Diluents for the Storage of Ram Spermatozoa At 37° C and 5° C. Australian journal of biological sciences, 19(4), 655-672.

Lenzi, A., Picardo, M., Gandini, L. and Dondero, F. (1996). Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Human reproduction update, 2:246–256.

Levine, R.L., Berlett, B.S., Moskovitz, J., Mosoni, L. and Stadtman, E.R. (1999). Methionine residues may protect proteins from critical oxidative damage. Mechanisms of Ageing and Development, 107: 323–332.

Li, H., Zhang, X.G., Fang, Q., Liu, Q., Du, R.R., Yang, G.S., et al. (2017). Supplemental effect of different levels of taurine in Modena on boar semen quality during liquid preservation at 17 _C. Animal Science Journal, 88: 1692–1699.

Liu, Y., Wang, D.K. and Chen, L.M. (2012). The physiology of bicarbonate transporters in mammalian reproduction. Biology of reproduction, 86 (4) 99:1-13.

Mahmoudi, M., Ebrahimzadeh, M.A., Nabavi, S.F., Hafezi, S., Nabavi, S.M. and Eslami, S.H. (2010). Antiinflammatory and antioxidant activities of gum mastic. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 14(9): 765-769.

Mann, T. (1964). The Biochemistry of Semen and of the Male Reproductive Tract. 2nd ed. London, United Kingdom: Methuen.

Mann, T. and Lutwak-Mann, C. (1981). Male reproductive function and semen: themes and trends in physiology, biochemistry and investigative andrology. Berlin, Germany: Springer-Verlag; 495.

Martı, E., Martı, J.I., Muin, o-Blanco.T. and Cebria´n-Pe´rez, J.A. (2008). Effect of the cryopreservation process on the activity and immunolocalization of antioxidant enzymes in ram spermatozoa. Journal of andrology, 29: 459–467.

Martı, E., Martı, J.I., Muin, o-Blanco.T. and Cebria´n-Pe´rez, J.A. (2008). Effect of the cryopreservation process on the activity and immunolocalization of antioxidant enzymes in ram spermatozoa. Journal of andrology, 29: 459–467.

Massa´nyi, P., Trandzik, J., Nad, P., Toman, R., Skalicka´, M. and Kore´nekova´, B. (2003). Seminal concentrations of trace elements in various animals and their correlations. Asian journal of andrology, 5:101–104.

Matsuoka, T., Imai, H., Asakuma, S., Kohno, H. and Fukui, Y. (2006). Changes of fructose concentrations in seminal plasma and glucose and testosterone concentrations in blood plasma in rams over the course of a year. Journal of reproduction and development, 52:805–810.

Maxwell, W. and Stojanov, T. (1996). Liquid storage of ram semen in the absence or presence of some antioxidants. Reproduction, Fertility and Development, 8: 1013-1020

Maxwell, W.M.C., Graaf, S.P., Ghaoui, R.E.H. and Evans, G. (2007). Seminal plasma effects on sperm handling and female fertility. Society of reproduction and fertility supplement, 64:13–38.

Michael, A.J., Alexopoulos, C., Pontiki, E.A., Hadjipavlou-Litina, D.J., Saratsis, P., Ververidis, H.N. and Boscos, C.M. (2009). Effect of antioxidant supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa. Animal Reproduction Science, 112: 119–135.

Miguel, A., Jesús L. Fernando, J., Santolaria, P. and Castelló-Ruiz, M. (2021). Role of Antioxidants in Cooled Liquid Storage of Mammal Spermatozoa. Antioxidants, 10: 1-19.

Miro´nczuk-Chodakowska, I., Witkowska, A.M. and Zujko, M.E. (2018). Endogenous non-enzymatic antioxidants in the human body. Advances in Medical Sciences, 63: 68–78.

Moghaddam, Gh., Pourseif, M.M. and Rafat, S.A.2012.Seasonal variation n semen quality and quality traits of Iranian crossbred rams.Slovak journal of Animal Science,45:67-75.

Mohammadi, S.H., Movahedin, M. and Mowla, S.J. (2008). Antioxidant effects of selenium on sperm parameters and testicular structure in young and aged mice. Journal of Reproduction and Infertility, 9(3): 229-237.

Momeni, H.N., Sepehri, H. and Yosefi, M. (2015). Effect of Silymarin on Plasma Membrane and Acrosome of Sperm Treated with Aluminum Chloride. Journal of Arak University of Medical Sciences, 18(4): 71-80. [In Persian]

Motta, J.P.R., Paraguassú-Braga, F.H., Bouzas, L.F. and Porto, L.C. (2014). Evaluation of intracellular and extracellular trehalose as a cryoprotectant of stem cells obtained from umbilical cord blood. Cryobiology, 68(3): 343-348.

Mousavi, S.M., Towhidi, A., Zhandi, M., Amoabediny, G., Mohammadi-Sangcheshmeh, A., Sharafi, M., et al. (2019). Comparison of two different antioxidants in a nano lecithin-based extender for bull sperm cryopreservation. Animal Reproduction Science, 209: 1-9.

Muzandu, K., Ishizuka, M., Sakamoto, K.Q., Shaban, Z., El Bohi, K., Kazusaka, A. and Fujita, S. (2006). Effect of lycopene and _-carotene on peroxynitrite-mediated cellular modifications. Toxicology and Applied Pharmacology, 215: 330–340.

Nateq, S., Moghaddam, Gh. Alijani, S. and Behnam, M. 2020. The effects of differen levels of Nano selenium on the quality of frozen- thawed sperm in ram. Journal of Applied Animal Science, 48:434-439.

Nateq, S., Moghaddam, Gh. Alijani, S.Nazari, F. and Ghamari,H. 2021. Effect of of Nano selenium supplementation in semen extender on ram sperm quality following frozing- thawing process. Journal of Animal Science Researches, 31:1-10. (in persian)

 

Neumark, H. and Schindler, H. (1967). Amino acids, amines and peptides of ram epidiymal semen. Journal of reproduction and fertility, 14: 469–471.

Nishigaki, T., Jose, O., Gonzalea-Cota, A.L., Romero, F., Trevino, C.L. and Darzson, A. (2014). Intracellular pH in sperm physiology. Biochemical and biophysical research communications, 450: 1149-1158.

O’Flaherty, C.M.O., Beorlegui, N.B. and Beconi, M.T. (1999). Reactive oxygen species requirements for bovine sperm capacitation and acrosome reaction. Theriogenology, 52:289–301.

Ollero, M., Garcı ´a-Lo´pez, M., Cebria´n-Pe´rez, J.A. and Muin˜o-Blanco, T. (1996). Viability of ram spermatozoa in relation to the abstinence period and successive ejaculations. International journal of andrology, 19:287–292.

Ortiz, A., Espino, J., Bejarano, I., Lozano, G.M., Monllor, F., García, J.F., et al. (2011). High endogenous melatonin concentrations enhance sperm quality and short-term in vitro exposure to melatonin improves aspects of sperm motility. Journal of Pineal Research, 50: 132–139.

Ozbal, S., Erbil, G., Kocdor, H., Tugyan, K. and Pekcetin, C. (2008). The effects of selenium against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Neurosci Letters, 438(3): 265-269.

Parks, J.E. and Graham, J.K. (1992). Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, 38:209–222.

Patel, A.B., Srivastava, S., Phadke, R.S. and Govil, G. (1998). Arginine activates glycolysis of goat epididymal spermatozoa: an NMR study. Biophysical journal, 75: 1522–1528

Pérez, G.O., Juárez-Mosqueda, M.D.L., Carvajal, S.U. and Ortega, M.E.T. (2009). Boar spermatozoa cryopreservation in low glycerol/trehalose enriched freezing media improves cellular integrity. Cryobiology, 58(3): 287-292.

Peruma, P., Chamuah, J.K. and Rajkhowa, C. (2013). Effect of catalase on the liquid storage of mithun (Bos frontalis) semen. Asian Pacific Journal of Reproduction, 2: 209–214.

Pezo, F., Yeste, M., Zambrano, F., Uribe, P., Risopatrón, J. and Sánchez, R. (2021). Antioxidants and their effect on the oxidative/nitrosative stress of frozen-thawed boar sperm. Cryobiology, 98: 5–11.

Pickett, B.W. and Komarek, R.J. (1966). Lipid and dry weight of bovine seminal plasma and spermatozoa from first and second ejaculates. Journal of dairy science, 50:742–746.

Piri Bagcheh Jacky, Kh., Qiasi Qala Kandi, J. and Beheshti, R. (2013). The effects of adding raffinose and terehalose on the quality indicators of buffalo sperm after thawing. Journal of Comparative Pathobiology, 2: 943-948. [In Persian]

Rao, A.V., Ray, M.R. and Rao, L.G. (2006). Lycopene. Advances in Food and Nutrition Research, 51: 99–164.

Rasad, S.D. and Simanjuntak, L.C. (2011). The Effect of Fructose Addition in Semen Extender on Quality of Separation of Garut Ram Sperm in Several Storage Length. Animal Production. 11(3): 196-201.

Rigby, S.L., Brinshko, S.P. and Cochran, M. (2001). Advances in cooled semen technology: seminal plasma and semen extender. Animal Reproduction science.,68:171-180.

Rudolph, A.S., Crowe, J.H. and Crowe, L.M. (1986). Effects of three stabilizing agents proline, betaine, and trehalose on membrane phospholipids. Archives of biochemistry and biophysics, 245(1): 134-143.

Ruffin, V.A., Salameh, A.I., Boron, W.F. and Parker, M.D. (2014). Intracellular pH regulation by acid-base transporters in mammalian neurons. Frontiers in physiology, 43(5): 1-11.

Safa, S., Moghaddam, Gh. Jafari, R., Daghigh kia, H. and Janmohammadi, H.2016.Effect of vitamin E and selenium nanoparticles on post- thawn variables and oxidative statys of rooster semen.Animal Reproduction Science,174: 100-106.

Salamon, S. and Maxwell, W.M.C. (1995). Frozen storage of ram semen I. Processing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, 37(3), 185-249.

Salamon, S. and Maxwell, W.M.C. (2000). Storage of ram semen. Animal Reproduction Science, 62:7-111.

Samaei, S.P., Ghorbani, M., Sadeghi Mahoonak, A.R. and Jafari, S. M. (2017). Physicochemical and functional properties of apricot tree gum. Journal of food science and technology(Iran), 65(14): 335-342. [In Persian]

Sanchez-Partida, L.G., Windsor, D.P., Eppleston, J., Setchell, B.P. and Maxwell, W.M.C. (1999). Fertility and its relationship to motility characteristics of spermatozoa in ewes after cervical, transcervical and intrauterine insemination with frowzen-thawed ram semen. Journal of andrology, 20:280–288.

Sarıözkan, S., Bucak, M.N., Canturk, F., Özdamar, S., Yay, A., Tuncer, P.B., et al. (2012). The effects of different sugars on motility, morphology and DNA damage during the liquid storage of rat epididymal sperm at 4° C. Cryobiology, 65(2), 93-97.

Scott, T.W. and Dawson, R.M.C. (1968). Metabolism of phospholipids by spermatozoa and seminal plasma. Biochemical journal, 108:457–463.

Setchell, B.P. and Brooks, D.E. (1988). Anatomy, vasculature, innervation and fluids of the male reproductive tract In: Knobil E, Neill J, eds. The Physiology of Reproduction. New York, NY: Raven Press; 753–836.

Shafaati Alishah, P., Moghaddam, Gh. (2021). The effect of morphometry, viscosity and liquefaction of semen on the quality of frozen ram sperm, Veterinary Clinical Pathology, 15(2): 155-167. [In Persian]

Shafaati Alishah, P., Moghaddam, Gh., Daghighkia, H. and Alijani, S. (2020). Investigating the effect of diluents containing EDTA and Propylene glycol on survival of frozen semen of Ghezel ram. Veterinary Clinical Pathology, 13(4): 353-369. [In Persian]

Shankar-Reddy, S.N., Jagan Mohanarao, G. and Atreja, S.K. (2010). Effects of adding taurine and trehalose to a tris-based egg yolk extender on buffalo (Bubalus bubalis) sperm quality following cryopreservation. Animal reproduction science, 119(3): 183-190.

Sheikholeslami, S.A., Soleimanzadeh, A., Rakhshanpour, A. and Shirani, D. (2020). The evaluation of lycopene and cysteamine supplementation effects on sperm and oxidative stress parameters during chilled storage of canine semen. Reproduction in Domestic Animals, 55: 1229–1239.

Shi, L., Jin, T., Hu, Y., Ma, Z., Niu, H. and Ren, Y. (2020). Effects of reduced glutathione on ram sperm parameters, antioxidant status, mitochondrial activity and the abundance of hexose transporters during liquid storage at 50C. Small Ruminant Research, 189: 106139.

Shi, L.G., Yang, R.J., Yue, W.B., Xun, W.J., Zhang, C.X., Ren, Y.S., et al. (2010). Effect of elemental nano-selenium on semen quality, gluthatione peroxidase activity and testis ultrastructure in male boer goats. Animal Reproduction Science, 118(2): 248-254.

Shore, L., Yehuda, R., Marcus, S., Bartoov, B. and Shemesh, M. (2003). Effect of hCG injection on prostaglandin E concentrations in ram seminal plasma. Prostaglandins & other lipid mediators, 70:291–301.

Sidhu, K.S. and Gill, H.K. (1992). Immunoreactive prolactin, progesterone and luteinizing hormone in the seminal plasma of buffalo (Bubalus bubalis). Acta veterinaria jungarica, 40:27–32.

Sinha, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K. and Prasad, R.L. (1996). The effect of glutathione on the motility, enzyme leakage and fertility of frozen goat semen. Animal reproduction science, 41:237–243.

Sirat, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K. and Prasad, R.L. (1996). Effects of cryoprotectants on release of various enzymes from buck spermatozoa during freezing. Theriogenology, 45: 405–416.

Sirat, M.P., Sinha, A.K., Singh, B.K. and Prasad, R.L., (1996). Effects of cryoprotectants on release of various enzymes from buck spermatozoa during freezing. Theriogenology, 45: 405–416.

Slaweta, R. and Laskowaska, T. (1987). The effect of glutatione on the motility and fertility of frozen bull semen. Animal reproduction science, 13: 249–253.

Soultanpour, F., Moghaddam,Gh., Daghigh kia, H. and Rafat, A. 2014.Evaluation of Ghezel- Merino , Merino- Moghani ram semen characteristics in breeding Season.Journal of Animal Science Researches, 24:31-41.(in persian).

 

Taha, T.A., Abdel-Gawad, E.I. and Ayoub, M.A. (2000). Monthly variations in some reproductive parameters of Barki and Awassi rams throughout 1 year under subtropical conditions 2—biochemical and enzymatic properties of seminal plasma. Journal of animal science, 71:325–332.

The´rie´n, I., Moreau, R. and Manjunath, P. (1998). Major proteins of bovine seminal plasma and high-density lipoprotein induce cholesterol efflux from epididymal sperm. Biology of reproduction. 59: 768–776.

Tummaruk, P., Lundeheim, N., Einarsson, S. and Dalin, A.M. (2000). Reproductive performance of purebred Swedish Landrace and Swedish Yorkshire sows: II, Effect of mating type, weaning-to-first service interval and lactation length. Acta agriculturae scandinavica, 50:217– 224.

Tuncer, P.B., Bucak, M.N., Sarıözkan, S., Sakin, F., Yeni, D., Çiğerci, İ.H., et al. (2010). The effect of raffinose and methionine on frozen/thawed Angora buck (Capra hircus ancryrensis) semen quality, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities. Cryobiology, 61(1), 89-93.

Upreti, G.C., Jensen, K., Munday, R., Vishwanath, R. and Smith, J.F. (1998). Studies on ram spermatozoal aromatic amino acid oxidase. Proceeding of the Australian society for reproductive biology, 51: 275-287.

Verstegen, J.P., Onclin, K. and Iguer-Ouada, M. (2005). Long-term motility and fertility conservation of chilled canine semen using egg yolk added Tris–glucose extender: In vitro and in vivo studies. Theriogenology, 64(3), 720-733.

Vishwanath, R. and Shannon, P. (2000). Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Anim. Reproductive Sciences, 62: 23–53.

Watanabe, M., Kikawada, T. and Okuda, T. (2003). Increase of internal ion concentration triggers trehalose synthesis associated with cryptobiosis in larvae of Polypedilum vanderplanki. Journal of experimental biology, 206(13): 2281-2286.

Watson, P.F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal reproduction science, 60: 481-492.

Wellington, K. and Jarvis, B. (2001). Silymarin: A review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs, 15(7): 465-489.

White, I.G. and Wallace, J.C. (1961). Breakdown of seminal glycerylphosphorylcholine by secretions of the female reproductive tract. Nature, 189:843–844.

White, I.G., Gol, P. and Voglmayr, J.K. (1987). Effect of male reproductive tract fluids and proteins on the metabolism and motility of ram spermatozoa. Archives of andrology, 19:115–125.

Wong, W.Y., Flik, G., Groenen, P.M., Swinkels, D.W., Thomas, C.M., Copius- Peereboom, J.H., et al. (2001). The impact of calcium, magnesium zinc, and copper in blood and seminal plasma on semen parameters in men. Reproductive toxicology, 15: 131–136.

Yanagimachi, R. (1994). Fertility of mammalian spermatozoa: its development and relativity. Zygote, 2: 371–372.

Zamiri, M. (2006). Physiology of reproduction. First Edition. Haghshenas Publications.

Zhai,W., Neuman, S.L., Latour, M.A. and Hester, P.Y. (2007). The effect of dietary L-carnitine on semen traits of white leghorns. Poultry Science, 86: 2228–2235.

Zhang, X.G., Liu, Q., Wang, L.Q., Yang, G.S., and Hu, J.H. (2016). Effects of glutathione on sperm quality during liquid storage in boars. Animal Science Journal, 87: 1195–1201.

Zubkova, E.V. and Robaire, B. (2004). Effect of glutathione depletion on antioxidant enzymes in the epididymes, seminal vesicles, and liver and on spermatozoa motility in the aging brown Norway rat. Biology of reproduction, 71:1002–1008.

The importance and characteristics of sperm diluents 

 (Received: ------------ Accepted: ------------)

 

Abstract

Despite the significant progress in sperm cryopreservation methods in recent years, the research has proven that long-term storage of sperm in freezing and cold storage causes serious damage to sperm. The occurrence of fat peroxidation and the metabolism of spermatozoids causes the destruction of spermatozoa during freezing and storage. Temperature shock, the formation of intracellular ice crystals, cellular dehydration, increased salt concentration and osmotic shock may occur during the freezing and thawing process. In addition, cryopreservation causes harmful structural changes in the plasma membrane. Changes in membrane permeability to some ions such as calcium during the freezing and thawing process have been reported. Also, during cryopreservation, the formation of intracellular and extracellular ice causes cell destruction and death. The sperm plasma membrane is the main site of damage during the freezing and thawing process and is very sensitive to lipid peroxidation due to the presence of many unsaturated fatty acids. These changes may be having a role in the accumulation of toxic products of metabolism, mainly reactive oxygen species (ROS) that are generated through lipid peroxidation of sperm membranes. In small amounts, ROS play an important role in sperm capacitation, increased sperm motility, acrosome reaction, and oocyte fertilization in humans, cows, horses, pigs, and rams. For this purpose, to solve these problems, various antioxidants, preservatives and chelators are used in sperm extenders.

Conflict of interest: None declared.

Keywords: additives, cooled preservation, cryopreservation, seminal plasma, sperm

---

[1] 2-Artificial Insemination

[2] 1- Superoxide dismutase

[3] 2- Glutathione reductase

[4] 3- Glutathione peroxidases

[5] 4- Glutathione

[6] 5- GPx–Se− plus oxidized glutathione

[7] 6- Catalase

[8] 1- Intracellular PH

---