Inhibition of Breast Cancer Cells by Microvesicles Containing Doxorubicin

Subject Areas : Journal of Animal Biology

Fatemeh Akhavan Attar ¹ ( Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran )
Shiva Irani ² ( Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran )
mana oloomi ³ ( Department of Molecular Biology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran )
Azam Bolhasani ⁴ ( Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran )
Loabat Geranpayeh ⁵ ( Department of 4th Surgery, Sina Hospital, Tehran, Iran )
Fatemeh Atyabi ⁶ ( Department of Pharmaceutical Nanotechnology, School of Pharmacy, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran )

Received: 2023-06-24 Accepted : 2023-10-15 Published : 2024-06-01

Keywords: Breast cancer, Mesenchymal stem cells, Microvesicle, Doxorubicin,

Abstract :

Breast cancer (BC) is the leading cause of cancer-related death among women in the whole world. Therefore, it is necessary to identify new methods for BC treatment. The purpose of this research is to investigate the effect of microvesicles containing doxorubicin (EV-Dox) on the MCF-7 cell line. Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from human adipose tissue. Microvesicles secreted from MSCs were extracted by ultracentrifugation. The shape and size of microvesicles were assessed by SEM and DLS, respectively. Doxorubicin (Dox) was loaded into microvesicles by sonication method. MCF-7 cells were treated with different concentrations of Dox (2.5, 5, 10, 20, and 40 µM) for 24 and 48 h and EV-Dox (0.625, 1.25, 2.5, 5, and 10 µM) for 48 and 72h. IC50 was determined based on MTT assay. The findings from SEM and DLS showed that the extracted microvesicles are spherical in shape, with a size of about 592.3 nm. MTT results showed that microvesicles aloan had no significant inhibitory effect on MCF-7 cells, and IC50 of Dox and EV-Dox were reported as 2.2 µM and 2.4 µM, respectively. EV-Dox can be a suitable strategy for treating BC because this study showed that the amount of cell death caused by this type of treatment is higher than the treatment with Dox. Also, the survival assay showed that the amount of apoptosis caused by EV-Dox (56.5%) was significantly higher than Dox (43%) ( p < 0.01).

 

References:

1. AbuHammad S., Zihlif M. 2013. Gene expression alterations in doxorubicin resistant MCF7 breast cancer cell line. Genomics, 101(4):213-220.
2. Bagheri E., Abnous K., Farzad S.A., Taghdisi S.M., Ramezani M., Alibolandi M. 2020. Targeted doxorubicin-loaded mesenchymal stem cells-derived exosomes as a versatile platform for fighting against colorectal cancer. Life Sciences, 261:118369.
3. Bai Y., Guo J., Liu Z., Li Y., Jin S., Wang T. 2020. The role of exosomes in the female reproductive system and breast cancers. OncoTargets and Therapy, 13:12567-12586.
4. Bigaard J., Stahlberg C., Jensen M.B., Ewertz M., Kroman N. 2012. Breast cancer incidence by estrogen receptor status in Denmark from 1996 to 2007. Breast Cancer Research and Treatment, 136:559-564.
5. Britt K.L., Cuzick J., Phillips K.A. 2020. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer, 20(8):417-436.
6. Bunnell B.A., Flaat M., Gagliardi C., Patel B., Ripoll C. 2008. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods, 45(2):115-120.
7. Burgess D.J., Doles, J., Zender L., Xue W., Ma B., McCombie W.R., Hemann M. T. 2008. Topoisomerase levels determine chemotherapy response in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(26):9053-9058.
8. Chen M., Li Y., Ma N., Zang J. 2022. Mesenchymal stem cell derived exosomes loaded with 5 Fu against cholangiocarcinoma in vitro. Molecular Medicine Reports, 25(6):1-6.
9. do Amaral J.B., Rezende-Teixeira P., Freitas V.M., Machado-Santelli G.M. 2011. MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer. Tissue Engineering Part C: Methods, 17(11):1097-1107.
10. Ghoncheh M., Pournamdar Z., Salehiniya H. 2016. Incidence and mortality and epidemiology of breast cancer in the world. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 17(S3):43-46.
11. Gomari H., Forouzandeh Moghadam M., Soleimani M., Ghavami M., Khodashenas S. 2019. Targeted delivery of doxorubicin to HER2 positive tumor models. International Journal of Nanomedicine, 14:7919.
12. Gong C., Tian J., Wang Z., Gao Y., Wu, X., Ding X., Gao S. 2019. Functional exosome-mediated co-delivery of doxorubicin and hydrophobically modified microRNA 159 for triple-negative breast cancer therapy. Journal of Nanobiotechnology, 17(1):1-18.
13. Hopkin K. 2016. Extracellular vesicles garner interest from academia and biotech. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(33):9126-9128.
14. Kalluri R., LeBleu V.S. 2020. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science, 367(6478):6977.
15. Katsuda T., Tsuchiya R., Kosaka N., Yoshioka Y., Takagaki K., Oki K., Ochiya T. 2013. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells secrete functional neprilysin-bound exosomes. Scientific Reports, 3(1):1197-1208.
16. Kibria G., Ramos E.K., Wan Y., Gius D. R., Liu H. 2018. Exosomes as a drug delivery system in cancer therapy: potential and challenges. Molecular Pharmaceutics, 15(9):3625-3633.
17. Lou G., Chen Z., Zheng M., Liu Y. 2017. Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a new therapeutic strategy for liver diseases. Experimental and Molecular Medicine, 49(6):e346-e346.
18. Łukasiewicz S., Czeczelewski M., Forma A., Baj J., Sitarz R., Stanisławek A. 2021. Breast cancer-epidemiology, risk factors, classification, prognostic markers, and current treatment strategies—an updated review. Cancers, 13(17):4287-4317.
19. Momenimovahed Z., Salehiniya H. 2019. Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world. Breast Cancer: Targets and Therapy, 11:151-164.
20. Salarpour S., Forootanfar H., Pournamdari M., Ahmadi-Zeidabadi M., Esmaeeli M., Pardakhty A. 2019. Paclitaxel incorporated exosomes derived from glioblastoma cells: comparative study of two loading techniques. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 27:533-539.
21. Samii A., Razmkhah F. 2020. Transformation of hematopoietic stem and progenitor cells by leukemia extracellular vesicles: a step toward leukemogenesis. Stem Cell Reviews and Reports, 16:1081-1091.
22. Skottvoll F.S., Berg H.E., Bjørseth K., Lund K., Roos N., Bekhradnia S., Wilson, S. R. 2018. Critical comparison of ultracentrifugation and a commercial kit for isolation of exosomes derived from glioblastoma and breast cancer cell lines. BioRxiv, doi.org/10.1101/274910.
23. Taylor C.W., Dalton W.S., Parrish P.R., Gleason M.C., Bellamy W.T., Thompson, F.H., Trent, J.M. 1991. Different mechanisms of decreased drug accumulation in doxorubicin and mitoxantrone resistant variants of the MCF7 human breast cancer cell line. British Journal of Cancer, 63(6):923-929.
24. Tkach M., Théry C. 2016. Communication by extracellular vesicles: where we are and where we need to go. Cell, 164(6):1226-1232.
25. Vakhshiteh F., Atyabi F., Ostad S.N. 2019. Mesenchymal stem cell exosomes: a two-edged sword in cancer therapy. International Journal of Nanomedicine, 14:2847-2859.
26. Venkitaraman A.R. 2019. How do mutations affecting the breast cancer genes BRCA1 and BRCA2 cause cancer susceptibility? DNA Repair, 81:102668.
27. Waks A.G., Winer E.P. 2019. Breast cancer treatment: a review. Jama, 321(3):288-300.
28. Weng Y., Sui Z., Shan Y., Hu Y., Chen, Y., Zhang L., Zhang Y. 2016. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. Analyst, 141(15):4640-4646.
29. Wu H., Chen L., Zhu F., Han X., Sun L., Chen K. 2019. The cytotoxicity effect of resveratrol: cell cycle arrest and induced apoptosis of breast cancer 4T1 cells. Toxins, 11(12):731.
30. Xie X., Lian S., Zhou Y., Li B., Lu Y., Yeung I., Jia L. 2021. Tumor-derived exosomes can specifically prevent cancer metastatic organotropism. Journal of Controlled Release, 331:404-415.
31. Zhu S., Li S., Yi M., Li N., Wu K. 2021. Roles of microvesicles in tumor progression and clinical applications. International Journal of Nanomedicine, 16:7071-7090.

Full-Text:



Inhibition of breast cancer cells by microvesicles containing doxorubicin

Fatemeh Akhavan Attar1, Shiva Irani*1, Mana Oloomi2, Azam Bolhasani3, Loabat Geranpayeh4, Fatemeh Atyabi5

1Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran, 2Department of Molecular Biology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran., 3Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran, 4Department of 4th Surgery, Sina Hospital, Tehran, Iran., 5Department of Pharmaceutical Nanotechnology, School of Pharmacy, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran

 

Abstract

Background and purpose: Breast cancer (BC) is the main leading cause of cancer-related death among women in the whole world. Therefore, there are new methods for treating BC. This research aims to investigate the effect of microvesicles containing doxorubicin (EV-Dox) on the MCF-7 cell line.

Methods: Mesenchymal stem cells (MSCs) were isolated from human adipose tissue. Microvesicles secreted from MSCs were extracted by ultracentrifugation. The shape and size of microvesicles were assessed by SEM and DLS, respectively. Doxorubicin (Dox) was loaded into microvesicles by sonication. MCF-7 cells were treated with different concentrations of Dox (2.5, 5, 10, 20, and 40 µM) for 24 and 48 h and EV-Dox (0.625, 1.25, 2.5, 5, and 10 µM) for 48 and 72h. IC50 was determined based on MTT assay results.

Result: The findings from SEM and DLS showed that the extracted microvesicles are spherical in shape, with a size of about 592.3 nm. Based on MTT results microvesicles had no significant inhibitory effect on MCF-7 cells, and IC50 values of Dox and EV-Dox were 2.2 µM and 2.4 µM, respectively.

Discussion: EV-Dox can be a suitable strategy for treating BC because this study showed that the amount of cell death caused by this type of treatment is higher than by Dox. Also, the live and dead assay showed that the rate of apoptosis caused by EV-Dox (56.5%) was significantly higher than Dox (43%) (p < 0.01). 

Key words: Breast cancer, Mesenchymal stem cells, Microvesicle, Doxorubicin

 

مهار سلول های سرطانی پستان توسط میکرووزیکول های حاوی دوکسوروبیسین

فاطمه اخوان عطار1، شیوا ایرانی1*، مانا علومی2، اعظم بولحسنی3، لعبت گرانپایه4، فاطمه اطیابی5

1گروه بیولوژی، دانشگاه علوم و تحقیقات، تهران، ایران، 2گروه بیولوژی مولکولی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران، 3گروه هپاتیت و ایدز، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران، 4گروه چهارم جراحی، بیمارستان سینا، تهران، ایران، 5گروه نانوتکنولوژی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

 

خلاصه

سابقه و هدف: سرطان پستان بیشترین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در میان زنان در کل جهان است.  بنابراین شناسایی روش های جدید برای درمان سرطان پستان ضروری می باشد. هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر میکرووزیکول های حاوی دوکسوروبیسین (EV-Dox) بر روی رده سلولی MCF-7 میباشد.

مواد و روش ها: سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی انسان جدا شدند. میکرووزیکول های مترشحه از سلول های بنیادی مزانشیمی با اولتراسانتریفوژ استخراج شدند. شکل و سایز میکرووزیکول ها به ترتیب با SEM  و DLS بررسی شدند. دوکسوروبیسین با روش سونیکاسیون در میکرووزیکول ها بارگذاری شد. سلول های سرطانی پستان رده MCF-7 با مقادیر 2.5، 5، 10، 20 و 40 میکرومولار از دوکسوروبیسین به مدت 24 و 48 ساعت و هم چنین با مقادیر 0.625، 1.25، 2.5، 5 و 10 میکرومولار از EV-Dox به مدت 48 و 72 ساعت تیمار شدند. IC50 براساس نتایج آزمایش MTT تعیین شد.

نتیجه: یافته های حاصل از SEM و DLS نشان دادند که میکرووزیکول های استخراج شده شکلی کروی با اندازه ای حدود 592.3 نانومتر داشتند. نتایج MTT نشان داد که میکرووزیکول ها به تنهایی فاقد هرگونه اثر مهاری معناداری بر روی سلول های MCF-7 هستند و میزان IC50 را برای دوکسوروبیسین و EV-Dox به ترتیب 2.2 و 2.4 میکرومولار گزارش کرد.

بحث: EV-Dox می تواند به عنوان یک داروی شیمی درمانی، استراتژی مناسبی برای درمان سرطان پستان باشد چرا که این مطالعه نشان داد میزان مرگ سلولی ایجاد شده ناشی از این نوع درمان بیشتر از درمان با دوکسوروبیسین است. همچنین سنجش زنده مانی نشان داد که میزان آپوپتوز ایجاد شده توسط EV-Dox (56.5 درصد) به میزان قابل توجهی بیشتراز Dox (43 درصد) می باشد (p < 0. 01).

واژگان کلیدی: سرطان پستان، سلول های بنیادی مزانشیمی،  میکرووزیکول، دوکسوروبیسین

 

مقدمه

شایع ترین سرطان تشخیص داده شده در میان زنان و دومین عامل مرگ پس از سرطان ریه، سرطان پستان می باشد (10). امروزه در کشور های پیشرفته میزان مرگ و میر ناشی از سرطان پستان به دلیل انجام غربالگری و در نتیجه تشخیص زود هنگام رو به کاهش است اما میزان بروز این نوع سرطان روز به روز در حال افزایش است (5).

عوامل ژنتیکی و غیر ژنتیکی در پیشرفت سرطان پستان نقش موثری دارند. از فاکتور های ژنتیکی می توان به جهش های بیماری زا در ژن هایی همچون BRCA1، BRCA2 وCHEK2 اشاره نمود (26) و از فاکتور های غیر ژنتیکی می توان به افزایش سن، عدم فعالیت فیزیکی، افزایش وزن و مصرف الکل اشاره نمود. طبق مطالعات مشخص شده که 30 درصد از موارد ابتلا به سرطان پستان به فاکتور های غیر ژنتیکی مربوط می باشد (19). 

زیر گروه های سرطان پستان از نظر هیستولوژیک با بیان یا عدم بیام گیرنده های هورمونی مثل گیرنده استروژن (ER)، گیرنده پروژسترون (PR) و گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی انسانی 2 (HER2) تقسیم بندی می شوند (4).

روش های درمانی برای سرطان پستان به ویژگی های بیولوژیکی خاص تومور بستگی دارد. بطور کلی قبل از درمان های هدفمند بسته به وضعیت هورمونی/ ErBb2 تومور، شیمی درمانی انجام می شود. یکی از آنتراسایکلین ها که برای درمان سرطان پستان بطور گسترده مورد استفاده قرار میگیرد، دوکسوروبیسین می باشد (18). دوکسوروبیسین با بکارگیری مکانیسم های متفاوتی باعث مرگ سلول های سرطانی میشود که یکی از کلیدی ترین مکانیسم ها مهار توپوایزومراز 2 ( TOP2A) می باشد (7).

با وجود اینکه یکی از حساس ترین تومور های جامد در پاسخ به داروهای شیمی درمانی سرطان پستان است، بیشتر تومورهایی که به دارو پاسخ داده اند پس از مدتی مجدد عود کرده و در مقابل طیف وسیعی از داروها مقاومت پیدا می کنند (27).

مطالعه ای علت اصلی شکست در درمان حدود 50 درصد از بیماران مبتلا به سرطان پستان را مقاومت آن ها به دوکسوروبیسین گزارش کرد (23).

بطور کلی دو نوع مقاومت در برابر شیمی درمانی وجود دارد که شامل مقاومت درونی (intrinsic) و مقاومت اکتسابی (acquired) می باشد. مقاومت درونی مقاومتی است که قبل از قرار گرفتن فرد در معرض یک داروی خاص وجود داشته است در حالیکه مقاومت اکتسابی پس از قرار گرفتن فرد در معرض دارو ایجاد می شود (1).

وزیکول های خارج سلولی (EV) ساختار های ناهمگن مشتق شده از سلول های مختلف هستند که امروزه می دانیم بازیگران مهمی در ارتباطات سلولی، هموستاز بافت و تمایز سلولی هستند (13). این ساختار ها قطری بین 100 تا 1000 نانومتر دارند (21) و اغلب حاوی پروتیین، RNA و DNA سلول های مبدا هستند (31).

EV ها حاوی دولایه لیپیدی هستند بنابراین می توان آن ها را به عنوان لیپوزوم های فیزیولوژیکی در نظرگرفت (24). از این رو از این ساختار ها می توان به عنوان سیستم های طبیعی برای انتقال ژن یا دارو استفاده نمود.

هدف اصلی این مطالعه بررسی اثر میکرووزیکول های خارج سلولی نشات گرفته از سلول های بنیادی مزانشیمی که حاوی دوکسوروبیسین (EV-Dox) می باشند بر روی رده MCF-7 از سلول های سرطانی پستان می باشد.  

 

مواد و روش ها

این مطالعه در کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات با شماره IR.IAU.SRB.REC.1401.362 تایید و ثبت شده است.

کشت سلولی

در این مطالعه تجربی از رده سلولي سرطان پستان MCF-7  استفاده شد كه از بانك سلولي انستیتو پاستورايران تهيه شدند. سلولها در محيط کشت DMEM-F12 (شرکت Bio-Idea، کشور ایران)  حاوي 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و يك درصد آنتي بيوتيك پنيسيلين – استرپتومايسين در دماي 37 درجه سانتيگراد، و 5 درصد CO2 كشت داده شدند (9).

برای  جداسازی سلول های بنیادی مزانشیمی از بافت چربی، از قیچی و تیغ برای حذف بافت همبند استفاده شد.  0.2 میلی گرم بر میلی لیتر کلاژناز به نمونه اضافه شد و به مدت 40 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس 5 میلی لیتر محیط کشت اضافه شده و محلول به مدت 15 دقیقه در 427 g سانتریفوژ شد. رسوب به دست آمده در فلاسک کشت سلولی 25 سانتی متر مربع حاوی محیط کشت DMEM-F12 به صورت10 درصد FBS  و يك درصد آنتي بيوتيك پنيسيلين – استرپتومايسين کشت داده شد. پس از گذشت 4 روز، سلول های بنیادی مزانشیمی با ظاهر دوکی شکل و تراکم حدود 60 درصد ظاهر شدند (6). جهت بررسی شاخص های سطحی ، فلوسایتومتری با دستگاه BD FACS Calibur (شرکت BD biosciences، آمریکا) برای آنتی بادی های CD34 و CD73 (شرکت BioLegend، آمریکا) انجام شد.

جداسازی میکرووزیکول

برای جداسازی میکرووزیکول ها، زمانیکه تراکم سلول های بنیادی مزانشیمی به 80-90 درصد رسیدند، محیط کشت DMEM-F12 تازه اضافه شد و به مدت 48 ساعت در انکوباتور باقی ماند. روش اولتراسانتریفوژ برای جداسازی میکرووزیکول ها استفاده شد. در این روش محیط رویی سلول ها جمع آوری شده ابتدا به منظور حذف سلول های مرده به مدت 30 دقیقه با دور 2000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد و رسوب سلولی خارج گردید. در مرحله بعد به مدت 60 دقیقه با دور 100000 g در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد و مایع رویی خارج شده و به پلت، 500 میکرولیتر بافر فسفات سالین (PBS) اضافه گردید (15).

شناسایی میکرووزیکول ها

جهت بررسی اندازه میکرووزیکول ها با سنجش تفرق دینامیکی نور (DLS) ، به 50 میکرولیتر از محلول میکرووزیکول، حدود 450 میکرولیتر PBS افزوده شد. پس از سونیکاسیون به مدت 20 دقیقه، نمونه در دستگاه قرار داده شد و نتیجه با استفاده از نرم افزار Nano Zetasizer (شرکت Malvern Instrument، انگلیس) مورد بررسی قرار گرفت.

برای بررسی شکل و ویژگی های مورفولوژیکی میکرووزیکول ها، 5 میکرولیتر از محلول میکرووزیکول بر روی لام ریخته شده و در دمای اتاق خشک گردید. سپس با میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)  مورد مطالعه قرار گرفت (3).

کیت سنجش پروتیین بیسینکنینیک اسید (BCA) (شرکت Thermo Fischer Scientific، آمریکا) برای اندازه گیری غلظت میکرووزیکول ها مورد استفاده قرار گرفت. نمونه به میزان 50 میکرولیتر و ولتاژ شتاب دهنده به میزان 25 کیلو ولت بود.

بارگذاری دوکسوروبیسین در میکرووزیکول ها

مقدار 1 میلی لیتر از محلول میکرووزیکول با غلظت 0.385 میلی گرم بر میلی لیتر با 2 میلی لیتر دوکسوروبیسین (Ebedoxo 50mg/25 ml) با غلظت های  0.625، 1.25، 2.5، 5 و 10 میکرومولار ترکیب شد و سپس سونیکاسیون با استفاده از یک پروب اولترا سونیک ( شرکت BANDELIN SONOPULS GM3200، آلمان) بصورت 6 چرخه کامل، فرکانس 20 کیلوهرتز، دامنه 20 درصد و 30 ثانیه روشن و خاموش با استراحت 2 دقیقه بین هر چرخه در حمام یخ انجام شد. برای بازیابی غشاء میکرووزیکول ها، محلول به مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در مرحله آخر دوکسوروبیسین آزاد با استفاده از سانتریفوژ با دور 14000 g به مدت 30 دقیقه جدا شد (20).

 

سنجش سمیت

برای بررسی اثر سمیت دوکسوروبیسین و میکرووزیکول های حاوی دوکسوروبیسین (EV-Dox) بر روی رده سلولی MCF-7 از روش MTT استفاده شد. به این منظور به هر چاهک از پلیت 96 خانه 5000 سلول اضافه شد و به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 قرار داده شد تا سلول ها به کف چاهک ها بچسبند. سپس سلول ها به مدت 24 و 48 ساعت توسط غلظت های مختلف دوکسوروبیسین 2.5، 5، 10، 20 و40 میکرومولار و به مدت 48 و 72 ساعت توسط غلظت های مختلف EV-Dox 0.625، 1.25، 2.5، 5 و 10 میکرومولار تیمار شدند. 

برای هر غلظت سه تکرار گذاشته شد و سلول های MCF-7 بدون تیمار به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. پس از گذشت زمان های ذکر شده 5 میکرولیتر از محلول MTT (با غلظت 5 میلی گرم بر میلی لیتر در PBS) (شرکت Sigma، آمریکا) به هر چاهک اضافه شد و بعد از 4 ساعت محتویات چاهک ها تخلیه شده و به هر یک 100 میکرولیتر از محلول آلی دی متیل سولفوکسید (DMSO) (شرکت Sigma، آمریکا) اضافه شد. جذب هر چاهک در طول موج 570 نانومتر توسط دستگاه خوانش الایزا (شرکت Bio Tek، آمریکا) خوانده شد (19).

سنجش زنده مانی سلول ها

برای رنگ آمیزی با آکریدین اورنج (AO) 5000 سلول MCF-7 در چاهک های پلیت 96 خانه به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 کشت داده شدند. سپس با غلظت های IC50 از دوکسوروبیسین و EV-Dox تیمار شدند. سلول ها در مرحله بعد با PBS شسته و با پارافرمالدهید 4 درصد تثبیت شدند، هسته ها با 50 میکرولیتر AO (شرکت Sigma، آمریکا) رنگ آمیزی شدند و از میکروسکوپ فلورسنت ( BLACK.L 5000MET) برای بررسی سلول های مرده و زنده استفاده شد (29).

 

 

آنالیز آماری

برای انجام آنالیز واریانس یک طرفه (one-way ANOVA) و آزمون T (t-test) از نسخه 8 نرم افزار Graph Pad Prism استفاده شد.

یافته ها

شاخص های سطحی

فلوسایتومتری جهت تایید این که سلول های تخلیص شده متعلق به رده سلول های بنیادی مزانشیمی است، انجام شد. یافته ها نشان داد که از نظر شاخص CD73 (95 درصد) مثبت بود و از نظر مارکر CD34 (0.74 درصد) بیانی مشاهده نشد که نشان میدهد سلول های استخراج شده از بافت چربی، سلول های بنیادی مزانشیمی هستند.

توصیف میکرووزیکول ها

میکرووزیکول های مشتق شده از سلول های بنیادی مزانشیمی شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) شکل کروی میکرووزیکول ها را نشان دادند (شکل 1الف) و اندازه متوسط میکرووزیکول ها با استفاده از داده های حاصل از سنجش تفرق دینامیکی نور، 592.3 نانومتر گزارش شد (شکل 1ب).

 

شکل 1: خصوصیات میکرووزیکول ها. (الف): میکروگراف SEM میکرووزیکول ها، نوار مقیاس = 1 میکرومتر. (ب): توزیع اندازه براساس تعداد میکرووزیکول های مترشحه از سلول های بنیادی

سنجش سمیت

شکل 2 میزان زنده مانی سلول های MCF-7 تحت درمان با دوکسوروبیسین پس از 24 و 48 ساعت و هم چنین تحت درمان باEV-Dox  را نشان میدهد. دوکسوروبیسین در مقایسه با گروه کنترل میزان زنده مانی سلول ها را به شکل معناداری (p < 0.001) کاهش داد. اثر مهاری دوکسوروبیسین بر سلول های MCF-7 با میزان زنده مانی 27.5 درصد در مقایسه با گروه کنترل در 48 ساعت قابل توجه بود (p < 0.0001). نتایج نشان داد که میکرووزیکول های حاصل از سلول های بنیادی مزانشیمی اثر مهاری بر روی زنده مانی سلول ها نداشتند (p = 0.096). در حالیکه EV-Dox اثر مهاری قابل توجهی به شیوه وابسته به غلظت بر سلول های MCF-7 داشت (p < 0.001). به علاوه سنجش MTT نشان داد که این اثر مهاری تا 72 ساعت در این گروه از سلول ها پایدار است. میزان IC50 برای دوکسوروبیسین و EV-Dox به ترتیب 2.2 و 2.4 میکرومولار گزارش شد (جدول 1).

 

شکل 2: بقای سلولی. (الف) بقای سلول های MCF-7 پس از کشت با دوکسوروبیسین (Dox) به مدت 24 ساعت. (ب) 48 ساعت. (ج) بقای سلول های MCF-7 پس از کشت با EV-Dox و میکرووزیکول ها به تنهایی (EV) به مدت 48 ساعت. (د) 72 ساعت.

جدول 1: مقادیر IC50 دوکسوروبیسین و EV-Dox

نوع سلول سرطانی پستان	IC50 - دوکسوروبیسین	EV-Dox-IC50
MCF-7	2.2 میکرومولار	2.4 میکرومولار

 

سنجش زنده مانی

سلول های MCF-7 تحت تاثیر غلظت IC50 از دوکسوروبیسین و EV-Dox به منظور ارزیابی اثر ضد سرطانی قرار گرفتند. این سنجش نشان داد که میزان آپوپتوز ایجاد شده توسط EV-Dox (56.5 درصد) به میزان قابل توجهی بیشتراز Dox (43 درصد) می باشد (p < 0. 01) (شکل 3).

 

شکل3: رنگ آمیزی آکریدین اورنج (AO). فلورسانس سبز و قرمز به ترتیب سلول های زنده و مرده را نشان می دهند. تصاویر از راست به چپ به ترتیب، سلول های MCF-7 بدون تیمار، تیمار با دوکسوروبیسین، تیمار با EV-Dox، نوار مقیاس = 50 میکرومتر، بزرگنمایی، 40X.

 

بحث

دوکسوروبیسین که اغلب به عنوان یک داروی ضد سرطان مورد استفاده قرار میگیرد معایب قابل توجهی از جمله سمیت قلبی و سیستمیک شدید دارد. به همین خاطر کپسوله کردن دوکسوروبیسین در ساختار هایی در مقیاس نانو جهت تحویل دارو می تواند فارماکوکینتیک و توزیع زیستی مطلوب را در حالیکه میزان سمیت را کاهش میدهد، فراهم کند (2). 

اخیرا میکرووزیکول های ترشح شده از سلول های مختلف برای انتقال مولکول های بیولوژی از جمله lncRNA، siRNA و پروتیین ها و هم چنین دارو هایی مثل تاکسول و دوکسوروبیسین مورد توجه قرار گرفته اند (12). 

در میان انواع میکرووزیکول ها، میکرووزیکول های نشات گرفته از سلول های بنیادی مزانشیمی سازگاری زیستی مطلوب و هم چنین تحریک ایمنی کمی را ایجاد می کنند. همین امر این مجموعه از میکرووزیکول ها  را به حامل های مناسب برای انتقال دارو تبدیل می کند (14).

نکته قابل توجه این است که بطور کلی در مقایسه با سلول ها، میکرووزیکول ها از لحاظ عملکرد و ساختار از ثبات بیشتری برخوردار هستند (17) و به عنوان یک سیستم جدید به منظور غلبه بر مشکلات و محدودیت های استفاده از سلول های درمانی در نظر گرفته می شوند (25).

روش های متعددی برای جداسازی میکرووزیکول ها وجود دارد که از آن جمله می توان به روش اولتراسانتریفوژ و جداسازی با استفاده از پلی اتیلن گلیکول (PEG) اشاره کرد. هر یک از این روش ها از مزایا و معایبی برخوردار هستند. در این میان از مزایای روش اولتراسانتریفوژ می توان به ظرفیت و خلوص بالا برای میکرووزیکول ها و پایین بودن میزان آلودگی اشاره کرد در حالیکه سرعت بالای سانتریفوژ می تواند به ساختار میکرووزیکول آسیب بزند (22) درمقایسه در روش PEG هیچ نیازی به تجهیزات ویژه نیست اما احتمال رسوب پروتیین به همراه میکرووزیکول ها وجود دارد (28). در پژوهش انجام شده از روش اولتراسانتیریفوژ استفاده شد و نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره نشان داد که میکرووزیکول ها تخلیص شده شکل کروی خود را حفظ کرده اند و آسیبی به آن ها وارد نشده است. 

به این منظور در این مطالعه، میکرووزیکول های حاصل از سلول های بنیادی مزانشیمی را با استفاده از روش اولتراسانتریفوژ تخلیص کرده و با تکنیک های DLS و SEM تایید شدند. میکرووزیکول های مشتق شده از سلول های بنیادی مزانشیمی اندازه 592 نانومتر را با توزیع اندازه باریک نشان دادند. 

میکرووزیکول های نشات گرفته از سلول های بنیادی مزانشیمی می توانند رشد سلول های سرطانی را مهار یا تقویت کنند و نتایج علکردی مشابهی با خود سلول های بنیادی مزانشیمی داشته باشند (16). نتایج سنجش MTT در مطالعه ما نشان داد که این میکرووزیکول ها اثر قابل توجهی بر روی سلول های MCF-7 نداشته و در نتیجه می توانند به عنوان حامل دارویی به کار گرفته شوند.  

یکی از مناسب ترین روش ها جهت بارگذاری دارو در میکرووزیکول ها روش سونیکاسیون می باشد (8). از این روش در مطالعات قبلی برای بارگذاری دارو هایی هم چون کورکومین، کروسین (30) و هم چنین دوکسوروبیسین (3) استفاده شده است. در این مطالعه نیز از EV-Dox برای درمان سلول های سرطانی پستان استفاده شد.

مطالعه ای که توسط گوماری و همکارانش انجام شد نیز از اگزوزوم های نشات گرفته از سلول های بنیادی مزانشیمی برای بارگذاری داروی دوکسوروبیسین استفاده کردند و نتایج حاصل از MTT آن ها نشان داد که سمیت سلولی اگزوزوم های بارگذاری شده با دوکسوروبیسین نسبت به دوکسوروبیسین در غلظت های برابر  برای رده سلولی TUBE در 72 ساعت بیشتر بود (P < 0.05) در حالیکه در 24 و 48 ساعت تفاوت معناداری دیده نشد (11).

نتایج این تحقیق نشان داد که زنده مانی سلول های MCF-7 در پاسخ به دوکسوروبیسین در 24 و 48 ساعت و  EV-Dox در 48 و 72 ساعت به شکل وابسته به دوز کاهش پیدا کرد. مشاهدات مورفولوژیکی در سنجش زنده مانی رنگ قرمز سلول ها را نشان داد که نمایانگر ویژگی های آپوپتوز در سلول های سرطانی پستان درمان شده با EV-Dox بود این امر نشان میدهد که میکرووزیکول ها به شکل مناسبی وارد سلول ها شده و باعث مرگ سلولی شده اند.

 

نتیجه گیری

میکرووزیکول های حاصل از سلول های بنیادی مزانشیمی در بسیاری از شرایط آزمایشگاهی مورد مطالعه قرار گرفته اند. می توان از آن ها به عنوان بستری برای انتقال انواع دارو و یا ژن های مختلف به سلول های هدف یا بافت مورد نظر استفاده نمود. در مطالعه حاضر می توانیم به این نتیجه برسیم که میکرووزیکول ها می توانند برای تحویل دوکسوروبیسین به سلول های سرطانی پستان مورد استفاده قرار گیرند و میزان آپوپتوز بالاتری را نسبت به دوکسوروبیسین ایجاد کنند.

منابع        

1.       AbuHammad, S., & Zihlif, M. 2013. Gene expression alterations in doxorubicin resistant MCF7 breast cancer cell line. Genomics, 101(4), 213-220.

2.       Bagheri, E., Abnous, K., Farzad, S. A., Taghdisi, S. M., Ramezani, M., & Alibolandi, M. 2020. Targeted doxorubicin-loaded mesenchymal stem cells-derived exosomes as a versatile platform for fighting against colorectal cancer. Life Sciences, 261, 118369. 

3.       Bai, Y., Guo, J., Liu, Z., Li, Y., Jin, S., & Wang, T. 2020. The role of exosomes in the female reproductive system and breast cancers. OncoTargets and therapy, 12567-12586.

4.       Bigaard, J., Stahlberg, C., Jensen, M. B., Ewertz, M., & Kroman, N. 2012. Breast cancer incidence by estrogen receptor status in Denmark from 1996 to 2007. Breast cancer research and treatment, 136, 559-564.

5.       Britt, K. L., Cuzick, J., & Phillips, K. A. 2020. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer, 20(8), 417-436.

6.       Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., & Ripoll, C. 2008. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods, 45(2), 115-120. 

7.       Burgess, D. J., Doles, J., Zender, L., Xue, W., Ma, B., McCombie, W. R., ... & Hemann, M. T. 2008. Topoisomerase levels determine chemotherapy response in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(26), 9053-9058.

8.       Chen, M., Li, Y., Ma, N., & Zang, J. 2022. Mesenchymal stem cell‑derived exosomes loaded with 5‑Fu against cholangiocarcinoma in vitro. Molecular Medicine Reports, 25(6), 1-6.

9.       do Amaral, J. B., Rezende-Teixeira, P., Freitas, V. M., & Machado-Santelli, G. M. 2011. MCF-7 cells as a three-dimensional model for the study of human breast cancer. Tissue Engineering Part C: Methods, 17(11), 1097-1107.

10.       Ghoncheh, M., Pournamdar, Z., & Salehiniya, H. 2016. Incidence and mortality and epidemiology of breast cancer in the world. Asian Pacific journal of cancer prevention, 17(S3), 43-46.

11.       Gomari, H., Forouzandeh Moghadam, M., Soleimani, M., Ghavami, M., & Khodashenas, S. 2019. Targeted delivery of doxorubicin to HER2 positive tumor models. International journal of nanomedicine, 5679-5690.

12.       Gong, C., Tian, J., Wang, Z., Gao, Y., Wu, X., Ding, X., ... & Gao, S. 2019. Functional exosome-mediated co-delivery of doxorubicin and hydrophobically modified microRNA 159 for triple-negative breast cancer therapy. Journal of nanobiotechnology, 17(1), 1-18.

13.       Hopkin, K. 2016. Extracellular vesicles garner interest from academia and biotech. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(33), 9126-9128.

14.       Kalluri, R., & LeBleu, V. S. 2020. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science, 367(6478), eaau6977.

15.       Katsuda, T., Tsuchiya, R., Kosaka, N., Yoshioka, Y., Takagaki, K., Oki, K., ... & Ochiya, T. 2013. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells secrete functional neprilysin-bound exosomes. Scientific reports, 3(1), 1197.

16.       Kibria, G., Ramos, E. K., Wan, Y., Gius, D. R., & Liu, H. 2018. Exosomes as a drug delivery system in cancer therapy: potential and challenges. Molecular Pharmaceutics, 15(9), 3625-3633.

17.       Lou, G., Chen, Z., Zheng, M., & Liu, Y. 2017. Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a new therapeutic strategy for liver diseases. Experimental & molecular medicine, 49(6), e346-e346.

18.       Łukasiewicz, S., Czeczelewski, M., Forma, A., Baj, J., Sitarz, R., & Stanisławek, A. 2021. Breast cancer—epidemiology, risk factors, classification, prognostic markers, and current treatment strategies—an updated review. Cancers, 13(17), 4287.

19.       Momenimovahed, Z., & Salehiniya, H. 2019. Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world. Breast Cancer: Targets and Therapy, 151-164.

20.       Salarpour, S., Forootanfar, H., Pournamdari, M., Ahmadi-Zeidabadi, M., Esmaeeli, M., & Pardakhty, A. 2019. Paclitaxel incorporated exosomes derived from glioblastoma cells: comparative study of two loading techniques. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 27, 533-539.

21.       Samii, A., & Razmkhah, F. 2020. Transformation of hematopoietic stem and progenitor cells by leukemia extracellular vesicles: a step toward leukemogenesis. Stem Cell Reviews and Reports, 16, 1081-1091.

22.       Skottvoll, F. S., Berg, H. E., Bjørseth, K., Lund, K., Roos, N., Bekhradnia, S., ... & Wilson, S. R. 2018. Critical comparison of ultracentrifugation and a commercial kit for isolation of exosomes derived from glioblastoma and breast cancer cell lines. BioRxiv, 274910.

23.       Taylor, C. W., Dalton, W. S., Parrish, P. R., Gleason, M. C., Bellamy, W. T., Thompson, F. H., ... & Trent, J. M. 1991. Different mechanisms of decreased drug accumulation in doxorubicin and mitoxantrone resistant variants of the MCF7 human breast cancer cell line. British journal of cancer, 63(6), 923-929.

24.       Tkach, M., & Théry, C. 2016. Communication by extracellular vesicles: where we are and where we need to go. Cell, 164(6), 1226-1232.

25.       Vakhshiteh, F., Atyabi, F., & Ostad, S. N. 2019. Mesenchymal stem cell exosomes: a two-edged sword in cancer therapy. International journal of nanomedicine, 2847-2859.

26.       Venkitaraman, A. R. 2019. How do mutations affecting the breast cancer genes BRCA1 and BRCA2 cause cancer susceptibility?. DNA repair, 81, 102668.

27.       Waks, A. G., & Winer, E. P. 2019. Breast cancer treatment: a review. Jama, 321(3), 288-300.

28.       Weng, Y., Sui, Z., Shan, Y., Hu, Y., Chen, Y., Zhang, L., & Zhang, Y. (2016). Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. Analyst, 141(15), 4640-4646.

29.       Wu, H., Chen, L., Zhu, F., Han, X., Sun, L., & Chen, K. 2019. The cytotoxicity effect of resveratrol: cell cycle arrest and induced apoptosis of breast cancer 4T1 cells. Toxins, 11(12), 731.

30.       Xie, X., Lian, S., Zhou, Y., Li, B., Lu, Y., Yeung, I., & Jia, L. 2021. Tumor-derived exosomes can specifically prevent cancer metastatic organotropism. Journal of Controlled Release, 331, 404-415.

31.       Zhu, S., Li, S., Yi, M., Li, N., & Wu, K. 2021. Roles of microvesicles in tumor progression and clinical applications. International Journal of Nanomedicine, 7071-7090.

 

---