Examining the in vitro and in vivo Effects of the HL-10 Peptide on the Immune System Modulation and Anticancer Activities of Hela Cancer Cells

Subject Areas : Journal of Animal Biology

Maryam Rezavand ¹ , Zahra Setayesh-Mehr ² , Fatemeh Hadadi ³

1 - Department of Biology, Faculty of Sciences, Zabol University, Zabol, Iran
2 - Department of Biology, Faculty of Sciences, Zabol University, Zabol, Iran
3 - Department of Biology, Faculty of Sciences, Zabol University, Zabol, Iran

Received: 2024-05-17 Accepted : 2024-08-29 Published : 2025-05-27

Keywords: Peptide, Cancer, Apoptosis, Inflammatory factor, Immune system,

Abstract :

The present study aimed to assess the anti-cancer properties, immune system regulation, and apoptosis signaling pathway impact of the HL-10 peptide through gene expression analysis of Bcl-2, Cytochrome c, and Bim. HeLa cervical cancer cells were subjected to treatment with HL-10 peptide for both 24 and 48 hours at varying concentrations. To assess the in vivo impacts of the HL-10 peptide, BALB-c mice were infected with cervical cancer. Serum levels of IFN-β and IL-4 were subsequently quantified via ELISA. Using real-time PCR, the expression of the genes Bim, Cytochrome c, and Bcl-2 in cells and tumors treated with the HL-10 peptide was analyzed, along with the percentage of viable cells and toxicity. The HL-10 peptide decreases the survival rate of HeLa cells in a way that is dependent on both the concentration and duration of exposure. The HL-10 peptide exhibited an IC50 value of 18.49 μM after 24 hours and 30.62 μM after 48 hours. The findings demonstrated that the HL-10 peptide exerted a significant impact on the expression of the investigated genes. The HL-10 peptide upregulated the expression of the BIM and Cytochrome c genes while downregulating the expression of the Bcl-2 gene in cancer cells treated with the HL-10 peptide, both in vitro and in vivo. The results indicated a significant decrease in the quantity of inflammatory components INF-γ, IL-1β, and IL-6 in the serum of untreated cancer mice (Sham) compared to untreated healthy mice (NC). Conversely, there was a significant rise in the concentration of IL-4 (p < 0.05). The HL-10 peptide likely functions in the modulation of the immune system and in the intrinsic pathways of apoptosis. The HL-7 peptide appears to be a viable and auspicious candidate in the realm of cervical cancer treatment.

References:

1. Abdel-Salam M.A.L., Pinto B., Cassali G., Bueno L., Pegas G., Oliveira F., Silve I., Klein A., de Souza-Fagundes E.M., de Lima M.E., Carvalho-Tavares J., 2021. LyeTx I-b peptide attenuates tumor burden and metastasis in a mouse 4T1 breast cancer model. Antibiotics (Basel), 10(9):1136.
2. Biron C.A., Nguyen K.B., Pien G.C., Cousens L.P., Salazar-Mather T.P., 1999. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annual Review of Immunology, 17:189-220.
3. Gao L., Shan B.E., Chen J., Liu J.H., Song D.X., Zhu B.C., 2005. Effects of spider Macrothele raven venom on cell proliferation and cytotoxicity in HeLa cells. Acta Pharmacologica Sinica, 26:369-376.
4. Gu Y., Liu S-L., Ju W-Z., Li C-Y., Cao P., 2013. Analgesic-antitumor peptide induces apoptosis and inhibits the proliferation of SW480 human colon cancer cells. Oncology letters, 5(2): 483-488.
5. Guo Y., Srinivasula S.M., Druilhe A., Fernandes-Alnemri T., Alnemri E.S., 2002. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria. Journal of Biological Chemistry, 277(16): 13430-13437.
6. Gupta S.D., Gomes A., Debnath A., Saha A., Gomes A., 2010. Apoptosis induction in human leukemic cells by a novel protein Bengalin, isolated from Indian black scorpion venom: through mitochondrial pathway and inhibition of heat shock proteins. Chemico-Biological Interactions, 183:293-303.
7. Harirchi I., Karbaksh M., Kashefi A., Momtahen A.J., 2004. Breast cancer in Iran: results of a multi-center study. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 5(1):24-27.
8. Heidari Esfahani E., Doosti A., 2021. The Effects of melittin coding gene of bee venom on Bcl-2 and Bax genes expression in ACHN cells. Anatomical Sciences Journal, 18(2):85-91.
9. Hoskin D.W., Ramamoorthy A., 2008. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochimica et Biophysica Acta, 1778(2):357-375.
10. Jeyaprakash J., Hoy M.A., 2009. First divergence time estimate of spiders, scorpions, mites and ticks (subphylum: Chelicerata) inferred from mitochondrial phylogeny. Experimental and Applied Acarology, 47(1):1-18.
11. Kawakami K., Kawakami M., Husain S.R., Puri R.K., 2003. Effect of interleukin (IL)-4 cytotoxin on breast tumor growth after in-vivo gene transfer of IL-4 receptor alpha chain. Clinical Cancer Research, 9(5):1826-1836.
12. Lee H.L., Park S.H., Kim T.M., Jung Y.Y., Park M.H., Oh S.H., Yun H.S., Jun H.O., Yoo H.S., Han S.B., Lee U.S., Yoon J.H., Song M.J., Hong J.T., 2015. Bee venom inhibits growth of human cervical tumors in mice. Oncotarget, 6(9):7280-7292.
13. Liu Z., Deng M., Xiang J., Ma H., Hu W., Zhao Y., Li D.W.C., Liang S., 2012. A novel spider peptide toxin suppresses tumor growth through dual signaling pathways. Current Molecular Medicine, 12(10):1350-1360.
14. Meki A.R., Nassar A.Y., Rochat H., 1995. A bradykinin-potentiating peptide (peptide K12) isolated from the venom of Egyptian scorpion Buthus occitanus. Peptides, 16(8): 1359-1365.
15. Mikaelian A.G., Traboulay E., Zhang X.M., Yeritsyan E., Pedersen P.L., Hee Ko.Y., Matalka K.Z., 2020. Pleiotropic Anticancer properties of scorpion venom peptides: Rhopalurus princeps venom as an anticancer agent. Drug Design, Develop and Therapeutics, 14:881-893.
16. Miyashita M., Sakai A., Matsushita N., Hanai Y., Nakagawa Y., Miyagawa H., 2010. A novel amphipathic linear peptide with both insect toxicity and antimicrobial activity from the venom of the scorpion Isometrus maculatus. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74(2): 364-369.
17. Moon D-O., Park S-Y., Heo M-S., Kim K-C., Park C., Ko W.S., 2006. Key regulators in bee venom-induced apoptosis are Bcl-2 and caspase-3 in human leukemic U937 cells through downregulation of ERK and Akt. International immunopharmacology, 6(12):1796-1807.
18. Ortiz E., Gurrola G.B., Schwartz E.F., Possani L.D., 2015. Scorpion venom components as potential candidates for drug development. Toxicon, 93:125-135.
19. Otsuki N., Dang N.H., Kumagai E., Kondo A., Iwata S., Morimoto C., 2010. Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects. Journal of Ethnopharmacology, 127(3):760-767.
20. Petricevich V.L., Lebrun I., 2005. Immunomodulatory effects of the Tityus serrulatus venom on murine macrophage functions in-vitro. Mediators of Inflammation, 1:39-49.
21. Pipelzadeh M.H., Dezfulian A.R., Jalali M.T., Mansori A.K. 2006. In vitro and in vivo studies on some toxic effects of the venom from Hemiscorpious lepturus scorpion. Toxicon, 48: 93-103.
22. Piperi C., Zisakis A.W., Lea R., Kalofoutis A., 2005. Role of cytokines in the regulation of glioma tumour growth and angiogenesis. American Journal of Immunology, 1:106-113.
23. Possani L.D., Becerril B., Delepierre M., Tytgat J., 1999. Scorpion toxins specific for Na+-channels. European Journal of Biochemistry, 264:287-300.
24. Riedl S., Zweytick D., Lohner K. 2011. Membrane-active host defense peptides-challenges and perspectives for the development of novel anticancer drugs. Chemistry and Physics of Lipids, 164(8):766-781.
25. Satitmanwiwat S., Changsangfa C., Khanuengthong A., Promthep K., Roytrakul S., Arpornsuwan T., 2016. The scorpion venom peptide BmKn2 induces apoptosis in cancerous but not in normal human oral cells. Biomedicine & Pharmacotherapy, 84: 1042-1050.
26. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., 2017. The inhibitory activity of HL-7 and HL-10 peptide from scorpion venom (Hemiscorpius lepturus) on angiotensin converting enzyme: Kinetic and docking study, Bioorganic Chemistry, 75:30-37.
27. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., 2019. Inhibitory effect of HL-7 and HL-10 peptides on human breast cancer cells by induction of the expression of antioxidant enzymes. International Journal of Peptide Science and Therapeutics, 25(40):1343-1341.
28. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., Poorsargol M., 2021. Upregulation of Bax, TNF-α and down-regulation of Bcl-2 in liver cancer cells treated with HL-7 and HL-10 peptides. Biologia, 76:2735-2743.
29. Sun X., Xu Q., Zeng L., Xie L., Zhao Q., Xu H., Wang X., Jiang N., Fu P., Sang M., 2020. Resveratrol suppresses the growth and metastatic potential of cervical cancer by inhibiting STAT3Tyr705 phosphorylation. Cancer Medicine. 9(22):8685-8700.
30. Wang Y.K., He H.L., Wang G.F., Wu H., Zhou B.C., Chen X.L., Zhang Y.Z., 2010. Oyster (Crassostrea gigas) hydrolysates produced on a plant scale have antitumor activity and immunostimulating effects in BALB/c mice. Marine Drugs, 8(2):255-268.
31. Willems J., Moerman L., Bosteels S., Bruyneel E., Ryniers F., Verdonck F., 2004. Parabutoporin an antibiotic peptide from scorpion venom can both induce activation and inhibition of granulocyte cell functions. Peptides, 25(7):1079-1084.
32. Yan W., Lu J., Li G., Wei H., Ren W.H., 2018. Amidated Scolopin-2 inhibits proliferation and induces apoptosis of Hela cells in vitro and in vivo. Biotechnology and Applied Biochemistry, 65:672-679.
33. Yglesias-Rivera A., Sánchez-Rodríguez H., Soto-Febles C., Monzote L., 2023. Heteroctenus junceus scorpion venom modulates the concentration of pro-inflammatory cytokines in F3II tumor cells. Life (Basel), 13(12):2287.
34. Zeng X.C., Li W.X., Peng F., Zhu Z.H. 2000. Cloning and characterization of a novel cDNA sequence encoding the precursor of a novel venom peptide (BmKbpp) related to a bradykinin-potentiating peptide from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch. IUBMB Life, 49(3):207-210.
35. Zeng X., Corzo G., Hahin R., 2005. Scorpion venom peptides without disulfide bridges. IUBMB Life, 57(1):13-21.

Full-Text:



 

 

 

 

Examining the in vitro and in vivo Effects of the HL-10 Peptide on the Immune System Modulation and Anticancer Activities of Hela Cancer Cells

 

Maryam Rezavand, Zahra Setayesh-Mehr*, Fatemeh Hadadi

 

Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Zabol, Zabol, Iran

*Corresponding author: [e-mail]

Received: 17 MAy 2024                                 Accepted: 29 August 2024

DOI:

 

Abstract

The present study aimed to assess the anti-cancer properties, immune system regulation, and apoptosis signaling pathway impact of the HL-10 peptide through gene expression analysis of Bcl-2, Cytochrome c, and Bim. HeLa cervical cancer cells were subjected to treatment with HL-10 peptide for both 24 and 48 hours at varying concentrations. To assess the in vivo impacts of the HL-10 peptide, BALB-c mice were infected with cervical cancer. Serum levels of IFN-β and IL-4 were subsequently quantified via ELISA. Using real-time PCR, the expression of the genes Bim, Cytochrome c, and Bcl-2 in cells and tumors treated with the HL-10 peptide was analyzed, along with the percentage of viable cells and toxicity. The HL-10 peptide decreases the survival rate of HeLa cells in a way that is dependent on both the concentration and duration of exposure. The HL-10 peptide exhibited an IC50 value of 18.49 μM after 24 hours and 30.62 μM after 48 hours. The findings demonstrated that the HL-10 peptide exerted a significant impact on the expression of the investigated genes. The HL-10 peptide upregulated the expression of the BIM and Cytochrome c genes while downregulating the expression of the Bcl-2 gene in cancer cells treated with the HL-10 peptide, both in vitro and in vivo. The results indicated a significant decrease in the quantity of inflammatory components INF-γ, IL-1β, and IL-6 in the serum of untreated cancer mice (Sham) compared to untreated healthy mice (NC). Conversely, there was a significant rise in the concentration of IL-4 (p < 0.05). The HL-10 peptide likely functions in the modulation of the immune system and in the intrinsic pathways of apoptosis. The HL-7 peptide appears to be a viable and auspicious candidate in the realm of cervical cancer treatment.

 

Keywords: Peptide, Cancer, Apoptosis, Inflammatory factor, Immune system.

 

 

 

 

 

 

 

 

بررسی خاصیت ضدسرطانی و تنظیم کنندگی سیستم ایمنی سلول‌های سرطانی Hela تیمار شده با پپتید HL-10 در شرایط برون‌تنی و درون‌تنی

مریم رضاوند، زهرا ستایش مهر*، فاطمه حدادی

گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه زابل، زابل، ایران

*مسئول مکاتبات: [e-mail]

تاریخ دریافت: 28/02/1403 تاریخ پذیرش: 08/06/1403

DOI:

 

چکیده

در این مطالعه خاصیت ضدسرطانی، تنظیم­کنندگی سیستم ایمنی و همچنین اثر پپتید HL-10 بر مسیر سیگنال‌دهی آپوپتوز با اندازه‌گیری بیان ژن­های Bcl-2، Cytochrome c و Bim بررسی شد. سلول‌های سرطان دهانه رحم HeLa  با پپتید HL-10 در غلظت­های مختلف و زمان‌های 24 و 48 ساعت تیمار شدند. به منظور ارزیابی اثرات درون­تنی پپتید HL-10، سرطان دهانه رحم در موش balb-c القا شد. سپس، سطوح IFN-γ و IL-4 سرم، با استفاده از ELISA اندازه­گیری شد. سمیت و درصد بقای سلولی، بیان ژن‌های Bim، Cytochrome c و Bcl-2 سلول‌ها و تومور تیمار شده با پپتید HL-10 به روش Real Time PCR بررسی شد. پپتید HL-10 زنده‌مانی سلول‌هایHeLa  را به صورت وابسته به غلظت و زمان کاهش می‌دهد. مقدار IC50 برای پپتید HL-10 در زمان 24 ساعت، 49/18 میکرومولار و در زمان 48 ساعت، 62/30 میکرومولار بدست آمد. نتایج نشان داد که پپتید HL-10 تأثیر معنی‌داری بر بیان ژن‌های مورد مطالعه داشت. پپتید Hl-10 باعث افزایش در بیان ژن BIM و Cytochrome c و کاهش بیان ژن Bcl-2 در سلول‌های سرطانی درمان شده با پپتید HL-10 در مقایسه با سلول‌های درمان نشده در شرایط درون­تنی و برون­تنی شد. همچنین، نتایج نشان داد که غلظت فاکتورهای التهابی INF- γ، IL-1β و IL-6 در سرم موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham) نسبت به موش­های سالم بدون تیمار (NC) کاهش معنادار، درحالیکه غلظت IL-4 افزایش نشان داد (05/0 p <).  احتمالاً پپتید HL-10 در مسیرهای ذاتی آپوپتوز و همچنین در تنظیم سیستم ایمنی نقش دارد. به نظر می­رسد پپتید HL-7 می‌تواند یک کاندید مناسب و امیدوارکننده برای درمان سرطان دهانه رحم باشد.

کلمات کلیدی: پپتید، سرطان، آپپتوز، فاکتور التهابی، سیستم ایمنی. 

مقدمه

 

عقرب‌ها، گروهی سازش­یافته از حیوانات سمی هستند که از 1500 میلیون سال در کره زمین زندگی می کرده اند. عامل اصلی بقای انها، تولید سموم قوی است که برای کشتن یا فلج کردن طعمه و شکارچیان مورد استفاده قرار می‌دهند (10). سموم عقرب‌ها از دیرباز است که در پزشکی سنتی کاربرد دارد. تحقیقات نشان داده است که قسمت­های مختلف بدن عقرب یا سموم آنها، جهت درمان بسیاری از بیماری­ها از قبیل سرطان مورد استفاده قرار می­گیرد (23). سموم عقرب‌ها دارای ترکیبات مختلفی از جمله، پپتیدها، یون­ها، مواد معدنی و آنزیم­ها می‌باشند (35). پپتیدهای فعال زیستی موجود در سموم عقرب‌ها را به دو دسته کلی پپتیدهای دارای پل دی­سولفیدی (DBPs) و پپتیدهای فاقد پل دی­سولفیدی (NDBPs) تقسیم می­کنند (34). نوروتوکسین­ها که جز پپتیدهای دارای پل دی سولفیدی می‌باشند، قادرند تا عملکرد انواع کانال­های یونی هدف در سلول‌ها را اصلاح یا مسدود سازند. بنابراین، برخی از نوروتوکسین­ها، به عنوان هدف درمانی برای توسعه دارو مورد استفاده قرار می­گیرند که دارای فعالیت­های ضدمیکروبی، ضدمالاریایی، سرکوب­کننده سیستم ایمنی و ضدسرطانی می‌باشند (23). پپتیدهای بدون پل دی سولفیدی جز مهمی از سموم عقرب‌ها می‌باشند، در عین حال درصد کمی از پپتیدها را شامل می‌شوند. از این رو، توجه محققین، معمولا به سمت پپتیدهایی با وزن مولکولی پایین تغییر یافت. با توجه به کشف فعالیت بیولوژیکی متنوع، NDBPs را می‌توان به عنوان کاندیدای دارویی امیدبخش در آینده مورد بررسی بیشتر قرار داد (34). در دهه های اخیر، پیشرفت قابل توجهی در تشخیص و روش درمان بیماری سرطان وجود داشته است. با این حال، عدم انتخاب پذیری مناسب برای سلول‌های توموری و بنابراین هدفگیری غیراختصاصی سلول‌های سالم با اثرات جانبی زیان بار، به طور جدی اثر داروهای شیمی درمانی موجود در بازار را محدود میکند (9و24). پپتیدهای ضدسرطانی، ترکیبات مهمی برای طراحی داروهای هدفگیری توموری و متعاقبا جلوگیری از توسعه و پیشرفت سرطان می‌باشند (14، 16). مطالعات نشان داده اند که پپتیدهای استخراجی از سم عقرب بواسطه توقف چرخه سلولی، تنظیم کانال­های یونی، مهار تکثیر و رگ زایی و همچنین القای آپوپتوز به درمان سرطان کمک می­کنند (15). به عنوان مثال، پپتیدی به نام بنگالین (Bengalin) استخراجی از سم عقرب سیاه هندی (Heterometrus bengalensis) سبب مهار رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی از جمله لوسمی انسانی (U937) گردید، در صورتی­که هیچ اثر سمیت معناداری بر سلول‌های لنفوسیت های طبیعی انسان نداشت. مشاهدات بیشتر نشان داد که پپتید بنگالین خواص ضدسرطانی خود را از طریق افزایش بیان ژن‌های کاسپاز 3 و 9 ، افزایش بیان نسبت Bax به Bcl-2  و افزایش نفوذپذیری غشای میتوکندری اعمال کرد (6). بررسی اثر سم عقرب Buthus martensii Karsch  بر سلول‌های گلیوما در شرایط درون­تنی و برون­تنی نشان داده که سم جدا شده منجر به القای آپوپتوز در رده سلولی گلیومای U251-MG  در شرایط برون­تنی شد، همچنین رشد سلول‌های تومور گلیوما را در درون بدن سرکوب کرد (21). در شرایط طبیعی، سیستم ایمنی بدن سبب شناسایی و از بین بردن سلول‌های سرطانی در ابتدای شکل­گیری می‌شود. بنابراین، بررسی وضعیت سیستم ایمنی و عوامل موثر بر آن در محیط شیمیایی سلول‌های توموری نقش بسیار مهمی در تشخیص، پیشرفت و درمان سرطان دارد. در این راستا، مطالعات نشان داده اند که سایتوکاین­ها با تنظیم پاسخ ایمنی قادر به ایجاد یا مهار بسیاری از بیماری­ها از جمله سرطان هستند (15). پاسخ ایمنی، یکی از حیاتی‌ترین پاسخ‌های بدن هنگام مواجهه با انواع تومورها است که این قبیل واکنش­های طبیعی، شامل ترشح سایتوکاین­هایی مانند اینترفرون گاما (γINF-) و اینترلوکین 4 (IL-4) می‌باشد (22). افزایش بیان IL-4 در افزایش تکثیر و رشد سلول‌های توموری و همچنین متاستاز آنها در بدن نقش دارد. از طرفی دیگر، سایتوکاین دیگری به نام γINF-، یک عامل متوقف­کننده رشد سلول‌های توموری، تقویت فعالیت ماکروفاژها و سلول‌های کشنده طبیعی است (2). در انواع سرطان­ها بیان ژن­های مرتبط با کانال­های یونی کنترل می‌گردد. تنظیم بیان کانال­های یونی منجر به تغییر مسیرهای سیگنالینگ داخل سلولی و متعاقباً تنظیم فعالیت سلول‌های ایمنی می‌شود (15). سم عقرب serrulatus Tityus فعالیت تنظیم­کنندگی ایمنی ماکروفاژها را بر عهده دارد. تزریق سم عقرب به موش سبب افزایش بیان فاکتور نکروز توموری آلفا (TNF-α) و اینترلوکین­ها (IL-1β، IL-6، IL-8 و IL-10) در ماکروفاژها می‌شود (20). همچنین برخی از پپتیدهای فاقد پیوند دی­سولفیدی مانند پارابوتوپورین Parabutoporin)) و اپیستوپورین (Opistopurin)، علاوه بر خواص ضد قارچی و ضدباکتریایی دارای فعالیت تنظیم­کننده سیستم ایمنی نیز هستند. این پپتیدها قادر به فعال کردن اگزوسیتوز یا مهار تولید سوپراکسید در گرانولوسیت­ها هستند (31). بنابراین، سم عقرب و اجزای آن، تأثیر بسزایی در تنظیم سیستم ایمنی دارند و تحقیقات بیشتر در این زمینه می‌تواند سم عقرب را به عنوان یک عامل مهم در درمان بیماری­های مرتبط با سیستم ایمنی و سرطان معرفی کند (18). به دلیل وجود پپتیدهای فعال زیستی در سم عقرب، کشف فعالیت بیولوژیکی پپتیدها به ویژه در درمان سرطان و متعاقبا معرفی آن­ها به عنوان عوامل امیدوارکننده در ساخت داروها، مطالعات اخیر به سمت بررسی بیشتر این نوع ترکیبات پیش رفته است. در مطالعات قبلی­مان، خواص ضدسرطانی پپتید HL-10 بر رده­های سلول سرطانی A549، MCF-7 و HepG2 بررسی شد (26، 27). در مطالعه حاضر، اثر پپتید HL-10 بر رده سلول سرطانی دهانه رحم HeLa در شرایط برون­تنی و درون­تنی بررسی گردید.

مواد و روش­ها

کشت و نگهداری سلول: پس از خریداری سلول‌های سرطانی دهانه رحم Hela از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران، سلول‌ها در محیط کشت RPMI1640 حاوی FBS ده درصد و آنتی­بیوتیک پنی­سیلین-استرپتوزوسین یک درصد کشت داده شدند. فلاسک­های حاوی سلول در 37 درجه سانتی‌گراد، 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت انکوبه شدند. پاساژهای سلول‌ها در دوره­های زمانی 48 ساعت و متعاقبا جایگزین محیط کشت سلولی تازه انجام گردید، تا زمانیکه تراکم سلول‌ها به 70 درصد رسید.

اندازه­گیری زنده­مانی سلول: برای بررسی درصد زنده­مانی سلول‌ها، از روش MTT استفاده شد. ابتدا سلول‌ها جهت چسبیدن به کف فلاسک محیط کشت و ایجاد شرایط پایدار، به مدت 24 و 48 ساعت کشت داده شدند. سپس میزان 106 × 5 سلول شمارش و به چاهک­های پلیت­های 96 خانه­ای اضافه شدند. تیمار سلول‌ها با غلظت­های 0، 5، 10، 15، 20، 30، 40، 50، 60، 70 و 80 میکرومولار پپتید HL-10 در زمان­های مختلف 24 و 48 ساعت انجام شد. پس از اضافه شدن محلول MTT (10 میکرولیتر)، پلیت­ها به مدت 4 ساعت در تاریکی انکوبه شدند و پس از اضافه شدن DMSO (150 میکرولیتر) به هر چاهک، میزان جذب پلیت­ها در طول موج 540 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر خوانده شد. درصد زیست­پذیری سلول‌ها با استفاده از فرمول زیر اندازه­گیری شد: Cell viability (%) = [A] sample / [A] control 100

در این رابطه؛ [A] sample میزان جذب نمونه و [A] control میزان جذب کنترل است.

حیوانات: تمامی آزمایشات بر روی موش‌های ماده نژاد balb/c (تهیه شده از موسسه انستیتو پاستور کرج)، در سن 8-6 هفته­ای و محدوده وزنی 30-25 گرم انجام شد. کلیه مراحل آزمایشات درون‌تنی توسط کمیته اخلاق دانشگاه زابل تایید شد (IR.UOZ.REC.1401.012). موش­ها تحت شرایط کنترل شده از لحاظ نور، دما و رطوبت در مرکز حیوانات دانشکده دامپزشکی دانشگاه زابل نگهداری شدند.

ایجاد مدل سرطان دهانه رحم در موش: به منظور القای مدل توموری سرطان گردن رحم در موش، از رده سلول سرطانی دهانه رحم Hela استفاده شد که به میزان 200 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی در سالین استریل (106× 5 سلول) به صورت زیر پوستی به ناحیه فلانک راست هر موش تزریق شد (29). پس از گذشت 10 روز و براساس حجم تومور، 24 سر موش به چهار گروه (6=n) تقسیم شدند.: گروه کنترل منفی (NC: Negative Control) (گروه موش­های سالم که تحت عمل جراحی قرار نگرفتند و فقط سالین نرمال دریافت کردند)؛ گروه شم (sham) (گروه موش­هایی که بدون دریافت هیچ نوع تیماری تحت عمل جراحی قرار گرفتند و فقط سالین نرمال دریافت کردند)؛ و گروه­های درمانی (که دریافت­کننده پپتید HL-10 با غلظت­های 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم بودند). تمام تیمارها به مدت سه هفته هر روز به صورت داخل صفاقی تزریق شدند.

سنجش فاکتورهای التهابی در سرم: تقریباً 5 هفته پس از القای سرطان، موش­ها با زایلازین (10 میلی­گرم/کیلوگرم) و کتامین (100 میلی­گرم/کیلوگرم) بیهوش شدند. پس از باز کردن قفسه سینه با کمک قیچی و پنس استریل، با استفاده از سرنگ انسولین عمل خون­گیری از قلب انجام شد. پس از انتقال خون به میکروتیوپ، نمونه مورد نظر به مدت 5 دقیقه و با دور rpm 15000 سانتریفیوژ گردید. سپس مایع رویی جمع­آوری و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. کیت­های ELISA برای اندازه­گیری γIFN-، IL-4­، IL-6 و IL-1β طبق پروتکل سازنده استفاده شد.

تهیه سلول‌ها از بافت توموری جهت سنجش بیان ژن­های Bcl-2، Bim و Cyt c: تومور جداسازی شده، در 2 میلی­لیتر از محیط کشت حاوی 10 درصد FBS با استفاده از کف سرنگ 2 میلی­لیتری خرد شد و تجمعات بافتی خارج گردید. برای تهیه سوسپانسیون سلولی، بافت تومور از یک شبکه سیمی به قطر 2/0 میلی­متری عبور داده شد. پس از افزودن 10 میلی لیتر از محیط کشت، نمونه­ها به مدت 10 دقیقه (3000 دور در دقیقه) سانتریفیوژ شدند. سپس رسوب سلولی در محیط کشت RPMI حاوی FBS 10 درصد حل گردید. پس از شمارش و سنجش میزان زنده­مانی سلول‌ها با رنگ­آمیزی، از هر نمونه، سوسپانسیون سلولی با غلظت 106×1 سلول تهیه شد. این سلول‌ها در پلیت­های 24 خانه ای به مدت 72 ساعت در انکوباتور کشت داده شدند. سپس مایع رویی جمع­آوری و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شد.

استخراج RNA و سنتز cDNA: برای انجام میزان بیان ژن، از روش Real time PCR استفاده شد. ابتدا سلول‌ها با غلظت 106 × 4 سلول در محیط مکمل RPMI1640 کشت داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت، سلول‌های Hela، با غلظت­های 15 و 25 میکرومولار از پپتید HL-10 به مدت 48 ساعت تیمار شدند. سپس جداسازی RNA توسط کیت Denazist Co. Mashhad, Iran از سلول‌ها استخراج گردید. پس از آن، کیت Kiagene Fanavar, Tehran, Iran، برای سنتز cDNA استفاده شد. ابتدا مخلوطی شامل 3 میکرولیتر RNA کل، 1 ماکرولیتر پرایمر الیگو dT و 10 ماکرولیتر آب عاری از نوکلئاز تهیه گردید و به دنبال آن، محلول حاصله به مدت 50 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. به مخلوط ایجاد شده، 2 میکرولیتر dNTP 10 میلی­مولار، 6 میکرولیتر بافر PCR 5X و یک میکرولیتر آنزیم ترانس­کریپتاز معکوس اضافه شد و به ترتیب انکوباسیون با دمای 37 درجه سانتی‌گراد در زمان 5 دقیقه و دمای 70 درجه سانتی‌گراد در زمان 5 دقیقه انجام شد. درنهایت cDNA ساخته شده از RNA، در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری و ذخیره گردید.

Real time PCR: واکنش RT-PCR، در دستگاه Real Time PCR (مدل X960B) انجام شد. در هر واکنش، محلول­های مورد استفاده شامل 10 میکرولیتر SYBR Green PCR master mix، یک میکرولیتر cDNA، 3 میکرولیتر پرایمر و 6 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز بودند و زمان و دمای مناسب برای انجام واکنش­ها، 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 ثانیه، 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 ثانیه تنظیم گردید. از ژن GAPDH، به عنوان کنترل داخلی استفاده شد. توالی پرایمرها برای آنالیز Real time PCR در جدول 1 آمده است.

آنالیز آماری: داده­ها با استفاده از نرم­افزار GraphPadPrism و آزمون ANOVA و Tuckey تجزیه­وتحلیل شدند نمودارها با نرم­افزار GraphPadPrism رسم شدند. سطح معناداری 05/0 در نظر گرفته شد.

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه

Table 1- Sequences of primers used in this study

Primer sequences: 5′       3′	Genes
Forward: AGCCAAAAGGGTCATCATC Reverse: TAAGCAGTTGGTGGTGCAGG	GAPDH
Forward: GGACCCAGAATACCAAGTGCAG Reverse: GTTGCTGGTGAGTGTGCATTCC	Bcl-2
Forward: AAGGGAGGCAAGCACAAGACTG   Reverse: CTCCATCAGTGTATCCTCTCCC	CytC
Forward: TAAGTTCTGAGTGTGACCGAGA Reverse: GCTCTGTCTGTAGGGAGGTAGG	Bim

 

نتایج

 

درصد زیست­پذیری سلولی و محاسبه IC50: نتایج سنجش MTT نشان داد که ارتباطی معکوس میان درصد زنده مانی سلول‌های زنده سرطانی HeLa تیمار شده با غلظت­های مختلف پپتید HL-10 و سلول‌های بدون تیمار وجود داشت، بطوریکه با افزایش غلظت پپتید HL-10، درصد سلول‌های زنده تیمار شده کاهش نشان داد (05/0 p <). مقدار IC50 برای پپتید HL-10 در زمان 24 ساعت، 49/18میکرومولار و در زمان 48 ساعت، 62/30 میکرومولار بدست آمد (شکل 1).

بیان ژن­های Bcl-2، Bim و Cytc: شکل دو، بیان ژن­های Bcl-2،Bim  و Cytc در سلول‌های سرطانی دهانه رحم Hela تیمارشده با غلظت­های 15 و 25 میکرومولار در شرایط برون­تنی و غلظت­های 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 را نشان می‌دهد. نتایج حاصل از این مطالعه در مطالعات برون­تنی نشان داد که پپتید HL-10، اثر معناداری بر روی بیان ژن­های Bcl-2، Bim و Cytc داشت، بدین صورت که پپتید Hl-10، سبب افزایش معنادار بیان ژن Bim و Cytc در سلول‌های سرطانی تیمار شده نسبت به سلول‌های بدون تیمار شد، در حالیکه تغییرات بیان ژن برای Bcl-2 کاهشی بود (05/0 p <). همچنین نتایج مطالعات درون‌تنی نشان داد که بیان ژن­های Bim و Cytc در گروه موش­های سرطانی تیمار شده با دو غلظت 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم، افزایش داشت، در صورتی­که بیان ژن Bcl-2 کاهش معناداری نشان داد (05/0 p <). میان بیان هر سه ژن مورد مطالعه گروه موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham) در مقایسه با گروه موش­های سالم بدون تیمار (NC) اختلاف معناداری دیده نشد (05/0 p <).

فاکتورهای التهابی: همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، مقادیر IFN-γ در سرم موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham) و موش­های سرطانی تیمار شده با دو غلظت 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار کمتر بود. سطوح این فاکتور میان سرم موش­های سرطانی تیمار شده با دو غلظت 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار (NC) تفاوت معناداری نداشت (05/0 p <). در حالیکه سطوح IFN-γ  موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham) در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار (NC) کاهش معناداری نشان داد (001/0 p <). نتایج این مطالعه نشان داد که غلظت IL-4 در سرم موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham) نسبت به موش­های سالم بدون تیمار (NC) افزایش معناداری نشان داد. سطوح سرمی IL-4 در موش­های سرطانی تیمار شده با 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 نسبت به موش­های سرطانی بدون تیمار (Sham)، کاهش معناداری داشت (001/0 p <). میان سطوح این سایتوکاین در موش­های سرطانی تیمار شده با غلظت 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار (NC) تفاوت معناداری دیده نشد (05/0 p <). نتایج نشان داد که غلظت IL-6 و  IL-1βدر سرم موش­های سرطانی بدون تیمار نسبت به موش­های سالم بدون تیمار (NC) کاهش معناداری نشان داد. میان سطوح IL-6، در موش­های سرطانی تیمار شده با غلظت­های 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار (NC) تفاوت معناداری دیده نشد (05/0 p <). همچنین میان سطوح IL-1β موش­های سرطانی تیمار شده با غلظت 10 میلی­گرم/کیلوگرم پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار (NC) تفاوت معناداری دیده نشد (05/0 p <).

 

 

 

شکل 1- منحنی دوز پاسخ حاصل از تیمار سلول‌های سرطانی دهانه رحم HeLa با غلظت­های مختلف پپتید HL-10 در زمان­های 24 و 48 ساعت.

Fig. 1. The dose-response curve shows the impact of HL-10 peptide treatment at varying concentrations on HeLa cervical cancer cells at the 24- and 48-hour time points.

 

 

شکل 2- نتایج Real time PCR ژن های BCL-2، Bim و Cyt c در سلول‌های سرطانی دهانه رحم Hela (a) و سلول‌های بافت تومور در مدل موش­های balb-c دارای سرطان دهانه رحم تیمار شده با پپتید HL-10. 0، 15 و 25 میکرومولار: میزان بیان ژن­های Bcl-2، Bim و Cyt c در سلول‌های سرطانی دهانه رحم Hela تیمار شده با غلظت­های 0، 15 و 25 میکرومولار پپتید HL-10. NC: کنترل منفی (گروه موش­های سالم تیمار نشده)؛ Sham: گروه شم (گروه موش­های سرطانی تیمار نشده)؛ 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم (گروه موش­های سرطانی و تیمارشده با پپتید HL-10 در دو غلظت 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم). ****، بیانگر اختلاف معنادار میان بیان ژن­های مذکور و نمونه کنترل بدون تیمار است (0001/0 p <).

Fig. 2. The real-time PCR findings of the BCL-2, Bim, and Cyt c genes in Hela cervical cancer cells (a) and tumor tissue cells in the balb-c mice model with cervical cancer treated with HL-10 peptide are as follows: The expression levels of the Bcl-2, Bim, and Cyt c genes in Hela cervical cancer cells were measured after treatment with doses of 0, 15, and 25 μM of the HL-10 peptide. NC refers to the negative control, which is a group of healthy mice that were not treated. Sham refers to the Sham group, which is a group of cancer mice that were also not treated. The 5 and 10 mg/kg groups are groups of cancer mice that were treated with the HL-10 peptide at two different concentrations: 5 mg/kg and 10 mg/kg. **** denotes a significant difference in the expression of the specified genes compared to the control sample that did not receive any treatment (p < 0.0001).

 

 

شکل 3- سطوح سرمی INF- γ ، IL-4، IL-6 و IL-1β پس از القای سرطان با رده سلولی Hela در گروه­های تیمار شده با پپتید HL-10. NC: کنترل منفی (گروه موش­های سالم تیمار نشده با پپتید HL-10)؛ Sham: شم (گروه موش­های سرطانی تیمار نشده با پپتید  HL-10)؛ 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم (گروه موش­های سرطانی و تیمار شده با پپتید HL-10 در دو غلظت 5 و 10 میلی­گرم/کیلوگرم). 01/0 ** p < و0001/0 **** p < ، نشان­دهنده وجود اختلاف معنادار میان بیان ژن­ها میان سلول‌های سرطانی تیمار شده با پپتید HL-10 در مقایسه با کنترل بدون تیمار است.

Fig. 3. In groups treated with HL-10 peptide, serum concentrations of INF-, IL-4, IL-6, and IL-1β were measured subsequent to cancer induction using the Hela cell line. NC represents the negative control, which consisted of healthy mice that were not exposed to the HL-10 peptide. Sham denotes the group of cancer mice that were not treated with the HL-10 peptide. The doses of HL-10 peptide administered to the cancer mice were 5 and 10 mg/kg. Significant differences in gene expression were observed between cancer cells treated with HL-10 peptide and untreated control cells, as indicated by ** (p<0.01) and ***(p<0.0001).

 

بحث

 

یکی از راهبردهای مهم در درمان سرطان، حذف هدف‌مند سلول‌های سرطانی از طریق القاء آپپتوز است (4، 5). در این مطالعه، اثر پپتید HL-10 بر سلول‌های سرطانی دهانه رحم در غلظت‌های مختلف و در زمان‌های 24 و 48 ساعت انجام شد. نتایج بیانگر کاهش زنده‌مانی و افزایش سمّیت سلول‌های سرطانی تیمار شده با پپتید HL-10 در یک روند وابسته به دوز و زمان بود. مقدار IC50 برای پپتید HL-10 در زمان 24 ساعت، 49/18 میکرومولار و در زمان 48 ساعت، 62/30 میکرومولار بدست آمد. Satitmanwiwat و همکاران (2016)، اثر پپتید BmKn-2 استخراج شده از سم عقرب را بر سلول‌های سرطانی و طبیعی دهانی بررسی کردند. نتایج تیمار سلول‌ها به‌مدت 24 ساعت توسط BmK-2 نشان داد که پپتید مذکور، از طریق القاء فرایندهای آپپتوز، دارای اثرات سمّیت سلولی قوی بر سلول‌های سرطانی دهان بود. همچنین نتایج آنها نشان داد که در غلظت‌هایی پپتید سبب مرگ سلول‌های سرطانی می‌شوند. در همان غلظت‌ها، زیست‌پذیری سلولی و القاء آپپتوز در سلول‌های طبیعی، تحت تأثیر قرار نگرفت (25). القاء آپپتوز توسط پپتید BmK-2 در سلول‌های سرطانی، در ارتباط با فعال‌سازی بیان ژن p53، افزایش بیان ژن Bax و کاهش Bcl-2 بود (25). نتایج آنالیز Real Time PCR نشان داد که پپتید HL-10، سبب کاهش بیان ژن Bcl-2 و افزایش بیان ژن­های BIM و Cytc در سلول‌های سرطانی تیمار شده با پپتید نسبت به سلول‌های سرطانی بدون تیمار شد. مطالعات نشان داده است که ملیتین، به‌عنوان ترکیبی مهم در سم زنبور عسل، خاصیت ضدسرطانی خود را از طریق افزایش بیان ژن Bax و کاهش Bcl-2 بر دو رده سلولی سینه و کبد نشان داد (8). همچنین، مون و همکاران، اثر سم زنبور عسل را بر سلول‌های سرطانی لوسمی U937 بررسی کردند. نتایج بیانگر آن بود که زهر زنبور عسل سبب کاهش بیان ژن‌های ERK و Bcl-2 شده و بدین‌صورت سبب آغاز فرایند آپپتوز می‌شود (17). در گزارش قبلی­مان، دو پپتید HL-7 و HL-10، اثرات ضدتوموری خود را بر سلول‌های سرطانی کبدی HepG2 از طریق افزایش بیان TNF-α، و همچنین افزایش نسبت Bax به Bcl-2 نشان دادند )28). در مطالعه حاضر، خواص ضدسرطانی پپتید HL-10 از طریق فرآیند آپپتوز بررسی گردید. این ویژگی، بواسطه افزایش بیان ژن­های Bim و Cytc و همچنین کاهش بیان ژن Bcl-2 نشان داده شد. در شرایط برون­تنی و درون­تنی، تغییرات در بیان ژن­های مورد مطالعه در سلول‌های Hela تیمار شده با پپتید HL-10 نسبت به سلول‌های بدون تیمار معنادار بود (p<0.05). لی و همکاران (2015) دریافتند که تیمار موش­های balb/c حامل سرطان دهانه رحم با سم زنبور عسل سبب افزایش بیان گیرنده­های مرگ (DR, DR3, DR6, FAS) و همچنین پروتئین­های پروآپپتوزی (کاسپاز 3 و Bax)، و کاهش بیان Bcl-2 و NF-kB گردید. این نتایج بیانگر مهار رشد سلول‌های سرطانی دهانه رحم از طریق مهار مسیر NF-Kb بود. نتایج نشان داد که توکسین­های طبیعی سم زنبور عسل، به عنوان عوامل ضدسرطانی از طریق فعال­سازی مسیر بیرونی آپپتوز سبب مهار رشد سلول‌های سرطانی دهانه رحم شدند (12). در مطالعه­ی دیگری نشان داده شد که اسکولوپین 2 (Scolopin-2)، پپتید کاتیونی استخراجی از سم هزارپا، اثرات ضدسرطانی داشت. بررسی­های بیشتر در این رابطه نشان داد که این پپتید مسیر آپپتوز درونی وابسته به میتوکندری را در سلول‌های سرطانی Hela تحریک کرده و درصد زنده مانی سلولی را با روشی وابسته به دوز کاهش داد (32). نتایج تحقیقی نشان داد که پپتید لیکوزین-1 (Lycosin-1)، استخراجی از سم عنکبوت Lycosa singoriensis، با کانفورماسیون آلفا هلیکال خطی خود سبب مهار رشد سلول‌های توموری در شرایط درون‌تنی و برون‌تنی گردید. لیکوزین 1 با غلظت 40 میکرومولار بیش از 90 درصد سلول‌ها را در رده سلول سرطانی انسانی از جمله H1080، H1299، Hela و A549 مهار کرد. نتایج بیانگر ورود پپتید به درون سلول و فعال سازی مسیر آپپتوز درونی، افزایش بیان ژن P27 و متعاقبا مهار تکثیر سلولی بود (13). همچنین تحقیقات درون‌تنی در موش­های حامل زنوگرافت Hela، H1299 و A549 انجام شد. نتایج نشان داد که پپتید لیکوزین 1 سبب مهار رشد تومورهای کاشته شده در یک روش وابسته به دوز گردید. علاوه بر این سلول‌های بافت توموری تیمار شده با پپتید لیکوزین تغییرات موروفولوژیکی در ارتباط با آپپتوز را نشان دادند (13). در مطالعه حاضر، افزایش بیان ژن­های Bim و Cytc و کاهش بیان Bcl-2 می‌تواند بیانگر فعال سازی مسیر درونی آپپتوز در سلول‌های سرطانی دهانه رحم در شرایط درون­تنی و برون­تنی باشد. مطالعات در محیط تومور، بیانگر تغییر ترشح برخی از سایتوکاین­ها، تکثیر سلول‌های ایمنی و کاهش پاسخ ایمنی است (7). سایتوکاین­های ترشح شده از سلول‌های T کمکی نوع یک (Th1: type 1 T helper) (مانند IFN-γ)، سبب تقویت خواص ضدسرطانی شده و از طریق فعال­سازی لنفوسیت­های T کشنده (CTLs: cytotoxic T lymphocytes) مانع رشد سلول‌های سرطانی می‌شوند (19). مطالعات نشان داده است که برخلاف IFN-γ، مقدار اینترلوکین 4 (IL-4) مترشحه از سلول‌های Th2، به طور معناداری در طول رشد و گسترش سلول‌های سرطانی افزایش یافت (11). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که پس از گذشت 5 هفته تزریق سلول‌های سرطان دهانه رحم Hela و متعاقبا القای تومور در موش­های balb/c، افزایش معناداری در سطوح سرمی IFN-γ در موش­های سرطانی تیمار شده با پپتید HL-10 در مقایسه با موش­های سالم بدون تیمار دیده شد، در حالیکه کاهش قابل توجهی در سطوح سرمی IL-4 مشاهده گردید. در مطالعه ای، اثرات ضدسرطانی و تنظیم­کنندگی سیستم ایمنی پپتید LyeTxI-b، استخراجی از سم عنکبوت Lycosa erythrognatha، در مدل موش حامل زنوگرافت 4T1 بررسی گردید. نتایج نشان داد که تیمار با پپتید LyeTxI-b، بیان فاکتور پیش­التهابی IL-1β را در بافت تومور مهار کرد. از سوی دیگر، بیان فاکتور ضدالتهابی IL-10 در بافت توموری تیمار شده با پپتید افزایش پیدا کرد (1). در گزارشی، فعالیت ضدتوموری و اثرات تحریک کننده ایمنی الیگوپپتیدهای صدف خوراکی در موش­های balb/c حامل S180 بررسی گردید. نتایج مطالعه نشان داد که فعالیت سلول‌های کشنده طبیعی، تکثیر لنفوسیت­ها در طحال و میزان فاگوسیتوز ماکروفاژها در موش­های حامل S180 بطور قابل توجهی پس از تزریق هیدرولیزات­های صدف به موش­ها افزایش یافت (30). در مطالعه دیگر، توانایی سم عقرب Heteroctenus juneus بر تنظیم و تعدیل غلظت سایتوکاین­ها بررسی گردید. در این مطالعه، غلظت سایتوکاین­های بافت تومور پس از تیمار موش­های حامل سلول‌های F3II با دوزهای مختلف سم به مدت 24 ساعت بررسی گردید. نتایج نشان داد که سم عقرب قادر به کاهش غلظت IL-6، IFN- γ و IL-1β بود، در حالیکه سطوح IL-12 و TNF-α را بر اساس غلظت سم و طول دوره انکوباسیون آن افزایش داد (33). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که مقادیر IFN-γ، IL-6 و IL-1β در موش­های حامل سلول‌های Hela  تیمار شده با دو غلظت از پپتید HL-10 نسبت به موش­های حامل سلول‌های Hela بدون تیمار افزایش نشان داد، در حالیکه مقدار IL-4 کاهش معناداری نشان داد (05/0 p <). به نظر می­رسد که پپتید HL-10 سیستم ایمنی موش­های balb/c حامل سلول‌های سرطانی دهانه رحم تحریک کرده که منجر به فعالیت ضدتوموری آن می‌گردد. اثرات تحریک کنندگی پپتید HL-10 بر سیستم ایمنی، خاصیت درمانی پپتید را در بیماری سرطان نشان می‌دهد.

نتیجه­گیری

به طور کلی، اثر پپتید HL-10 بر بیان ژن‌‍‌های Bcl-2، Bim و Ctyc دخیل در تنظیم برنامه سلولی آپوپتوز مورد تایید قرار گرفت این گزارش، بیانگر دخیل بودن احتمالی پپتید HL-10 در تنظیم مسیرهای سیگنالینگ آپوپتوز سلولی و در‌نهایت مرگ سلولی است. یکی دیگر از عوامل موثر در اثرات ضدتوموری پپتید HL-10 را می‌توان به تنظیم سیستم ایمنی از طریق تغییر در سطوح سایتوکاین­ها نسبت داد. در آینده، مطالعات بیشتری در مورد آپوپتوز و ابعاد مولکولی آن و همچنین بررسی بیشتر در زمینه تعدیل سیستم ایمنی برای تایید خواص ضدسرطانی پپتید HL-10 مورد نیاز است.

منابع

1. Abdel-Salam M.A.L., Pinto B., Cassali G., Bueno L., Pegas G., Oliveira F., Silve I., Klein A., de Souza-Fagundes E.M., de Lima M.E., Carvalho-Tavares J., 2021. LyeTx I-b peptide attenuates tumor burden and metastasis in a mouse 4T1 breast cancer model. Antibiotics (Basel), 10(9):1136.

2. Biron C.A., Nguyen K.B., Pien G.C., Cousens L.P., Salazar-Mather T.P., 1999. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annual Review of Immunology, 17:189-220.

3. Gao L., Shan B.E., Chen J., Liu J.H., Song D.X., Zhu B.C., 2005. Effects of spider Macrothele raven venom on cell proliferation and cytotoxicity in HeLa cells. Acta Pharmacologica Sinica, 26:369-376. 

4. Gu Y., Liu S-L., Ju W-Z., Li C-Y., Cao P., 2013. Analgesic-antitumor peptide induces apoptosis and inhibits the proliferation of SW480 human colon cancer cells. Oncology letters, 5(2): 483-488.

5. Guo Y., Srinivasula S.M., Druilhe A., Fernandes-Alnemri T., Alnemri E.S., 2002. Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria. Journal of Biological Chemistry, 277(16): 13430-13437.

6. Gupta S.D., Gomes A., Debnath A., Saha A., Gomes A., 2010. Apoptosis induction in human leukemic cells by a novel protein Bengalin, isolated from Indian black scorpion venom: through mitochondrial pathway and inhibition of heat shock proteins. Chemico-Biological Interactions, 183:293-303.

7. Harirchi I., Karbaksh M., Kashefi A., Momtahen A.J., 2004. Breast cancer in Iran: results of a multi-center study. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 5(1):24-27.

8. Heidari Esfahani E., Doosti A., 2021. The Effects of melittin coding gene of bee venom on Bcl-2 and Bax genes expression in ACHN cells. Anatomical Sciences Journal, 18(2):85-91. 

9. Hoskin D.W., Ramamoorthy A., 2008. Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochimica et Biophysica Acta, 1778(2):357-375.

10. Jeyaprakash J., Hoy M.A., 2009. First divergence time estimate of spiders, scorpions, mites and ticks (subphylum: Chelicerata) inferred from mitochondrial phylogeny. Experimental and Applied Acarology, 47(1):1-18.

11. Kawakami K., Kawakami M., Husain S.R., Puri R.K., 2003. Effect of interleukin (IL)-4 cytotoxin on breast tumor growth after in-vivo gene transfer of IL-4 receptor alpha chain. Clinical Cancer Research, 9(5):1826-1836.

12. Lee H.L., Park S.H., Kim T.M., Jung Y.Y., Park M.H., Oh S.H., Yun H.S., Jun H.O., Yoo H.S., Han S.B., Lee U.S., Yoon J.H., Song M.J., Hong J.T., 2015. Bee venom inhibits growth of human cervical tumors in mice. Oncotarget, 6(9):7280-7292.

13. Liu Z., Deng M., Xiang J., Ma H., Hu W., Zhao Y., Li D.W.C., Liang S., 2012. A novel spider peptide toxin suppresses tumor growth through dual signaling pathways. Current Molecular Medicine, 12(10):1350-1360.

14. Meki A.R., Nassar A.Y., Rochat H., 1995. A bradykinin-potentiating peptide (peptide K12) isolated from the venom of Egyptian scorpion Buthus occitanus. Peptides, 16(8): 1359-1365.

15. Mikaelian A.G., Traboulay E., Zhang X.M., Yeritsyan E., Pedersen P.L., Hee Ko.Y., Matalka K.Z., 2020. Pleiotropic Anticancer properties of scorpion venom peptides: Rhopalurus princeps venom as an anticancer agent. Drug Design, Develop and Therapeutics, 14:881-893.

16. Miyashita M., Sakai A., Matsushita N., Hanai Y., Nakagawa Y., Miyagawa H., 2010. A novel amphipathic linear peptide with both insect toxicity and antimicrobial activity from the venom of the scorpion Isometrus maculatus. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 74(2): 364-369.

17. Moon D-O., Park S-Y., Heo M-S., Kim K-C., Park C., Ko W.S., 2006. Key regulators in bee venom-induced apoptosis are Bcl-2 and caspase-3 in human leukemic U937 cells through downregulation of ERK and Akt. International immunopharmacology, 6(12):1796-1807.

18. Ortiz E., Gurrola G.B., Schwartz E.F., Possani L.D., 2015. Scorpion venom components as potential candidates for drug development. Toxicon, 93:125-135.

19. Otsuki N., Dang N.H., Kumagai E., Kondo A., Iwata S., Morimoto C., 2010. Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects. Journal of Ethnopharmacology, 127(3):760-767.

20. Petricevich V.L., Lebrun I., 2005. Immunomodulatory effects of the Tityus serrulatus venom on murine macrophage functions in-vitro. Mediators of Inflammation, 1:39-49.

21. Pipelzadeh M.H., Dezfulian A.R., Jalali M.T., Mansori A.K. 2006. In vitro and in vivo studies on some toxic effects of the venom from Hemiscorpious lepturus scorpion. Toxicon, 48: 93-103.

22. Piperi C., Zisakis A.W., Lea R., Kalofoutis A., 2005. Role of cytokines in the regulation of glioma tumour growth and angiogenesis. American Journal of Immunology, 1:106-113.

23. Possani L.D., Becerril B., Delepierre M., Tytgat J., 1999. Scorpion toxins specific for Na+-channels. European Journal of Biochemistry, 264:287-300.

24. Riedl S., Zweytick D., Lohner K. 2011. Membrane-active host defense peptides-challenges and perspectives for the development of novel anticancer drugs. Chemistry and Physics of Lipids, 164(8):766-781.

25. Satitmanwiwat S., Changsangfa C., Khanuengthong A., Promthep K., Roytrakul S., Arpornsuwan T., 2016. The scorpion venom peptide BmKn2 induces apoptosis in cancerous but not in normal human oral cells. Biomedicine & Pharmacotherapy, 84: 1042-1050.

26. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., 2017. The inhibitory activity of HL-7 and HL-10 peptide from scorpion venom (Hemiscorpius lepturus) on angiotensin converting enzyme: Kinetic and docking study, Bioorganic Chemistry, 75:30-37.

27. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., 2019. Inhibitory effect of HL-7 and HL-10 peptides on human breast cancer cells by induction of the expression of antioxidant enzymes. International Journal of Peptide Science and Therapeutics, 25(40):1343-1341.

28. Setayesh-Mehr Z., Asoodeh A., Poorsargol M., 2021. Upregulation of Bax, TNF-α and down-regulation of Bcl-2 in liver cancer cells treated with HL-7 and HL-10 peptides. Biologia, 76:2735-2743.

29. Sun X., Xu Q., Zeng L., Xie L., Zhao Q., Xu H., Wang X., Jiang N., Fu P., Sang M., 2020. Resveratrol suppresses the growth and metastatic potential of cervical cancer by inhibiting STAT3Tyr705 phosphorylation. Cancer Medicine. 9(22):8685-8700.

30. Wang Y.K., He H.L., Wang G.F., Wu H., Zhou B.C., Chen X.L., Zhang Y.Z., 2010. Oyster (Crassostrea gigas) hydrolysates produced on a plant scale have antitumor activity and immunostimulating effects in BALB/c mice. Marine Drugs, 8(2):255-268.

31. Willems J., Moerman L., Bosteels S., Bruyneel E., Ryniers F.,  Verdonck F., 2004. Parabutoporin an antibiotic peptide from scorpion venom can both induce activation and inhibition of granulocyte cell functions. Peptides, 25(7):1079-1084.

32. Yan W., Lu J., Li G., Wei H., Ren W.H., 2018. Amidated Scolopin-2 inhibits proliferation and induces apoptosis of Hela cells in vitro and in vivo. Biotechnology and Applied Biochemistry, 65:672-679.

33. Yglesias-Rivera A., Sánchez-Rodríguez H., Soto-Febles C., Monzote L., 2023. Heteroctenus junceus scorpion venom modulates the concentration of pro-inflammatory cytokines in F3II tumor cells. Life (Basel), 13(12):2287.

34. Zeng X.C., Li W.X., Peng F., Zhu Z.H. 2000. Cloning and characterization of a novel cDNA sequence encoding the precursor of a novel venom peptide (BmKbpp) related to a bradykinin-potentiating peptide from Chinese scorpion Buthus martensii Karsch. IUBMB Life, 49(3):207-210.

35. Zeng X., Corzo G., Hahin R., 2005. Scorpion venom peptides without disulfide bridges. IUBMB Life, 57(1):13-21. 

 

 

 

127