بررسي اثر سوپرناتانت لاكتوباسيلوس پلانتاروم و كليستين بر رشد، آب گريزی سطحي، اگزوپلي ساكاريد خارج سلولي، و تشکيل بيوفيلم در كلبسيلا پنومونيه

الموضوعات : microbiology

فاطمه نوربخش ¹ , فائزه عبادی ² , اکرم سادات طباطبایی بفرویی ³

1 - گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، پیشوا، ایران
2 - گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 - گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

تاريخ الإرسال : 28 السبت , ربيع الأول, 1447 تاريخ التأكيد : 26 السبت , ربيع الثاني, 1447 تاريخ الإصدار : 17 الثلاثاء , ربيع الأول, 1447

الکلمات المفتاحية: کلبسیلا پنومونیه, لاکتوباسیلوس پلانتاروم, کولیستین, بیوفیلم, مقاومت ضد میکروبی, هم‌افزایی,

ملخص المقالة :

مقدمه: کلبسیلا پنومونیه یک باکتری بیماریزا است که به دلیل مقاومت آنتی‌بیوتیکی و توانایی تشکیل بیوفیلم اهمیت بسیاری دارد. این مطالعه با هدف بررسی اثر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین بر کلبسیلا پنومونیه، با تمرکز بر فعالیت ضد میکروبی و مهار بیوفیلم انجام شد.

مواد و روش‌ها: این مطالعه روی 100 نمونه بالینی از بیماران انجام شد و با استفاده از آزمایش‌های بیوشیمیایی 20 جدایه کلبسیلا پنومونیه جدا شد. حساسیت آنتی‌بیوتیکی با روش آنتی‌بیوگرام تعیین شد. حداقل غلظت مهارکننده و حداقل غلظت کشنده  برای کولیستین و سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم ارزیابی شدند. شاخص غلظت مهارکننده کسری، فعالیت ضد بیوفیلم، پراکندگی بیوفیلم، آبگریزی سطح سلول  و تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی  تحت تیمار با کولیستین و سوپرناتانت ارزیابی شدند.

یافته ها: کولیستین فعالیت ضد میکروبی بالاتری در مقایسه با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم نشان داد. شاخص مهاری از 517/0 تا 827/0 متغیر بود که نشان دهنده اثرات افزایشی است. تشکیل بیوفیلم با تیمار کولیستین در مقایسه با تیمار سوپرناتانت به طور معنی دار کاهش نشان داد (05/0 > p). پراکندگی بیوفیلم با تیمار ترکیبی در مقایسه با تیمار‌های تکی افزایش یافت. آبگریزی سطح سلول از 62% (کنترل) به 34% با تیمار ترکیبی کاهش یافت. تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی از 473 میلی‌گرم (کنترل) به 231 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر با تیمار ترکیبی کاهش یافت.

نتیجه‌گیری: ترکیب سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین افزایش اثربخشی ضد میکروبی و کنترل تشکیل بیوفیلم در برابر کلبسیلا پنومونیه را نشان داد. این رویکرد هم‌افزایی می‌تواند به طور بالقوه منجر به کاهش دوز آنتی‌بیوتیک و بهبود نتایج درمان برای عفونت‌های کلبسیلا پنومونیه شود.

المصادر:

1. Abbas R, Chakkour M, Zein El Dine H, Obaseki EF, Obeid ST, Jezzini A, et al. General Overview of Klebsiella pneumonia: Epidemiology and the Role of Siderophores in Its Pathogenicity. Biol (Basel). 2024;13(2). doi:10.3390/biology13020112

2. Riwu KHP, Effendi MH, Rantam FA, Khairullah AR, Widodo A. A review: Virulence factors of Klebsiella pneumonia as emerging infection on the food chain. Vet World. 2022;15(9):2172-9. doi:10.14202/vetworld.2022.2172-2179

3. Krasowska A, Sigler K. How microorganisms use hydrophobicity and what does this mean for human needs? Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:112. doi:10.3389/fcimb.2014.00112

4. Singh S, Datta S, Narayanan KB, Rajnish KN. Bacterial exo-polysaccharides in biofilms: role in antimicrobial resistance and treatments. J Genet Eng Biotechnol. 2021;19(1):1-9. doi:10.1186/s43141-021-00242-y

5. Geladari A, Simitsopoulou M, Antachopoulos C, Roilides E. Immunomodulatory effects of colistin on host responses against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae biofilms. Int J Antimicrob Agents. 2020;56(6):106182. doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.106182

6. Narimisa N, Goodarzi F, Bavari S. Prevalence of colistin resistance of Klebsiella pneumoniae isolates in Iran: A systematic review and meta-analysis. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2022;21(1):1-9. doi:10.1186/s12941-022-00541-3

7. El-Mokhtar MA, Hassanein KM, Ahmed AS, Gad GF, Amin MM, Hassanein OF. Antagonistic activities of cell-free supernatants of lactobacilli against extended-spectrum β-lactamase producing Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. Infect Drug Resist. 2020;13:543-52. doi:10.2147/IDR.S238588

8. Yan R, Lu Y, Wu X, Yu P, Lan P, Wu X, et al. Anticolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by Lactobacillus plantarum LP1812 through accumulated acetic acid in mice intestinal. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:1276. doi:10.3389/fcimb.2021.804177

9. Jin F, Yang H. Effects of Lactobacillus salivarius LN12 in combination with amoxicillin and clarithromycin on Helicobacter pylori biofilm in vitro. Microorganisms. 2021;9(8):1611. doi:10.3390/microorganisms9081611

10. Mirani ZA, Aziz M, Khan MN, Lal I, Hassan NU, Khan SI. Biofilm formation and dispersal of Staphylococcus aureus under the influence of oxacillin. Microb Pathog. 2013;61-62:66-72. doi:10.1016/j.micpath.2013.05.002

11. Haroun MF, Al-Kayali RS. Synergistic effect of Thymbra spicata L. extracts with antibiotics against multidrug-resistant Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae strains. Iran J Basic Med Sci. 2016;19(11):1193. doi:10.22038/IJBMS.2016.7633

12. Saidi N, Saderi H, Owlia P, Soleimani M. Anti-biofilm potential of Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus cell-free supernatant extracts against Staphylococcus aureus. Adv Biomed Res. 2023;12(1):50. doi:10.4103/abr.abr_268_22

13. Mu Y, Zeng H, Chen W. Quercetin inhibits biofilm formation by decreasing the production of EPS and altering the composition of EPS in Staphylococcus epidermidis. Front Microbiol. 2021;12:631058. doi:10.3389/fmicb.2021.631058

14. Li M, Xu X, Jia Y, Yuan Y, Na G, Zhu L, et al. Transformation of mulberry polyphenols by Lactobacillus plantarum SC-5: Increasing phenolic acids and enhancement of anti-aging effect. Food Res Int. 2024;192:114778. doi:10.1016/j.foodres.2024.114778

15. Olaitan AO, Morand S, Rolain JM. Mechanisms of polymyxin resistance: acquired and intrinsic resistance in bacteria. Front Microbiol. 2014;5:643. doi:10.3389/fmicb.2014.00643

16. Nation RL, Li J. Colistin in the 21st century. Curr Opin Infect Dis. 2015;28(6):517-25. doi:10.1097/QCO.0000000000000207

17. Li Y, Kumar S, Zhang L, Wu H. Klebsiella pneumonia and Its Antibiotic Resistance: A Bibliometric Analysis. Biomed Res Int. 2022;2022:1668789. doi:10.1155/2022/1668789

18. Oelschlaeger TA. Mechanisms of probiotic actions -- A review. Int J Med Microbiol. 2010;300(1):57-62. doi:10.1016/j.ijmm.2009.08.005

19. Gao Y, Li D, Liu J. Antimicrobial potential of Lactobacillus plantarum ZP11 by producing bacteriocins against Staphylococcus aureus. Food Control. 2019;98:274-9. doi:10.1016/j.foodcont.2018.11.023

20. Izhar MZ, Nawaz M, Yaqub T, Avais M, Anjum AA. In vitro characterization of probiotic potential of Lactobacillus plantarum CM49 against selected cattle mastitogens. BMC Microbiol. 2024;24(1):310. doi:10.1186/s12866-024-03459-2

21. Das MC, Samaddar S, Jawed JJ, Ghosh C, Acharjee S, Sandhu P, et al. Vitexin alters Staphylococcus aureus surface hydrophobicity to obstruct biofilm formation. Microbiol Res. 2022;263:127126. doi:10.1016/j.micres.2022.127126

22. Pimentel-Filho N, Martins MCF, Nogueira GB, Mantovani HC, Vanetti MCD. Bovicin HC5 and nisin reduce Staphylococcus aureus adhesion to polystyrene and change the hydrophobicity profile and Gibbs free energy of adhesion. Int J Food Microbiol. 2014;190:1-8. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.08.029

23. Gladysheva IV, Cherkasov SV. Antibiofilm activity of cell-free supernatants of vaginal isolates of Corynebacterium amycolatum against Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumonia. Arch Microbiol. 2023;205:158. doi:10.1007/s00203-023-03499-w

24. Elkashef SMM, Sahloul NS, Mowafy HL. Exploring the antibacterial potential of probiotics against colistin‑resistant Klebsiella pneumoniae: An in vitro study. Microbes Infect Dis. 2025. doi:10.21608/mid.2024.301152.1883

نص كامل:



بررسي اثر سوپرناتانت لاكتوباسيلوس پلانتاروم و كليستين بر رشد، آب گريزی سطحي، 

اگزوپلي ساكاريد خارج سلولي، و تشکيل بيوفيلم در كلبسيلا پنومونيه

 

فائزه عبادی1، فاطمه نوربخش2*، اکرم طباطبایی بفروئی1

 

1- گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2- گروه ميکروبيولوژی، دانشکده علوم زيستی، واحد ورامين-پيشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، ورامین، ایران

 

 

ارسال: 29/6/1404

بازنگری 24/7/1404

 پذیرش : 26/7/1404

 

پست الکترونیکی: [e-mail]

 

 

 

چکیده

مقدمه: کلبسیلا پنومونیه یک باکتری بیماریزا است که به دلیل مقاومت آنتی‌بیوتیکی و توانایی تشکیل بیوفیلم اهمیت بسیاری دارد. این مطالعه با هدف بررسی اثر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین بر کلبسیلا پنومونیه، با تمرکز بر فعالیت ضد میکروبی و مهار بیوفیلم انجام شد.

مواد و روش‌ها: این مطالعه روی 100 نمونه بالینی از بیماران انجام شد و با استفاده از آزمایش‌های بیوشیمیایی 20 جدایه کلبسیلا پنومونیه جدا شد. حساسیت آنتی‌بیوتیکی با روش آنتی‌بیوگرام تعیین شد. حداقل غلظت مهارکننده و حداقل غلظت کشنده برای کولیستین و سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم ارزیابی شدند. شاخص غلظت مهارکننده کسری، فعالیت ضد بیوفیلم، پراکندگی بیوفیلم، آبگریزی سطح سلول و تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی تحت تیمار با کولیستین و سوپرناتانت ارزیابی شدند.

یافته ها: کولیستین فعالیت ضد میکروبی بالاتری در مقایسه با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم نشان داد. شاخص مهاری از 517/0 تا 827/0 متغیر بود که نشان دهنده اثرات افزایشی است. تشکیل بیوفیلم با تیمار کولیستین در مقایسه با تیمار سوپرناتانت به طور معنی دار کاهش نشان داد (05/0 > p). پراکندگی بیوفیلم با تیمار ترکیبی در مقایسه با تیمار‌های تکی افزایش یافت. آبگریزی سطح سلول از 62% (کنترل) به 34% با تیمار ترکیبی کاهش یافت. تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی از 473 میلی‌گرم (کنترل) به 231 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر با تیمار ترکیبی کاهش یافت.

نتیجه‌گیری: ترکیب سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین افزایش اثربخشی ضد میکروبی و کنترل تشکیل بیوفیلم در برابر کلبسیلا پنومونیه را نشان داد. این رویکرد هم‌افزایی می‌تواند به طور بالقوه منجر به کاهش دوز آنتی‌بیوتیک و بهبود نتایج درمان برای عفونت‌های کلبسیلا پنومونیه شود.

 

کلمات کلیدی: کلبسیلا پنومونیه، لاکتوباسیلوس پلانتاروم، کولیستین، بیوفیلم، مقاومت ضد میکروبی، هم‌افزایی

 

 

شـــیوه آدرس دهـــی این مقاله : ف عبادی، ف نوربخش، ا طباطبایی بفروئی. بررسي اثر سوپرناتانت لاكتوباسيلوس پلانتاروم و كليستين بر رشد، آب گريزی سطحي، اگزوپلي ساكاريد خارج سلولي، و تشکيل بيوفيلم در كلبسيلا پنومونيه. مجله دانش زیســـتی ایـــران. 1404؛20 (1): ۱-..

 

 

 

مقدمه

کلبسیلا پنومونیه یک باکتری گرم منفی کپسول‌دار است که در سطوح مخاطی پستانداران وجود دارد. این باکتری معمولاً اوروفارنکس و دستگاه گوارش را کلونیزه می‌کند و می‌تواند به راحتی وارد گردش خون و سایر بافت‌ها شده و باعث عفونت‌هایی مانند باکتریمی، سپتی‌سمی، عفونت محل جراحی، عفونت دستگاه ادراری، پنومونی اکتسابی بیمارستانی و پنومونی مرتبط با دستگاه تنفس مصنوعی شود. یکی از ویژگی‌های مهم این باکتری، توانایی آن در تشکیل بیوفیلم است. بیوفیلم‌ها جوامعی از باکتری‌ها هستند که در یک ماتریکس خارج سلولی متشکل از پروتئین‌ها، اگزوپلی‌ساکاریدها، DNA  و لیپوپپتیدها قرار دارند (1و2).

آبگریزی سطح سلول (CSH) یک پارامتر بیوفیزیکی مهم است که بر تعامل سلول-سلول و برهمکنش سطح سلول با محیط تأثیر می‌گذارد. آبگریزی سطحی به میکروارگانیسم‌ها اجازه می‌دهد تا به قطرات هیدروکربن روی سطح سلول‌ها بچسبند و از آب به فاز آلی هیدروکربنی حرکت کنند. توانایی اتصال به سطوح برای شروع کلونیزاسیون باکتریایی بسیار مهم است (3).

اگزوپلی‌ساکارید (EPS) یک جزء کلیدی از ماتریکس بیوفیلم در بسیاری از باکتری‌های تشکیل‌دهنده بیوفیلم است و عملکرد اصلی آن نگهداری جامعه باکتریایی، تثبیت سلول‌های باکتری روی سطوح جامد و حفظ هیدراتاسیون مناسب و در دسترس بودن مواد مغذی است. کلبسیلا پنومونیه می‌تواند یک لایه ضخیم از بیوفیلم خارج سلولی تولید کند که از اتصال باکتری به سطوح زنده یا غیرزنده پشتیبانی می‌کند و از نفوذ آنتی‌بیوتیک‌ها محافظت کرده و اثرات آنها را کاهش می‌دهد(4).

آنتی‌بیوتیک‌های پلی‌میکسین مانند کولیستین (CST) یکی از معدود عوامل ضدمیکروبی هستند که علیه باکتری‌های گرم منفی مقاوم به چند دارو (MDR) فعالیت دارند و آخرین خط درمان عفونت‌های ناشی از این باکتری‌ها محسوب می‌شوند. پلی‌میکسین‌ها پپتیدهای ضدمیکروبی کاتیونی هستند که بخش فسفات لیپوپلی‌ساکارید باکتریایی (LPS) را هدف قرار می‌دهند، بار منفی غشای خارجی را مختل می‌کنند و باعث مرگ سلولی می‌شوند(5و6). 

درمان عفونت‌های جدی با باکتری کلبسیلا پنومونیه به دلیل مقاومت همزمان به آنتی‌بیوتیک‌های متعدد، بسیار دشوار است بنابراین، نیاز فوری به استراتژی‌های درمانی جدید برای این گروه‌های حیاتی از باکتری‌های بیماری‌زا وجود دارد. کودکان در برابر عوارض ناشی از آنتی‌بیوتیک‌ها مانند کولیستین آسیب‌پذیرتر هستند. در کارآزمایی برای یافتن گزینه‌های درمانی غیر آنتی‌بیوتیکی، امروزه درمان با پروبیوتیک در حال افزایش است (4).

لاکتوباسیل‌ها یکی از مهمترین پروبیوتیک‌ها هستند که به طور کلی به عنوان یک عامل درمانی بیولوژیکی ایمن  (GRAS) شناخته می‌شوند و همچنین برای تقویت پاسخ‌های ایمنی میزبان استفاده می‌شوند. مکانیسم‌های مختلفی وجود دارد که لاکتوباسیل‌ها می‌توانند فعالیت ضدمیکروبی خود را اعمال کنند، از جمله تولید ترکیبات بازدارنده، تحریک سیستم ایمنی، رقابت با باکتری‌های بیماری‌زا برای اتصال گیرنده و رقابت بر روی مواد مغذی. ترکیبات بازدارنده تولید شده توسط لاکتوباسیل‌ها شامل اسیدهای آلی مانند اسید لاکتیک، اسید استیک و اسید فرمیک یا باکتریوسین‌ها هستند. لاکتوباسیل‌ها از طریق این مکانیسم‌های ضدمیکروبی، فعالیت‌های آنتاگونیستی را علیه باکتری‌های بیماری‌زای مختلف از جمله انتروباکتریاسه‌های مقاوم به کارباپنم نشان داده‌اند (7و8).

درمان ترکیبی سوپرناتانت باکتری پروبیوتیک و آنتی‌بیوتیک، به دلیل خواص ضدباکتریایی و ضدالتهابی آنها برای جلوگیری از افزایش مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها و نیز به عنوان یک راه حل جایگزین برای کاهش استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های شیمیایی بسیار مهم است(5). با ترکیب کلیستین با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس، می توان به کاهش مصرف کلیستین و همچنین پیشگیری از ایجاد مقاومت در برابر آن کمک کرد. آبگریزی سطحی، اگزوپلی‌ساکارید خارج سلولی و تشکیل بیوفیلم از عوامل مهم در بیماری‌زایی کلبسیلا پنومونیه هستند. در این پژوهش، تأثیر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و آنتی‌بیوتیک کولیستین بر آبگریزی سطحی، اگزوپلی‌ساکارید خارج سلولی و تشکیل بیوفیلم در کلبسیلا پنومونیه مورد مطالعه قرار گرفت.

 

مواد و روش ها:

این مطالعه با کد اخلاق IR.IAU.ET.REC.1403.050 انجام شده است. در این مطالعه تعداد 100 نمونه بالینی مشکوک به عفونت کلبسیلا پنومونیه جدا شده از ادرار و خون بیماران مراجعه کننده به بیمارستان های شهر تهران (میلاد، شریعتی و امام خمینی)  از تاریخ مهر تا اسفند 1402جداسازی شد. نمونه ها روی محیط EMB و مک کانکی کشت داده شد، سپس کشت ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد نگهداری شدند و از کشت های تازه جهت تست های افتراقی مانند رنگ آمیزی گرم، کشت در محیط‌های SIM، TSI، MRVP، اوره آز و سیمون سیترات برای تأیید کلبسیلا پنومونیه انجام شد.  بعد از انجام تست های افتراقی تعداد 20 سویه جدا شد.

 

تهیه‌ی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم

سویه لاکتوباسیل از سازمان پژوهش های علمی و صنعتی (ATCC 14917) تهیه شد. برای تهیه‌ی محلول رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم، باکتری‌ها به محیط کشت مایع de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) تلقیح شده و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و در شرایط بی‌هوازی انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، کشت باکتریایی به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با سرعت 10000 × g سانتریفیوژ شد تا سلول‌های باکتریایی ته‌نشین شوند. سپس محلول رویی با دقت جمع‌آوری شد و اطمینان حاصل شد که هیچ سلول باکتریایی به آن منتقل نشده باشد. در ادامه، محلول رویی با استفاده از فیلتر غشایی 22/0 میکرومتری استریل شد تا هرگونه باکتری باقی‌مانده حذف شود. محلول رویی بدون سلول (CFS) حاصل در دمای -20 درجه سانتی‌گراد تا زمان استفاده نگهداری شد. قبل از انجام آزمایش‌ها، pH محلول رویی به حالت خنثی (7=pH) تنظیم شد تا تاثیر اسیدیته حذف شود و اطمینان حاصل شود که هرگونه اثر مشاهده شده بر روی کلبسیلا پنومونیه به دلیل متابولیت‌های ضد میکروبی است.

 

تعیین حداقل غلظت بازدارندگی (MIC)

برای تعیین MIC از روش سریال دایلوشن به صورت سه تکرار در محیط کشت مولرهینتون براث (MHB) استفاده شد. بدین صورت که ابتدا به تمامی چاهک های مورد مطالعه 100 میکرولیتر از محیط MHB افزوده شد. سپس به چاهک های ردیف اول 100 میکرولیتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم  با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر اضافه شد و به روش سریال دایلویشن تا آخرین چاهک مورد مطالعه رقیق سازی انجام گردید. در انتها100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری کلبسیلا پنومونیه با غلظت 106 (100/1 کدورت نیم مک فارلند) به تمامی چاهک های مورد مطالعه افزوده شد. برای هر پلیت یک چاهک کنترل مثبت (محیط کشت و سوسپانسیون باکتری) و یک چاهک کنترل منفی (محیط کشت) استفاده شد. پلیت ها در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت در گرمخانه تیمار شدند.تمامی این مراحل برای آنتی بیوتیک کولیستین (با غلظت 5/7 میکروگرم در میلی لیتر) نیز انجام شد. نهایتاً، کدورت تمام چاهک ها با استفاده از دستگاه الیزا در طول موج 620 نانومتر خوانش شدند. 

 

بررسی تشکیل بیوفیلم در سویه های جمع آوری شده به روش میکروتیتر پلیت

ابتدا محیط کشت Trypic Soy Broth(TSB) حاوی 2% گلوکز تهیه و استریل گردید. برای تهیه سوسپانسیون باکتری، سویه های مورد مطالعه در مقداری از محیط TSB حاوی 2% گلوکز به کدورت نیم مک فارلند رسانده شد. در انتها در یک پلیت 96 خانه به هر چاهک سوسپانسیون باکتری یاد شده اضافه شد. 3چاهک کنترل منفی که در آن باکتری اضافه نشده بود (عدم رشد باکتری در نتیجه عدم تشکیل بیوفیلم) و 3 چاهک کنترل مثبت که حاوی باکتری بود (رشد باکتری و تشکیل بیوفیلم) در پلیت استفاده شد. جهت بررسی اثر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس بر تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه، بعد از تهیه سوسپانسیون نیم مک فارلند از سویه های مورد مطالعه در محیط کشت TSB حاوی 2% گلوکز در هنگام اضافه کردن سوسپانسیون باکتری به چاهک ها، غلظت MIC سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم نیز به چاهک ها اضافه شد. سپس پلیت ها 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه گردید(10).

 

روش رنگ آمیزی برای مطالعه بیوفیلم

ابتدا محیط کشت ها از داخل چاهک ها دور ریخته شد. چاهک ها 1 الی 2 بار با بافر PBS شستشو داده شد. بعد از شستشوی مرحله قبل و خالی کردن چاهک ها به چاهک ها متانول مطلق افزوده و در دمای اتاق انکوبه گردید سپس متانول دور ریخته شد و پلیت ثابت گذاشته شد تا الکل از آن حذف شود. به چاهک ها کریستال ویوله 1% اضافه گردید و در دمای اتاق انکوبه شد. با آب مقطر چاهک ها شستشو داده شد تا رنگ اضافی حذف گردد. در انتها چاهک ها خالی گردید. به هر یک از چاهک ها استیک اسید گلاسیال 33% افزوده شد و بعداز گذشت 20 دقیقه پلیت با دستگاه الایزا ریدر با طول موج 570 نانومتر خوانده شد.

برای بررسی نتایج از روش Optical density cut-off (ODc) استفاده گردید. به منظور بررسی طبق فرمول زیر محاسبه انجام گرفت(10).

ODc = چاهک های کنترل منفی OD میانگین + (3 × انحراف معیار چاهک های کنترل منفی)

بعداز محاسبه ی ODc یا کات اف، OD چاهک های مورد مطالعه به صورت زیر دسته بندی گردید(9).

بیوفیلم قوی OD>4×Odc، بیوفیلم متوسط 2×ODc<OD≤4×Odc، بیوفیلم ضعیف  ODc<OD≤2×ODcو

بیوفیلم منفی OD≤Odc

 

ارزیابی پراکندگی بیوفیلم

پس از تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه، سلول‌های پلانکتونی با شستشوی ملایم چاهک‌ها سه بار با 200 میکرولیتر محلول نمکی فسفات (PBS) حذف شدند. برای ارزیابی پراکندگی بیوفیلم، 100 میکرولیتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم، کولیستین یا ترکیبی از هر دو به چاهک‌ها اضافه شد، که شامل کنترل‌های مناسب مانند کنترل مثبت (بیوفیلم بدون تیمار با ماده)، کنترل منفی (محیط کشت استریل بدون باکتری)،کنترل سوپرناتانت (فقط سوپرناتانت و محیط کشت)، کنترل کولیستین (فقط کولیستین و محیط کشت). پلیت به مدت 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد تا پراکندگی بیوفیلم رخ دهد. پس از انکوباسیون، محلول‌های تیمار حذف شدند و چاهک‌ها سه بار با PBS شسته شدند. بیوفیلم باقی مانده با افزودن 200 میکرولیتر محلول کریستال ویوله 1/0٪ به هر چاهک رنگ‌آمیزی شد و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس چاهک‌ها سه بار با PBS شسته شدند تا رنگ اضافی حذف شود و کریستال ویوله متصل شده با افزودن 200 میکرولیتر اتانول 95٪ یا اسید استیک 30٪ به هر چاهک حل شد. جذب در 570 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانش میکروپلیت برای تعیین مقدار پراکندگی بیوفیلم اندازه‌گیری شد. درصد پراکندگی بیوفیلم با مقایسه جذب چاهک‌های تیمار شده با چاهک‌های کنترل تعیین شد. همه آزمایش‌ها به صورت سه تایی انجام شدند تا تکرارپذیری تضمین شود. فرمول محاسبه درصد پراکندگی بیوفیلم به صورت زیر است:

% پراکندگی بیوفیلم = [(AC - AT) / AC] × 100

که در آن، AC: جذب کنترل (بیوفیلم بدون تیمار) در 570 نانومتر و AT: جذب چاهک تیمار شده (با مایع رویی، کولیستین، یا ترکیب هر دو) در 570 نانومتر(10).

 

تعیین شاخص FIC

برای تعیین شاخص FIC (غلظت مهاری کسری) سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین در برابر کلبسیلا پنومونیه، از روش رقیق‌سازی میکروپلیت به صورت شطرنجی استفاده ‌شد. ابتدا، سوپرناتانت با کشت لاکتوباسیلوس پلانتاروم، سانتریفیوژ و فیلتر کردن تهیه ‌شد. همچنین محلول استوک کولیستین نیز تهیه ‌شد. سپس، رقت‌های سریالی دو برابری از کولیستین و سوپرناتانت در یک پلیت 96 خانه‌ای تهیه شده و سپس سوسپانسیون کلبسیلا پنومونیه به آن اضافه ‌شد. پس از 3 روز انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 5٪ CO2، MIC  (حداقل غلظت مهاری) کولیستین وسوپرناتانت به تنهایی و در ترکیب با یکدیگر، با بررسی بصری کدورت و اندازه‌گیری OD600 تعیین ‌شد. در نهایت، شاخص FIC با استفاده از فرمول زیر محاسبه ‌شد (11) :

 

FIC = (ترکیب کولیستین با سوپرناتانت MIC / کولیستین به تنهایی MIC) + (ترکیب کولیستین با سوپرناتانت MIC /  سوپرناتانت به تنهاییMIC)

 

بر اساس نتیجه، تعامل به صورت هم‌افزایی، افزایشی، بی‌تفاوت یا آنتاگونیستی صورت زیر تفسیرمی شود.

FIC ≤ 0.5 هم‌افزایی (Synergistic)، 0.5 < FIC ≤ 1 افزایشی (Additive)، 1 < FIC ≤ 4 بی‌تفاوت (Indifferent)، FIC > 4 آنتاگونیستی (Antagonistic) 

 

ارزیابی آب گریزی سطح سلول  (CSH)

برای ارزیابی آب گریزی سطح سلول (CSH)، از روش چسبندگی میکروبی به حلال (MATS) با استفاده از هگزادکان به عنوان حلال استفاده شد. باکتری کلبسیلا پنومونیه در محیط کشت تریپتیک سوی براث (TSB) حاوی غلظت‌ زیرمهاری سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم یا کولیستین به مدت 24 ساعت کشت داده شد. پس از انکوباسیون، سلول‌های باکتریایی با سانتریفیوژ در 7000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه جمع‌آوری و یک بار با محلول نمکی فسفات (PBS) شستشو داده شدند تا محیط کشت باقی مانده حذف شود. سپس یک سوسپانسیون باکتریایی در PBS تهیه شد و چگالی نوری (OD) در 600 نانومتر به 3/0 (OD1) تنظیم شد. به 8/0 میلی‌لیتر هگزادکان به 2/5 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتریایی اضافه شد و مخلوط ورتکس شد تا امولسیون ایجاد شود. پس از یک دوره انکوباسیون 20 دقیقه‌ای که اجازه جداسازی فاز را می‌دهد، OD  فاز آبی در 600 نانومتر (OD2) اندازه‌گیری شد. یک گروه کنترل متشکل از کلبسیلا پنومونیه کشت داده شده بدون سوپرناتانت یا کولیستین برای مقایسه استفاده شد. سپس CSH به صورت درصد با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد(12).

CSH٪ = 1 – (OD2/OD1) × 100

ارزیابی محتوای پلی‌ساکارید خارج سلولی (EPS) 

برای این آزمایش ابتدا، کلبسیلا پنومونیه  در محیط کشت لوریا-برتانی کشت داده شد و به مدت یک شب در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد با تکان دادن (با سرعتrpm  ۱۵۰) انکوبه شد. سپس، کشت باکتری به چند قسمت مساوی تقسیم شد و هر قسمت تحت تیمار متفاوتی قرار گرفت: کنترل منفی (بدون تیمار، فقط محیط کشت و باکتری)، تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم ، تیمار با کولیستین و تیمار ترکیبی با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین. کشت‌ها به مدت ۲۴ ساعت در دمایC  ° 37 درجه با تکان دادن انکوبه شدند. پس از انکوباسیون، کشت‌ها با سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند تا سلول‌های باکتریایی رسوب کنند و مایع رویی حاوی EPS جمع‌آوری شد. برای رسوب  EPS، به مایع رویی سه برابر حجم اتانول مطلق سرد (ترجیحاً در دمای -۲۰ درجه سانتی‌گراد) اضافه شد و سپس به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد تا EPS به طور کامل رسوب کند. سپس EPS رسوب کرده با سانتریفیوژ درrpm ۴۰۰۰ به مدت ۲۰ دقیقه در دمای C  ° 4 بازیابی شد. رسوب حاصل به دقت خشک و سپس در حجم ۱ میلی‌لیتر آب مقطر حل شد. برای تعیین مقدار EPS، از روش فنل-سولفوریک اسید استفاده شد. به طور خلاصه، ۲۰۰ میکرولیتر از نمونه EPS حل شده با ۲۰۰ میکرولیتر محلول فنل ۵% مخلوط شد. سپس ۱ میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ (۹۵-%۹۸) به آرامی و با احتیاط به مخلوط اضافه شد. لوله به خوبی ورتکس شد و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد تا واکنش رنگی کامل شود. جذب نوری (OD) در طول موج ۴۹۰ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. غلظت EPS با مقایسه جذب نمونه‌ها با منحنی استاندارد گلوکز محاسبه شد. نتایج به صورت میکروگرم در میلی‌لیتر EPS بیان شدند (13).

 

تحلیل داده‌ها

برای تحلیل داده‌ها از روش‌های آماری مختلفی استفاده شد. داده‌های به‌دست‌آمده از سنجش‌های مهار رشد، آزمایش‌های آبگریزی سطحی، کمی‌سازی پلی‌ساکارید خارج سلولی (EPS) و سنجش‌های تشکیل بیوفیلم ابتدا با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk از نظر نرمال بودن بررسی شدند. سپس داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) از حداقل سه آزمایش مستقل بیان شدند. برای ارزیابی اهمیت آماری تفاوت‌ها بین گروه‌های تیمار شده و کنترل، از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA)  و به دنبال آن آزمون post-hoc Tukey استفاده شد. برای مقایسه‌های دوتایی، در صورت لزوم از آزمون t مستقل استفاده شد. مقدار p کمتر از 05/0 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد. تمام تحلیل‌های آماری با استفاده از نرم‌افزارهای آماری SPSS (نسخه 25) انجام شد.

 

نتایج

از مجموع 100 نمونه مورد بررسی از نمونه های بیمارستانی، 20 جدایه با استفاده از تست‌های تشخیصی افتراقی کلبسیلا تشخیص داده شدند.

 

نتایج MIC ایزوله های کلبسیلا پنومونیه

آنالیزهای حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) کولیستین و سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم در 20 جدایه کلبسیلا پنومونیه، حساسیت‌های متفاوتی را نسبت به هر دو عامل ضد میکروبی نشان داد. کولیستین MICهایی را در محدوده  µg/ml 937/0 تا 75/3 (میانگینµg/ml 45/1) و  MBCهایی را از µg/ml 937/0 تا 5/7 (میانگین  µg/ml 81/2) نشان داد. سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم طیف وسیع‌تری از MICها (37/9 تا 150 ؛ میانگین µg/ml 09/81) و MBCها ( µg/ml 375/9 تا >150) را نشان داد نتایج کمی و آزمون آماری نشان می‌دهند که کولیستین از حیث هر دو شاخص MIC و MBC به‌طور معنی‌داری (05/0 > p) مؤثرتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم است (نمودار 1)

 

 

نمودار 1.  مقادیر میانگین MIC  و MBC  کولیستین وسوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم برای ایزوله های کلبسیلا پنومونیه

 

شاخص غلظت مهارکننده جزئی (FIC)

شاخص‌های FIC برای ایزوله‌های آزمایش شده از 517/0 تا 827/0 با میانگین شاخص FIC  659/0  متغیر بود. که نشان دهنده تعامل افزایشی بین سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کلیستین است. قابل ذکر است که هیچ یک از ایزوله‌ها تعاملات بی‌تفاوت یا آنتاگونیستی را نشان ندادند. این نتایج نشان می‌دهد که ترکیب سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم با کلیستین می‌تواند به طور بالقوه اثربخشی آنتی‌بیوتیک را در برابر کلبسیلا پنومونیه افزایش دهد، که به طور بالقوه امکان دوزهای کمتر کلیستین را فراهم می‌کند و خطر سمیت مرتبط را کاهش می‌دهد.

 

اثر سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کلیستین بر تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه

در مطالعه حاضر تمامی سویه های کلبسیلا پنومونیه مورد بررسی توانایی تشکیل بیوفیلم قوی را نشان دادند.برای بررسی مهار تشکیل بیوفیلم در سویه های مورد مطالعه از غلظت های MIC2/1 سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کلیستین استفاده شد. میزان تشکیل بیوفیلم سویه های مورد مطالعه پس از تیمار با غلظت MIC2/1 سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم به صورت بیوفیلم قوی با 45% ، بیوفیلم متوسط با 35%و  بیوفیلم ضعیف %20 فراوانی مشاهده شد کاهش بیوفیلم «قوی» در مقایسه با کنترل در سطح 05/0 > p معنی‌دار بود.  پس از تیمار با غلظت MIC 2/1 کلیستین  به صورت، بیوفیلم قوی با 6% و بیوفیلم متوسط 12% و بیوفیلم ضعیف 82% فراوانی مشاهده شد این تغییرات در مقایسه با گروه کنترل در سطح 05/0 > p معنی‌دار بودند. ترکیب MIC 2/1 کولیستین با MIC 2/1 سوپرناتانت با فراوانی بیوفیلم قوی 28% ، بیوفیلم متوسط 58%و بیوفیلم ضعیف 14% مشاهده شد مقایسه پس از آزمون (Tukey) نشان داد که این کاهش در برابر هر سه تیمار دیگر در سطح 05/0 > p  معنی‌دار است.

 

 

نمودار2. تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه پس از تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم  و کولیستین و ترکیب آنها

 

سنجش پراکندگی بیوفیلم

نتایج سنجش پراکندگی بیوفیلم، اثربخشی مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین را به صورت جداگانه و ترکیبی، بر تخریب بیوفیلم تشکیل شده توسط کلبسیلا پنومونیه نشان می‌دهد. نمونه کنترل چگالی نوری نسبتاً بالایی در 570 نانومتر (15/0) نشان داد که نشان‌دهنده حضور قابل توجه بیوفیلم است. تیمار با MIC 2/1 کولیستین اثر قوی پراکندگی بیوفیلم با فراوانی 6/84% نسبت به گروه کنترل را نشان ‌داد. MIC 2/1 سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم نیز پراکندگی 6/38% را نشان داد. به طور قابل توجهی، ترکیب 2/1 MIC کولیستین و 2/1 CFS  پراکندگی 56% را نشان می‌دهد و نشان‌دهنده اثر هم‌افزایی بین دو تیمار است. کاهش جزئی در بیوفیلم توسط تیمار ترکیبی نشان می‌دهد که در حالی که کولیستین به تنهایی بسیار موثر است، افزودن مایع رویی نشان می‌دهد که در حالی که هم کولیستین و هم مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم به طور مستقل تشکیل بیوفیلم را مختل می‌کنند، ترکیب آنها ممکن است یک استراتژی درمانی بالقوه برای افزایش پراکندگی بیوفیلم در کلبسیلا پنومونیه ارائه دهد و احتمالاً مقاومت باکتریایی مرتبط با عفونت‌های مرتبط با بیوفیلم را کاهش دهد. آزمون چندمقایسه‌ای Tukey نشان داد که ترکیب در مقایسه با هر سه گروه دیگر (و همچنین هر دو تیمار منفرد در مقایسه با کنترل) تفاوت معنی‌دار دارد (01/0 > p).

 

 

نمودار 3. سنجش پراکندگی بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه پس از تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم  و کولیستین و ترکیب آنها

 

سنجش آب گریزی سطح سلول

نتایج سنجش آب گریزی سطح سلول تغییرات قابل توجهی را در خواص سطحی کلبسیلا پنومونیه پس از تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین، به صورت جداگانه و ترکیبی، نشان می‌دهد. نمونه کنترل آبگریزی بالایی معادل 62% قوی، 33% متوسط و 5% ضعیف را نشان داد که نشان‌دهنده خاصیت آب گریزی قوی است که معمولاً با افزایش چسبندگی باکتریایی و تشکیل بیوفیلم مرتبط است. تیمار با  MIC 2/1کولیستین منجر به کاهش قابل توجه آب گریزی به 24% قوی، 13% متوسط و 63% ضعیف شد که نشان می‌دهد کولیستین به طور موثر آب گریزی کلبسیلا پنومونیه را کاهش می‌دهد و به طور بالقوه توانایی آن را برای چسبیدن به سطوح و تشکیل بیوفیلم را مختل می‌کند این تغییر در سطح 05/0 > p نسبت به کنترل معنی‌دار بود. سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم در غلظت MIC  2/1 نیز آبگریزی سطح سلول را کاهش داد، که به صورت 51% قوی، 21% متوسط و 28% ضعیف مشاهده شد ( 05/0 > p )، سوپرناتانت تأثیر متوسطی بر آب گریزی سطحی کلبسیلا پنومونیه دارد. تیمار ترکیب  MIC 2/1 کولیستین و  MIC 2/1 سوپرناتانت منجر به ایجاد  آبگریزی سطحی به صورت  34% قوی، 18% متوسط و 48% ضعیف شد که نشان‌دهنده کاهش بیشتر آبگریزی در مقایسه با سوپرناتانت  به تنهایی است، اما به اندازه کولیستین به تنهایی مشخص نیست. اختلاف این مقادیر با هر سه گروه دیگر در آزمون Tukey در سطح 01/0 > p  معنی‌دار بود (نمودار4).

 

 

نمودار4. سنجش آب گریزی سطح سلول کلبسیلا پنومونیه پس از تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم  و کولیستین و ترکیب آنها

 

تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی

تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی (EPS) نشان داد که قرار گرفتن در معرض کلیستین و سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم، به طور معنی داری محتوای EPS را در کلبسیلا پنومونیه کاهش می‌دهد. گروه کنترل بیشترین میزان تولید EPS (32±473 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر کشت) را نشان داد که بیانگر سنتز قوی EPS در شرایط رشد استاندارد است. تیمار با MIC2/1 کلیستین منجر به کاهش  تولید EPS (15±172 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر) شد که نشان دهنده اثر مهاری آنتی‌بیوتیک بر سنتز EPS است. همچنین، قرار گرفتن در معرض MIC 2/1 سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم منجر به کاهش محتوای EPS (12±326 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر) شد که نشان دهنده وجود عوامل مهارکننده EPS در سوپرناتانت است. تیمار ترکیب MIC 2/1 کلیستین و MIC2/1  سوپرناتانت منجر به کاهش EPS (9±231 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر) در سطح تولید شد که کمتر از سوپرناتانت به تنهایی اما بیشتر از کلیستین به تنهایی بود. این مشاهده نشان دهنده یک اثر هم‌افزایی بالقوه، هرچند نه کاملاً افزایشی، از دو تیمار در کاهش تولید EPS در کلبسیلا پنومونیه است. تحلیل واریانس یک‌طرفه که روی مقادیر EPS چهار گروه انجام شد، اختلاف میانگین‌ها را به‌طور بسیار معنی‌داری تأیید کرد (001/0p < ). (نمودار5).

 

 

نمودار5.  تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی سلول کلبسیلا پنومونیه پس از تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم  و کولیستین و ترکیب آنها

بحث

کلبسیلا پنومونیه، یک پاتوژن (عامل بیماری‌زا) مضر، مسئول انواع عفونت‌ها، به ویژه در افراد دارای نقص ایمنی است و توانایی آن در ایجاد مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های متعدد، از جمله گزینه‌های آخرین راه حل مانند کولیستین، منجر به شکست درمان و افزایش میزان مرگ و میر شده است. ظهور سویه‌های مقاوم به چند دارو (MDR) بر فوریت نیاز به رویکردهای جدید برای مبارزه با این پاتوژن تأکید می‌کند. در این زمینه، استفاده از مواد مشتق شده از پروبیوتیک‌ها، مانند سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم، به دلیل خواص ضد میکروبی بالقوه‌شان مورد توجه قرار گرفته است. لاکتوباسیلوس پلانتاروم به دلیل توانایی خود در تولید ترکیبات زیست فعال که می‌توانند رشد و عوامل بیماری‌زای مختلف را مهار کنند، شناخته شده است (14).

نتایج حداقل غلظت مهارکننده (MIC) و حداقل غلظت کشنده (MBC) نشان داد که کولیستین مؤثرتر از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم است، این مطالعه همچنین تعامل بین این دو عامل را از طریق شاخص غلظت مهارکننده کسری (FIC) بررسی کرد، که عمدتاً اثر افزایشی را نشان داد، و برخی از جدایه‌ها هم‌افزایی را نشان دادند. این تعاملات هم‌افزایی نشان می‌دهد که مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم می‌تواند اثربخشی کولیستین را افزایش دهد، که به طور بالقوه امکان کاهش دوزها و به حداقل رساندن خطرات سمیت را فراهم می‌کند.

با مقایسه این نتایج با مطالعات قبلی، آشکار است که کولیستین همچنان یک آنتی‌بیوتیک قوی آخرین راه حل در برابر کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چند دارو است، همانطور که در مطالعات مختلف مستند شده است (15و16) با این حال، ظهور مقاومت به کولیستین یک نگرانی رو به رشد است(17).  تحقیقات Oelschlaeger (2010) و دیگران به پتانسیل ضد میکروبی سویه‌های پروبیوتیک اشاره کرده است(18). نتایج مطالعه حاضر که اثربخشی قابل ملاحظه مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم را نشان می‌دهد با این تنوع مطابقت دارد، که نشان می‌دهد همه سویه‌های پروبیوتیک یا متابولیت‌های آنها دارای خواص ضد باکتریایی قوی نیستند.

هم‌افزایی مشاهده شده بین کولیستین و مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم می‌تواند به چندین مکانیسم بالقوه نسبت داده شود. یک احتمال این است که ترکیبات مایع رویی ممکن است نفوذپذیری دیواره سلولی باکتری را تغییر دهند، کولیستین آنتی بیوتیکی است که بر هم ریختگی در غشاء خارجی در دیواره باکتری و غشاء سیتوپلاسمی ایجاد می کند و در نتیجه تعامل این دو عامل موجب از بین رفتن باکتری می گردد. Gao  و همکاران نیز نشان دادند برخی از ترکیبات زیست فعال می‌توانند غشاهای باکتریایی را مختل کنند(19). این مطالعات نشان می دهد ترکیب آنتی بیوتیک ها و ترکیبات زیست فعال لاکتوباسیل ها می تواند یک رویکرد جدید برای درمان بیماری های عفونی و درمان های ضد میکروبی در باکتری های بیماری زای بیمارستانی مقاوم به چند دارو باشد 

در این مطالعه خواص ضد بیوفیلم سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم و کولیستین در برابر کلبسیلا پنومونیه پرداخته شد و بر توانایی هر دو عامل در مهار و پراکنده کردن بیوفیلم‌ها تأکید می‌کند. در نمونه‌های کنترل تیمار نشده، تشکیل قوی بیوفیلم مشاهده شد. تیمار با کولیستین به طور قابل توجهی تشکیل بیوفیلم را کاهش داد و به حالت تشکیل بیوفیلم ضعیف تبدیل شد. در همین حال، سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم منجر به کاهش بیوفیلم و تبدیل آن از حالت قوی به متوسط شد. قابل ذکر است که ترکیب هر دو عامل نیز تشکیل بیوفیلم را بیشتر کاهش داد و به حالت ضعیف رسید، که نشان دهنده تعامل هم‌افزایی است که اثرات مهاری آنها را افزایش می‌دهد. سنجش پراکندگی بیوفیلم این یافته‌ها را تأیید کرد، جایی که کولیستین به تنهایی حضور بیوفیلم را به حالت ضعیف کاهش داد و توانایی‌های پراکندگی قوی را نشان داد. این نتایج همراستا با مطالعه Bayatinejad به پتانسیل این عوامل به عنوان عوامل موثر در کاهش تشکیل بیوفیلم و به عنوان یک استراتژی در درمان عفونت با کلبسیلا پنومونیه دلالت دارد(19). تحقیقات نشان داده‌اند که برخی متابولیت‌های تولیدشده توسط پروبیوتیک‌ها، مانند اسیدهای آلی، پراکسید هیدروژن و ترکیبات ضد میکروبی دیگر، قادرند بیوفیلم‌های باکتریایی را به طور مستقیم یا غیرمستقیم مختل کنند. این اختلال می‌تواند شامل تغییر در چسبندگی سلولی، کاهش تولید پلی‌ساکاریدهای ماتریکس یا تخریب کامل ساختار بیوفیلم باشد (20).

نتایج سنجش CSH نشان می‌دهد که کلبسیلا پنومونیه تیمار نشده سطح آبگریزی بالایی را نشان می‌دهد که ارتباط نزدیکی با ظرفیت آن برای افزایش چسبندگی و تشکیل بیوفیلم دارد. تیمار با کولیستین به طور قابل توجهی CSH را کاهش داد، که نشان می‌دهد کولیستین به طور مؤثر ماهیت آبگریز سطح سلول را مختل می‌کند و به طور بالقوه توانایی باکتری‌ها را برای چسبیدن و تشکیل بیوفیلم مختل می‌کند. در همین حال، تیمار با سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم به تنهایی CSH به طور متوسطی کاهش داد. با این حال، ترکیب کولیستین و سوپرناتانت اثر افزایشی بر CSH نشان داد، اگرچه به اندازه کولیستین به تنهایی مؤثر نیست. این کاهش متوسط نشان می‌دهد که تیمار ترکیبی ممکن است مزایای بیشتری در کاهش چسبندگی باکتری در مقایسه با مایع رویی به تنهایی ارائه دهد.

علاوه بر این، تجزیه و تحلیل تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی نشان داد که کلبسیلا پنومونیه تیمار نشده 473 میلی‌گرم EPS  در 100 میلی‌لیتر کشت تولید می‌کند، که بر ظرفیت قوی سنتز EPS آن تأکید می‌کند، که برای توسعه بیوفیلم و حدت بسیار مهم است. تیمار با کولیستین به تنهایی منجر به کاهش چشمگیر تولید EPS به 9/68% شد، که نشان دهنده توانایی قوی آن در مهار سنتز EPS است. در مقابل، تیمار با مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم محتوای EPS را به 4/36% کاهش داد، که نشان می‌دهد مایع رویی حاوی عواملی است که به طور متوسط تولید EPS را مهار می‌کنند. هنگامی که کولیستین و مایع رویی با هم ترکیب شدند، تولید EPS را به 8/48% کاهش دادند، این نتیجه نشان دهنده تعامل هم‌افزایی بین دو عامل در کاهش تولید EPS است، اگرچه این اثر کاملاً افزایشی نیست.  Das و همکاران (2022) در مطالعه خود بر روی اثر ویتکسین مشاهده کردند که این ترکیب موجب کاهش 35 درصدی آبگریزی سطح سلول و کاهش 45 درصدی میزان EPS شد، به گونه‌ای که تشکیل بیوفیلم به طور قابل توجهی کاهش یافت (21)؛ افزون بر این، Pimentel-Filho و همکاران (2014) با به کارگیری ترکیباتی مانند Bovicin HC5 و نینیس نشان دادند که کاهش 60 درصدی در چسبندگی سلولی و تغییر قابل‌توجهی در انرژی آزاد گیبس، به ویژه کاهش 20 درصدی انرژی چسبندگی، می‌تواند زمینه‌ساز مهار موفقیت‌آمیز تشکیل بیوفیلم شود(22) در مطالعه دیگر Gladysheva  نشان داد CFS  استخراج‌شده از سویه‌های واژینال Corynebacterium amycolatum  کاهش قابل‌توجه در تولید اگزوپلی‌ساکارید (EPS) که یکی از اجزای کلیدی ماتریکس بیوفیلم محسوب می‌شود، ایجاد می کند که مؤید نقش فعال ترکیبات موجود در CFS در مهار سنتز یا ترشح پلی‌ساکاریدهای خارج‌سلولی است. همچنین تیمار با CFS باعث تغییر در هیدروفوبیسیته سطحی باکتری‌ها شده است. این تغییرات احتمالاً منجر به کاهش توان چسبندگی باکتری به سطح‌های زنده یا غیرزنده و در نتیجه مهار اولیه تشکیل بیوفیلم می‌گردد (23).

مکانیسم‌های بالقوه‌ای که زیربنای این نتایج هستند، می‌توانند به تعاملات پیچیده بین کولیستین و مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم با ساختار پوشش سلولی باکتری و ماتریکس بیوفیلم مرتبط باشند. کولیستین، به‌عنوان یک آنتی‌بیوتیک پلی‌کاتیونی، از طریق اتصال به لیپوپلی‌ساکاریدهای موجود در غشای خارجی باکتری‌های گرم‌منفی عمل می‌کند. این اتصال باعث تغییر ساختار غشا، اختلال در یکپارچگی آن، و در نهایت افزایش نفوذپذیری غشا می‌شود. این فرایند تخریبی می‌تواند منجر به نشت محتوای سلولی و متعاقباً مرگ سلولی شود. از سوی دیگر، مایع رویی لاکتوباسیلوس پلانتاروم ممکن است با تولید ترکیبات زیست‌فعال ساختار بیوفیلم و غشای سلولی باکتری را هدف قرار دهد. این ترکیبات می‌توانند ماتریکس بیوفیلم را تضعیف کرده و باعث تخریب بخش‌هایی از آن شوند که معمولاً به‌عنوان یک سد حفاظتی برای باکتری عمل می‌کنند. چنین تغییری نه تنها اثربخشی کولیستین را افزایش می‌دهد بلکه ممکن است حساسیت سلول‌های باکتریایی نسبت به سایر عوامل ضد میکروبی را نیز تقویت کند (24).  

 

نتیجه گیری

یافته‌های این مطالعه بر پتانسیل چندوجهی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس پلانتاروم در مختل کردن مراحل مختلف بیماری‌زایی کلبسیلا پنومونیه تأکید می‌کند. با تداخل در چسبندگی باکتری‌ها، تشکیل بیوفیلم و تولید عوامل حدت، سوپرناتانت می‌تواند به طور بالقوه اثربخشی کولیستین را افزایش داده و از ظهور مقاومت جلوگیری کند. این تعامل هم‌افزایی یا افزایشی می‌تواند امکان دوزهای کمتر کولیستین را فراهم کند و به طور بالقوه خطر سمیت مرتبط را در حالی که اثربخشی درمانی را حفظ می‌کند، کاهش دهد.

 

 

References

1. Abbas R, Chakkour M, Zein El Dine H, Obaseki EF, Obeid ST, Jezzini A, et al. General Overview of Klebsiella pneumonia: Epidemiology and the Role of Siderophores in Its Pathogenicity. Biol (Basel). 2024;13(2). doi:10.3390/biology13020112

 

2. Riwu KHP, Effendi MH, Rantam FA, Khairullah AR, Widodo A. A review: Virulence factors of Klebsiella pneumonia as emerging infection on the food chain. Vet World. 2022;15(9):2172-9. doi:10.14202/vetworld.2022.2172-2179

 

3. Krasowska A, Sigler K. How microorganisms use hydrophobicity and what does this mean for human needs? Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:112. doi:10.3389/fcimb.2014.00112

 

4. Singh S, Datta S, Narayanan KB, Rajnish KN. Bacterial exo-polysaccharides in biofilms: role in antimicrobial resistance and treatments. J Genet Eng Biotechnol. 2021;19(1):1-9. doi:10.1186/s43141-021-00242-y

 

5. Geladari A, Simitsopoulou M, Antachopoulos C, Roilides E. Immunomodulatory effects of colistin on host responses against carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae biofilms. Int J Antimicrob Agents. 2020;56(6):106182. doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.106182

 

6. Narimisa N, Goodarzi F, Bavari S. Prevalence of colistin resistance of Klebsiella pneumoniae isolates in Iran: A systematic review and meta-analysis. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2022;21(1):1-9. doi:10.1186/s12941-022-00541-3

 

7. El-Mokhtar MA, Hassanein KM, Ahmed AS, Gad GF, Amin MM, Hassanein OF. Antagonistic activities of cell-free supernatants of lactobacilli against extended-spectrum β-lactamase producing Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. Infect Drug Resist. 2020;13:543-52. doi:10.2147/IDR.S238588

 

8. Yan R, Lu Y, Wu X, Yu P, Lan P, Wu X, et al. Anticolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae by Lactobacillus plantarum LP1812 through accumulated acetic acid in mice intestinal. Front Cell Infect Microbiol. 2021;11:1276. doi:10.3389/fcimb.2021.804177

 

9. Jin F, Yang H. Effects of Lactobacillus salivarius LN12 in combination with amoxicillin and clarithromycin on Helicobacter pylori biofilm in vitro. Microorganisms. 2021;9(8):1611. doi:10.3390/microorganisms9081611

 

10. Mirani ZA, Aziz M, Khan MN, Lal I, Hassan NU, Khan SI. Biofilm formation and dispersal of Staphylococcus aureus under the influence of oxacillin. Microb Pathog. 2013;61-62:66-72. doi:10.1016/j.micpath.2013.05.002

 

11. Haroun MF, Al-Kayali RS. Synergistic effect of Thymbra spicata L. extracts with antibiotics against multidrug-resistant Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae strains. Iran J Basic Med Sci. 2016;19(11):1193. doi:10.22038/IJBMS.2016.7633

 

12. Saidi N, Saderi H, Owlia P, Soleimani M. Anti-biofilm potential of Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus cell-free supernatant extracts against Staphylococcus aureus. Adv Biomed Res. 2023;12(1):50. doi:10.4103/abr.abr_268_22

 

13. Mu Y, Zeng H, Chen W. Quercetin inhibits biofilm formation by decreasing the production of EPS and altering the composition of EPS in Staphylococcus epidermidis. Front Microbiol. 2021;12:631058. doi:10.3389/fmicb.2021.631058

 

14. Li M, Xu X, Jia Y, Yuan Y, Na G, Zhu L, et al. Transformation of mulberry polyphenols by Lactobacillus plantarum SC-5: Increasing phenolic acids and enhancement of anti-aging effect. Food Res Int. 2024;192:114778. doi:10.1016/j.foodres.2024.114778

 

15. Olaitan AO, Morand S, Rolain JM. Mechanisms of polymyxin resistance: acquired and intrinsic resistance in bacteria. Front Microbiol. 2014;5:643. doi:10.3389/fmicb.2014.00643

 

16. Nation RL, Li J. Colistin in the 21st century. Curr Opin Infect Dis. 2015;28(6):517-25. doi:10.1097/QCO.0000000000000207

 

17. Li Y, Kumar S, Zhang L, Wu H. Klebsiella pneumonia and Its Antibiotic Resistance: A Bibliometric Analysis. Biomed Res Int. 2022;2022:1668789. doi:10.1155/2022/1668789

 

18. Oelschlaeger TA. Mechanisms of probiotic actions -- A review. Int J Med Microbiol. 2010;300(1):57-62. doi:10.1016/j.ijmm.2009.08.005

 

19. Gao Y, Li D, Liu J. Antimicrobial potential of Lactobacillus plantarum ZP11 by producing bacteriocins against Staphylococcus aureus. Food Control. 2019;98:274-9. doi:10.1016/j.foodcont.2018.11.023

 

20. Izhar MZ, Nawaz M, Yaqub T, Avais M, Anjum AA. In vitro characterization of probiotic potential of Lactobacillus plantarum CM49 against selected cattle mastitogens. BMC Microbiol. 2024;24(1):310. doi:10.1186/s12866-024-03459-2

 

21. Das MC, Samaddar S, Jawed JJ, Ghosh C, Acharjee S, Sandhu P, et al. Vitexin alters Staphylococcus aureus surface hydrophobicity to obstruct biofilm formation. Microbiol Res. 2022;263:127126. doi:10.1016/j.micres.2022.127126

 

22. Pimentel-Filho N, Martins MCF, Nogueira GB, Mantovani HC, Vanetti MCD. Bovicin HC5 and nisin reduce Staphylococcus aureus adhesion to polystyrene and change the hydrophobicity profile and Gibbs free energy of adhesion. Int J Food Microbiol. 2014;190:1-8. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2014.08.029

 

23. Gladysheva IV, Cherkasov SV. Antibiofilm activity of cell-free supernatants of vaginal isolates of Corynebacterium amycolatum against Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella pneumonia. Arch Microbiol. 2023;205:158. doi:10.1007/s00203-023-03499-w

 

24. Elkashef SMM, Sahloul NS, Mowafy HL. Exploring the antibacterial potential of probiotics against colistin‑resistant Klebsiella pneumoniae: An in vitro study. Microbes Infect Dis. 2025. doi:10.21608/mid.2024.301152.1883

 

 

 

 

 

 

 

Submitted: 20 ⁄  9 ⁄  2025

Revised: 19  ⁄  10 ⁄  2025

Accepted:   21 ⁄  10 ⁄  2025

 

 

 

The Impact of Lactobacillus plantarum Supernatant and Colistin on Growth, Surface Hydrophobicity, Exopolysaccharide Production, and Biofilm Formation in Klebsiella pneumoniae

 

 

Faezeh Ebadi1, Fatemeh Noorbakhsh2*, Akram Sadat Tabatabaee Bafroee3

 

1- Department of Biology, ET.C., Islamic Azad University, Tehran, Iran

2- Department of Microbiology, VP.C., Islamic Azad university,Varamin-Pishva, Iran

 

 

Abstract

 

Introduction: Klebsiella pneumoniae is a significant bacterial pathogen, notable for its antibiotic resistance and ability to form biofilms. This study aimed to investigate the effect of Lactobacillus plantarum supernatant and colistin on Klebsiella pneumoniae, focusing on antimicrobial activity and biofilm inhibition.

Materials and Methods: In this study, 100 clinical samples were collected from patients, and 20 isolates of Klebsiella pneumoniae were identified using biochemical tests. Antibiotic susceptibility was determined by the antibiogram method. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) for colistin and Lactobacillus plantarum supernatant were evaluated. The Fractional Inhibitory Concentration (FIC) index, anti-biofilm activity, biofilm dispersion, cell surface hydrophobicity, and exopolysaccharide production under treatment with colistin and the supernatant were also assessed.

Results: Colistin demonstrated higher antimicrobial activity compared to Lactobacillus plantarum supernatant. The FIC index ranged from 0.517 to 0.827, indicating an additive effect. Biofilm formation was significantly reduced with colistin treatment compared to supernatant treatment (p < 0.05). Biofilm dispersion increased with the combined treatment compared to individual treatments. Cell surface hydrophobicity decreased from 62% (control) to 34% with the combined treatment. Exopolysaccharide production decreased from 473 mg (control) to 231 mg per 100 ml with the combined treatment.

Conclusion: The combination of Lactobacillus plantarum supernatant and colistin demonstrated enhanced antimicrobial efficacy and control of biofilm formation against Klebsiella pneumoniae. This synergistic approach could potentially lead to a reduction in antibiotic dosage and improved treatment outcomes for Klebsiella pneumoniae infections.

 

Keywords: Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus plantarum, Colistin, Biofilm, Synergistic effect, CFS,EPS.

 

 

 

 

 

Cite this article: F. Ebadi, F. Noorbakhsh, A S Tabatabaee Bafroee. The Impact of Lactobacillus plantarum Supernatant and Colistin on Growth, Surface Hydrophobicity, Exopolysaccharide Production, and Biofilm Formation in Klebsiella pneumoniae. Iranian Journal of Biological Sciences. 2025; 20 (1): 1-…

 

---