تعیین الگوی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه¬های یوروپاتوژنیک اشریشیا کلی جدا شده از مواردکلینیکی در شهرستان شهرکرد

الموضوعات :

امین روزبهی ¹

1 -

تاريخ الإرسال : 27 الخميس , صفر, 1447 تاريخ التأكيد : 02 الأربعاء , ربيع الثاني, 1447 تاريخ الإصدار : 02 الأربعاء , ربيع الثاني, 1447

الکلمات المفتاحية: اشریشیا کلی یوروپاتوژنیک, الگوی فنوتیپی, مقاومت آنتی بیوتیکی,

ملخص المقالة :

اشریشیا کلی یکی از مهم­ترین علل میکروبی شایع در عفونت­های ادراری است. مقاومت آنتی بیوتیکی به دلیل استفاده گسترده از آنتی بیوتیک­ها، یکی از بزرگ­ترین علل ناکامی در درمان آنتی بیوتیکی است. هدف از این تحقیق تعیین الگوی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری­های اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک جدا شده از موارد کلینیکی در شهرستان شهرکرد است. این تحقیق به صورت توصيفي- تحلیلی و مقطعی بر روی 130 بیمار مبتلا به عفونت ادراری مراجعه کننده به آزمایشگاه­های تشخیص طبی شهرستان شهرکرد صورت گرفت. با استفاده از روش­های بیوشیمیایی و تکنیک مولکولی بر اساس ردیابی ژن 16srRNA همه ایزوله‌ها تایید و مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله‌ها با استفاده از روش دیسک دیفیوژن و روش مولکولی بر اساس ژن­های (qnr،tet A، tet B, aac (3)IIa و sul1) بررسی شدند. از130نمونه ی مورد بررسی در بررسی الگوی مقاومت ضد میکروبی بیشترین مقاومت به آمپی سیلین (96/67 صد) و کمترین مقاومت نسبت به نیتروفورانتئین (53/1درصد) برآوردگردید. ژن aac (3)IIa (کد کننده مقاومت به جنتامایسین) با فراوانی 95/86 درصد و ژن qnr (کد کننده مقاومت به سیپروفلوکساسین) با فراوانی 58/14 درصد بیشترین و کمترین ژن­های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی ردیابی شده در ایزوله­های اشریشیا کلی بودند. این نتایج بیانگر افزایش مقاومت اشریشیا کلی به آنتی بیوتیک­های جنتامایسین و تتراسایکلین در مقایسه با مطالعات پیشین است. تحقیقات بیشتر در این زمینه، سبب افزایش دانش ما و مواجهه موثرتر با مقاومت آنتی بیوتیکی میکروارگانیسم­های بیماری­زا خواهد شد.

المصادر:

Servais P, Passerat J. Antimicrobial resistance of fecal bacteria in waters of the Seine river watershed (France). Science of The Total Environment. 2009; 408 (2): 356-372.
Seiffert SN, Hilty M, Perreten V, Endimiani A. Extended-spectrum cephalosporin-resistant gram-negative organisms in livestock: An emerging problem for human health? Drug Resist Updates. 2013; 16 (1-2): 22-45.
Ahmed KS, Feroz F, Noor R. Study of extended-spectrum b-lactamase-producing bacteria from urinary tract infections in Bangladesh. Tzu ChiMed J. 2013; 25(1): 39-42.
Schaeffer AJ. Potential role of phase variation of type I pilli in urinary tract infection and bacterial prostitutes. Infect Dis. 2005; 3:144-149.
Heidari M, Momtaz H, Madani M. Detection of the antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus isolated from human infections and bovine mastitis. African J Microbiol Res. 2011; 5(31): 5745-5749.
National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS): Methods for disk antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5. Wayne, Pa: 2003
نخعی مقدم م، مشرفی ش. تعيين الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي ايزوله‌هاي ادراري اشريشيا كلي و شيوع بتالاكتامازهاي وسيع طيف در بين آن¬ها. مجله ی دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني سبزوار. 1388: (4)16: 228-223.
Akbari-Nakhjavani F, Mirsalehi A, HamidianM, Kazemi B, Mirafshar M, Jabal Ameli F. Antimicrobial susceptibility testing of Escherichiacoli strains isolated from urinary tract infections tofluoroquinolones and detection of gyrA mutationsin resistant strains. Daru. 2007; 15(2): 94-99.
Soleimani-Asl Y, Zibaei M, Firoozeh F. Detection of qnrA gene among quinolone-resistant Escherichia coli isolated from urinary tract infections in Khorram Abad during. 2011-2012; Feyz. 17(5): 488-495.
Muhammad I, Uzma M, Yasmin B, Mehmood Q, Habib B. Prevalence of antimicrobial resistance and integrons in Escherichia coli from Punjab, Pakistan. Braz J Microbiol. 2011; 42(3): 462-466.
Moreno E, Prats G, Sabate M, Perez T, Johnson JR, Andreu A. Quinolone, fluoroquinolone and trimethoprim/sulfamethoxazole resistance in relation to virulence determinants and phylogenetic background among uropathogenic Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 57(2): 204-211.
Bean DC, Livemore D, Hall LM. E .coli implications for Plasmids imparting sulfonamide resistance in persistence. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (4): 1088-1093.
Norouzi J, Akhavan sepahy A, Bazzazzadeh N. Detection of Sul2 Gene in Escherichia coli Isolated from Patients with Urinary Tract Infections Admitted to Clinical Centers of Khoy City. Zanjan Univ Med Sci. 2013; 21(88): 76-83.
Hammerum A, Sandvaye D, Andersen SR. Detection of sul1, sul2, sul3, in sulfonamide resistant Escherichia coli isolates obtained from healthy humans pork and pigs in Denmark. Int J Food Microbiol. 2006; 106 (4): 235-239.
Koljalg S, Trusaluk K, Vainumae I, Stsepetova J, Mikelsaar M. Presistance of Escherichia coli colones and phenotype and genotypic antibiotic resistance in recurrent urinary tract infections in childhood. J Clin microbial. 2009; 47 (3): 99-105.
Al-Agamy M. Molecular resistance mechanisms to older antimicrobial agents in Escherichia coli isolates. J African Microbiol.2012; 6: 106-111.

نص كامل:



رهیافتُ های نوین در علوم سلولی و مولکولی JNACMS  دوره 3 شماره 2 تابستان 1404 Journal homepage: https://sanad.iau.ir/journal/nacms

 

تعیین الگوی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه­های یوروپاتوژنیک اشریشیا کلی جدا شده از مواردکلینیکی در شهرستان شهرکرد

امین روزبهی1*

گروه زیست شناسی، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، ایران

 

اطلاعات مقاله		چکیده
تاریخچه مقاله: دریافت:24/05/1404 پذیرش:31/06/1404 چاپ:تابستان 1404 DOI:		اشریشیا کلی یکی از مهم­ترین علل میکروبی شایع در عفونت­های ادراری است. مقاومت آنتی بیوتیکی به دلیل استفاده گسترده از آنتی بیوتیک­ها، یکی از بزرگ­ترین علل ناکامی در درمان آنتی بیوتیکی است. هدف از این تحقیق تعیین الگوی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری­های اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک جدا شده از موارد کلینیکی در شهرستان شهرکرد است. این تحقیق به صورت توصيفي- تحلیلی و مقطعی بر روی 130 بیمار مبتلا به عفونت ادراری مراجعه کننده به آزمایشگاه­های تشخیص طبی شهرستان شهرکرد صورت گرفت. با استفاده از روش­های بیوشیمیایی و تکنیک مولکولی بر اساس ردیابی ژن srRNA16 همه ایزوله‌ها تایید و مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله‌ها با استفاده از روش دیسک دیفیوژن و روش مولکولی بر اساس ژن­های (qnr،tet A، tet B, aac (3)IIa و sul1) بررسی شدند. از 130 نمونه مورد بررسی در مطالعه‌ی الگوی مقاومت ضد میکروبی، بیشترین میزان مقاومت مربوط به آمپی‌سیلین (96/67 درصد) و کمترین میزان مقاومت مربوط به نیتروفورانتئین (53/1 درصد) برآورد گردید. ژن aac (3)IIa (کد‌کننده مقاومت به جنتامایسین) با فراوانی 95/86 درصد و ژن qnr (کد کننده مقاومت به سیپروفلوکساسین) با فراوانی 58/14 درصد بیشترین و کمترین ژن­های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی ردیابی شده در ایزوله­های اشریشیا کلی بودند. این نتایج بیانگر افزایش مقاومت اشریشیا کلی به آنتی بیوتیک­های جنتامایسین و تتراسایکلین در مقایسه با مطالعات پیشین است. تحقیقات بیشتر در این زمینه، سبب افزایش دانش ما و مواجهه موثرتر با مقاومت آنتی بیوتیکی میکروارگانیسم­های بیماری­زا خواهد شد.
کلمات کلیدی:  اشریشیا کلی یوروپاتوژنیک، الگوی فنوتیپی، مقاومت آنتی بیوتیکی
* نویسنده مسئول: Email  [e-mail]

 

 

 

 

 

 

مقدمه

خانواده انتروباکتریاسه به­طور وسیعی در طبیعت وجود دارند. این ارگانیسم‌ها از جمله پاتوژن‌های مهم فرصت طلب انسان می‌باشند که باعث بیماری‌های عفونی به خصوص عفونت‌های دستگاه ادراری، سپتی سمی، پنومونی وابسته به بیمارستان و عفونت‌های دستگاه گوارش می‌باشند  (1). اشریشیا کلی مسئول انواع عفونت‌های روده‌ایی و خارج روده‌ایی در انسان می‌باشد  (2). در میان پاتوژن‌های ادراری، اشریشیا‌کلی عامل حدود 80 درصد عفونت‌های ادراری اکتسابی از جامعه و نزدیک به 50 درصد عفونت‌های ادراری مرتبط با مراقبت‌های بهداشتی‌درمانی گزارش شده است. این باکتری حدود 90 درصد عفونت‌های دستگاه ادراری درخانم‌های جوان را به خود اختصاص می‌دهد. عفونت دستگاه ادراری دومین عفونت شایع در بیماران می‌باشد که منجر به حدود هفت میلیون ویزیت توسط پزشکان در هر سال می‌شود. افزایش در مقاومت آنتی بیوتیکی میان پاتوژن‌های ادراری یک مشکل جهانی است. هر سال حدود 150 میلیون نفر به عفونت دستگاه ادراری دچار می‌شوند. اگر چه مقاومت به آنتی بیوتیک‌ها از اوایل دهه 1940 به رسمیت شناخته شده است، اما استفاده غیر صحیح از آنتی بیوتیک‌ها در درمان بیماری‌های انسانی و حیوانی و در کشاورزی، به دلیل استفاده ناصحیح از آنتی بیوتیک‌ها به میزان زیادی افزایش پیدا کرده است. استفاده بی رویه از آنتی بیوتیک‌ها خصوصا انواعی که مصرف مشترک انسانی دارند،‌ زمینه ساز ایجاد مقاومت‌ها و ایجاد سویه‌های مقاوم باکتریایی شده و مشکلات زیادی به همراه می آورد. برای مثال موجب بروز بیماری­هایی می‌شود که درمان آن‌ها بسیار مشکل و در بعضی موارد غیر ممکن است و در نهایت موجب گسترش بیماری و شیوع یک همه گیری بدون درمان در جامعه می‌گردد (4،3). مقاومت دارویی این اشریشیا کلی اهمیت زیادی به خصوص در بیماران بستری در بیمارستان‌ها دارد. این باکتری از مهم­ترین علل میکروبی شایع در عفونت‌های ادراری است. عامل بسیاری از عفونت‌های بیمارستانی از قبیل سپسیس، عفونت‌های زخم، گاستروانتریت، و مننژیت نوزادی به شمار می‌رود. اشریشیا کلی یکی از پاتوژن‌های فرصت طلب بیمارستانی می‌باشد و به علت کسب پلاسمیدهایی که کد کننده‌ی بتالاکتامازهای وسیع الطیف هستند، به آنتی بیوتیک‌های بتالاکتام مقاوم شده‌اند. به همین دلیل، درمان عفونت‌های ناشی از اشریشیا کلی با مشکل مواجه شده است مقاومت ضد میکروبی در اشریشیا کلی در سرتاسر جهان گزارش شده است و سرعت افزایش مقاومت در این باکتری، نگرانی‌های زیادی در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته ایجاد کرده است (5،6).

مواد و روش ها

نمونه گیری و جداسازی اشریشیا کلی

تحقيق حاضر یک مطالعه توصيفي- مقطعی می‌باشد که در یک فاصله زمانی یک ساله در سال 1392 در شهرستان شهرکرد صورت گرفت. تعداد 130 سویه اشریشیا کلی جدا شده از بیماران مبتلا به علائم عفونت ادراری مراجعه کننده به آزمایشگاه­های تشخیص طبی شهرستان شهرکرد مورد مطالعه قرار گرفتند. این سویه‌ها با روش بیوشیمیایی به عنوان اشریشیا کلی مورد تایید قرارگرفته بودند و جهت بررسی‌های مولکولی به مرکز تحقیقات میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل شدند. کلنی‌ها‌ی مشکوک به اشریشیا کلی در محیط EMB آگار ساخت شرکت مرک آلمان، انکوبه گذاری شدند. کلنی‌های سبز متالیک با جلای فلزی رشد کرده در این محیط به عنوان باکتری اشریشیا کلی موردپذیرش قرار گرفتند و به منظور تایید تشخیص به منظور شناسایی از تست‌هایی نظیر IMViC، اوره و لیزین دکربوکسیلاز استفاده گردید. تست‌های بیوشیمیایی مورد استفاده برای شناسایی اشریشیا کلی در جدول 1 نشان داده شده است (7).

 

جدول 1: تست‌های بیوشیمیایی مورد استفاده برای شناسایی باکتری اشریشیا کلی

نوع باکتری

نوع تست

تولید اندول

متیل رد

ووژس پروسکائر

سیترات

H2S

اوره

لیزین دکربوکسیلاز

اشریشیا کلی

+

+

-

-

-

-

-

 

 

تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی

برای تعیین حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی بیوتیک‌ها از روش کربی- بایر¹ بر طبق دستورالعمل CLSI استفاده شد. در این تحقیق از سویه استاندارد اشریشیا کلی ATCC 25922 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

آزمایش آنتی بیوگرام

 به­منظور تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله­های اشریشیا کلی از روش کربی بائر طبق دستورالعمل NCCLS و سویه استاندارد اشریشیا کلی ATCC 25922  به­عنوان کنترل مثبت استفاده شد. برای این منظور باکتری­های جدا شده به مدت 24 ساعت در محیط جامد مولر هینتون آگار (های مدیا، هند) در حضور دیسک های آنتی‌بیوتیکی کوتریموکسازول (تری‌متو‌پریم+سولفامتوکسازول) (SXT)، آمیکاسین (AM30)، سفتریاکسون (CRO30)، نیتروفورانتئین (FM300)، سفالوتین (CF30)، نالیدیکسیک اسید (NA30)، نورفلوکساسین (NOR)، تتراسایکلین (TE30)، ایمی پنم (IPM10) و جنتامایسین (GM10) (شرکت پادتن طب، ایران) در دمای 37 درجه کشت داده شدند. سپس با اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد، الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی ایزوله‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مورد مطالعه تعیین و ثبت گردید (6).

داده‌های حاصل از مطالعه با استفاده از نرم افزار آماری SPSS ver 19 و مدل­های آماری کای اسکوار و دقیق فیشر مورد ارزیابی قرار گرفت. در این راستا وجود (P<0.05) به عنوان وجود رابطه آماری معنی دار بین دو فاکتور مورد مطالعه در نظر گرفته شد.

آزمایشات مولکولی

به منظور تائید قطعی وجود اشریشیا کلی در نمونه های کشت داده شده و ردیابی ژن­های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله­ها، از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد. در این راستا ابتدا DNA ژنومی باکتری­ها با استفاده از روش بویلینگ، استخراج و آزمایش PCR روی DNA تخلیص شده انجام گرفت. در مرحله اول حضور قطعی اشریشیا کلی در ایزوله­ها با ردیابی ژن کد کننده S rRNA16 باکتری با استفاده از زوج پرایمرهای نشان داده شده در جدول 2 انجام گرفت. در این مرحله واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر واجد 30 میلی مول KCl، 10 میلی مول Tris-HCl،250 میکرومول dNTP (سیناژن، ایران)، 5/1 میلی مول Mgcl2، 1 میکرولیتر از زوج پرایمرهای R و F، 1 واحد آنزیم DNATaq پلیمراز (سیناژن، ایران) و 5 میکرولیتر از DNA هر نمونه تنظیم و با برنامه حرارتی 94 درجه به مدت 5 دقیقه یک سیکل، 30 سیکل تکراری 94 درجه 45 ثانیه، 55 درجه 60 ثانیه، 72 درجه 60 ثانیه و یک سیکل انتهایی 72 درجه 5 دقیقه واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر مستر سایکلر گرادیانت (اپندرف، آلمان) انجام گرفت.

 

---

[1]  Kirby Bauer

جدول 2: توالي پرايمرهاي مربوط به رديابي ژن 16srRNA در ایزوله‌های اشریشیا کلی

ژن	توالي پرايمر (3َ-5َ)	اندازه محصول جفت باز
SrRNA16	S-F, GCGGACGGGTGAGTAATGT16 S-R, TCATCCTCTCAGACCAGCTA16	200

 

در مرحله دوم ژن­های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی شامل ژن­های tetA و tetB (مقاومت به تتراسیکلین)، qnr (مقاومت به فلوروکینولون­ها)، aac (3)IIa (مقاومت به جنتامایسین) و ژنsul1 (مقاومت به سولفونامیدها)به روش PCR چندگانه ای با استفاده از زوج پرایمرهای نشان داده شده در جدول 2 به شرح زیر انجام گرفت.

 

جدول 2: پرایمر‌های مورد استفاده جهت ردیابی ژن‌های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله‌های اشریشیا کلی

آنتی بیوتیک	ژن مقاومت	توالی	اندازه (جفت باز)
Tetracycline	tetA	GTGAAACCCAACATACCCC GAAGGCAAGCAGGATGTAG	888
Tetracycline	tetB	CCTTATCATGCCAGTCTTGC ACTGCCGTTTTTTCGCC	774
Fluoroquinolone	qnr	ATTTCTCACGCCAGGATTTG GATCGGCAAAGGTTAGGTCA	516
Gentamicin	aac (3)IIa	CGGAAGGCAATAACGGAG TCGAACAGGTAGCACTGAG	740
Sulfonamide	Sul1	CGGCGTGGGCTACCTGAACG GCCGATCGCGTGAAGTTCCG	433

 

 

واکنش PCR در حجم 20 میکرولیتر برای ژن­های tetA و aac(3)IIa شامل2 میکرولیتر از پرایمرهایF  و R، 5 میکرولیتر از DNA الگو و 13 میکرولیتر آب مقطر، برای ژن­های tetB وqnr درحجم 20 میکرولیتر با افزودن 1 میکرولیتر از پرایمرهای F وR، 5 میکرولیتر DNA الگو و 13 میکرولیتر آب مقطر و ژن sul1 در حجم 20 میکرولیتر با افزودن 1 میکرولیتر از پرایمرهایF  و R، 5 میکرولیتر DNA الگو و 14 میکرولیتر آب مقطر به محتویات کیت Accupower PCR PreMix (BioNEER) انجام گرفت. برنامه ی دمایی برای انجام واکنش PCR برای ژن‌های مختلف در جدول 3 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

جدول 3: برنامه دمایی برای انجام واکنش PCR برای ژن‌های مورد بررسی

نام ژن	برنامه واکنش زنجیره‌ای پلی مراز
tetA و aac (3)IIa	1 سیکل 5 دقیقه -------- 94 30 سیکل 15 ثانیه -------- 94   60 ثانیه -------- 55 60 ثانیه -------- 72 1 سیکل 5 دقیقه -------- 72
tetB, qnr	1 سیکل 5 دقیقه -------- 94     30 سیکل 15 ثانیه -------- 94 50 ثانیه -------- 56 60 ثانیه -------- 72 1 سیکل 5 دقیقه -------- 72
Sul1	1 سیکل 5 دقیقه -------- 94 30 سیکل 20 ثانیه -------- 94 60 ثانیه -------- 59 60 ثانیه -------- 72 1 سیکل 6 دقیقه -------- 72

 

 

بعد از انجام آزمایشات PCR، محصول PCR روی ژل 1درصد آگارز واجد اتیدیوم بروماید در ولتاژ ثابت 80 ولت در حضور مارکر 100 جفت بازی DNA (فرمنتاز، آلمان) الکتروفورز و نتیجه با دستگاه تصویر بردار از ژل (انگلستان، Uviteck) مورد بررسی قرار گرفت (5).

یافته­ها:

از مجموع 130 بیمار مورد مطالعه ، 101 نفر زن ( 69/77 درصد) و 29 نفر (30/22 درصد) مرد بودند. در آزمایش آنتی بیوگرام جهت تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله­های اشریشیا کلی از آنتی بیوتیک­های معمول در درمان عفونت­های ادراری در انسان استفاده شد که این نتایج برحسب جنسیت در جدول­های 4 و 5 نشان داده شده است. در این آزمایش 2/66 درصد از ایزوله­ها نسبت به آمپی سیلین و تنها 3/2 درصد از آن ها نسبت به آنتی بیوتیک نیتروفورانتوئین مقاوم بودند.در تجزیه و تحلیل آماری بین جنسیت و آنتی بیوتیک‌های آمپی سیلین، تتراسایکلین، نالیدیکسیک اسید، کوتریموکسازول، سفالوتین، سفتریاکسون، سیپروفلوکساسین و آمیکاسین رابطه آماری معنی داری مشاهده نگردید (P-value> 0/05). اما بین جنسیت و آنتی بیوتیک‌های نورفلوکساسین، ایمی پنم و جنتامایسین رابطه آماری معنی دار مشاهده گردید (P-value < 0/05). هم چنین با استفاده از آزمون دقیق فیشر نیز بین جنسیت و آنتی بیوتیک FM رابطه آماری معنی داری مشاهده گردید (P-value< 0/05).

 

جدول 4: مقاومت آنتی بیوتیکی ایزوله‌های اشریشیا کلی جدا شده از موارد عفونت ادراری در شهرکرد در دو جنس زن و مرد

آنتی بیوتیک		جنسیت							p-value
مرد	درصد		زن		درصد
آمپی سیلین		21		41/72		65		35/64	384/0
تتراسایکلین		20		96/68		53		47/52	115/0
نالیدیکسیک اسید		17		62/58		51		49/50	44/0
کوتریموکسازول		19		51/65		48		52/47	087/0
سیپروفلوکساسین		13		82/44		36		64/35	0573/0
سفالوتین		15		7/51		35		3/33	07/0
نورفلوکساسین		22		86/75		25		75/24	001/0
سفتریکسون		11		93/37		25		75/24	162/0
آمیکایسین		8		58/27		23		77/22	878/0
ایمی پنم		11		93/37		19		81/18	031/0
جنتامایسین		9		03/31		14		86/13	033/0
نیتروفورانتئین		2		86/6		0		0	048/0

 

جدول 5: نتایج مربوط به مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله‌های اشریشیا کلی

رديف		آنتي بيوتيك			مقاوم				نیمه حساس				حساس		جمع كل
تعداد	درصد		تعداد	درصد		تعداد		درصد
1		ایمی پنم			30		1/23		5		8/3		95	1/73	130
2		کوتریموکسازول			67		5/51		8		2/6		55	3/42	130
3		سفتریاکسون			36		7/27		8		2/6		86	2/66	130
4		نوروفلوکسازین			47		2/36		8		2/6		75	7/57	130
5		تتراسایکلین			73		2/56		12		2/9		45	6/34	130
6		سفالوتین			49		7/37		14		8/10		67	5/51	130
7		سپروفلوکساسین			49		7/37		7		4/5		74	9/56	130
8		نالیدیک سیک اسید			68		3/52		11		8/5		51	2/39	130
9		آمپی سیلین			86		2/66		23		7/17		21	2/16	130
10		آمیکاسین			31		8/23		28		5/21		71	6/54	130
11		جنتامایسین			23		7/17		9		9/6		98	4/75	130
12		نیتروفورانتیئن			3		3/2		12		2/9		115	5/88	130

 

 

توزیع انواع ژن‌های کد‌کننده مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه‌های اشریشیا کلی مورد بررسی قرار گرفتند. از 73 ایزوله مقاوم به تتراسایکلین ژن tet A در 59 ایزوله با فراوانی 82/80 درصد و ژن tet B در 55 ایزوله با فراوانی 34/75 درصد مشاهده گردید. از 68 ایزوله مقاوم به نالیدیکسیک اسید در 8 ایزوله (76/11 درصد)، از 54 ایزوله مقاوم به نورفلوکساسین در 8 ایزوله (81/14 درصد) و از 48 ایزوله مقاوم به سیپروفلوکساسین در 7 ایزوله (58/14درصد) ژن qnr گزارش گردید. از 67 ایزوله مقاوم به کوتریموکسازول در 14 ایزوله (89/20 درصد) ژن sul 1 و از 23 ایزوله مقاوم به جنتامایسین در 20 ایزوله (95/86 درصد) ژن aac (3)IIa گزارش گردید.

 

 

 

جدول 6: فراوانی ژن‌های مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله‌های اشریشیا کلی

نوع ژن	آنتی بیوتیک	مقاومت به روش PCR	مقاومت با دیسک	P-value
tet A	تتراسایکلین	59 82/80 %	73 20/56 %	000/0
tet B	تتراسایکلین	55 34/75 %	73 20/56 %	000/0
Qnr	نالیدیکسیک اسید	8 76/11 %	68 20/52 %	000/0
Qnr	نورفلوکساسین	8 81/14 %	54 53/41 %	000/0
qnr	سیپروفلوکساسین	7 58/14 %	49 7/37 %	000/0
sul 1	سولفونامیدها	14 89/20 %	67 53/51 %	000/0
aac (3)IIa	جنتامایسین	20 95/86 %	23 70/17 %	617/0

 

 

تصویر 1. الکتروفورز محصولات PCR. ستون M: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز. ستون 1: کنترل منفی ستون های 2 و 3 باند 888 جفت بازی مربوط به ژن tetA و باند 740 جفت بازی مربوط به ژن aac (3)IIa. ستون های 4 و 5: نمونه های منفی

 

 

تصویر 2. الکتروفورز محصولات PCR. ستون 1: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز، ستون 2: کنترل منفی، ستون های 3 و 4 باند 774 جفت بازی مربوط به ژن tetB. و باند 516 جفت بازی مربوط به ژن qnr

 

 

تصویر 3. الکتروفورز محصولات PCR. ستون 5: مارکر 100 جفت بازی فرمنتاز. ستون های 2-4 باند 433 جفت بازی مربوط به ژن sul1. ستون 1: کنترل منفی

 

بحث

مطالعه حاضر با هدف تعیین الگوی فنوتیپی و ژنوتیپی مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری­های اشریشیا کلی یوروپاتوژنیک جدا شده از موارد کلینیکی در شهرستان شهرکرد با دو روش معمول آنتی بیوگرام و مولکولی انجام گرفت. مقاومت به آنتی بیوتیک‌های مختلف بر اساس الگوهای درمانی که در مناطق مختلف صورت می‌گیرد، متفاوت است. به عنوان مثال در مطالعه ی ما بیشترین مقاومت نسبت به آمپی سیلین (96/67 درصد) و کمترین مقاومت نسبت به نیتروفورانتئین (53/1 درصد) گزارش شد.

در تحقیق انجام شده توسط نخعی مقدم و همکاران که بر روی 109 ایزوله اشریشیا کلی عفونت ادراری انجام شد، مقاومت ايزوله‌ها نسبت به كوتريموكسازول، ناليديكسيك اسيد، سيپروفلوكساسين، جنتامايسين، پلي ميكسين و نيتروفورانتوئين به ترتیب 05/55 درصد، 86/34 درصد، 10/21 درصد، 84/12 درصد، 75/4 درصد و 83/1 درصد گزارش گردید. در این تحقیق بیشترین مقاومت نسبت به کوتریموکسازول و کمترین مقاومت نسبت به ایمی پنم گزارش گردید. در حالی که نخجوانی و همکاران در 2007 میزان مقاومت نسبت به نالیدیکسیک اسید و سیپروفلوکساسین را به ترتیب 3/49 درصد و 2/40 درصد گزارش کردند. که نسبت به تحقیق ما از مقاومت پایین­تری برخوردار می‌باشد (8).

با توجه به مقایسه‌ی درصدهای مختلف نتایج آنتی بیوگرام با آزمایش‌های مشابه، باید توجه داشت که تفاوت منطقه‌ای در نقاط مختلف دنیا یا حتی یک کشور، پاسخ‌های درمانی متفاوتی را نسبت به داروهای ضد میکروبی ایجاد می‌کند. منشا این تفاوت‌ها در نقاط مختلف را می‌توان تفاوت‌های ژنتیکی افراد، تفاوت‌های ژنتیکی سویه‌ها و تفاوت در زمینه‌های دیگر دانست که با توجه به این امر، الگوهای درمانی مورد استفاده در نقاط مختلف، متفاوت و براساس ویژگی‌های خاص هر منطقه تعریف می‌شود. بنابراین بایستی تحقیقات منظم و دنباله داری در نقاط مختلف جهان انجام شود. با توجه به نتایج به دست آمده می‌توان نتیجه گیری کرد که حساسیت به این آنتی بیوتیک‌ها به دلیل عواملی از جمله تجویز مکرر و غیر منطقی آنتی بیوتیک‌ها، جهش‌های آنزیماتیک و هم چنین انتقال مقاومت از طریق پلاسمیدها کاهش یافته است. با توجه به بررسی نتایج این مطالعه و دیگر تحقیقات و با توجه به افزایش روز افزون مقاوم تنها به انواع مواد ضد میکروبی از جمله سیپروفلوکساسین و ایمی پنم که از جمله شاخص‌های درمانی برای عفونت‌های اشریشیا کلی هستند، لزوم مطالعات بیشتر در این زمینه و هم چنین کاهش مصرف آنتی بیوتیک و تجویز منطقی آن‌ها توسط پزشکان ضروری به نظر می‌رسد.

در تحقیق انجام شده توسط سلیمانی اصل و همکاران که بر روی 140 ایزوله اشریشیا کلی عامل عفونت ادراری در سال 1391 انجام گرفت مقاومت به آنتی بیوتیک‌های نالیدیکسیک اسید و سیپروفلوکساسین به ترتیب 8/82 درصد و 43 درصد گزارش گردید که نسبت به تحقیق ما از مقاومت بالاتری برخوردار می‌باشند. در این تحقیق مشخص گردید 1/12درصد از ایزوله‌های مقاوم به نالیدیکسیک اسید و 3/14 درصد از ایزوله‌های مقاوم به سیپروفلوکساسین دارای ژن qnrA می‌باشند (9).

از جمله آنتی بیوتیک‌های کینولونی مورد استفاده در این تحقیق نالیدیکسیک اسید، سیپروفلوکساسین و نورفلوکساسین بودند که میزان مقاومت به آن‌ها به ترتیب 30/52 درصد، 92/36 درصد و 53/41 درصد برآورد گردید. در این تحقیق از 68 ایزوله مقاوم به نالیدیکسیک اسید در 8 ایزوله (76/11درصد)، از 54 ایزوله مقاوم به نورفلوکساسین در 8 ایزوله (81/14 درصد) و از 48 ایزوله مقاوم به سیپروفلوکساسین در 7 ایزوله (58/14درصد) ژن qnr گزارش گردید نتایج حاصل از فراوانی ژن qnr در تحقیق ما با نتایج سلیمانی اصل و همکاران تقریبا تطابق دارد.

در مطالعه انجام شده در پاکستان در سال 2011 مقاومت در ایزوله‌های ادراری اشریشیا کلی نسبت به سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید به ترتیب 45/36 درصد و 16/84 درصد گزارش گردید. مقاومت بالا نسبت به آنتی بیوتیک‌های کینولونی می‌تواند می‌تواند ناشی از مصرف بی رویه و بدون نظارت داروهای فوق باشد. در مطالعه انجام شده در سال 2006 در آمریکا مقاومت نسبت به کینولون‌ها 21 درصد و مقاومت نسبت به فلوروکینولون‌ها 12 درصد گزارش شده است. اختلاف نتايج مطالعه انجام شده در آمريكا با مطالعه حاضر از نظر ميزان مقاومت مشاهده شده ميتواند به دليل وجود برنامه‌هاي نظارتي دقيق تر در آن كشور و در دسترس نبودن داروهاي با در جدایه‌هاي اهميت فوق باشد. مطالعات حاکی از آن است كه يك ارتباط مستقيم بين ميزان مصرف كينولون‌ها و درصد مقاومت به اين آنتي بيوتيك‌ها وجود دارد (11).

در مورد دیگر آنتی بیوتیک­های مورد مطالعه نیز نتایج مشابه یا متفاوتی با دیگر محققان از ایران یافت شد که این اختلافات می تواند ناشی از اختصاصات بومی هرمنطقه، روش به کار رفته جهت تعیین میزان حساسیت و عوامل دخیل در ایجاد مقاومت دارویی از جمله پلاسمیدهای قابل انتقال و .. .باشد اما در مجموع تمام ایزوله های اشریشیا کلی مورد بررسی در مطالعه حاضر دارای مقاومت چندگانه به آنتی بیوتیک مختلف هستند که این خود خطر استفاده بی رویه از آنتی بیوتیک­ها را در سطح جامعه دو چندان می کند.

در قسمت دیگر از این تحقیق، ژن­های کد کننده مقاومت آنتی بیوتیکی در اشریشیا کلی مورد بررسی قرار گرفتند و از روش PCR چندگانه جهت ردیابی ژن های مورد مطالعه استفاده شد که نتایج نشان داد ژن aac (3)IIa (کد کننده مقاومت به جنتامایسین) با فراوانی 95/86 درصد و ژن qnr (کد کننده مقاومت به سیپروفلوکساسین) با فراوانی 58/14 درصد از ایزوله های اشریشیا کلی جدا شده از عفونت های ادراری وجود دارد.

Bean و همکاران در مطالعه ایی که بر روی 391 ایزوله اشریشیا کلی جدا شده از موارد عفونت‌های ادراری در بیمارستان رویال لندن انجام دادند، مقاومت به سولفونامیدها را 5/45 درصد گزارش کردند و فراوانی ژن sul 2 در ایزوله‌های اشریشیا کلی مقاوم 81 درصد گزارش گردید که نسبت به تحقیق ما از فراوانی بالاتری برخوردار می‌باشد (12).

در تحقیق انجام شده توسط Norouzi و همکاران که به منظور ردیابی ژن sul 2 در باکتری‌های اشریشیا کلی جدا شده از موارد عفونت ادراری مراجعه کننده به مراکز کلینیکی شهر خوی بر روی 300 بیمار انجام گرفت، مقاومت به کوتریموکسازول 71 درصد و فراوانی ژن sul 2 80 درصد گزارش گردید که نسبت به تحقیق ما از فراوانی بالاتری برخوردار می‌باشد (13).

در مطالعه انجام شده توسط Hammerum و همکاران که بر روی 199 ایزوله اشریشیا کلی مقاوم به سولفونامیدها انجام شد، فراوانی ژن sul 2 81 درصد گزارش گردید (14). Koljalg و همکارانش به بررسی 78 ایزوله اشریشیا کلی جدا شده از کودکان مبتلا به عفونت مجاری ادراری پرداختند که میزان مقاومت به کوتریموکسازول را 40 درصد گزارش کردند. در این تحقیق فراوانی ژن sul 2 در ایزوله‌های مقاوم به کوتریموکسازول 40 درصد گزارش گردید (15).

Al-Agamy میزان مقاومت به آنتی بیوتیک کوتریماکسازول را در 100 ایزوله اشریشیا کلی جدا شده از موارد عفونت ادراری را 62% گزارش کرد و فراوانی ژن sul 2 در ایزوله‌های مقاوم به کوتریماکسازول 36/86 درصد گزارش گردید (16). به این ترتیب مشخص می‌گردد که در تمامی تحقیقات انجام شده توسط محقیقین مختلف ژن sul 2 نسبت به ژن‌های sul 1 و sul 3 از فراوانی بالاتری برخوردار می‌باشد

نتیجه گیری:

درمجموع نتایج حاصل از مطالعه ی حاضر جلوگيري از انتشار مقاومت‌هاي دارويي يكي از مسائل مهم درمان عفونت‌ها در جامعه محسوب مي‌شود. با توجه به افزايش شيوع مقاومت نسبت به آنتي بيوتيك‌ها، تشخيص سريع و به موقع سويه‌هاي مقاوم به منظور انتخاب گزينه‌هاي درماني مناسب و جلوگيري از گسترش مقاومت، امري ضروري به نظر مي‌رسد. هم­چنین پیشنهاد می‌شود، درمان عفونت‌هاي ادراري که از اهمیت خاصی برخوردار است، با توجه به الگوي حساسیت و مقاومت منطقه صورت گیرد تا از ایجاد پدیده ی مقاومت دارویی و شکست‌هاي درماني که منجر به عارضه دار شدن عفونت می‌گردد، جلوگیري شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مراجع

 

1Servais P, Passerat J. Antimicrobial resistance of fecal bacteria in waters of the Seine river watershed (France). Science of The Total Environment. 2009; 408 (2): 356-372.

.2 Seiffert SN, Hilty M, Perreten V, Endimiani A. Extended-spectrum cephalosporin-resistant gram-negative organisms in livestock: An emerging problem for human health? Drug Resist Updates. 2013; 16 (1-2): 22-45.

 .3Ahmed KS, Feroz F, Noor R. Study of extended-spectrum b-lactamase-producing bacteria from urinary tract infections in Bangladesh. Tzu ChiMed J. 2013; 25(1): 39-42.

.4 Schaeffer AJ. Potential role of phase variation of type I pilli in urinary tract infection and bacterial prostitutes. Infect Dis. 2005; 3:144-149.

.5 Heidari M, Momtaz H, Madani M. Detection of the antibiotic resistance genes in Staphylococcus aureus isolated from human infections and bovine mastitis. African J Microbiol Res. 2011; 5(31): 5745-5749.

.6 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS): Methods for disk antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A5. Wayne, Pa: 2003

7- نخعی مقدم م، مشرفی ش. تعيين الگوي مقاومت آنتي بيوتيكي ايزوله‌هاي ادراري اشريشيا كلي و شيوع بتالاكتامازهاي وسيع طيف در بين آن­ها. مجله ی دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني سبزوار. 1388: (4)16: 228-223.

.8 Akbari-Nakhjavani F, Mirsalehi A, HamidianM, Kazemi B, Mirafshar M, Jabal Ameli F. Antimicrobial susceptibility testing of Escherichiacoli strains isolated from urinary tract infections tofluoroquinolones and detection of gyrA mutationsin resistant strains. Daru. 2007; 15(2): 94-99.

.9 Soleimani-Asl Y, Zibaei M, Firoozeh F. Detection of qnrA gene among quinolone-resistant Escherichia coli isolated from urinary tract infections in Khorram Abad during. 2011-2012; Feyz. 17(5): 488-495.

10. Muhammad I, Uzma M, Yasmin B, Mehmood Q, Habib B. Prevalence of antimicrobial resistance and integrons in Escherichia coli from Punjab, Pakistan. Braz J Microbiol. 2011; 42(3): 462-466.

.11 Moreno E, Prats G, Sabate M, Perez T, Johnson JR, Andreu A. Quinolone, fluoroquinolone and trimethoprim/sulfamethoxazole resistance in relation to virulence determinants and phylogenetic background among uropathogenic Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 57(2): 204-211.

.12 Bean DC, Livemore D, Hall LM. E .coli implications for Plasmids imparting sulfonamide resistance in persistence. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (4): 1088-1093.

.13 Norouzi J, Akhavan sepahy A, Bazzazzadeh N. Detection of Sul2 Gene in Escherichia coli Isolated from Patients with Urinary Tract Infections Admitted to Clinical Centers of Khoy City. Zanjan Univ Med Sci. 2013; 21(88): 76-83.

.14 Hammerum A, Sandvaye D, Andersen SR. Detection of sul1, sul2, sul3, in sulfonamide resistant Escherichia coli isolates obtained from healthy humans pork and pigs in Denmark. Int J Food Microbiol. 2006; 106 (4): 235-239.

.15 Koljalg S, Trusaluk K, Vainumae I, Stsepetova J, Mikelsaar M. Presistance of Escherichia coli colones and phenotype and genotypic antibiotic resistance in recurrent urinary tract infections in childhood. J Clin microbial. 2009; 47 (3): 99-105.

.16 Al-Agamy M. Molecular resistance mechanisms to older antimicrobial agents in Escherichia coli isolates. J African Microbiol.2012; 6: 106-111.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Determination of phenotypic and genotypic patterns of antibiotic resistance in uropathogenic Escherichia coli strains isolated from clinical samples in Shahrekord.

Amin Roozbehi*

Department of Biology, ShK.C., Islamic Azad University, Shahrekord, Iran

Corresponding author: [e-mail]

 

Abstract:

Escherichia coli is one of the most common microbial causes of urinary tract infections. Antibiotic resistance is one of the biggest causes of failure in antibiotic treatment due to the widespread use of antibiotics. The aim of this study was to determine the phenotypic and genotypic pattern of antibiotic resistance in uropathogenic Escherichia coli isolated from clinical samples in Shahrekord city. This descriptive-analytical and cross-sectional study was conducted on 130 patients with urinary tract infections referred to medical diagnostic laboratories in Shahrekord city. All isolates were confirmed using biochemical methods and molecular techniques based on 16srRNA gene detection, and the antibiotic resistance of the isolates was investigated using the disk diffusion method and molecular methods based on (qnr, tet A, tet B, aac (3)IIa and sul1) genes.

Of the 130 samples studied in the study of antimicrobial resistance pattern, the highest resistance was to ampicillin (96.67%) and the lowest resistance was to nitrofurantoin (53.1%). The aac (3)IIa gene (encoding resistance to gentamicin) with a frequency of 95.86% and the qnr gene (encoding resistance to ciprofloxacin) with a frequency of 58.14% were the highest and lowest antibiotic resistance genes detected in E. coli isolates. These results indicate an increase in E. coli resistance to gentamicin and tetracycline antibiotics compared to previous studies. Further research in this field will increase our knowledge and more effectively confront antibiotic resistance of pathogenic microorganisms.

Keywords: Antibiotic resistance, Phenotypic pattern, Uropathogenic E. coli,

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

27

 

---