بررسی مولکولی و همسان سازی ژن متيونيناز از باسیلوس های هالوفیل در سلول مستعد جهت استفاده در صنعت

الموضوعات :

فروغ سهی راد ¹ , منصور بیات ² , محدثه لاری پور ³

1 - 1ـ دانش آموخته کارشناسی ارشد ميكروبيولوژي صنعتي, گروه زیست شناسی, دانشكده علوم پايه و فناوري هاي نوين, دانشگاه آزاد اسلامي, تهران, ایران
2 - استاد قارچ شناسی دامپزشکی, گروه پاتوبیولوژی, دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات, تهران, ایران
3 - دانشیار قارچ شناسی پزشکی,گروه میکروبیولوژی, دانشکده علوم زیستی, دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال, تهران, ایران

تاريخ الإرسال : 27 الخميس , صفر, 1447 تاريخ التأكيد : 22 الثلاثاء , ربيع الثاني, 1447 تاريخ الإصدار : 15 الأربعاء , ربيع الأول, 1446

الکلمات المفتاحية: متیونیناز , باسیلوس, همسان سازي, مولکولی, هالوفیل, PCR,

ملخص المقالة :

متیونیناز آنزيمي است که در زمینه ی داروسازی به ویژه کانسرتراپی بسيار مورد مطالعه قرار گرفته است.  باسیلوس های هالوفیلیک گروهي از باکتری های گرم مثبتی هستند که در محیط نمکی زندگی می کنند. این ارگانیسم ها مخازن بالقوه آنزیم هایی هستند که به وفور در صنایع مختلف کاربرد دارند. از این رو هدف این مطالعه بررسی مولکولی و همسان سازی ژن متیونیناز از باسیلوس های هالوفیل در سلول مستعد جهت استفاده در صنعت می باشد. سویه های جنس باسیلوس از مجموع 20 نمونه آب شور از بندرعباس-خليج فارس جداسازی و تعیین هویت شدند و سپس با روش PCRّ، ژن متیونیناز از این باسیلوس ها جدا گردید. قطعه تکثیر یافته توسط روش TA کلونینگ به وکتور انتقالی pTG19  وارد شد. در مرحله بعد وکتور نوترکیب به اشرشیا اوریگامی استاندارد ترانسفورم شد از 12 سویه باسیلوس جدا شده تنها 2 سویه واجد ژن متیونیناز بود. به منظور تعیین هویت مولکولی جنس باسیلوس حامل ژن متیونیناز از پرایمر خانه دار استفاده گردید. در نهایت با سکانس محصول PCR بیان ژن متيونيناز در باکتری اشریشیاکلی اوريگامي تایید شد. بیان آنزیم متيونيناز با استفاده از روش real-time PCR ارزیابی شد. در نتیجه این پژوهش موفق به پیدا کردن باسیلوس های هالوفیل بومی مولد آنزیم متیونیناز شده و ژن آن با موفقیت از باکتری باسیلوس سوبتليس به باکتری اشرشیا اوریگامی به منظور بازدهی تولید بالا، وارد گردید که طبق نتایج، بهینه دمایی فعالیت آنزیم در دمای 37 درجه بود.

المصادر:

1. Abozeid, A.A., 2023. Short review on microbial L-methioninase and its applications. Bulletin of Faculty of Science, Zagazig University, 20 (4), pp.107-139.
2. Aledo, J.C., 2019. Methionine in proteins: The Cinderella of the proteinogenic amino acids. Protein Science, 28(10), pp.1785-1796.
3. Alshehri, W.A., 2020. Bacterium Hafnia alvei secretes L-methioninase enzyme: Optimization of the enzyme secretion conditions. Saudi journal of biological sciences, 27(5), pp.1222-1227.
4. Alzahrani, K.J., 2021. Microbiome studies from Saudi Arabia over the last 10 years: achievements, gaps, and future directions. Microorganisms, 9(10), p.2021.
5. Azizi, E., FARAHMAND, M. and Shahhosseini, M.H., 2018. Isolation and Identification of extremophiles producing anticancer L-glutaminase and L-Methioninas enzymes from Yale Gonbad hot spring in Qazvin, Iran.
6. Bandaru, N., Noor, S.M., Kammili, M.L., Bonthu, M.G., Gayatri, A.P. and Kumar, P.K., 2025. Methionine restriction for cancer therapy: From preclinical studies to clinical trials. Cancer Pathogenesis and Therapy.
7. Bernasocchi, T. and Mostoslavsky, R., 2024. Subcellular one carbon metabolism in cancer, aging and epigenetics. Frontiers in epigenetics and epigenomics, 2, p.1451971.
8. Bray, F., Laversanne, M., Weiderpass, E. and Soerjomataram, I., 2021. The ever‐increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide. Cancer, 127(16), pp.3029-3030.
9. George, S. and Narayanan, D.P., 2025. Biocatalytic Properties of Mangrove Microbiome. In Mangrove Microbiome: Diversity and Bioprospecting (pp. 297-308). Singapore: Springer Nature Singapore.
10. Ghalehno, A.D., Ghavidel-Aliabadi, M., Shahmohamadi, Z., Mehrshad, M., Amoozegar, M.A. and Danesh, A., 2018. Isolation and Discovery of New Antimicrobial-agent Producer Strains Using Antibacterial Screening of Halophilic Gram-positive Endospore-forming Bacteria Isolated from Saline Lakes of Iran. Arak. Med. Univ. J, 20, pp.10-23.
11. Javia, B.M., Gadhvi, M.S., Vyas, S.J., Ghelani, A., Wirajana, N. and Dudhagara, D.R., 2024. A review on L-methioninase in cancer therapy: Precision targeting, advancements and diverse applications for a promising future. International Journal of Biological Macromolecules, 265, p.130997.
12. Kaiser, P., 2020. Methionine dependence of cancer. Biomolecules, 10(4), p.568.
13. Kavya, D. and Nadumane, V.K., 2020. Identification of highest L-Methioninase enzyme producers among soil microbial isolates, with potential antioxidant and anticancer properties.
14. Kharayat, B. and Singh, P., 2018. Statistical optimization of reaction condition of L-methioninase from Bacillus subtilis. Research Reports, 2(2018), pp.1-9.
15. Lauinger, L. and Kaiser, P., 2021. Sensing and signaling of methionine metabolism. Metabolites, 11(2), p.83.
16. Ma, C., Xu, A., Zuo, L., Li, Q., Fan, F., Hu, Y. and Sun, C., 2025. Methionine Dependency and Restriction in Cancer: Exploring the Pathogenic Function and Therapeutic Potential. Pharmaceuticals, 18(5), p.640.
17. Mohkam, M., Taleban, Y., Golkar, N., Berenjian, A., Dehshahri, A., Mobasher, M.A. and Ghasemi, Y., 2020. Isolation and identification of novel L-methioninase producing bacteria and optimization of its production by experimental design method. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 26, p.101566.
18. Navik, U., Sheth, V.G., Khurana, A., Jawalekar, S.S., Allawadhi, P., Gaddam, R.R., Bhatti, J.S. and Tikoo, K., 2021. Methionine as a double-edged sword in health and disease: Current perspective and future challenges. Ageing research reviews, 72, p.101500.
19. Navik, U., Sheth, V.G., Khurana, A., Jawalekar, S.S., Allawadhi, P., Gaddam, R.R., Bhatti, J.S. and Tikoo, K., 2021. Methionine as a double-edged sword in health and disease: Current perspective and future challenges. Ageing research reviews, 72, p.101500.

نص كامل:



 

 

 

نشریه میکروبیولوژی‌ دامپزشکی دوره بیستم، شماره اول، بهار و تابستان 1403،  پیاپی 48: 74-66

 

 

 

 

مقاله پژوهشی

بررسی مولکولی و همسان سازی ژن متيونيناز از باسیلوس های هالوفیل در سلول مستعد جهت استفاده در صنعت

فروغ سهي راد1، منصور بیات*2، محدثه لاری پور3

1- دانش آموخته  کارشناسی ارشد ميكروبيولوژي صنعتي،  گروه زیست شناسی،  دانشكده علوم پايه و فناوري هاي نوين، دانشگاه آزاد اسلامي، تهران،  ایران

2- استاد قارچ شناسی دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

3- دانشیار قارچ شناسی پزشکی،گروه میکروبیولوژی, دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران

تاریخ دریافت: 30/05/1404                      تاریخ پذیرش: 22/07/1404            

چکیده

متیونیناز آنزيمي است که در زمینه ی داروسازی به ویژه کانسرتراپی بسيار مورد مطالعه قرار گرفته است. باسیلوس های هالوفیلیک گروهي از باکتری های گرم مثبتی هستند که در محیط نمکی زندگی می کنند. این ارگانیسم ها مخازن بالقوه آنزیم هایی هستند که به وفور در صنایع مختلف کاربرد دارند. از این رو هدف این مطالعه بررسی مولکولی و همسان سازی ژن متیونیناز از باسیلوس های هالوفیل در سلول مستعد جهت استفاده در صنعت می باشد. سویه های جنس باسیلوس از مجموع 20 نمونه آب شور از بندرعباس-خليج فارس جداسازی و تعیین هویت شدند و سپس با روش PCRّ، ژن متیونیناز از این باسیلوس ها جدا گردید. قطعه تکثیر یافته توسط روش TA کلونینگ به وکتور انتقالی pTG19  وارد شد. در مرحله بعد وکتور نوترکیب به اشرشیا اوریگامی استاندارد ترانسفورم شد از 12 سویه باسیلوس جدا شده تنها 2 سویه واجد ژن متیونیناز بود. به منظور تعیین هویت مولکولی جنس باسیلوس حامل ژن متیونیناز از پرایمر خانه دار استفاده گردید. در نهایت با سکانس محصول PCR بیان ژن متيونيناز در باکتری اشریشیاکلی اوريگامي تایید شد. بیان آنزیم متيونيناز با استفاده از روش real-time PCR ارزیابی شد. در نتیجه این پژوهش موفق به پیدا کردن باسیلوس های هالوفیل بومی مولد آنزیم متیونیناز شده و ژن آن با موفقیت از باکتری باسیلوس سوبتليس به باکتری اشرشیا اوریگامی به منظور بازدهی تولید بالا، وارد گردید که طبق نتایج، بهینه دمایی فعالیت آنزیم در دمای 37 درجه بود.

کلمات کلیدی: متیونیناز ، باسیلوس، همسان سازي، مولکولی، هالوفیل، PCR

*  نویسنده مسئول : منصور بیات  

آدرس: استاد قارچ شناسی دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

پست الکترونیک: [e-mail]

 

مقدمه

ال- متیونین-گاما-لیاز(EC 4.4.1.11) که به عنوان متیوناز، متیونیناز، L-متیونین- 𝛾-دمتیولاز و   L-متیونین متانتیول-لیاز شناخنه مي شود. متيونين گاما لياز (MGL) دارای وزن مولکولی در حدود 149 تا 173 کیلو دالتون بوده و از چهار زیر واحد یکسان (تقریبا 41 تا 45 کیلو دالتون) تشکیل شده است. متیونیناز یک آنزیم وابسته به پیریدوکسال-5-فسفات (PLP) است كه یک مزیت منحصر به فرد در مهار سرطان دارد. متيونيناز توانايي هدف قرار دادن انتخابی و مهار رشد سلول‌های سرطانی، بدون آسیب رساندن به سلول‌های سالم را دارد. چرا که سلول‌های تومور فاقد یک آنزیم ضروری به نام متیونین سنتاز هستند که سلول‌های سالم از آن برای ساخت اسید آمینه حیاتی  متیونین استفاده می‌کنند. مطالعات اخير نشان مي دهد که بسیاری از متابولیت ها می توانند خودشان به عنوان یک مولکول پیام رسان عمل کنند و برنامه رشد سلول را کنترل کنند. مطالعات بسياري، بویژه توسط پژوهشگران سرطان شناسي به این مطلب اشاره داشته اند که «متیونین» ممکن است یک متابولیت پیام رسان باشد. تحقیقات نشان می دهد که بسیاری از سلول هاي سرطاني برای رشد، به متیونین وابسته هستند. متابولیسم غیرعادی سرطان یک پدیده تکرارشونده در طول پیشرفت سرطان است. بنابراین، جذب متیونین خارج سلولی تغییر یافته ممکن است باعث تومورزایی و پیشرفت شود (Abozeid, A.A, 2023).

متیونین (L-Methionine) با (cas number 3-68-63) يكي از هشت اسيد آمينه ي ضروري براي بدن است. متیونین به عنوان یک اسید آمینه ضروری برای مهره‌داران، با کاربرد های بیوتکنولوژیکی، از جمله در صنایع غذایی، خوراک دام و داروسازی، بسیار مورد توجه است (Neubauer, C. and Landecker, H., 2021).

در محیط سلولی، متیونین نه تنها برای شروع بیوسنتز پروتئین، بلکه برای تاخوردگی و پایداری پروتئین نیز حیاتی است. علاوه بر این، نقش مهمی به عنوان نقطه شروع فرآیندهای متابولیکی مختلف، از جمله  -Sآدنوزیل متیونین (SAM)، یک دهنده برجسته گروه متیل در واکنش‌های متیلاسیون سلولی، ایفا می‌کند (Bernasocchi, T. and Mostoslavsky, R., 2024).

بسياري از رده هاي سلولي بدخيم انساني نيازمند متيونين بيشتري براي افزايش سنتز پروتئين و تنظيم بيان DNA هستند. در دسترس بودن بيشتر متيونين باعث فراهمي زيستي بيشتر S-آدنوزيل متيونين براي اهداي گروه هاي متيل به DNA مي شود كه اين مي تواند منجر به هيپرمتيلاسيون در DNA مي شود(Vaccaro, J.A. and Naser, S.A., 2021) .

از اولين تغييرات اپي ژنتيكي شناسايي شده در سرطان، تغيير در متيلاسيون DNA است. شواهد زيادي وجود دارد كه محدوديت متيونين مي تواند رشد سلول هاي سرطاني را مهار كند (Bandaru, N., et al 2025).

توانایی متیونیناز در کاهش سطح متیونین بدن، دلیل اصلی اثرات ضد سرطانی قوی آن است. متیونین نقش مهمی در رشد و تکثیر بسیاری از سلول‌های سرطانی، به ویژه آن‌هایی که در انواع خاصی از تومورها دیده می‌شوند، ایفا می‌کند. متیونیناز می‌تواند با کاهش در دسترس بودن این اسید آمینه حیاتی، ضمن حفظ سلول‌های طبیعی که کمتر به متیونین وابسته هستند، اثرات کشنده‌ای در سلول‌های سرطانی ایجاد کند. کاهش متیونین چندین اثر پایین‌دستی دارد. اول، باعث آپوپتوز می‌شود؛ کاهش سطح متیونین ممکن است باعث شود سلول‌های سرطانی مسیرهای آپوپتوز را آغاز کنند و در نتیجه مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی رخ دهد. دوم، با کاهش تأمین یک ماده مغذی حیاتی، رشد سلول‌های سرطانی را کند یا متوقف می‌کند که تکثیر سلولی را محدود می‌کند (Wahib., et al 2025). متيونيناز، متیونین را به 𝛼-کتوبوتیرات، متانتیول و آمونیاک کاتالیز می کند (George, S. and Narayanan, D.P., 2025)

مطالعات نشان مي دهد MGL از منابع مختلف از جمله: باکتری ها، قارچ ها و گیاهان جدا شده است. اما انسان ها فاقد این آنزیم هستند. در میان منابع MGL که قبلا توضیح داده شد، باسیلوس های آبزی و هالوفيل بهترین منبع باكتريايي برای تولید MGL گزارش شده است (Abozeid, A.A., 2023) .

مواد و روش ها

نمونه برداري

این مطالعه از نوع توصيفي-تحليلي می باشد و به صورت مطالعه علوم پایه انجام شده است. نمونه برداری از آب شور در بندرعباس-خليج فارس انجام شد که در مجموع 20 نمونه آب از سطح تا عمق 10 سانتی متری نمونه برداری و بعد از بسته بندی در ظروف شيشه اي که از قبل استریل شده به آزمایشگاه ارسال گردید. نمونه ها با دور rpm 8000  سانتریفیوژ شد و از قسمت رسوب آن در محیط لوريا برتاني آگار به صورت چهار منطقه ای کشت انجام گردید. از قسمت کلنی های رشد یافته مشکوک به باسیلوس از نظر ماكروسكوپي، ميكروسكوپي و تست هاي بيوشيميايي مورد مطالعه قرار گرفتند. از سویه استاندارد باسیلوس به عنوان کنترل مثبت در تمامی مراحل کار استفاده شد. برای غربال گری 20 نمونه آب شور ارسالی به آزمایشگاه کلنی های مشکوک به باسیل های گرم مثبت جداسازی شده که بر اساس خصوصیات مورفولوژیک، میکروسکوپی و تست های بیوشیمیایی تحت عنوان باسیلوس تعیین هویت شدند. به منظور تاييد هویت مولکولی جنس باسیلوس حامل ژن متیونیناز از پرایمرهای عمومی 16srRNA به روش PCR استفاده گردید.

جداسازي باسيلوس هاي توليد كننده آنزیم متيونيناز

به منظورشناسایی ژن کد کننده ی آنزیم متیونیناز (mdeA) از كيت دي ان اي اكستركشن و آزمون PCR  با استفاده از زوج پرايمر هاي اختصاصي سنتز شده توسط sinacolon  انجام گرفت و محصول توسط ژل آگارز 1% الكتروفورز شد. الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1% نشان می دهد که تنها 2 سویه حامل ژن mdeA  می باشد.

آغازگر هاي مورد استفاده در اين پژوهش

نام ژن	توالي ژن	سايز باند
M13-FP	5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′	190
16s rRNA	F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′	1420

کلون کردن ژن کد کننده ی آنزیم متيونيناز (mdeA) در اشریشیاکلی اوريگامی

باکتری E.Coli  سویه اوريگامي از بانك ميكروارگانيسم ها تهیه گردید. در این پژوهش به منظور کلونینگ سریع تر و موثرتر محصول PCR از روش TA-Cloning  استفاده شد. کیت TA کلونینگ از شرکت Sinaclon تهیه گردید. همانطور که در پروتکل کیت آمده بود از یک وکتور خطی بنام PTG19-T که در انتهای ´3 آن باز تیمین قرار دارد استفاده شد. استفاده از وکتور خطی PTG19-T که در انتهای ´3 خود دارای باز تیمین است منجر به اتصال مستقیم و سریع و آسان محصول PCR  به وکتور کلونینگ می گردد، سپس آنزیم ligase T4 DNA با تشکیل پیوند کووالان اتصال DNA مورد نظر به وکتور خطی را محکم می کند، در نتیجه یک مولکول حلقوی که حاوی ژن مورد نظر ماست تشکیل شده که توانایی تکثیر خود بخود را در میزبان مناسب مانند E.coli دارا می باشد.

انتقال وکتور به میزبان اشرشیاکلی اوريگامي

باکتری E.coli  سویه اوريگامي در محیط کشت LB در دمای 37 درجه سانتی گراد بمدت 17-16 ساعت کشت داده شد و سپس در دستگاه سانتریفوژ لوله ای بمدت 10 دقیقه در دور g10000 سانتریفوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته شده و رسوب باکتری بدست آمد. 100 میکرولیتر از بافر s به رسوب باکتری اضافه کرده سپس بمدت 1 دقیقه در سانتریفوژ یخچال دار در دور 12000 g قرار داده شد. سپس 50 میکرولیتر از بافر s روی رسوب ریخته و بمدت 5 دقیقه در یخ قرار گرفت. دوباره در دور g 12000 بمدت 1 دقیقه سانتریفوژ شده، این بار 500 میکرولیتر از بافر s روی رسوب ریخته و پیپتاژ شد و 100 میکرولیتر از آن را به محلول Ligation  اضافه کرده و بمدت 30 دقیقه دیگر در یخ قرار داده شد. سپس 90 ثانیه در 42 درجه سانتی گراد قرار گرفت و دوباره 10 دقیقه دیگر بر روی یخ قرار داده شد. درنهایت محلول بدست آمده در حجم 75 میکرولیتردر تیوب های 5/1 میلی لیتری درب پیچ دار مخصوص ذخیره گردید و در دمای 70- درجه سانتی گراد بصورت بلند مدت نگهداری شد.

400 میکرولیتر از محیط کشت ساخته شده برداشته و در ویال 5/1 میلی لیتری ریخته شد و مواد transfer  شده را که در یخ قرار دارند به آن اضافه شد. پس از پيپتاژ کردن بمدت 60-45 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد قرار گرفت. به محیط کشت آنتی بیوتیک آمپی سیلین اضافه شد تا باکتری بتواند در محیط رشد کند و وکتوری که دریافت کرده را نگه دارد. سپس محتویات بمدت 1 دقیقه در دور 650g سانتریفوژ شده و محلول رویی دور ریخته شد و رسوب باکتری روی پلیت LB کشت داده شد و بمدت 1 الی 2 روز در 37 درجه سانتی گراد انکوبه و در نهایت انجام کلونینگ تایید گردید.

و در نهایت به منظور تایید کلونینگ مرحل زیر انجام شد:

1. کلونال سلکشن (کلونی های سفيد و آبي)

2. پرایمر M13 

3. سکانس و توالی یابی جانکشن­ها

محصولPCR  برای سکانس و بررسي بيان به شرکت Bioner ارسال گردید و BLAST شد.

 

 

تایید کلونیگ با روش کلونال سلکشن آبی و سفید

توالی های به دست آمده از نظر تشابه ژنتیکی با سایر توالی های ثبت شده در سایت NCBI هم ردیف شده و درخت فیلوژنی ترسیم گردید. به این صورت که ابتدا توالی DNA و mRNAی ژن 16srRNA در سایت NCBI شناسایی شد. سپس توالی چندین ژن 16srRNA از بانک اطلاعاتی NCBI گرفته شد و با استفاده از نرم افزار clustalX توالی های این ژن با سایر باکتری ها هم تراز گردید. در ادامه تعداد جهش ها، تنوع نوکلئوتیدی، درصد تفرق ژنی و ... با استفاده از قسمت آنالیز ژنی در سایت NCBI انجام گردید. برای رسم درخت فیلوژنی از نرم افزار Mega5 استفاده شد.

 محل ایجاد جانکشن و سکانس مربوط به آن توسط شرکت بیونر

 

 

 

 

 

اطلاعات پرایمر متیونیناز سنتز شده توسط شرکت سیناکلون به سفارش پژوهشگر

Oligo name	Seq.(5-3)	MW	OD (1000µl)	nmol	Water/tube (µl)	TM	GC%	Mer
Methioninase-F-1042bp	ATGAGCATCACCCAGAAC	5461.6	2	12.08	120.84	53.69	50	18
Methioninase-R	TCATTTTTCCAATCTTCCAT	5967.9	2	11.06	110.59	49.10	30	20

 

 

 

 درخت فیلوژنی رسم ش ده بر اساس توالی ژن 16srRNA با استفاده از نرم افزار Mega5

 میزان بیان ژن متیو نینازتوسط سویه ی نوترکیب به وسیله ی آزمون  Real time PCR بررسی شد

نتایج

در نتیجه غربال گری 20 نمونه آب ارسالی به آزمایشگاه در مجموع 12 کلنی مشکوک به باسیل های گرم مثبت جداسازی شد. الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1% نشان داد که تنها 2 سویه حامل ژن mdeA  می باشد. پس از کلون کردن سویه حامل ژن متیونیناز توسط کلنی سلکشن (آبی/سفید) سویه های کلون شده جداسازی شدند و برای تایید حضور پرایمر M13از کلنی های مشکوک DNA استخراج شد. توسط آزمون PCR و الكتروفورز محصول PCR، ورود ژن های پلازميد به باکتری اشریشیاکلی اوريگامي تایید شد. در نتیجه آزمون کلونینگ نشان داد که این ژن در اشریشیا کلی اوریگامی بطور موفقیت آمیزی کلون شده است. بررسی درخت فیلوژنی گونه هاي مـورد مطالعه و مقایسه با گونه هاي مشابه در بخشی از تحقیق حاضـر، روابـط فیلـوژنتیکی بین گونه هاي باسیلوس با اسـتفاده از ژن  16srRNA مورد بررسـی قـرار گرفـت. نتـایج درخـت فیلوژنتیکی به روش پیوند همجواري (Neighbor-Joining) نشـان می دهـد کـه نمونه ما با گونـه هـاي باسیلوس سوبتیلیس بــا بــوت اســترپ 99% در یک کــلاد (خوشــه) قــرار گرفتنــد کــه بیــانگر رابطــه خویشاوندي نزدیک آن ها با هم بود.

بحث

سلول های سرطانی در مقایسه با سلول‌های طبیعی، برای رشد و تکثیر سریع به مقدار زیادی گلوکز نیاز دارند. اما درمان های بر پایه ی حذف، گلوکز به علت اینکه سلول‌های طبیعی نیز برای زنده ماندن و رشد به گلوکز نیاز دارند غیر ممکن است. یکی دیگر از  ضروریات متابولیکی سلول‌های سرطانی، وابستگی آن ها به سطوح بالای اسیدهای آمینه خاص، از جمله متیونین برای رشد و تکثیر است. به همین جهت آنزیم متیونیناز به عنوان یک عامل محدودیت متیونین بسیار مورد توجه واقع شده است(Qoura, L.A. et al., 2024) . Mohkam و همکاران در سال 2020 برای اولین بار، تولید ال-متیونیناز از یک جنس جدید Alcaligenes را گزارش کرد که از نمونه های خاک جدا و شناسایی شد. در این مطالعه نمونه‌ها از خاک باغ‌های مختلف شهر شیراز در استان فارس، ایران، جمع آوری شده بود. Ghalehno و همکاران در سال 2018 "به بررسی جداسازی و شناسایی سویه های تولیدکننده مواد فعال ضدمیکروبی در طی غربال‌گری باکتری‌های گرم‌مثبت تشکیل‌دهنده‌ی آندوسپور هالوفیل جداشده از دریاچه‌های شورایران پرداختند. تعداد 62 ایزوله از دریاچه‌های شور مختلف ایران جداسازی شدند." استخراج آنزیم متیونیناز از باکتری های تولید کننده این آنزیم، یکی از روش های دستیابی به این آنزیم است که در این مورد نیز تحقیقات متعددی انجام یافته است. در این مورد Azizi, E و همکاران در سال 2018 در مطالعه اي "تحت عنوان جداسازی و شناسایی اکستروموفیل های مولد ضد سرطان آنزیم های ال-گلوتامیناز و ال-متیونیناس از چشمه آب گرم ییل گنبد كه در قزوین، ایران انجام شده بود دریافتند که از مجموع 20 نمونه آب گرم یله گنبد قزوین 12 کلنی رشد کرد اما تنها 1 ایزوله دارای متیونیناز فعال بود. در این مطالعه، باسیلوس لیکینی فورمیس  به عنوان یک سویه غالب و یک سویه بومی برای تولید  متیونیناز شناسایی شد." در مطالعه ي ديگري که در اندونزي توسطPrihanto, A.A در سال 2018 تحت عنوان باسیلوس سوبتیلیس UBTn7، یک تولیدکننده بالقوه L-متیوناز جدا شده از گیاه حرا، Rhizophora mucronata انجام گرفت. "هدف از این مطالعه به دست آوردن باکتری اندوفیت مولد ال متیونیناز جدا شده از ریشه، ساقه و برگ درختان حرا بود كه بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، بهترین تولید کننده باسیلوس سوبتیلیس بود". تولید آنزیم متیونیناز توسط سایر گونه هاي میکروبی مانند قارچ ها نیز انجام می گیرد. در مطالعه ای که در عربستان توسط Alzahrani  و همکاران در سال 2021 انجام گرفت "از 24 گونه قارچی که از ریزوسفر گیاهی جدا شده بود 8 جدایه توانایی تولید آنزیم را داشتند که در مقایسه با باسیلوس های جدا شده در این مطالعه از توانایی بالایی در این زمینه برخورد بودند. آن ها همچنین توالی 16srRNA جدایه های قارچی را آنالیز کردند و گزارش دادند که اکثر این قارچ ها از نوع آسپرژیلوس و پنی سیلیوم بوده اند."

نتيجه گيري

تولید دارو از طریق فناوری DNA نوترکیب و اثرات درماني آن از مباحث روز جوامع علوم پزشكي جهان است. ایران دارای تنوعی از محيط هاي شور با غلظت هاي مختلف است. این محيط ها شامل معادن نمکی، بيابان هاي شور، رودخانه های نمکی و به ویژه درياچه هاي نمک است. دریاچه ارومیه بزرگ‏ترین و شورترین دریاچه دائمی ایران و یکی از دریاچه¬های فوق اشباع از نمک دنیا است که از این نظر با دریاچه نمک بزرگ آمریکا شباهت دارد. همچنین خليج فارس به عنوان يكي از شور ترين آب هاي آزاد شناخته مي شود. میکروارگانیسم‌های هالوفیل (نمک‌دوست) میکروارگانیسم‌هایی هستند که در محیط‌های شور و غنی از نمک زندگی می‌کنند. این موجودات به دلیل توانایی تحمل شرایط سخت و نقش در چرخه‌های زیستی، توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند. متیونیناز یکی از آنزیم های صنعتی با ارزش درمانی بالا است و به عنوان یک عامل ضد سرطانی قوی در برابر انواع مختلف رده های سلولی تومور به حساب می آید. بسیاری از رده های سلولی سرطانی انسان و تومورهای اولیه نیاز مطلق به L-متیونین، یک اسید آمینه ضروری برای بقا و تکثیر دارند. از سوی دیگر، سلول‌های طبیعی به دلیل متیونین سنتاز فعال، توانایی رشد بر روی هموسیستئین، به جای متیونین را دارند. بسیاری از سلول های تومور فاقد متیونین سنتاز فعال هستند بنابراین به مکمل متیونین خارجی از طریق رژیم غذایی وابسته هستند. در نتیجه، متیونین هدف اصلی تومور های خاص برای درمان است؛ بنابراین، بهره برداری درمانی از  L-متیونیناز برای تخلیه متیونین پلاسما یک روش امیدوارکننده به نظر می رسد. علاوه بر این، توزیع محدود L-متیونیناز به عنوان آنزیم درون سلولی در بین همه پاتوژن های میکروبی، اما نه در انسان، این آنزیم را به یک هدف دارویی امیدوارکننده برای درمان های ضد باکتری، ضد قارچ و ضد تک یاخته تبدیل می کند. با توجه به اهمیت این مسئله و استفاده دارویی از آنزیم متیونیناز، در این مطالعه تلاش شد تا تولید این آنزیم از طریق روش کلونینگ توسط باکتری سریع الرشد اشریشیا کلی اوريگامي انجام بگیرد تا قدمی در راستای تولید انبوه از این آنزیم با کمک باکتری ها صورت پذیرد. نتایج تحقیق حاضر نيز نشان داد که ژن آنزیم ميونيناز در باسیلوس های هالوفیل موجود در آب هاي بندرعباس-خليج فارس وجود دارد و با کلونینگ آن در اشرشيا كلي اوريگامي مي توان به میزان گسترده تر و با صرفه اقتصادی بیشتر این آنزیم صنعتی را تولید نمود.

منابع

1.       Abozeid, A.A., 2023. Short review on microbial L-methioninase and its applications. Bulletin of Faculty of Science, Zagazig University, 20 (4), pp.107-139.

2.       Aledo, J.C., 2019. Methionine in proteins: The Cinderella of the proteinogenic amino acids. Protein Science, 28(10), pp.1785-1796.

3.       Alshehri, W.A., 2020. Bacterium Hafnia alvei secretes L-methioninase enzyme: Optimization of the enzyme secretion conditions. Saudi journal of biological sciences, 27(5), pp.1222-1227.

4.       Alzahrani, K.J., 2021. Microbiome studies from Saudi Arabia over the last 10 years: achievements, gaps, and future directions. Microorganisms, 9(10), p.2021.

5.       Azizi, E., FARAHMAND, M. and Shahhosseini, M.H., 2018. Isolation and Identification of extremophiles producing anticancer L-glutaminase and L-Methioninas enzymes from Yale Gonbad hot spring in Qazvin, Iran.

6.       Bandaru, N., Noor, S.M., Kammili, M.L., Bonthu, M.G., Gayatri, A.P. and Kumar, P.K., 2025. Methionine restriction for cancer therapy: From preclinical studies to clinical trials. Cancer Pathogenesis and Therapy.

7.       Bernasocchi, T. and Mostoslavsky, R., 2024. Subcellular one carbon metabolism in cancer, aging and epigenetics. Frontiers in epigenetics and epigenomics, 2, p.1451971.

8.       Bray, F., Laversanne, M., Weiderpass, E. and Soerjomataram, I., 2021. The ever‐increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide. Cancer, 127(16), pp.3029-3030.

9.       George, S. and Narayanan, D.P., 2025. Biocatalytic Properties of Mangrove Microbiome. In Mangrove Microbiome: Diversity and Bioprospecting (pp. 297-308). Singapore: Springer Nature Singapore.

10.       Ghalehno, A.D., Ghavidel-Aliabadi, M., Shahmohamadi, Z., Mehrshad, M., Amoozegar, M.A. and Danesh, A., 2018. Isolation and Discovery of New Antimicrobial-agent Producer Strains Using Antibacterial Screening of Halophilic Gram-positive Endospore-forming Bacteria Isolated from Saline Lakes of Iran. Arak. Med. Univ. J, 20, pp.10-23.

11.       Javia, B.M., Gadhvi, M.S., Vyas, S.J., Ghelani, A., Wirajana, N. and Dudhagara, D.R., 2024. A review on L-methioninase in cancer therapy: Precision targeting, advancements and diverse applications for a promising future. International Journal of Biological Macromolecules, 265, p.130997.

12.       Kaiser, P., 2020. Methionine dependence of cancer. Biomolecules, 10(4), p.568.

13.       Kavya, D. and Nadumane, V.K., 2020. Identification of highest L-Methioninase enzyme producers among soil microbial isolates, with potential antioxidant and anticancer properties.

14.       Kharayat, B. and Singh, P., 2018. Statistical optimization of reaction condition of L-methioninase from Bacillus subtilis. Research Reports, 2(2018), pp.1-9.

15.       Lauinger, L. and Kaiser, P., 2021. Sensing and signaling of methionine metabolism. Metabolites, 11(2), p.83.

16.       Ma, C., Xu, A., Zuo, L., Li, Q., Fan, F., Hu, Y. and Sun, C., 2025. Methionine Dependency and Restriction in Cancer: Exploring the Pathogenic Function and Therapeutic Potential. Pharmaceuticals, 18(5), p.640.

17.       Mohkam, M., Taleban, Y., Golkar, N., Berenjian, A., Dehshahri, A., Mobasher, M.A. and Ghasemi, Y., 2020. Isolation and identification of novel L-methioninase producing bacteria and optimization of its production by experimental design method. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 26, p.101566.

18.       Navik, U., Sheth, V.G., Khurana, A., Jawalekar, S.S., Allawadhi, P., Gaddam, R.R., Bhatti, J.S. and Tikoo, K., 2021. Methionine as a double-edged sword in health and disease: Current perspective and future challenges. Ageing research reviews, 72, p.101500.

19.       Navik, U., Sheth, V.G., Khurana, A., Jawalekar, S.S., Allawadhi, P., Gaddam, R.R., Bhatti, J.S. and Tikoo, K., 2021. Methionine as a double-edged sword in health and disease: Current perspective and future challenges. Ageing research reviews, 72, p.101500.

20.       Neubauer, C. and Landecker, H., 2021. A planetary health perspective on synthetic methionine. Lancet Planet Health 5 (8): e560–e569 [online]

21.       Prihanto, A.A., 2018, April. Bacillus subtilis UBTn7, a potential producer of L-Methioninase isolated from mangrove, Rhizophora mucronata. In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science (Vol. 137, No. 1, p. 012077). IOP Publishing.

22.       Qoura, L.A., Balakin, K.V., Hoffman, R.M. and Pokrovsky, V.S., 2024. The potential of methioninase for cancer treatment. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer, 1879(4), p.189122.

23.       Raboni, S., Faggiano, S., Bettati, S. and Mozzarelli, A., 2024. Methionine gamma lyase: Structure-activity relationships and therapeutic applications. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1872(3), p.140991.

24.       Suganya, K., Govindan, K., Prabha, P. and Murugan, M., 2017. An extensive review on L-methioninase and its potential applications. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 12, pp.104-115.

25.       Vaccaro, J.A. and Naser, S.A., 2021, December. The role of methyl donors of the methionine cycle in gastrointestinal infection and inflammation. In Healthcare (Vol. 10, No. 1, p. 61). MDPI.

26.       Wahib, Z.M., Muslim, S.N. and Shafi, F.A.A., 2025. Production, Purification, and Characterization of L-Methioninase Produced by Escherichia coli Isolates: Potential Application in Cancer Treatment. Asian Pacific Journal of Cancer Biology, 10 (2), pp.285-292.

27.       Wanders, D., Hobson, K. and Ji, X., 2020. Methionine restriction and cancer biology. Nutrients, 12(3), p.684.

 

 

 

Molecular study and cloning of Methioninase gene from halophilic bacilli in cells susceptible to industrial application

Forough sahirad1, Mansour bayat*2, mohaddeseh larypoor3

1. Master's degree in Industrial Microbiology, Department of Biology, Faculty of Basic Sciences and New Technologies, Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

2. Professor of Veterinary Mycology, Pathobiology Department, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

3. Associate Professor of Medical Mycology, Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

Received: 21 August 2025         Accepted: 14 October 2025  

Abstract

Methioninase is an enzyme that has been widely studied in the field of pharmacy, especially cancer therapy. Halophilic bacillus are a group of gram-positive bacteria that live in saline environments. These organisms are potential reservoirs of enzymes that are widely used in industries. Therefore, the aim is molecular investigation and coloning of the methioninase gene from halophilic bacilli is in the susceptible cell for use in industry. Bacillus strains were isolated and identified from a total of 20 saline water samples in persian gulf-bandarabbas, and then the methioninase gene was isolated from the bacilli by PCR method. The amplified fragment was inserted into the the pTG19 transfer vector by TA cloning method. In the next step, the recombinant vector was transformed into E.coli uragami. The expression level of pectinase enzyme was evaluated using real-time PCR method. Out of 12 Bacillus strains isolated, only 2 strains had methioninase gene. In order to determine the molecular identity of the Bacillus genus carrying the methioninase gene, housekeeping primers were used. Finally, the expression of methioninase gene in Escherichia coli Oragami bacteria was confirmed by PCR product sequence. As a result of this research, it was possible to find local halophilic bacilli producing methioninase enzyme and its gene was successfully transferred from Bacillus bacterium to E.coli bacterium for high production efficiency. According to the results, the optimal temperature of enzyme activity is at It was 37 degrees.

Keywords: Methioninase, Bacilli, cloning, Molecular, Halophile, PCR

*Corresponding author: Mansour bayat

Address: Professor of Veterinary Mycology, Pathobiology Department, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

E. mail: [e-mail]

 

---