A Novel Approach for Water Conservation and Yield Enhancement in Rice: Genetic Engineering with OsNAC5 and EPSPS Genes

Subject Areas :

Seyyed Mohammad Mousavi pakza ¹ , Elahe Moatamed ² , Nasrin Soltani ³ , Mohaddeseh Mohsenpour ⁴ , Aliakbar Ebadi ⁵ , مطهره محسن پور ⁶

1 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
2 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
3 - Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
4 -
5 - Rice Research Institute of Iran (RRII), Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO) Rasht, Iran
6 - پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج

Received: 2024-11-23 Accepted : 2024-12-12 Published : 2025-01-11

Keywords: Keywords: Rice Genetic Engineering, EPSPS, OsNAC5, Combined Gene Transfer, Reduced Water Use ,

Abstract :

Introduction: Utilizing scientific approaches to address weed-related challenges in rice cultivation could revolutionize farming methods, eliminating the need for flooded fields and plot-based systems while significantly reducing production costs. This study focuses on leveraging advanced technologies by combining herbicide tolerance genes with genes conferring drought tolerance or yield improvement. Methods: To achieve this, a multigenic construct was designed, incorporating a herbicide tolerance gene alongside OsNAC5, a gene associated with drought tolerance, improved yield, and root architecture modification. The coding sequence of OsNAC5 was codon-optimized and placed under the control of the RCc3 promoter and tahsp17 terminator, alongside an EPSPS gene cassette within the T-DNA region of an Agrobacterium-based vector. The resulting genetic construct was introduced into rice using Agrobacterium tumefaciens, followed by continuous selection and regeneration processes. Results: Polymerase chain reaction (PCR) analysis using gene- and construct-specific primers confirmed the presence of transgenes in regenerated plants grown on selective media. Six independent transformation events of the recombinant construct, recombinant pUhErN5, were obtained. These events were further characterized by inverse PCR to distinguish individual events and identify transgene insertion sites. Conclusion: The development of these transgenic rice lines represents a significant step toward addressing the country’s climatic and resource constraints, supporting food security and self-sufficiency. The adoption of such technologies could contribute to the sustainability of rice production in Iran, ensuring resilience against environmental challenges.

References:

Dehghannezhad H, Zaefarian F, Abbasi R, Nouralizadeh Otaghsara M. weed management methods in direct-seeded rice (Oryza sativa L.). J Crop Prod [Internet]. 2023;16(4):21–40. Available from: https://ejcp.gau.ac.ir/article_6784.html
2. Bayer DE, Hill JE, Seaman DE. Rice (Oryza sativa). In: Principles of Weed Control in California Fresno, CA: California Weed Conf. 1985. p. 262–8.
3. Monaco TJ, Weller SC, Ashton FM. Weed science: principles and practices. John Wiley & Sons; 2002.
4. Sahrawat KL. Soil fertility in flooded and non-flooded irrigated rice systems. Arch Agron Soil Sci. 2012;58(4):423–36.
5. Wu W, Cheng S. Root genetic research, an opportunity and challenge to rice improvement. F Crop Res. 2014;165:111–24.
6. Jeong JS, Kim YS, Redillas MCFR, Jang G, Jung H, Bang SW, et al. OsNAC5 overexpression enlarges root diameter in rice plants leading to enhanced drought tolerance and increased grain yield in the field. 2013;10:101–14.
7. Redillas MCFR, Jeong JS, Kim YS, Jung H, Bang SW, Choi YD, et al. The overexpression of OsNAC9 alters the root architecture of rice plants enhancing drought resistance and grain yield under field conditions. Plant Biotechnol J. 2012;10(7):792–805.
8. Takasaki H, Maruyama K, Kidokoro S, Ito Y, Fujita Y, Shinozaki K, et al. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice. Mol Genet Genomics. 2010;284(3):173–83.
9. Sperotto RA, Ricachenevsky FK, Duarte GL, Boff T, Lopes KL, Sperb ER, et al. Identification of up-regulated genes in flag leaves during rice grain filling and characterization of OsNAC5, a new ABA-dependent transcription factor. Planta. 2009;230(5):985–1002.
10. Song S-Y, Chen Y, Chen J, Dai X-Y, Zhang W-H. Physiological mechanisms underlying OsNAC5-dependent tolerance of rice plants to abiotic stress. Planta. 2011;234(2):331–45.
11. Arai-Sanoh Y, Takai T, Yoshinaga S, Nakano H, Kojima M, Sakakibara H, et al. Deep rooting conferred by DEEPER ROOTING 1 enhances rice yield in paddy fields. Sci Rep. 2014;4:5563.
12. Rogers ED, Benfey PN. Regulation of plant root system architecture: Implications for crop advancement. Curr Opin Biotechnol [Internet]. 2015;32(Figure 1):93–8. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2014.11.015
13. Zhang T-Q, Chen Y, Liu Y, Lin W-H, Wang J-W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nat Commun. 2021;12(1):1–12.
14. Kawai T, Shibata K, Akahoshi R, Nishiuchi S, Takahashi H, Nakazono M, et al. WUSCHEL-related homeobox family genes in rice control lateral root primordium size. Proc Natl Acad Sci. 2022;119(1):e2101846119.
15. Zandi M, Hosseini R, Mohsenpour M, HOSSEINI SG, Ghareyazie B. Transformation of DRO1, OsNAC5, OsEXPA8 genes in order to improve rice root architecture modification and improved drought tolerance in rice. 2019;
16. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press; 1989.
17. An G, Watson BD, Chiang CC. Transformation of tobacco, tomato, potato, and Arabidopsis thaliana using a binary Ti vector system. Plant Physiol. 1986;81(1):301–5.
18. Chamani Mohasses F, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Entesari M, Bidadi H, Molaahmad Nalousi A, et al. Efficient genetic transformation of rice using Agrobacterium with a codon-optimized chromoprotein reporter gene (ChromoP) and introducing an optimized iPCR method for transgene integration site detection. Plant Cell, Tissue Organ Cult. 2024;156(1):5.
19. Chamani Mohasses F, Solouki M, Ghareyazie B, Fahmideh L, Mohsenpour M. Correlation between gene expression levels under drought stress and synonymous codon usage in rice plant by in-silico study. PLoS One. 2020;15(8):e0237334.
20. Mohammadizadeh N, Tohidfar M, Mohsenpour M. Agrobacterium-Mediated Transformation of Wheat (Triticum Aestivum) Using Chitinase and Glucanase Genes. 2010;
21. Raufi A, Tohidfar M, Soluki M, Mohsenpour M. Isolation and Cloning of Two Genes from PR1 Family and Construction of Treble Plasmids Containing 3 Groups of Genes for Producing Transformed Plants Resistant to Fungal Diseases. J Agric Biotechnol. 2012;3(2):27–46.
22. Mohsenpour M, Tohidfar M, Jelodar NB, Jouzani GS. Designing a new marker-free and tissue-specific platform for molecular farming applications. J Plant Biochem Biotechnol. 2015;24(4).
23. Mohkami A, Marashi H, Shahriary Ahmadi F, Tohidfar M, Mohsenpour M. Evaluation of Agrobacterium-mediated Transformation of Chlamydomonas reinhardtii using a Synthetic amorpha-4, 11-diene Synthase Gene. J Cell Mol Res. 2015;7(1):53–8.
24. Mohsenpour M, Tohidfar M. Genetic Engineering of Plant Nuclear Genome for Specific gene Expression in Chloroplast Using Design and Transformation of Hybrid Sigma Factor. Crop Biotechnol. 2011;
25. Saboori-Robat E, Solouki M, Habashi AA, Moshenpour M, Emamjomeh A. Design and construction of two-genes construct consists of 11 kDa delta zein and EPSPS genes in order to transform soybean to improve the methionine content and induce resistance to glyphosate herbicide. Crop Biotechnol. 2019;9(27):69–77.
26. Ghareyazie B, Alinia F, Menguito CA, Rubia LG, De Palma JM, Liwanag EA, et al. Enhanced resistance to two stem borers in an aromatic rice containing a synthetic cryIA(b) gene. Mol Breed. 1997;3(5):401–14.
27. Bennett J, Cohen MB, Katiyar SK, Ghareyazie B, Khush GS. Enhancing insect resistance in rice through biotechnology. Adv insect Control role transgenic plants. 1997;75–93.
28. Kazemi M, Ghorbanzadeh Z, Pourhang L, Mousavi pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Rice genetic engineering using transformation of Deeper Rooting1 and Phosphorus-Starvation Tolerance1 genes. Agric Biotechnol J [Internet]. 2022;14(1):1–20. Available from: https://jab.uk.ac.ir/article_3211.html
29. Ghorbanzadeh Z, Kazemi Alamouti M, Pourhang L, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Identificatioan and investigation of DRO1 gene in rice cultivar Hashemi and its simultaneous transfer with OsCKX4 gene to improve root structure. Crop Biotechnol [Internet]. 2022;11(36):49–62. Available from: https://cropbiotech.journals.pnu.ac.ir/article_8590.html
30. Pourhang L, Ghorbanzadeh Z, Kazemi Alamuti M, Mousavi Pakzad SM, Moatamed E, Mapar M, et al. Multi-gene transformation evaluation of a serine/threonine protein kinase with a gene from the cytokinin oxidase/dehydrogenase family and a transcription factor induced under stress from the NAM-ATAF-CUC family to rice. Modares J Biotechnol. :0.
31. Ye X, Al-Babili S, Klöti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, et al. Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science (80- ). 2000;287(5451):303–5.
32. Li L, Zhou Y, Cheng X, Sun J, Marita JM, Ralph J, et al. Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees through multigene cotransformation. Proc Natl Acad Sci. 2003;100(8):4939–44.
33. Mohsenpour M, Kahak S, Ghareyazie B. Genetic Engineering and Food Security. Strateg Res J Agric Sci Nat Resour [Internet]. 2018;3(2):195–208. Available from: http://srj.asnr.ias.ac.ir/article_112926.html
34. https://agrilib.areeo.ac.ir/book_11874.html

Full-Text:



فصلنامه ی تازه های زیست فناوری میکروبی

 

ارزیابي خصوصیات ضد میکروبي عصاره میخک، عصاره دارچین و اسید استیک بر علیه سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری و تعیین اثرات سینرژیستي آن

عاطفه بزرگی1*، مهدی شریفی سلطانی2

1.گروه میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بابل، بابل، ایران

2. دانشکده کشاورزی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد چالوس، چالوس، ایران

 

چکیده

سابقه و هدف: استفاده از گياهان دارویي از زمان­های گذشته­ براي درمان انواع بيماري­های گوناگون مورد توجه بوده است که از این بین، بيماري­هاي عفوني اهميت والایی داشته­اند. هدف از اين مطالعه بررسي خصوصیات ضدميكروبي عصاره گياهان دارچین و میخک و عصاره اسید استیک بر دو نوع از ميكروارگانيسم­های عفونی انسان شامل سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری بوده است. 

مواد و روش­ها: عصاره­ میخک، عصاره دارچین و اسید استیک با درصد غلظت­های مختلف تهیه و در 18 گروه تیمار مختلف بررسی شدند. خصوصیات ضد ميكروبي در هر یک از این گروه­های تیمار بر علیه سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری مورد مطالعه قرار گرفت.

 یافته­ها: عصاره دارچین در غلظت 06/39 میلی­گرم در میلی لیتر و 42/30 میلی­گرم در میلی لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. عصاره میخک در غلظت 21/15 میلی­گرم در میلی لیتر و 61/7 میلی­گرم در میلی لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. اسید استیک در غلظت 82/3 میلی­گرم در میلی لیتر و 71/1 میلی­گرم در میلی لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. نتیجه­گیری: نتايج حاصل از مطالعه نشان داد که خصوصیت ضد میکروبی به ترتیب برتری برای اسید استیک، عصاره میخک و عصاره دارچین بر علیه سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری بوده است. همچنین مشخص شد که استفاده توامان از این سه ماده ضد میکروب در همه موارد باعث افزایش قدرت ضد میکروبی نشده و در برخی موارد اثرات افزایشی و یا آنتاگونیستی را نشان داده است. با توجه به نتایج این تحقیق می­توان با توجه به ماهیت غذا بهترین نوع ترکیب را با حداکثر کارایی در نظر گرفت.

کلمات کلیدی: سالمونلا انتریتیدیس، شیگلا فلکسنری، دارچین، میخک، اسید استیک

 

 

 

 

Evaluation of antimicrobial properties of clove extract, cinnamon extract and acetic acid against Salmonella enteritidis and Shigella flexneri and determining its synergistic effects

Atefeh Bozorgi1*, Mehdi Sharifi Soltani²

1. Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine, Islamic Azad University, Babol Branch, Babol, Iran.

2. Faculty of Agriculture, Islamic Azad University, Chalus branch, Chalus, Iran

 

Introduction: The medicinal plants to treat various diseases has been of interest since the past, among which infectious diseases have been of great importance. The purpose of this study was to investigate the antimicrobial properties of clove plant extract and cinnamon extract and acetic acid on two types of human infectious microorganisms, including Salmonella enteritidis and Shigella flexneri.

Methods: clove extract, cinnamon extract and acetic acid were prepared with different concentration percentages and were evaluated in 18 different treatment groups. Antimicrobial properties studied in these treatment groups against Salmonella enteritidis and Shigella flexneri. Results: Cinnamon extract at 39.06 mg/ml and 30.42 mg/ml inhibited the growth of Salmonella enteritidis and Shigella flexneri, respectively. Clove extract at a concentration of 15.21 mg/ml and 7.61 mg/ml inhibited the growth of Salmonella enteritidis and Shigella flexneri, respectively. Acetic acid at a concentration of 3.82 mg/ml and 1.71 mg/ml inhibited the growth of Salmonella enteritidis and Shigella flexneri, respectively. 

Conclusion: The results of the study showed that acetic acid, clove extract and cinnamon extract were superior against Salmonella enteritidis and Shigella flexneri respectively. It was also found that the combined use of these three antimicrobial substances did not increase the antimicrobial power in all cases and showed additive or antagonistic effects in some cases. According to the results of this research, the best type of combination with maximum efficiency can be considered according to the nature of the food.

Key words: Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, cinnamon, cloves, acetic acid

 

 

 

 

 

مقدمه

 

علـم شناسـائی و اسـتفاده از گـیاهان دارویـی قدمت طولانی دارد و استفاده از این گیاهان از اصلی­ترین راهکارهای درمان بیماری­ها، زخم­ها و آسیب­های گوناگون وارده به بدن انسان بوده است. با توجه به پیشرفت سریع و روزافزون علم و تکنولوژی ترکیبات شیمیایی جایگزین این داروهای گیاهی شدند اما امروزه بسیاری از دانشـمندان به استفاده مجدد از داروهای گیاهـی روی آورده­انـد. در حال حاضر بررسی اثـرات ضـد میکروبـی، ضد سـرطانی و ضد قارچی گیاهان منشأ بسیاری از پژوهش­ها بوده است (1) 

نویسنده مسئول: استادیار ، دانشگاه آزاد اسلامی واحد بابل آدرس الکترونیک: [e-mail] تاریخ دریافت مقاله: ۲۲/۰۲/۱۴۰۳ تاریخ پذیرش: ۲۲/۰۹/۱۴۰۳

سالمونلا باکتری میله­ای شکل، گرم منفی،  بی هوازی اختیاری و فاقد اسپور از خانواده آنتروباکتریاسه است که از نظر اندازه متفاوت است (2). این باکتری مسبب ایجاد بیماری سالمونلوز می­باشد که یکی از بیماری­های عمده حاصل از مواد غذایی است و منجر به نگرانی­هایی در سطح بهداشت عمومی ­است (3). از بین سروتیپ­های مختلف سالمونلا، سروتیپ­های سالمونلا اینتریتیدس و سالمونلا تیفی موریوم در مقام اول مسمومیت­های غذایی قرار دارند (4).  شیگلاها، باسیل­های گرم منفی، غیر هاگدار و غیر متحرک از خانواده آنتروباکتریاسه هستند که از نظر ژنتیکی و فنوتیپی قرابت نزدیکی با اشرشیا کولای و گونه­های جنس سالمونلا دارند (5).  شیگلا فقط در انسان و نخستین­سانان بیماریزا بوده اما در سایر جانوران بیماریزایی ندارد.  این باکتری موجب اسهال خونی در انسان می­شود (6). میخک با نام علمی سیزگیوم آروماتیکوم یکی از قدیمی­ترین گیاهان دارویی جهان است که همچنان در صنعت پزشکی و دارویی کاربرد دارد که در حال حاضر در کشورهای هند، اندونزی، ماداگاسکار، زنگبار، پاکستان، ویتنام و سریلانکا برداشت می­شود(29،36و7). ماده موثره اسانس میخک، اوژنول است که به دلیل خصوصیات ضد میکروبی نمایانگر این ویژگی در اسانس و عصاره میخک می­باشد(8).  در تحقیق Mounika و همکاران که در سال 2020 انجام شد خصوصیات ضد میکروبی اسانس میخک در شرایط آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت. در این تحقیق مشخص شد که غلظت 15 و 18 میلی­گرم در میلی­لیتر اسانس میخک باعث مهار رشد استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کولای شده است (9).  در پژوهش دیگری که در سال 2019 بر روی خصوصیات ضد میکروبی اسانس میخک هندی انجام شد، تایید گردید که اسانس میخک بر علیه استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کولای، لیستریا مونوسیتوژنز و سالمونلا تیفیموریوم خاصیت ضد میکروبی دارد ولی این خصوصیت در غلظت­های مختلف اسانس متفاوت است (10).  دارچین با نام علمی سینامونیوم کاسیا به عنوان گیاه دارویی و ادویه­ای بوده است که کاربردهای فراوانی در آشپزی و شیرینی­پزی دارد و در هندوستان و چین می­روید (30).  اسانس دارچین در بسته­بندی مواد غذایی مورد استفاده بوده است و نشانگر خصوصیات ضد میکروبی می­باشد(11). در پژوهشی عصاره روغنی دارچین با غلظت 4/0% علیه سالمونلا انتریتیدیس استفاده شد و حاکی از کاهش فعالیت میکروبی علیه این باکتری بوده است (12). در پژوهش­های متعددی ذکر شده که عصاره روغنی گیاهان میخک و دارچین دارای اثرات ضد میکروبی علیه پاتوژن­های غذازاد (Food-Borne) می­باشد (13-16 ،7 ) همچنین در پژوهشی در سال 2021 نشان داده شد که عصاره روغنی میخک و دارچین منجر به کاهش کلونیزه شدن باکتری سالمونلا می­شود(17). در پژوهش دیگری که به صورت درون تنی علیه پاتوژن­های غذایی به واسطه حضور میخک و دارچین انجام گرفت نشان از عملکرد موثر این دو گیاه دارویی علیه فعالیت میکروبی بوده است(18).  استیک اسید جز اسیدهای کربوکسیلیک می­باشد و در نامگذاری آیوپاک به اتانوئیک اسید معروف است و دارای فرمول شیمیایی CH3COOH می­باشد (19). این اسید در صنعت غذا، تحت کد افزودنی E260 به عنوان تنظیم اسیدیته و به عنوان چاشنی استفاده می­شود(20).  اسید استیک به عنوان یک ماده افزودنی در مواد غذایی نظیر سس کچاپ، سرکه،  سس سالاد، میوه های کنسرو شده،  انواع سس،  مایونز، خردل و غذاهای دریایی استفاده می­شود.  این اسید به طور گسترده در سایر مواد غذایی مانند لبنیات، شیر و پنیر، مرغ و گوشت به کار می رود(21). در پژوهشی که بر روی خصوصیات ضد میکروبی اسید استیک انجام گرفت، مشخص شد که باکتری­های باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس، شیگلا دیزانتریه و سالمونلا تیفی به استفاده از اسید استیک حساس بودند و این اسید نمایانگر اثرات ضد میکروبی بر این باکتری­­ها بوده است(22). در پژوهشی دیگر مشخص گردید استیک اسید در مقایسه با سیتریک اسید و لاکتیک اسید،  بیشترین فعالیت ضد میکروبی را علیه گونه­های شیگلا سونی، شیگلا بویدی، شیگلا فلکسنری و شیگلا دیسنتریا دارد که در این مطالعه از غلظت 5/0% از استیک اسید استفاده شد (23).  همچنین در مطالعه دیگری میزان 5 میلی­گرم بر میلی­لیتر از استیک اسید به تنهایی و یا همراه با مالیک اسید علیه سالمونلا استفاده شد و نشان داد بیشترین فعالیت میکروبی مربوط به زمانی است که استیک اسید همراه با مالیک اسید استفاده شده است (24). در مطالعه Cosansu و همکاران، سینه و ران مرغ آغشته به سالمونلا انتریدیتیس ((4-5log (MPN)/cm2   شده و سپس در استیک اسید 1 و 2% غوطه ور شد و کاهش بار آلودگی میکروبی را نشان داد (25) . در این پژوهش ما به بررسی و تعیین خصوصیات ضد میکروبی عصاره دارچین،  عصاره میخک و استیک اسید برعلیه سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری پرداخته و ارزیابی خصوصیات سینرژیستی ضد میکروبی استفاده توامان عصاره میخک، عصاره دارچین و اسید استیک را بر ضد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری بررسی کردیم.

 

مواد و روش ها

فعال سازی باکتری­های سالمونلا انتريتیديس و شیگلا فلكسنری

 

باکتری سالمونلا انتریتیدیس ((ATCC 13076 و باکتری شیگلا فلکسنری (ATCC12022) پس از تهیه از مرکز کلکسیون قارچ­ها و باکتری­های صنعتی شهریار کرج، به آزمایشگاه میکروب­شناسی دانشگاه بابل منتقل شد و برای دو مرتبه متوالی در محیط نوترینت براث کشت داده شدند و به مدت ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند تا فعال شوند. تیمارهای مورد مطالعه بر اساس جدول ۱ تهیه شد که ترکیبی از عصاره میخک،  عصاره دارچین و اسید استیک بوده است (جدول ۱).

 

 

 

 

 

جدول ۱. تیمارهای مطالعه

 

                        تیمار                     میخک%                   دارچین%                     اسید استیک%

 

         ۰         ۰         ۱۰۰         ۱

         ۰         ۲۰         ۸۰         ۲

         ۰         ۴۰         ۶۰         ۳

         ۲۰         ۲۰         ۶۰         ۴

         ۲۰         ۴۰         ۴۰         ۵

         ۰         ۵۰         ۵۰         ۶

         ۰         ۱۰۰         ۰         ۷

         ۰         ۸۰         ۲۰         ۸

         ۰         ۶۰         ۴۰         ۹

         ۲۰         ۶۰         ۲۰         ۱۰

         ۱۰۰         ۰         ۰         ۱۱

         ۸۰         ۲۰         ۰         ۱۲

         ۸۰         ۰         ۲۰         ۱۳

         ۶۰         ۲۰         ۲۰         ۱۴

         ۶۰         ۴۰         ۰         ۱۵

         ۶۰         ۰         ۴۰         ۱۶

         ۵۰         ۰         ۵۰         ۱۷

         ۵۰         ۵۰         ۰         ۱۸

 

 

 

آزمون حداقل غلظت ممانعت از رشد باکتری (MIC)

 

برای تعیین حداقل غلظت متابولیت که باعث مهار رشد باکتری شده بود به روش ۱۱ لوله عمل شد. برای این کار ابتدا سوسپانسیون میکروبی از باکتری سالمونلا انتریتیدیس با غلظت معادل کدورت نیم مک فارلند تهیه شد. ۱۱لوله آزمایش تهیه شد که هر لوله حاوی ۱ میلی­لیتر محیط کشت تریپتیک سوی براث بوده است.  سپس لوله­ها شماره گذاری شدند و به هر لوله ۱۰ لاندا از سوسپانسیون نیم مک فارلند سالمونلا انتریتیدیس اضافه شد. پس از مخلوط کردن محتویات لوله اول، مقدار ۱ میلی­لیتر از این لوله به لوله دوم منتقل شد و این کار تا لوله ۱۱ ادامه یافت. لوله شماره ۱۱ در حکم شاهد بود و به آن استوک تیمار اضافه نشد. در انتها لوله­ها در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی­گراد به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شدند. لوله ای که در آن کدورت ناشی از رشد دیده نشد به عنوان غلظت ممانعت از رشد در نظر گرفته شد. این عمل برای باکتری شیگلا فلکسنری نیز به طور جداگانه انجام گرفت.

 

 

تعیین اثرات برهمكنشی

 

برای تعیین برهمکنش ضد میکروبی با استفاده از روابط ۱ و ۲ مقدار FIC هر ماده جداگانه محاسبه شد.

رابطه :۱

FIC A: MIC of A in combination/MIC of A alone.

رابطه :۲

FIC A: MIC of A in combination/MIC of A alone.

و در ادامه برای تعیین شاخص FIC از رابطه 3 استفاده شد.

رابطه :۳

FIC Index: FIC A + FIC B.

یا

FIC Index: FIC A + FIC B + FIC C.

تفسیر نتایج طبق جدول ۲ عمل شد (37).

 

جدول ۲ تفسیر نتایج شاخص FIC

تفسیر	مقدار شاخص  FIC
اثرسینرژیستی	کمتر از ۵/۰
اثر افزایشی	۵/۰ تا ۵
اثر آنتاگونیستی	بیش از ۴

 

 

آنالیز آماری

 

در این مطالعه تمامی آزمون­ها با 3 تکرار انجام شدند و میانگین نتایج به دست آمده با استفاده از نرم افزار SPSS ورژن ۲۰ و آزمون واریانس یک طرفه و تست دانکن با سطح اطمینان ۹۵ درصد ارائه شده و نمودارها با استفاده از نرم افزار اکسل ۲۰۱۶ طراحی شدند.

 

 

نتایج

 

نتايج آزمون میكروبی MIC

 

طبق نتایج به دست آمده میزان MIC برای باکتری­های شیگلا فلکسنری و سالمونلا انتریتیدیس در جدول ۳ آورده شده است.

 

 

 

 

 

 

جدول ۳. نتایج آزمون میکروبی MIC

	MIC
شیگلا فلکسنری		سالمونلا انتریتیدیس	تیمار
۳۰/۴۲ ± ۱/۶۲ Ca		۳۹/۰۶ ± ۴/۶۲ Cb	عصاره دارچین
۷/۶۱ ± ۰/۴۱ Ba		۱۵/۲۱ ±۰/۴۱ Bb	عصاره میخک
۱/۷۱ ± ۰/۴۹ Aa		۳/۸۲ ± ۰/۲۷ Ab	اسید استیک

حروف بزرگ لاتین به معنی اختلاف معنی دار در هر ستون است.

حروف کوچک لاتین به معنی اختلاف معنی دار در هر سطر است.

 

 

بر اساس نتایج مقاومت سالمونلا انتریتیدیس نسبت به اسید استیک کمتر بود و بعد آن به عصاره میخک و دارچین حساسیت داشت. همچنین در مورد شیگلا فلکسنری نیز بیشترین میزان حساسیت به ترتیب مربوط به اسید استیک، عصاره میخک و عصاره دارچین بود. به علاوه نتایج حاکی از آن بود که شیگلا فلکسنری نسبت به سالمونلا انتریتیدیس حساسیت بیشتری به عصاره دارچین، عصاره میخک و اسید استیک داشته است (نمودار ۱).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شیگلافلکسنری سالمونلا انتریتیدیس
نمودار۱. میزان MIC برای باکتریهای مورد مطالعه .

نتايج آزمون میكروبی سالمونلا انتريتیديس

نتایج آزمون­ها در جدول ۴ آورده شده است.

 

                           جدول ۴. نتایج آزمون حداقل غلظت ممانعت از رشد میکروبی سالمونلا انتریتیدیس

MIC       Mean      SD		اسید استیک%	دارچین%	میخک%	تیمار
۱۵/۲۱	۰/۴۱	۰	۰	۱۰۰	۱
۲۷/۳۴	۱/۸۱	۰	۲۰	۸۰	۲
۳۰/۴۴	۱/۶	۰	۴۰	۶۰	۳
۷/۷۳	۰/۱۵	۲۰	۲۰	۶۰	۴
۷/۸۶	۰/۰۹	۲۰	۴۰	۴۰	۵
۷/۹۸	۰/۳۴	۰	۵۰	۵۰	۶
۳۹/۰۶	۴/۶۲	۰	۱۰۰	۰	۷
۱۹/۵۳	۱/۷۸	۰	۸۰	۲۰	۸
۱۵/۲۱	۰/۸۱	۰	۶۰	۴۰	۹
۱۱/۷۱	۱/۹	۲۰	۶۰	۲۰	۱۰
۳/۸۲	۰/۱۵	۱۰۰	۰	۰	۱۱
۲/۴۳	۰/۲۷	۸۰	۲۰	۰	۱۲
۱/۱۹	۰/۰۷	۸۰	۰	۲۰	۱۳
۴/۰۵	۰/۱۷	۶۰	۲۰	۲۰	۱۴
۳/۹	۰/۲۴	۶۰	۴۰	۰	۱۵
۳/۷۵	۰/۱۷	۶۰	۰	۴۰	۱۶
۵/۴۵	۰/۱۲	۵۰	۰	۵۰	۱۷
۵/۶۲	۰/۱۱	۵۰	۵۰	۰	۱۸

 

 

 

نتايج آزمون میكروبی شیگلا فلكسنری

نتایج آزمونها در جدول ۵ آورده شده است.

                             جدول ۵ نتایج آزمون حداقل غلظت ممانعت از رشد میکروبی شیگلا فلکسنری

MIC  Mean           SD		اسید استیک%	دارچین%	میخک%	تیمار
۷/۶۱	۰/۴۱	۰	۰	۱۰۰	۱
۱۱/۵۱	۳/۷۱	۰	۲۰	۸۰	۲
۳۰/۴۲	۱/۶۲	۰	۴۰	۶۰	۳
۷/۶۱	۰/۲۱	۲۰	۲۰	۶۰	۴
۷/۹۱	۰/۱۹	۲۰	۴۰	۴۰	۵
۱۶/۳۱	۰/۷۹	۰	۵۰	۵۰	۶
۳۰/۴۲	۱/۶۲	۰	۱۰۰	۰	۷
۲۶/۵۳	۷/۴۳	۰	۸۰	۲۰	۸
۱۹/۸۷	۷/۶۱	۰	۶۰	۴۰	۹
۷/۹۸	۰/۳۴	۲۰	۶۰	۲۰	۱۰
۱/۷۱	۰/۴۹	۱۰۰	۰	۰	۱۱
۳/۳	۰/۳۷	۸۰	۲۰	۰	۱۲
۱/۹۹	۰/۰۸	۸۰	۰	۲۰	۱۳
۳/۸۲	۰/۱۵	۶۰	۲۰	۲۰	۱۴
۲/۴۳	۰/۲۷	۶۰	۴۰	۰	۱۵
۱/۹۷	۰/۰۵	۶۰	۰	۴۰	۱۶
۱/۹۱	۰/۰۷	۵۰	۰	۵۰	۱۷
۲/۳۶	۰/۳۲	۵۰	۵۰	۰	۱۸

 

 

 

 

 

 

تعیین برهمكنش ضد میكروبی

نتايج برهمكنش ضد میكروبی سالمونلا انتريتیديس

 

نتایج آنالیز داده­ها برای تعیین برهمکنش ضد میکروبی باکتری سالمونلا انتریتیدیس در جدول ۶ نشان داده شده است که در همه موارد تیمارها برهمکنش ضد میکروبی به صورت افزایشی بوده است بجز تیمار شماره ۱۰ که آنتاگونیست بوده است.

 

 

 

 

جدول ۶ نتایج برهمکنش ضد میکروبی سالمونلا انتریتیدیس

تیمار	میخکFIC	دارچینFIC	اسیدFIC	FICindex	برهمکنش ضد میکروبی
۱	۱/۷۹	۰/۶۹	-	۲/۴۸	افزایشی
۲	۲	۰/۷۷	-	۲/۷۷	افزایشی
۳	۰/۵	۰/۱۹	۲/۰۲	۲/۷۱	افزایشی
۴	۰/۵۱	۰/۲	۲/۰۵	۲/۷۶	افزایشی
۵	۰/۵۲	۰/۲	-	۰/۷۲	افزایشی
۶	۱/۲۸	۰/۵	-	۱/۷۸	افزایشی
۷	۱	۰/۳۸	-	۱/۸۳	افزایشی
۸	۰/۷۶	۰/۲۹	۳/۰۶	۴/۱۱	آنتاگوتیست
۹	-	۰/۰۶	۰/۶۳	۰/۶۹	افزایشی
۱۰	۰/۰۷	-	۰/۳۱	۰/۳۸	افزایشی
۱۱	۰/۲۶	۰/۱	۱/۰۶	۱/۴۲	افزایشی
۱۲	-	۰/۰۹	۱/۰۲	۱/۱۱	افزایشی
۱۳	۰/۲۴	-	۰/۹۸	۱/۲۲	افزایشی
۱۴	۰/۳۵	-	۱/۴۲	۱/۷۱	افزایشی
۱۵	-	۰/۱۴	۱/۴۷	۱/۶۱	افزایشی

 

نتايج برهمكنش ضد میكروبی شیگلا فلكسنری

 

نتایج آنالیز داده­ها برای تعیین برهمکنش ضد میکروبی باکتری شیگلا فلکسنری در جدول ۷ نشان داده شده است و حاکی از آن بوده است که در تیمارهای شماره ۳، ۴، ۵، ۸ و ۱۰ برهمکنش ضد میکروبی به صورت آنتاگونیست بوده است و در سایر تیمارها به صورت افزایشی بوده است.

 

 

 

جدول ۷ نتایج برهمکنش ضد میکروبی باکتری شیگلا فلکسنری

تیمار	میخکFIC	دارچینFIC	اسیدFIC	FICindex	برهمکنش ضد میکروبی
۱	۱/۵۱	۰.۳۷	-	۱/۸۸	افزایشی
۲	۳/۹۹	۱	-	۴/۹۹	آنتاگوتیست
۳	۱	۰/۲۵	۴/۴۵	۵/۷	آنتاگوتیست
۴	۱/۰۳	۰/۲۶	۴/۶۲	۵/۹۱	آنتاگوتیست
۵	۲/۲۴	۰/۵۳	-	۲/۶۷	افزایشی
۶	۳/۴۸	۰/۸۷	-	۴/۳۵	آنتاگوتیست
۷	۲/۶۱	۰/۶۵	-	۳/۲۶	افزایشی
۸	۱/۰۴	۰/۲۶	۴/۶۶	۵/۹۶	آنتاگوتیست
۹	-	۰/۱	۱/۹۲	۲/۰۲	افزایشی
۱۰	۰/۲۶	-	۱/۱۶	۱/۴۲	افزایشی
۱۱	۰/۵	۰/۱۲	۲/۲۳	۲/۸۵	افزایشی
۱۲	-	۰/۰۸	۱/۴۲	۱/۵	افزایشی
۱۳	۰/۲۵	-	۱/۱۵	۱/۴	افزایشی
۱۴	۰/۲۵	-	۱/۱۱	۱/۳۶	افزایشی
۱۵	-	۰/۰۷	۱/۳۸	۱/۴۵	افزایشی

 

 

 

 

 

بحث

 

افزایش نگرانی مردم و مراجع بهداشتی از نگهدارنده­های شیمیایی باعث شد تا صنعت غذا به دنبال جایگزین­های طبیعی آن برود.  استفاده از اسانس و عصاره گیاهی در غذا ایراداتی دارد که مهمترین آن احتمال واکنش با ترکیبات اصلی موجود در غذا اعم از اسید، نمک، چربی و پروتئین مواد غذایی می­باشد (1).  با توجه به این مهم که باکتری­هایی اعم از سالمونلا انتریدیتیس و شیگلا فلکسنری از عمده باکتری­های مسمویت­زا در مواد غذایی بوده و می­توانند اثرات جبران ناپذیری را در فرد درگیر ایجاد کند، این پژوهش در راستای حذف و کاهش فعالیت این دو باکتری در صنعت مواد غذایی کوشیده است.  از بین گیاهان دارویی مختلف دارچین و میخک را به علت دارا بودن محتوای ضدمیکروبی گوناگون مورد بررسی قرار گرفتند.  دارچین دارای مواد ضد میکروب متعددی است که از آن جمله می­توان به آلدئید سینامیک، فنل­ها، مخصوصا اوژنول همراه با فلاندرن، سافرول و به مقدار کمتر فورفورول اشاره کرد (16و26).  میخک نیز ترکیباتی دارد که مسئول خصوصیت ضد میکروبی هستند مانند اوژنول، اوژنول استات و هپتاکوزان (16).  در این تحقیق استفاده توامان و تکی عصاره آبی میخک و دارچین در مجاورت اسید استیک که یک اسید آلی می­باشد ارزیابی شده است. در تحقیق حاضر عصاره دارچین در غلظت ۰۶/۳۹ میلی­گرم در میلی­لیتر و ۴۲/۳۰ میلی­گرم در میلی­لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. قبلا نیز تحقیقات نشان داده شد که دارچین دارای خصوصیات ضد میکروبی است.  در تحقیق اجاق و همکاران در سال ۱۳۹۱ اثر ضد باکتریایی اسانس پوست دارچین در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی شد و مشخص شد که حداقل غلظت بازداری اسانس دارچین در مقابل باکتری­های گرم منفی ۵۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر بوده است (31). در تحقیق عبداله زاده و همکاران در سال ۱۳۹۶، فعالیت ضد باکتریایی اسانس دارچین علیه لیستریا مونوسیتوژنز مطالعه شد که نتایج اثر ضد میکروبی آن را نشان داد (32). خصوصیات ضد میکروبی اسانس و عصاره دارچین در پژوهش­های متعددی بررسی شد و در همه موارد نتایج همراستا با نتایج تحقیق حاضر بوده است (33). عصاره میخک در غلظت ۲۱/۱۵ میلی­گرم در میلی­لیتر و ۶۲/۷ میلی­گرم در میلی­لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. در همین راستا نتایج تحقیق Hu و همکاران حاکی از آن بود که خصوصیات ضد میکروبی اسانس میخک را نشان داد و می­توان به عنوان ماده ضد میکروب در غذا استفاده کرد که به وسیله آن عمر ماندگاری محصول را افزایش داد (27).  مشابه همن ادعا در تحقیق دیگری نیز ذکر شد. در این تحقیق اسانس میخک بر علیه باکتری­های گرم منفی مورد مطالعه قرار گرفت و مشخص شد که تقریبا تامی باکتری­های مورد مطالعه به اسانس میخک حساس هستند (28). اسید استیک در غلظت ۸۲/۳ میلی­گرم در میلی­لیتر و ۷۱/۱ میلی­گرم در میلی­لیتر به ترتیب باعث مهار رشد سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری شد. در مطالعه­ایی مشخص شده بود که باکتری­های باسیلوس سرئوس، استافیلوکوکوس اورئوس، شیگلا دیزانتریه و سالمونلا تیفی به اسانس گیاهان دارویی حساس هستند ولی استفاده از اسید استیک باعث تقویت اثرات ضد میکروبی اسانس شده بود(22). نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان داد که عصاره دارچین، عصاره میخک و اسید استیک بر روی باکتری­های سالمونلا انتریتیدیس و شیگلا فلکسنری اثر ضد میکروبی دارند که این خصوصیت ضد میکروبی به ترتیب برای اسید استیک، عصاره میخک و عصاره دارچین بوده است.  همچنین مشخص شد که استفاده توامان از این سه ماده ضد میکروب همیشه باعث افزایش قدرت ضد میکروبی نشده و در برخی موارد اثرات افزایشی و در برخی دیگر اثرات آنتاگونیستی داشته است.  برای مثال در تیمار شماره ۱۰ (۲۰% عصاره میخک، ۶۰ % عصاره دارچین و ۲۰% اسید استیک) برای سالمونلا انتریتیدیس حالت آنتاگونیستی داشت و تیمارهای شماره ۳ (۶۰ %  عصاره میخک و ۴۰ % عصاره دارچین)، تیمار شماره ۴ (۶۰ % عصاره میخک، ۲۰ % عصاره دارچین و ۲۰ % اسید استیک)، تیمار شماره ۵ (۴۰ %  عصاره میخک، ۴۰ % عصاره دارچین و ۲۰ % اسید استیک)، تیمار شماره ۸ (۲۰% عصاره میخک و ۸۰ % عصاره دارچین) و تیمار شماره ۱۰ (۲ % عصاره میخک و ۶۰ % عصاره دارچین و ۲۰ % اسید استیک) برای شیگلا فلکسنری حالت آنتاگونیستی داشتند. بنابر نتایج این پژوهش می­توان بهترین نوع ترکیب را با حداکثر کارایی با توجه به ماهیت ماده غذایی در نظر گرفت. در مجموع با استناد به نتایج به دست آمده از این تحقیق می­توان در آینده خصوصیات ضد میکروبی و برهم کنش ضد میکروبی سایر اسیدهای آلی و خصوصیات ضد میکروبی و برهم کنش ضد میکروبی ترکیبات ضد میکروب طبیعی بر سایر میکروب­های مهم در صنعت غذا و خصوصیات ضد میکروبی و برهم کنش ضد میکروبی ترکیبات طبیعی با نگه­دارنده­های شیمیایی را مورد مطالعه قرار داد تا بتوان بهترین روش­ها و ماده­های موثر در کاهش بار میکروبی غذا را بدست آورد. 

Reference

1.       Pradhan S, Huidrom P. Antimicrobial properties and phytochemical analysis of some medicinal plants: A review. Inter J Sci Res. 2024;13(1):508-11.

2.       Lee KM, Runyon M, Herrman TJ, Phillips R, Hsieh J. Review of Salmonella detection and identification methods: Aspects of rapid emergency response and food safety. Food Control. 2015;47:264-76.

3.       Johnson R, Mylona E, Frankel G. Typhoidal Salmonella: Distinctive virulence factors and pathogenesis. Cellular Microbiol. 2018;20(9):e12939.

4.       Kenney LJ. The role of acid stress in Salmonella pathogenesis. Curr Opin Microbiol. 2019;47:45-51.

5.       Lampel KA, Formal SB, Maurelli AT. A brief history of Shigella. EcoSal Plus. 2018;8(1):14-7.

6.       Schnupf P, Sansonetti PJ. Shigella pathogenesis: New insights through advanced methodologies. Microbiol Spectrum. 2019;7(2):7-2.

7.       Maggini V, Semenzato G, Gallo E, Nunziata A, Fani R, Firenzuoli F. Antimicrobial activity of Syzygium aromaticum essential oil in human health treatment. Molecules. 2024;29(5):999.

8.       Marchese A, Barbieri R, Coppo E, Orhan IE, Daglia M, Nabavi SF, Ajami M. Antimicrobial activity of eugenol and essential oils containing eugenol: A mechanistic viewpoint. Crit Rev Microbiol. 2017;43(6):668-83.

9.       Mounika AMA, Sushma MSM, Sidde LSL, Malathi SMS, Rajani KRK. In vitro evaluation of antimicrobial activity of clove buds (Euginea aromatica). Inter J Indigenous Herbs Drugs. 2020;25-33.

10.       Radünz M, da Trindade MLM, Camargo TM, Radünz AL, Borges CD, Gandra EA, Helbig E. Antimicrobial and antioxidant activity of unencapsulated and encapsulated clove (Syzygium aromaticum, L.) essential oil. Food Chem. 2019;276:180-6.

11.       Matan N, Rimkeeree H, Mawson AJ, Chompreeda P, Haruthaithanasan V, Parker M. Antimicrobial activity of cinnamon and clove oils under modified atmosphere conditions. Int J Food Microbiol. 2006;107(2):180-5.

12.       Tsai HC, Sheng L, Zhu MJ. Antimicrobial efficacy of cinnamon oil against Salmonella in almond-based matrices. Food Control. 2017;80:170-5.

13.       Al Bayati MHM, Cengiz MF, Kitiş YE, Çınar O. Comparison of antimicrobial activities of oregano, lavender, sage, anise and clove extracts obtained by supercritical fluid carbon dioxide extraction and essential oils obtained by hydrodistillation. J Essen Oil Res. 2024;1-13.

14.       Burin RCK, Silva JA, Nero LA. Influence of lactic acid and acetic acid on Salmonella spp. growth and expression of acid tolerance-related genes. Food Res Inter. 2014;64:726-32.

15.       Iseppi R, Truzzi E, Sabia C, Messi P. Efficacy and synergistic potential of cinnamon (Cinnamomum zeylanicum) and clove (Syzygium aromaticum L. Merr. & Perry) essential oils to control food-borne pathogens in fresh-cut fruits. Antibiotics. 2024;13(4):319.

16.       Kaur M, Sharma S, Kalia A, Sandhu N. Essential oils and their blends: mechanism of antibacterial activity and antibiofilm potential on food-grade maize starch packaging films. Inter Microbiol. 2024;1-18.

17.       Lang M, Montjarret A, Duteil E, Bedoux G. Cinnamomum cassia and Syzygium aromaticum essential oils reduce the colonization of Salmonella Typhimurium in an in vivo infection model using Caenorhabditis elegans. Molecules. 2021;26(18):5598.

18.       Banik A, Abony M, Zerin T, Datta S. Antibacterial activity of Allium sativum, Syzygium aromaticum, and Cinnamomum zeylanicum against food borne pathogens in vitro. IOSR J Pharm Biol Sci. 2018;13:68-73.

19.       Wang B, Shao Y, Chen F. Overview on mechanisms of acetic acid resistance in acetic acid bacteria. World J Microbiol Biotechnol. 2015;31(2):255-63.

20.       Gomes RJ, de Fatima Borges M, de Freitas Rosa M, Castro-Gómez RJH, Spinosa WA. Acetic acid bacteria in the food industry: systematics, characteristics and applications. Food Technol Biotech. 2018;56(2):139-41.

21.       Matsushita K, Toyama H, Tonouchi N, Okamoto-Kainuma A. Acetic acid bacteria. Ecol Physiol. 2016;22-5.

22.       Hashemi SMB, Jafarpour D, Gholamhosseinpour A. Antimicrobial activity of Carum copticum and Satureja khuzestanica essential oils and acetic acid in vapor phase at different relative humidities and temperatures in peanuts. J Food Processing Preserv. 2022;46(2):e16269.

23.       In YW, Kim JJ, Kim HJ, Oh SW. Antimicrobial activities of acetic acid, citric acid and lactic acid against Shigella species. J Food Safety. 2013;33(1):79-85.‏

24.       Olaimat AN, Al‐Holy MA, Abu Ghoush MH, Al‐Nabulsi AA, Qatatsheh AA, Shahbaz HM, Holley RA. The use of malic and acetic acids in washing solution to control Salmonella spp. on chicken breast. J Food Sci. 2018;83(8):2197-2203.

25.       Cosansu S, Ayhan K. Effects of lactic and acetic acid on survival of Salmonella enteritidis during refrigerated and frozen storage of chicken meats. Food Bioprocess Technol. 2012;5:372-7.

26.       Banik A, Abony M, Zerin T, Datta S. Antibacterial activity of Allium sativum, Syzygium aromaticum, and Cinnamomum zeylanicum against food borne pathogens in vitro. IOSR J Pharm Biol Sci. 2018;13:68-73.

27.       Hu Q, Zhou M, Wei S. Progress on the antimicrobial activity research of clove oil and eugenol in the food antisepsis field. J Food Sci. 2018;83(6):1476-83.

28.       Kammon A, Almaeyoufi A, Asheg A. In vitro antimicrobial activity of clove oil against gram-negative bacteria isolated from chickens. Appro Poult Dairy & Vet Sci. 2018;6(2):33-5.

 

 

 

29.       زرین‌کمر ف. بررسی آناتومی تیره میخک (Caryophyllaceae) در ارسباران، شمال غرب ایران. مجله گیاه‌شناسی ایران. 1380؛ 9(1):93-102.

30.       محمدی‌فر ش. خاستگاه، تاریخچه و مسیر تجارت دارچین. تاریخ علم. 1390؛ 9(9):37-51.

31.       اجاق س، رضایی م، رضوی س، حسینی س. مطالعه اثر ضد باکتریایی اسانس پوست دارچین (Cinnamomumzeylanicum) در شرایط آزمایشگاهی در برابر پنج باکتری عامل فساد غذایی. علوم و صنایع غذایی ایران. 1391؛ 9(35):67-76.

32.       عبدالله‌زاده ا، اجاق س، حسینی ه، قائمی ع، ایراجیان غ. ارزیابی کمی و کیفی فعالیت ضدباکتریایی اسانس دارچین و نانوذرات اکسید روی علیه لیستریا مونوسیتوژنز. علوم و فنون شیلات. 1396؛ 7(1):49-55.

33.       شفقی‌اصل س، نوری‌زاده ع، قاسمی‌گرمی ک، مالوفی ن. مقایسه تاثیر عصاره‌های آبی و الکلی دارچین و زردچوبه بر رشد هلیکوباکتر پیلوری در شرایط آزمایشگاهی. دانشگاه علوم پزشکی سبزوار. 1384؛ 12(3):17-21.

34.       مشاک ز، مرادی ب، مرادی ب. اثر ترکیبی اسانس دارچین و آویشن شیرازی بر رشد Bacillus cereus در یک مدل غذایی. گیاهان دارویی. 1391؛ 11(42):62-73.

35.       نوشیروانی ن، قنبرزاده ب، رضایی‌مکرم ر، هاشمی م. خواص ضد میکروبی، ضد اکسایشی و فیزیکی فیلم‌های بر پایه کیتوزان-کربوکسی‌متیل‌سلولز–اسید‌اولئیک حاوی اسانس دارچین. مجله علوم تغذیه و صنایع غذایی ایران. 1397؛ 13(1):41-52.

36.       بندیان ل، مقدم م، بحرینی م. بررسی اثر ضدباکتریایی و خاصیت سینرژیستی عصاره اتانولی آویشن شیرازی (Zatariamultiflora)، مریم گلی بنفش (Froriepia subpinnata) و اناریجه (Salvia verticillata) بر باکتری‌های عامل پوسیدگی سبزیجات. میکروب‌شناسی مواد غذایی. 1400؛ 8(1):45-57.

37.       بصیری اصفهانی ش، بیدی ب، اسدی م، رحیمی‌نژاد‌رنجبر م. بررسی آرایه‌شناسی جنس Acanthophyllum از تیره میخک در ایران. مجله گیاه‌شناسی ایران. 1390؛ 17(1):24-39