بررسی میزان آلودگی به بروسلوزیس در نمونه خون های افراد سرولوژی مثبت بروسلا در شهرستان های شهرکرد و اصفهان به روش Real Time PCR
الموضوعات :حسین خدابنده شهرکی 1 , نازیلا ارباب سلیمانی 2
1 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
2 - گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران
الکلمات المفتاحية: بروسلا آبورتوس, بروسلا ملی تنسیس, سرولوژی, Real Time PCR,
ملخص المقالة :
چکیده بیماري بروسلوز جزء شایع ترین بیماري هاي باکتریایی مشترك انسان و دام است که در انسان ایجاد تب مالت نموده و خسارات اقتصادي بالایی را در حیوانات اهلی به بار می آورد. در این تحقیق با استفاده از روش Real Time PCR به بررسی فراوانی گونه های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس در سرم افراد سرولوژی مثبت پرداختیم. نمونه های سرمی 30 نفر از افرادی که تست رایت آن ها مثبت شده بود (بالای 160/1)، از آزمایشگاهای تشخیص طبی شهرستان های شهرکرد و اصفهان جمع آوری و DNA ِنمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA سیناژن استخراج شد. به منظور تشخیص جنس و گونه های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس واکنش Real Time PCR بر روی نمونه ها انجام شد. در این بررسی تمام 30 نمونه مورد بررسی با روش Real time PCR تأیید شدند. در جنس مونث پس از انجام آزمون Real Time PCR فقط باکتری بروسلا آبورتوس تشخیص داده شد در حالی که در جنس مذکر 22 مورد (33/73درصد) بروسلا آبورتوس و 3 مورد (10درصد) بروسلا ملی تنسیس شناسایی گردید. از 7 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی زیر 30 سال، 6 مورد (7/85درصد) بروسلا آبورتوس و 1 مورد (3/14درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. در صورتی که از 23 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی بالای 30 سال، 21 مورد (3/91درصد) بروسلا آبورتوس و 2 مورد (7/8درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. در سال هاي اخير روش هاي مولكولي زيادي براي تشخيص اين باكتري مورد استفاده قرار گرفته اند. روش Real Time PCR از اين نظر كه نيازمند صرف زمان كم و داراي حساسيت و اختصاصيت بالايي مي باشد، در تشخيص اين بيماري بسيار مفيد مي باشد.
1. Franco MP, Mulder M, Gilman RH, Smits HL. (2007). Human brucellosis. Lancet infect dis. 7(12): 775-786.
2. جاوتز ا، ملنیک ج، آدلبرگ ا. (1378)، هموفیلوس، بوردتلا، بروسلا، میکروبیولوژی جاوتز، نوروزی ج، چاپ اول، مؤسسه فرهنگی انتشاراتی حیان، تهران، 300-303.
3. Ko J, Splitter GA. (2003). Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans.Clin Microbiol Rev. 16(1): 65-78.
4. Pakzad I, Rezaee A, Emaneini M, Hosseini AZ, Tabbaraee B, Taherikalani M. (2009). Expression of Human Serum Albumin - L 7/L 12 (Brucella abortus Ribosomal Protein) Fusion Protein in Saccharomyces cerevisiae. Pol J Microbiol. 58(2): 99-104.
5. Probert WS, Schrader KN, Khuong NY, Bystrom SL, Grave MH. (2003).
Real-Time Multiplex PCR Assay for Detection of Brucella spp, B. abortus, and B. melitensiss. J Cn Microbiol. 42(3): 1290-1293.
6. ناصري ز، یوسف علیخانی م، هاشمی ح، عربستانی م. (1393). تعیین گونه هاي بروسلا ایزوله شده از نمونه هاي خون بیماران مشکوك به بروسلوزیس با روش .PCR مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراك. 17(5): 52-59.
7. جعفرپور م، کترا ابراهیمی ن، ناظمی ع، آسمار م، خاتمی نژاد م. (1389). مقایسه آزمایش های سرولوژیک (رزبنگال، رایت لوله های و کومبس رایت) و مولکولی (PCR) در تشخیص بروسلوز گوسفند و بز. پاتوبیولوژی مقایسه ای، علمی پژوهشی. 7(4):337-342.
8. Sohrabi M, Mohabati Mobarez A, Behmanesh M, Khoramabadi N,
Hosseini Dous R. (2011). Evaluation of a new set of Real-Time PCR for Brucella detection within human and animal samples. J Pharma Health Sci. 1(2): 14-17.
9. دوستی ع، کارگر م، قربانی دالینی ص، سرشار م. (1391). مبانی Real Time PCR و تکنیک FRET در تشخیص بیماری های عفونی. دنیای میکروب ها. 4 (14): 41-45.
10. Hinic V, Brodard I, Thomann A, Cvetnic Z, Makaya PV, Frey J, Abril C. (2008). Novel identification and differentiation of Brucella melitensis, B. abortus, B. suis,
B. ovis, B. canis, and B. neotomae suitable for both conventional and Real-time PCR systems. J Microbiol Methods. 75(2): 375–378.
11. زینلی م، شیرزادی م ر. (1387). عوامل مؤثر در افزایش و کاهش بروز بروسلوز (تب مالت) در انسان در کشور از سال 65 لغایت 85، پانزدهمین کنگره دامپزشکی ایران، تهران، جامعه دامپزشکان ایران. سال1387، 200-201
12. Ghasemi B, Mohammadian B, Majidpour M. (2004). Epidemiology of human and animal brucellosis in Kurdistan province in 1997-2001. Kurdistan Uni Med Sci. 8 (30)): 23-32.
13. زهرايي صالحي ت، آقايي پور خ ، عالميان س، اكبري الف ، اسماعيل زاد م، نيري فسايي ب، صفويه ص ، اعتمادي الف. (1392). پنجمین کنگره ی بروسلوزیز بین المللی ایرانیان. سال1392، 31-29.
14. محمد زاده ر، یوسف زاده ر. (1390). تشخیص بروسلا ملی تنسیس به روش Real Time PCR. اولین کنگره بین المللی باکتریولوژی. دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تبریز. سال1390، 2459.
15. دل بیشه م، ناظمی ع، جعفر پور م. (1391). راه اندازی روش حساس و اختصاصیReal-Time PCR به منظور تشخیص گونه های بروسلا. مجله تحقیقات آزمایشگاهی دامپزشکی. 4 (1): 110.
16. Newby DT, Hadfield TL, Roberto FF. (2003). Real-Time PCR Detection of Brucella abortus: a Comparative Study of SYBR Green I, Exonuclease, and Hybridization Probe Assays. Appl Environ Microbiol. 69(8): 4753-4759.
17. Jolie CS, Mark SK, Michael RS, Adrian MW. (2007). Multiplex assay based on single-nucleotide polymorphisms for rapid identification of brucella isolates at the species level. Appl Environ Microbiol. 73(22): 7331–7337.
18. مالک نژاد پ، پیری دوگاهه ه، امیر زرگر ع، جعفری س، فتح اله زاده ب. (1387). تشخیص بروسلوز با استفاده از محیط کشت خون BACTEC و تائید آن با PCR. مجله تحقیقات دامپزشکی. 62(4): 83-86.
19. Hinić V, Brodard I, Thomann A, Holub M, Miserez R, Abril C. (2009). IS711-based real-time PCR assay as a tool for detection of Brucella spp. in wild boars and comparison with bacterial isolation and serology. Bio Med Central. 5(22): 1-8.
20. Bertu WJ, Dapar M, Gusi AM, Ngulukun SS, Leo S, Jwander LD. (2010). Prevalence of brucella antibodies in marketed milk in Jos and environs. Afr J Food Sci. 4(2): 62-64
رهیاف های نوین در علوم سلولی و مولکولی JNACMS دوره 2 شماره 2 تابستان 1403 Journal homepage: https://sanad.iau.ir/journal/nacms |
|
بررسی میزان آلودگی به بروسلوزیس در نمونه خون افراد سرولوژی مثبت بروسلا در شهرستانهای شهرکرد و اصفهان به روش Real Time PCR
حسین خدابنده1، نازیلا ارباب سلیمانی2*، حسین آقاجانی1، محمدرضا افشارزاده3
1. مرکز تحقیقات تغذیه و محصولات ارگانیک، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
2. گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، دامغان، ایران.
3 . گروه دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران.
اطلاعات مقاله |
| چکیده |
تاریخچه مقاله: دریافت:20/2/1403 پذیرش:25/4/1403 چاپ:30/6/140 DOI: |
| بیماري بروسلوز جز شایعترین بیماريهاي باکتریایی مشترك انسان و دام است که در انسان ایجاد تب مالت نموده و خسارات اقتصادي بالایی را در حیوانات اهلی به بار می آورد. در این تحقیق با استفاده از روش Real Time PCR به بررسی فراوانی گونه های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس در سرم افراد سرولوژی مثبت پرداختیم. نمونه های سرمی 30 نفر از افرادی که تست رایت آنها مثبت شده بود (بالای 160/1)، از آزمایشگاههای تشخیص طبی شهرستانهای شهرکرد و اصفهان جمع آوری و DNA ِنمونه ها با استفاده از کیت استخراج DNA سیناژن استخراج شد. به منظور تشخیص جنس و گونه های بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس واکنش Real Time PCR بر روی نمونه ها انجام شد. در این بررسی تمام 30 نمونه مورد بررسی با روش Real time PCR تأیید شدند. در شهرهای اصفهان و شهرکرد در تمامی موارد بروسلا آبورتوس تشخیص داده شد. در جنس مونث پس از انجام آزمون Real Time PCR فقط باکتری بروسلا آبورتوس تشخیص داده شد در حالیکه در جنس مذکر 22 مورد (33/73 درصد) بروسلا آبورتوس و 3 مورد (10 درصد) بروسلا ملی تنسیس شناسایی گردید. از 7 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی زیر 30 سال، 6 مورد (7/85 درصد) بروسلا آبورتوس و 1 مورد (3/14درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. در صورتیکه از 23 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی بالای 30 سال، 21 مورد (3/91 درصد) بروسلا آبورتوس و 2 مورد (7/8 درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. در سال هاي اخير روش هاي مولكولي زيادي براي تشخيص اين باكتري مورد استفاده قرار گرفته اند. روش Real Time PCR از اين نظر كه نيازمند صرف زمان كم و داراي حساسيت و اختصاصيت بالايي ميباشد، در تشخيص اين بيماري بسيار مفيد ميباشد. |
کلمات کلیدی: بروسلا آبورتوس، بروسلا ملی تنسیس، سرولوژی، Real Time PCR
|
| |
* نویسنده مسئول: Email nazilaarbab@yahoo.co.uk
|
مقدمه
بروسلوز یکی از پنج بیماري مشترك بین انسان و دام است که در اثر آلودگی با باکتريهاي جنس بروسلا به وجود می آید (1). بعضي از انواع بروسلا مثل بروسلا آبورتوس، بروسلا ملي تنسيس و بروسلا سوئيس داراي ميزبانهاي ويژه میباشند، بروسلاها باکتریهاي کوکوباسیل گرم منفی، کوچک، باریک و کوتاهی هستند، که گاهی به شکل باسیل و یا کوکسی نیز مشاهده میشوند طول متغیري حدود 5/1-6/0 میکرومتر و عرض 7/0-5/0 دارد. غیر متحرك بوده و اسپور تولید نمی کند. از منابع طبیعی شکل L-Form باکتري نیز جداسازي شده است. مقاومت در برابر رنگ بري به وسیله محلولهاي رقیق اسیدي و قلیای امکان به کارگیري رنگ آمیزي هاي متفاوت و غیر اختصاصی را در بافت هاي آلوده، از قبیل زیل نیلسون اصلاح شده، ماشیاولو و روش کوستر فراهم کرده است (2،3).
بروسلوز در تمام مناطق دنیا وجود دارد و از مشکلات بهداشتی در بسیاري از کشورها محسوب میگردد. به طور تقریبی بروسلا آبورتوس و بروسلا ملی تنسیس مسئول تمامی موارد بروسلوز در انسان و دام کشور ما هستند. در ایران بروسلوز یک بیماري اندمیک در تمام قسمت هاي کشور میباشد (4). علائم بالینی بروسلوز بسیار غیر اختصاصی است. این بیماری به اشکال مختلف نمایان می گردد. علائم این بیماری شامل: تب، تعریق، لرز، سردرد، درد عضلانی، خستگی، بی اشتهائی، درد مفاصل، کمر درد، کاهش وزن، یبوست، درد گلو، سرفه خشک، علائم شبیه سرماخوردگی، التهاب مفاصل، بزرگ شدن غدد لنفاوی، افسردگی (درگیری عصبی مرکزی)، درگیری قرنیه چشم و ضایعات پوستی، کاهش وزن، درد شکم، اختلال خواب، بزرگ شدن کبد و طحال، رنگ پریدگی و درد ستون فقرات میباشد. البته گاهی بیماری بروسلوز مزمن می شود که در این حالت علائم خفیفتر ولی مداوم و یا مکرر شده و این افراد مثلاً با تب مکرر ولی خفیف، درد مفاصل و یا خستگی مراجعه میکنند. گاهی نیز در عفونت های شدید، دستگاه عصبی مرکزی و یا گاهی لایه داخلی قلب گرفتار میشود که در این موارد، بیماری عوارض خطرناکی میتواند داشته باشد (5). سالانه 500 هزار مورد جدید درگیري با بروسلوز در جهان گزارش میشود که طبق گزارش سازمان جهانی بهداشت این تعداد در برابر شیوع واقعی آن ناچیز میباشد، زیرا این بیماري علائم بالینی متفاوتی دارد. تنوع، غیراختصاصی و غیر تیپیک بودن علائم بالینی بروسلوز ضرورت تشخیص بر اساس یافته هاي آزمایشگاهی را روشن میسازد (6). به طور کلی پیشگیری، کنترل و ریشه کنی بروسلوز نیازمند شناخت سریع و صحیح فراوانی و توزیع مکانی و زمانی آن است. کشتهای باکتریولوژیکی و آزمایشهای سرولوژیکی متکی بر آگلوتیناسیون شایعترین آزمونهای مورد استفاده در تشخیص عفونتهای انسانی و حیوانی بروسلوز هستند (7). در سالهاي اخير روش هاي مولكولي زيادي براي تشخيص اين باكتري مورد استفاده قرار گرفتهاند. روش Real Time PCR از اين نظر كه نيازمند صرف زمان كم و داراي حساسيت و اختصاصيت بالايي ميباشد، در تشخيص اين بيماري بسيار مفيد ميباشد(8).
این روش تلفیقی از تکنیک PCR و تکنیک کاربرد پروب های فلورسنس است که هر دو در یک واکنش جمع گردیده اند به طور کلی در این روش نوین واکنشPCR و شناسایی قطعه تکثیر یافته در یک ساعت یا کمتر انجام میشود که این امر باعث افزایش سرعت و صرفه جویی در زمان نسبت به سیستم های رایج PCR گردیده است. مزیت دیگر این تکنیک نسبت به PCR این است که مراحل Post PCR که شامل ژل الکتروفورز، رنگ آمیزی با ماده سرطانزای اتیدیوم بروماید و تفسیر ژل با نور ماورای بنفش می باشد، حذف گردیده و آلودگی محیط آزمایشگاه به اتیدیوم بروماید و قطعات DNA تکثیر یافته به روش PCR نیز به حداقل میرسد. کار با تجهیزات و دستگاه های به کار گرفته شده در PCR Real Time به طور قابل ملاحظه ای نسبت به PCR ساده تر بوده و مجموعه مزایایی نظیر ترکیب حساسیت و ویژگی بالا، خطر آلودگی پایین، ساده بودن کارکرد و سرعت بالا، باعث شده است تا فناوری PCR Real Time جذابتر از روشهای رایج بر پایه کشت یا تستهای ایمونولوژیکی در آزمایشگاه میکروبیولوژی بالینی برای تشخیص عوامل عفونی گردد (9).
با توجه به قرار گرفتن ایران در منطقه شایع بروسلوز و همچنین عوارض و خطرات بالقوه بروسلوز و هزینه‌هایی که بر اقتصاد تحمیل می‌کند، اهمیت لزوم تحقیق در مورد میزان شیوع واقعی و همچنین استفاده از بهترین، دقیق‌ترین و به صرفه‌ترین روش برای تشخیص این شیوع لازم به نظر میرسد. هدف از انجام این مطالعه، ارزیابی روش Real Time PCR برای تشخیص بروسلوزیس در نمونه های سرم مثبت بروسلا به عنوان ابزار تشخیصی کارآمد در تشخیص افراد آلوده حقیقی و بررسی گونه های درگیر کننده بروسلا در این افراد است.
مواد و روش کار
نمونه گیری
در این مطالعه توصیفی- مقطعی، نمونه های سرمی مربوط به 30 نفر از افرادی که تست رایت آنها مثبت شده بود، از آزمایشگاه های تشخیص طبی شهرستان های شهرکرد و اصفهان جمع آوری و در مجاورت یخ به مرکز تحقیقات تغذیه و محصولات ارگانیک دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل گردیدند.
استخراج DNA
به منظور تشخیص مولکولی، استخراج DNAبا استفاده کیت استخراج DNA(شرکت سیناژن) مطابق روش کار کیت انجام شد. برای ارزیابی کیفی DNA استخراج شده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز استفاده شده و مقدار μl5 از آن را بر روی ژل آگارز 1 درصد ران می‌کنیم. ژل را درون تانك الكتروفورز گذاشته و از هر نمونه DNA تخليص شده به ميزان μl 5 با رنگ برموفنل بلو مخلوط كرده و توسط سمپلر درون چاهك‌ها ريخته شد. در يكي از چاهك‌ها ماركر ريخته شد و پس از نيم ساعت ران شدن با ولتاژ 80، ژل را برداشته و با رنگ DNA Self Saine رنگ آمیزی شد. براي رنگ‌آميزي، ابتدا درون يك ظرف مقداري آب ديونيزه ريخته شد و شيشه‌ها به آرامي از روي ژل برداشته شد (نبايد ژل پاره شود). سپس ژل را درون ظرف آب قرار داده و 15 میکرولیتر رنگ مورد نظر به آن اضافه گرديد و پس از حدود 15 دقيقه توسط دستگاه ژل داك (UV) از ژل فوق عكس گرفته شد و کیفیت DNA استخراج شده را ارزیابی می‌کنیم. به منظور کمیت سنجی DNA تخلیص شده از دستگاه بایوفوتومتر استفاده شد و با اندازه گیری میزان DNA در نمونه در طول موج نوری280 نانومتر میزان DNA موجود در نمونه تعیین گردید.
واکنش Taq-Man Real Time PCR
به منظور انجام واکنش Taq-Man Real Time PCR پرایمر مورد استفاده برای تشخیص جنس بروسلا و گونه های آبورتوس و ملی تنسیس و هم چنین توالی پروب مورد استفاده جهت سنتز به شرکت تکاپو زیست سفارش داده شدند. پرایمرهای مخصوص و پروب TaqMan مطابق دستورالعمل کارخانه رقیق سازی گردید. توالي پرايمرهاي و پروبهای مورد استفاده در اين تحقيق در جدول (1) نشان داده شده است (10). جهت رقیق سازی پروب مطابق دستورالعمل شرکت سازنده در تاریکی و تحت شرایط استریل 1000میکرولیتر آب Nuclease free بدون عمل پیپتینگ به ویال حاوی پروب افزوده و به مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار دادیم. سپس 50 میکرولیتر از پروب را برداشتیم و با 200 میکرولیتر آب Nuclease free مخلوط نمودیم. واکنش Real Time PCR جهت تشخیص جنس بروسلا و گونه های آبورتوس و ملی تنسیس در حجم نهایی 25 میکرولیتر متشکل از 5/12 میکرولیتر TaqMan Universal PCR Master Mix (2X)، 625/0 پرایمر F، 625/0 پرایمرهای R، 3/0 میکرولیتر پروب، 5/2 میکرولیتر DNA الگو و 43/8 میکرولیتر آب مقطر، به صورت جداگانه برای هر ژن صورت گرفت. در نهایت نمونهها در دستگاه Light Cycler مخصوص Real Time PCR قرار داده شده اند. برنامه زمانی- گرمايي با استفاده از نرم افزار Rotor-Gene 6000 در 95 درجه سانتيگراد 10 دقيقه (Hot Start)، سپس 45 چرخه دمايي به ترتيب 95 درجه سانتي گراد 20 ثانیه، 62 درجه سانتيگراد 20 ثانیه و يک مرحله نهايي 72 درجه سانتيگراد 20 ثانیه دقيقه تنظيم گرديد. علاوه بر 45 سیکل تکثیر، یک سیکل نیز در دامنه دمایی 60 تا 95 درجه سانتی گراد جهت رسم منحنی ذوب، به وسیله قرائت رنگ فلورسانس TaqMan probe برای دستگاه تعریف شد.
توالی پروب (3′→5′) | توالی پرایمر (3′→5′) | توالی هدف |
FAM-AAGCCAACACCCGGCCATTATGGT-TAMRA | GCTTGAAGCTTGCGGACAGT GGCCTACCGCTGCGAAT | IS711 |
Cy5-CCTCGGCATGGCCCGCAA-BHQ-2 | TCGCATCGGCAGTTTCAA/ CCAGCTTTTGGCCTTTTCC | BMEII0466 |
FAM-TGGAACGACCTTTGCAGGCGAGATC-BHQ-1 | GCACACTCACCTTCCACAACAA/ CCCCGTTCTGCACCAGACT | BruAb2_0168 |
جدول 1- توالی آغازگرها و پروب‌ها
آنالیز آماری
در نهایت ارتباط آماری (جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها) حاصل از نتایج به دست آمده مورد بررسی آماری قرار گرفت. در نتیجه به‌منظور تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها از آمار استنباطی (آزمون های دقیق فیشر و مربع کای) با استفاده از نرم افزار SPSS20 استفاده گردید و ارتباط آماری حاصل از نتایج به دست آمده مورد بررسی آماری قرار گرفت و در این بررسی P < 0.05 به‌عنوان معنی دار، معرفی شد.
نتایج
نتايج کيفي مربوط به استخراج DNA
استخراج DNA طبق روش شرکت سازنده کیت انجام شد و در شکل 1 نتايج استخراج DNA نشان داده شده است. شماره‌های 1 تا 5 همگی نشان دهنده غلظت بالای DNA است.
شکل 1- تصویر الکتروفورDNA استخراج شده روی ژل آگارز 1 درصد
در این بررسی تعداد 30 نمونه سرم مثبت به منظور ردیابی ژنوم باکتری بروسلا، مورد بررسی قرار گرفتند (نمودار 1). 15 مورد مربوط به شهرستان اصفهان و 15 مورد (50 درصد) مربوط به شهرستان شهرکرد بودند. از 15 نمونه مورد بررسی در شهرستان اصفهان، 8 مورد در شهرها (3/53 درصد) و 7 مورد (7/46 درصد) در روستاها اقامت داشتند (جدول 2). بیشترین میزان ابتلا در شهر اصفهان مربوط به ساکنین شهرها (3/53 درصد) می باشد در حالیکه 7 مورد از روستاییان اصفهان (7/46 درصد) به بروسلوز مبتلا بودند. از 8 مورد آلودگی به بروسلا در شهرستان اصفهان 8 مورد (100 درصد) بروسلا آبورتوس تشخیص داده شدند و بروسلا ملی تنسیس در هیچ نمونه ایی یافت نشد. در صورتیکه از 7 نمونه آلوده به بروسلا در روستاهای اصفهان 5 نمونه (43/71 درصد) بروسلا آبورتوس و 2 نمونه (57/28 درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند.
از 15 نمونه مورد بررسی در شهرستان شهرکرد 11 مورد در شهرها (3/73 درصد) و 4 مورد (7/26 درصد) در روستاها اقامت داشتند. بیشترین میزان ابتلا در شهرستان شهرکرد، مربوط به ساکنین شهرها میباشد. از 11 مورد آلودگی به بروسلا در شهرستان شهرکرد، 11 مورد (100درصد) بروسلا آبورتوس تشخیص داده شدند و بروسلا ملی تنسیس در هیچ نمونه ای یافت نشد. در صورتی که از 4 نمونه آلوده به بروسلا در روستاهای شهرکرد، 3 نمونه (75 درصد) بروسلا آبورتوس و 1 نمونه (25درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. که نشان میدهد که بروسلا آبورتوس بیشترین فراوانی را در مناطق روستایی شهرکرد دارد (نمودار1).
فراوانی را در مناطق روستایی شهرکرد دارد (نمودار1).
| ||
نمودار 1- فراوانی بروسلا آبورتوس و ملی تنسیس در شهرستان های اصفهان و شهرکرد |
جدول 2- مقایسه میزان فراوانی باکتری‌ها در شهرها و روستاهای اصفهان و شهرکرد
شهر و محل سکونت | اصفهان | شهرکرد | p-value | ||||||
شهر (8) 7/53% | روستا (7) 7/46% | شهر (11) 3/73% | روستا (4) 7/26% | ||||||
تعداد | درصد | تعداد | درصد | تعداد | درصد | تعداد | درصد | ||
جنس بروسلا | 8 | 100 | 7 | 100 | 11 | 100 | 4 | 100 |
251/0 |
بروسلا آبورتوس | 8 | 100 | 5 | 43/71 | 11 | 100 | 3 | 75 | |
بروسلا ملی تنسیس | 0 | 0 | 2 | 57/28 | 0 | 0 | 1 | 25 | |
در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر بین منطقه (شهر و روستا) و آلودگی بروسلا ارتباط معنی داری مشاهده نگردید (p-value>0/05). از 30 نمونه مورد بررسی 25 مورد (3/83 درصد) مربوط به جنس مذکر و 5 مورد (7/16درصد) مربوط به جنس مونث بودند. که در جنس مونث پس از انجام آزمون Real Time PCR فقط باکتری بروسلا آبورتوس تشخیص داده شد در حالیکه در جنس مذکر 22 مورد (33/73 درصد) بروسلا آبورتوس و 3 مورد (10درصد) بروسلا ملی تنسیس شناسایی گردید (جدول 3).
|
نمودار 2- فراوانی بروسلا آبورتوس و ملی تنسیس در دو جنس مذکر و مونث |
جدول 3- مقایسه میزان فراوانی باکتری‌ها در جنس مونث و مذکر
جنسیت | مونث | مذکر | p-value | ||
تعداد | درصد | تعداد | درصد | ||
جنس بروسلا | 5 | 100 | 25 | 100 |
00/1 |
بروسلا آبورتوس | 5 | 100 | 22 | 88 | |
بروسلا ملی تنسیس | 0 | 0 | 3 | 12 | |
در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر بین جنسیت و آلودگی به بروسلا ارتباط آماری معنی داری مشاهده نگردید (P-Value=1/00>0/05). از نظر گروه های سنی، افراد مورد مطالعه به دو گروه زیر 30 سال و بالای 30 سال طبقه بندی شدند. 7 مورد (33/23 درصد) مربوط به افراد زیر 30 سال و 23 مورد (67/76 درصد) مربوط به افراد بالای 30 سال میباشد (نمودار 4). از 7 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی زیر 30 سال، 6 مورد (7/85 درصد) بروسلا آبورتوس و 1 مورد (3/14درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند. در صورتیکه از 23 مورد آلودگی به بروسلوز در گروه سنی بالای 30 سال، 21 مورد (3/91 درصد) بروسلا آبورتوس و 2 مورد (7/8 درصد) بروسلا ملی تنسیس تشخیص داده شدند (جدول 5).
|
نمودار4- درصد آلودگی به در گروه های سنی زیر 30 و بالای 30 سال |
جدول 5- مقایسه میزان فراوانی باکتری‌ها در گروه های سنی زیر 30 و بالای 30 سال
سن | 30> (7) | 30< (23) | p-value | |||||
تعداد | درصد | تعداد | درصد | |||||
جنس بروسلا | 7 | 100 | 23 | 100 |
00/1 | |||
بروسلا آبورتوس | 6 | 7/85 | 21 | 3/91 | ||||
بروسلا ملی تنسیس | 1 | 3/14 | 2 | 7/8 | ||||
در تجزیه و تحلیل آماری با آزمون دقیق فیشر بین گروه سنی و آلودگی به بروسلا ارتباط آماری معنی داری مشاهده نگردید (P-value=1/00>0/05).
نتایج Real Time PCR
در مرحله اول ابتدا از طریق روش Real Time PCR به تشخیص بروسلا پرداخته شد. در مرحله بعدی بر اساس آنالیز منحنی ذوب ایجاد شده از واکنش Real Time PCR میتوان به تشخیص گونه‌های بروسلا ملی تنسیس و بروسلا آبورتوس پی برد. در شکل های 1، 2 و 3 مراحل پروفایل حرارتی برای جنس بروسلا و گونه های بروسلا در دستگاه Real Time PCR نشان داده شده است. CTکمتر از 40 مثبت در نظر گرفته شد.
شکل2- آنالیز منحنی ذوب برای جنس بروسلا: خط 1: کنترل مثبت. خطوط 2، 3 و 4: نمونه‌های مثبت جنس بروسلا. خط 5: کنترل منفی. خط 6: نمونه منفی برای واکنش است.
شکل3- آنالیزمنحنی ذوب برای گونه بروسلا آبورتوس. خط A: کنترل مثبت.خط B: نمونه مثبت. خطC : کنترل منفی.خطD : نمونه منفی برای واکنش است.
شکل4- آنالیزمنحنی ذوب برای گونه بروسلا ملی تنسیس. خط 1: کنترل مثبت.خط 2: نمونه مثبت. خط3: کنترل منفی. خط4: نمونه منفی برای واکنش است.
بحث
طبق آخرین گزارشهای وزارت بهداشت و کتاب راهنمای کشوری مبارزه با بروسلوز (تب مالت) پراکندگی بیماری در ایران در استان چهارمحال و بختیاری نسبت به استان اصفهان بیشتر است که بر این اساس استان چهارمحال و بختیاری جز استانهای با آلودگی متوسط (میزان بروز 20-11 درصد) است و استان اصفهان جز استان های با آلودگی پایین (میزان بروز 10-0 درصد) است. در تحقیق ما آلودگی به بروسلا در ساکنین شهرها نسبت به روستاها بیشتر میباشد که می تواند به علت عواملی از قبیل توزیع لبنیات غیر پاستوریزه (خامه و پنیر محلی) و ارتباط تنگاتنگ ساکنین شهرها با روستاها باشد. بیماری در تمامی سنین وجود دارد ولی وفور آن در سن 30-20 سالگی است، یعنی نیروی فعال و کارآمد کشور در معرض خطر این بیماری هستند. در مطالعه حاضر بیماری بروسلوز در گروه سنی بالای 30 سال شیوع بیشتری دارد در حالیکه در تحقیق انجام شده توسط زینلی و همکاران بیشترین گروه سنی مبتلایان 30-20 سال و در تحقیق قاسمی و همکاران بیشترین گروه سنی مبتلایان 19-15 برآورد گردید (11،12). با توجه به شیوع بالاتر بیماري بروسلوز در گروه سنی بالای 30 سال در تحقیق ما میتوان نتیجه گیري کرد که آگاهی این گروه نسبت به راه هاي انتقال بیماري به اندازه کافی نیست و جا دارد که با آموزش بیشتر و تأکید بر راه هاي انتقال بیماري میزان آگاهی را نسبت به این بیماري بالا برد. بیماری در هر دو جنس دیده میشود تحقیقات متعدد انجام شده حاکی از آن است که میزان آلودگی به بروسلوز در جنسیت مرد نسبت به جنسیت زن بیشتر میباشد که در تحقیق ما نیز چنین نتیجه ای به دست آمد. بیماری را انحصارا نمیتوان یک بیماری شغلی محسوب نمود ولی شغل به عنوان یک عامل خطر در ابتلا به بیماری مطرح است به خصوص نزد خانمهای خانه دار (خانم های خانه دار عمدتا به عنوان دامدار و کشاورز دوشادوش همسرانشان در مناطق روستایی به فعالیت میپردازند)، دامداران، کشاورزان. بیماری در تمام فصول وجود دارد ولی در فصل بهار و تابستان هم زمان با فصل زایش و شیردهی دامها بیش تر دیده میشود. در تحقیق حاضر تمامی نمونه های سرم مثبت در آزمون Real Time PCR مثبت تشخیص داده شدند که یکی از دلایل اختلاف با تحقیق دل بیشه میتواند متفاوت بودن تیتر واکنش رایت لوله ای باشد. در تحقیق دیگری که توسط سهرابی و همکاران درسال 2011 بر روی 50 نمونه (25 نمونه سرم مثبت و 25 نمونه سرم منفی) و 75 نمونه از دام ذبح شده با تب مالت را به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار دادند. سرمهای منفی آلودگی به بروسلا تشخیص داده نشد ولی آلودگی بروسلا در 46 مورد از 75 نمونه حیوانات ذبح شده و هم چنین نمونه های سرم مثبت را مورد تأیید قرار داد(8). در مطالعه ای که توسط زهرايي صالحي و همکاران در سال 1392 برای طراحي و بهينه سازي روش Real Time PCR جهت تشخيص باكتري بروسلا آبورتوس بر روی سويه استاندارد و واكسن بروسلا آبورتوس، ملي تنسيس، سوئيس، نئوتومه و 15 ايزوله بروسلا آبورتوس جداشده از شير گاو انجام شد، قطعه 215 نوكلئوتيدي بر اساس منحني ذوب حاصله در دماي 85 درجه سانتيگراد يك الگوي صعودي كاملا اختصاصي را نشان داد. نتايج مشخص کرد كه با استفاده از اين روش ميتوان باكتري بروسلا آبورتوس به صورت اختصاصي از ساير گونه ها تمايز داد (13). در بررسی انجام شده توسط محمدزاده و همکاران درسال 1390 که بر روی 64 نمونه سرم از افرادی که از نظر آزمایش رایت لوله ای عیار تیتر برابر و بالای 160 داشتند، جهت گونه بروسلا ملی تنسیس به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحقیق از 64 نمونه مورد بررسی در 43 نمونه 87/71 درصد بروسلا ملی تنسیس گزارش گردید (14). در صورتی که در تحقیق ما بروسلا آبورتوس از فراوانی بالاتری برخوردار می باشد. در تحقیق انجام شده توسط دل بیشه و همکاران که درسال 1391 که بر روی 45 نمونه ی مثبت خون گوسفند از نظر تستهای سرولوژیکی در چندین شهرستان استان مازندران صورت گرفت، تنها 20 نمونه از نظر حضور باکتریهای جنس بروسلا با استفاده از روش Real Time PCR TaqMan مثبت تشخیص داده شدند(15).Newby و همکاران در سال 2003 تشخیص بروسلا آبورتوس به روش Real Time PCR انجام گرفت که مقایسه ای را بین سه تکنیک SYBR Green، 1 و 5 اگزونوکلئازی و پروبهای هیبرید شونده انجام دادند. در این سه روش از همان پرایمر تقویت شده برای تولید یک قطعه ی یکسان استفاده شده است این قطعه محدوده های یک منطقه از ژنوم بروسلا آبورتوس که شامل بخشهایی از ژن Alk B و عنصر IS711 الحاق شده است هر سه روش دارای حساسیت قابل ملاحظه ای بوده است با این حال بیشترین ویژگی را با استفاده از روش پروب هیبریداسیون بهدست آوردند (16). در مطالعه انجام شده توسط Jolie و همکاران در سال 2007 تعیین سریع جدایه های در مرحله تشخیص گونه با روش Multiplex- PCR بر پايه SNP صورت گرفت که در آن سه ژن omp25 ، glk و trpE هدف بودند (17). در ایران توسط مالک نژاد و همکاران در سال 1387 برای تعیین گونه های بروسلا در مناطق مرکزی کشور با تکنیک PCR-RLFP روی ژن های Omp2b و Omp2a پروتئین های غشای خارجی مطالعه شد که اختلاف بین انواع بروسلاهای بیماری زا و برخی بیوتایپهای آن را مشخص کرد (18). در سال 2009 Hinic و همکاران روش Real Time PCR مبتنی بر پایه ی IS711 به توصیف ارزیابی روش بر پایه سکوئنس درج شده روی بروسلا آبورتوس با نمونه های خون 199 گراز نر و نمونه ی بافت 53 گراز نر وحشی جمع آوری شده از سوئیس پرداختند بروسلا در 1/11 درصد از نمونه ی خون 199 نر وحشی با روش IS711 Real Time PCR که تست سرولوژی آن ها منفی بود تشخیص داده شد (19). در سال2010 توسط Bertu و همکاران روی نمونه های شیر از گله های فاقد واکسیناسیون و گاوهای بدون علایم آبسه ی غده ی پستانی مطالعه شد. در این بررسی آنتی بادیهای ضد بروسلابه عنوان ملاک تشخیصی به کار گرفته شد(20). در بررسی انجام شده توسط محمدزاده و همکاران درسال 1390که بر روی 64 نمونه سرم از افرادی که از نظر آزمایش رایت لوله ای عیار تیتر برابر و بالای160 داشتند، جهت گونه بروسلا ملی تنسیس به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحقیق از 64 نمونه مورد بررسی در 43 نمونه 87/71 درصد بروسلا ملی تنسیس گزارش گردید (14). در تحقیق انجام شده توسط سهرابی و همکاران در سال 2011 که بر روی 50 نمونه (25 سرم مثبت و 25 سرم منفی) و 75 نمونه از دام ذبح شده با تب مالت را به روش Real Time PCR مورد بررسی قرار دادند. سرمهای منفی آلودگی به بروسلا تشخیص داده نشد ولی آلودگی بروسلا در 46 مورد از 75 نمونه حیوانات ذبح شده مورد تأیید قرار گرفت (8). در مطالعه ای که توسط زهرايي صالحي و همکاران در سال 1392 برای طراحي و بهينه سازي روش Real Time PCR جهت تشخيص باكتري بروسلا آبورتوس بر روی سويه استاندارد و واكسن بروسلا آبورتوس، ملي تنسيس، سوئيس، نئوتومه و 15 ايزوله بروسلا آبورتوس جداشده از شير گاو انجام شد، قطعه 215 نوكلئوتيدي بر اساس منحني ذوب حاصله در دماي 85 درجه سانتي گراد يك الگوي صعودي كاملاً اختصاصي را نشان داد. نتايج مشخص کرد كه با استفاده از اين روش ميتوان باكتري بروسلا گونه آبورتوس به صورت اختصاصي از ساير گونه ها تمايز داد (13).
نتیجه گیری کلی
با توجه به محدودیتهای کشت های باکتریولوژیکی و آزمایش های سرولوژیک و فقدان حساسیت لازم چنین تستهایی در بیمارانی که به بروسلوز مزمن مبتلا هستند، از طرف دیگر وجود واکنش متقاطع با ديگر باكتریهای گرم منفی که منجر به نتايج مثبت كاذب ميگردد، به منظور تسهیل در این مشکلات و با وجود درجه ی بالایی از شباهت ژنتیکی بین گونه های بروسلا روشهای مولکولی از قبیل PCR و Real time PCR که آسانتر، سریعتر، امن تر، راحتتر و دقیق تر از روش های سنتی هستند مناسب به نظر می رسند.
مراجع
1. Franco MP, Mulder M, Gilman RH, Smits HL. Human brucellosis. Lancet Infect Dis. 2007; 7(12): 775-786.
2. جاوتز ا، ملنیک ج، آدلبرگ ا. (1378)، هموفیلوس، بوردتلا، بروسلا، میکروبیولوژی جاوتز، نوروزی ج، چاپ اول، مؤسسه فرهنگی انتشاراتی حیان، تهران، 300-303.
3. Ko J, Splitter GA. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans.Clin Microbiol Rev. 2003; 16(1): 65-78.
4. Pakzad I, Rezaee A, Emaneini M, Hosseini AZ, Tabbaraee B, Taherikalani M. Expression of Human Serum Albumin - L 7/L 12 (Brucella abortus Ribosomal Protein) Fusion Protein in Saccharomyces cerevisiae. Pol J Microbiol. 2009; 58(2): 99-104.
5. Probert WS, Schrader KN, Khuong NY, Bystrom SL, Grave MH. Real-Time Multiplex PCR Assay for Detection of Brucella spp, B. abortus, and B. melitensiss. J Cn Microbiol. 2003; 42(3): 1290-1293.
6. ناصري ز، یوسف علیخانی م، هاشمی ح، عربستانی م. (1393). تعیین گونه هاي بروسلا ایزوله شده از نمونه هاي خون بیماران مشکوك به بروسلوزیس با روش .PCR مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراك. 17(5): 52-59.
7. جعفرپور م، کترا ابراهیمی ن، ناظمی ع، آسمار م، خاتمی نژاد م. (1389). مقایسه آزمایش های سرولوژیک (رزبنگال، رایت لوله های و کومبس رایت) و مولکولی (PCR) در تشخیص بروسلوز گوسفند و بز. پاتوبیولوژی مقایسه ای، علمی پژوهشی. 7(4):337-342.
8. Sohrabi M, Mohabati Mobarez A, Behmanesh M, Khoramabadi N,
Hosseini Dous R. Evaluation of a new set of Real-Time PCR for Brucella detection within human and animal samples. J Pharma Health Sci. 2011; 1(2): 14-17.
9. دوستی ع، کارگر م، قربانی دالینی ص، سرشار م. (1391). مبانی Real Time PCR و تکنیک FRET در تشخیص بیماریهای عفونی. دنیای میکروبها. 4 (14): 41-45.
10. Hinic V, Brodard I, Thomann A, Cvetnic Z, Makaya PV, Frey J, Abril C. (2008). Novel identification and differentiation of Brucella melitensis, B. abortus, B. suis,
B. ovis, B. canis, and B. neotomae suitable for both conventional and Real-time PCR systems. J Microbiol Methods. 75(2): 375–378.
11. زینلی م، شیرزادی م ر. (1387). عوامل مؤثر در افزایش و کاهش بروز بروسلوز (تب مالت) در انسان در کشور از سال 65 لغایت 85، پانزدهمین کنگره دامپزشکی ایران، تهران، جامعه دامپزشکان ایران. سال1387، 200-201
12. Ghasemi B, Mohammadian B, Majidpour M. Epidemiology of human and animal brucellosis in Kurdistan province in 1997-2001. Kurdistan Uni Med Sci. 2004; 8 (30): 23-32.
13. زهرايي صالحي ت، آقايي پور خ ، عالميان س، اكبري الف ، اسماعيل زاد م، نيري فسايي ب، صفويه ص ، اعتمادي الف. (1392). پنجمین کنگره ی بروسلوزیز بین المللی ایرانیان. سال1392، 31-29.
14. محمد زاده ر، یوسف زاده ر. (1390). تشخیص بروسلا ملی تنسیس به روش Real Time PCR. اولین کنگره بین المللی باکتریولوژی. دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تبریز. سال1390، 2459.
15. دل بیشه م، ناظمی ع، جعفر پور م. (1391). راه اندازی روش حساس و اختصاصیReal-Time PCR به منظور تشخیص گونه های بروسلا. مجله تحقیقات آزمایشگاهی دامپزشکی. 4 (1): 110.
16. Newby DT, Hadfield TL, Roberto FF. Real-Time PCR Detection of Brucella abortus: a Comparative Study of SYBR Green I, Exonuclease, and Hybridization Probe Assays. Appl Environ Microbiol. 2003; 69(8): 4753-4759.
17. Jolie CS, Mark SK, Michael RS, Adrian MW. Multiplex assay based on single-nucleotide polymorphisms for rapid identification of brucella isolates at the species level. Appl Environ Microbiol. 2007; 73(22): 7331–7337.
18. مالک نژاد پ، پیری دوگاهه ه، امیر زرگر ع، جعفری س، فتح اله زاده ب. (1387). تشخیص بروسلوز با استفاده از محیط کشت خون BACTEC و تائید آن با PCR. مجله تحقیقات دامپزشکی. 62(4): 83-86.
19. Hinić V, Brodard I, Thomann A, Holub M, Miserez R, Abril C. IS711-based real-time PCR assay as a tool for detection of Brucella spp. in wild boars and comparison with bacterial isolation and serology. Bio Med Central. 2009; 5(22): 1-8.
20. Bertu WJ, Dapar M, Gusi AM, Ngulukun SS, Leo S, Jwander LD. Prevalence of Brucella antibodies in marketed milk in Jos and environs. Afr J Food Sci. 2010; 4(2): 62-64.
Contamination of brucellosis in blood samples of seropositive patients for Brucella in the Shahr-e Kord and Isfahan city by Real Time PCR method
Hossein Khodabandeh1, Nazila Arbab Soleimani2*, Hossein Aghajani1, Mohammad Reza Afsharzadeh3
1. Research Center of Nutrition and Organic Products (R.C.N.O.P), Islamic Azad University, Shahrekord Branch, Shahrekord ,Iran.
2. Department of Microbiology, Department of Microbiology,Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan,Iran.
3. Department of Veterinary Medicine, Islamic Azad University, Shahrekord Branch, Shahrekord, Iran.
*Corresponding author: Nazilaarbab@yahoo.co.uk
Abstract
Brucellosis is one of the most common bacterial diseases in both humans and animals.It causes human to suffer from Malta fever and has highly economic losses in livestock. Bacteriological culture and serological tests for the diagnosis of chronic cases are insensitive. Therefore, the use of Real Time PCR is a great help to evaluate the frequency of types of Brucella abortus and Brucella melitensis in serum of people with positive serology.Serum samples of 30 cases with right positive test (over 1/160) were collected from DNA clinical laboratories in the cities of Shahrekord and Esfahan and they were extracted with the use of signagen DNA extraction kit. In order to identify the genus and the types of Brucella abortus and Brucella melitensis Real Time PCR reaction was carried out on the samples.In this study, all 30 samples were confirmed with the use of Real Time PCR. Brucella abortus was detected in all samples in the cities of Esfahan and Shahrekord. After Real Time PCR test was run on females, brucella abortus was just detected, While in males, 22 (%73.33) cases suffered from Brucella abortus and 3 (%10) suffered from brucella melitensis. From the total of 7 cases with brucellosis infection in the age group below 30 years old, 6 (%85.7) cases suffered from brucella abortus and 1 (%14/3) suffered from brucella melitensis, While from the 23 cases with brucellosis in the age group over 30 years old, 21 (%91.3) had Brucella abortus and 2 (% 8.7) had Brucella melitensis. In recent years many molecular methods have been used for the detection of this bacteria. Real Time PCR method in the sense that it requires less time and has high sensitivity and specificity is very useful in the diagnosis of the disease.
Keywords: Brucella abortus, Brucella melitensis, Serology, Real Time PCR
