طراحی محاسباتی ادغام ریبوسوئیچ تتراسایکلین در بالادست ژن ERG11 در مخمر کومگاتائلا فافی با استفاده از سیستم کریسپر-کس9

الموضوعات :

سجاد یزدان پناه ¹ , حسن محبت کار ² , محمد برشان تشنیزی ³ , ساره ارجمند ⁴

1 - گروه زیست فناوری، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
2 - استاد-دانشگاه اصفهان
3 - گروه آموزشی مهندسی علوم زیستی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانشگاه تهران، تهران، ایران.
4 - مرکز فناوری پروتئین، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

تاريخ الإرسال : 02 الأربعاء , ربيع الثاني, 1447 تاريخ التأكيد : 02 الأربعاء , ربيع الثاني, 1447 تاريخ الإصدار : 02 الأربعاء , ربيع الثاني, 1447

الکلمات المفتاحية: پروتئین‌های نوترکیب, کومگاتائلا, ارگوسترول, ریبوسوئیچ‌ها, سیستم‌ کریسپر-کس9, سیالیت غشاء.,

ملخص المقالة :

سابقه و اهداف: کومگاتائلا فافی (Komagataella phaffii) به طور گسترده به‌عنوان گزینه‌ای برتر برای تولید پروتئین‌های نوترکیب شناخته شده است. بااین‌حال، کارایی آن در ترشح این پروتئین‌ها هنوز ایده‌آل نیست. یکی از عوامل محدودکننده، سختی غشای سلولی است که تا حد زیادی تحت‌تأثیر میزان ارگوسترول قرار دارد. ژن ERG11 مسئول کدگذاری آنزیم مهمی در مسیر بیوسنتز ارگوسترول است. کاهش بیان ERG11 می‌تواند باعث افزایش سیالیت غشاء و به طور بالقوه بهبود ترشح پروتئین شود. در این مطالعه، هدف ما طراحی روشی برای کنترل پویای بیان ERG11 با الحاق ریبوسوئیچ تتراسایکلین (TcRs) در ناحیه غیرکدشونده ۵′ (5′UTR) آن است. مواد و روش‌ها: از تکنیک‌های محاسباتی شامل پیش‌بینی ساختار ثانویه RNA و داکینگ مولکولی استفاده شد تا محل‌های بهینه برای الحاق ریبوسوئیچ شناسایی شوند. علاوه بر این، راهبردی مبتنی بر کریسپر-کس9 (CRISPR-Cas9) طراحی شد تا الحاق دقیق TcRs بالادست ERG11 از طریق نوترکیبی هم‌ساخت ممکن شود. نتایج: تحلیل‌های محاسباتی ما چهار محل مناسب برای وارد کردن TcRs را شناسایی کرد. یک سازه DNA دهنده شامل TcRs با دو بازوی همسان برای الحاق دقیق طراحی شد. همچنین، سه sgRNA به‌صورت راهبردی طراحی شدند تا توالی‌های مجاور محل الحاق ریبوسوئیچ را هدف قرار دهند که این امر موجب افزایش کارایی و دقت الحاق از طریق نوترکیبی هم‌ساخت می‌شود. نتیجه‌گیری: این مطالعه محل‌های مؤثر برای الحاق را مشخص و روش معتبری برای وارد کردن ریبوسوئیچ در جایگاه ژنی ERG11 ارائه می‌دهد. این روش می‌تواند به عنوان راهکاری برای تنظیم پویای سیالیت غشاء و افزایش ترشح پروتئین‌های نوترکیب در کومگاتائلا فافی مورد استفاده قرار گیرد.